一種煙草中不同形態(tài)硒的提取凈化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種煙草中不同形態(tài)硒的提取凈化方法，該方法是將煙草樣品研磨后，先用酸溶液萃取，冷卻后加入合適的酶再萃取，靜置后過濾，得到樣品。本發(fā)明的提取凈化方法采用鹽酸-蛋白酶K的萃取液組合，即保證了各種形態(tài)的硒被均勻萃出，并在萃取液中均勻地分布，方便一次性進(jìn)樣分析，該方法采用漩渦混合振蕩極大地提高提取的效率，縮短前處理周期。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于理化檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種煙草中不同形態(tài)硒的提取凈化方法。 -種煙草中不同形態(tài)硒的提取凈化方法

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草中含有重金屬，在抽吸過程中，這些重金屬可通過煙氣進(jìn)入人體，對(duì)人體造成 潛在的危害。美國1989年報(bào)導(dǎo)的107種卷煙煙氣有害成分中，八 8、0(1、〇、？13、附、(：11、取等 赫然在列，1990年的Hoffman清單也將As、Cd、Cr、Pb、Ni、Se、Hg列入煙草44種有害成分。 越來越多的研究證實(shí)，吸煙已成為煙民體內(nèi)某些重金屬的主要來源之一。
[0003] 然而重金屬的生物毒性不僅與其含量有關(guān)，更大程度上由其存在形態(tài)決定。以硒 為例，其主要形態(tài)有：亞砷酸（As(III))、砷酸（As( V ))、一甲基砷酸（MMA)、二甲基砷酸 (DMA)、砷甜菜堿和砷膽堿，此外還有砷糖、砷酯類化合物等。其中，無機(jī)砷的毒性大于有機(jī) 砷，它們的毒性排序?yàn)椋篈s (III) >As ( V ) >MMA>DMA，而砷膽堿和砷甜菜堿常被認(rèn)為是無毒 的。由此可見，對(duì)重金屬進(jìn)行形態(tài)分析比總量檢測(cè)更加科學(xué)。
[0004] 目前，硒的形態(tài)分析在海產(chǎn)品、中藥等的食品領(lǐng)域研究已經(jīng)很深入，相關(guān)的樣品前 處理（提取凈化）的方法報(bào)道較多，但是針對(duì)煙草中硒形態(tài)檢測(cè)的提取凈化卻未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種適用于煙草中硒形態(tài)檢測(cè)的提取凈化方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：研磨后的樣品先用酸溶液 萃取，冷卻后加入特定的酶再萃取，靜置后過濾進(jìn)樣。
[0007] 具體地說：稱取研磨后的樣品，加入鹽酸水溶液，高溫超聲萃取一段時(shí)間，冷卻后 加入一定量的蛋白酶K漩渦振蕩，靜置后經(jīng)水相膜過濾后進(jìn)樣。
[0008] 更具體地說：稱取約0· 2?0· 5g研磨后的的樣品于50mL具蓋離心管中，加入15? 20mL含0. 05?0. lmol/L鹽酸的水溶液，在50?80°C下超聲萃取30?60min，冷卻至37°C 后加入10?30mg的蛋白酶K，置于漩渦混合振蕩儀上以1500?2500r/min速度振蕩15? 30min,靜置后取上清液經(jīng)0. 22 μ m水相膜過濾后進(jìn)樣。
[0009] 發(fā)明人在對(duì)煙草樣品進(jìn)行普查時(shí)發(fā)現(xiàn)，煙草中硒主要以硒酸鹽（SeVI)、亞硒酸鹽 (Se IV )、硒代蛋氨酸（SeMet)、硒代胱氨酸（SeCys2)、硒代乙硫氨酸（SeEt)的形式存在。發(fā) 明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，采用上述技術(shù)方案能夠?qū)崿F(xiàn)不同形態(tài)的硒一次同時(shí)萃取，并且不同 形態(tài)的硒在萃取液中均勻地分布，方便一次性進(jìn)樣分析，萃取效率高，樣品前處理周期短。
[0010] 因此，本發(fā)明主要涉及以下兩個(gè)方面。
[0011] 本發(fā)明的第一方面涉及一種煙草中不同形態(tài)硒的提取凈化方法，該方法是將煙草 樣品研磨后，先用酸溶液萃取，冷卻后加入合適的酶再萃取，靜置后過濾，得到樣品。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的提取凈化方法，其特征在于以下（i)?（Vi)中的一項(xiàng) 或多項(xiàng)：
[0013] (i)所述的酸溶液為鹽酸水溶液，優(yōu)選濃度為0. 05?0. lmol/L鹽酸水溶液，優(yōu)選 的鹽酸水溶液的用量為3. 5?4mmol/g煙草樣品（例如3. 75mmol/g煙草樣品、4mmol/g煙 草樣品、4.2mmol/g煙草樣品）；
[0014] (ii)所述的合適的酶為蛋白酶K，優(yōu)選的蛋白酶K的用量為40?70mg/g煙草樣 品（例如50mg/g煙草樣品或60mg/g煙草樣品）；
[0015] (iii)酸溶液萃取的方式為高溫超聲萃取，優(yōu)選萃取溫度為50?80°C，優(yōu)選萃取 30 ?60min ;
[0016] (iv)冷卻的溫度為37°C以下；
[0017] (v)酶萃取的方式為漩渦振蕩，優(yōu)選的漩渦震蕩的條件為以1500?2500r/min速 度振蕩15?30min ;
[0018] (vi)過濾方式為水相膜過濾，優(yōu)選0. 22 μ m的水相膜。
[0019] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的提取凈化方法，包括以下步驟： 稱取約〇. 2?0. 5g研磨后的的煙草樣品于50mL具蓋離心管中，加入15?20mL含0. 05? 0. lmol/L鹽酸的水溶液，在50?80°C下超聲萃取30?60min，冷卻至37°C后加入10? 30mg的蛋白酶K，置于漩渦混合振蕩儀上以1500?2500r/min速度振蕩15?30min，靜置 后取上清液經(jīng)〇. 22 μ m水相膜過濾后，得到樣品。
[0020] 本發(fā)明的第二方面涉及一種煙草中硒形態(tài)的分析方法，其中煙草樣品前處理方法 采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的提取凈化方法。
[0021] 具體地，本發(fā)明第二方面所述的分析方法，包括以下步驟：
[0022] (1)采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的提取凈化方法對(duì)煙草樣品進(jìn)行前處理，得到 待測(cè)樣品；
[0023] (2)采用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法分析檢測(cè)待測(cè)樣品。
[0024] 本發(fā)明所述的煙草樣品可以是任何品種、任何形式的煙草，例如白肋煙、香料煙、 烤煙等等，可以是煙葉，也可以是煙絲或煙末。
[0025] 發(fā)明的有益效果
[0026] 本發(fā)明的提取凈化方法采用鹽酸-蛋白酶K的萃取液組合，即保證了各種形態(tài)的 硒被同時(shí)均勻萃出，并在萃取液中均勻地分布，方便一次性進(jìn)樣分析。該方法采用漩渦混合 振蕩極大地提高提取的效率，縮短前處理周期。應(yīng)用本發(fā)明提供的提取凈化方法對(duì)煙草進(jìn) 行前處理，然后對(duì)煙草中硒形態(tài)進(jìn)行分析檢測(cè)，該分析方法靈敏度高，檢出限在〇. 2?2ug/ L之間，并且回收率高、相對(duì)偏差小，操作簡單、效率高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是本發(fā)明的提取凈化方法的操作流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或原料未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0029] 下面的實(shí)施例中采用本發(fā)明所述的提取凈化方法對(duì)煙草樣品中不同形態(tài)的硒進(jìn) 行提取凈化，然后采用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)其進(jìn)行分析測(cè)試，得 到煙草樣品中硒形態(tài)的分析結(jié)果。具體方法是：稱取研磨后的煙草樣品，加入鹽酸水溶液， 高溫超聲萃取一段時(shí)間，冷卻后加入一定量的蛋白酶K漩渦振蕩，靜置后經(jīng)水相膜過濾后 進(jìn)樣，操作流程圖如圖1所示。
[0030] 下面實(shí)施例1-3中所述的研磨是采用旋轉(zhuǎn)切割式研磨儀將煙絲研磨，并過40目 篩。
[0031] 實(shí)施例1-3中采用的分析儀器為美國Agilent公司1100型高效液相色譜儀，配有 HamiltonPRP-XlOO 陰離子交換色譜柱（250X4. lmm，10ym);以及美國 Agilent 公司 7500 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS)，具體的工作條件參見表1。
[0032] 表1 HPLC-ICP-MS儀器工作條件
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種煙草中不同形態(tài)硒的提取凈化方法，該方法是將煙草樣品研磨后，先用酸溶液 萃取，冷卻后加入合適的酶再萃取，靜置后過濾，得到樣品。
2. 權(quán)利要求1所述的提取凈化方法，其特征在于以下（i)?（vi)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)： (i) 所述的酸溶液為鹽酸水溶液，優(yōu)選濃度為〇. 05?0. lmol/L鹽酸水溶液，優(yōu)選的鹽 酸水溶液的用量為3. 5?4mmol/g煙草樣品（例如3. 75mmol/g煙草樣品、4mmol/g煙草樣 品、4.2mmol/g煙草樣品）； (ii) 所述的合適的酶為蛋白酶K，優(yōu)選的蛋白酶K的用量為40?70mg/g煙草樣品（例 如50mg/g煙草樣品或60mg/g煙草樣品）； (iii) 酸溶液萃取的方式為高溫超聲萃取，優(yōu)選萃取溫度為50?80°C，優(yōu)選萃取30? 60min ； (iv) 冷卻的溫度為37°C以下； (v) 酶萃取的方式為漩渦振蕩，優(yōu)選的漩渦震蕩的條件為以1500?2500r/min速度振 蕩 15 ?30min ; (vi) 過濾方式為水相膜過濾，優(yōu)選0. 22 μ m的水相膜。
3. 權(quán)利要求1或2所述的提取凈化方法，包括以下步驟：稱取約0. 2?0. 5g研磨后的 的煙草樣品于50mL具蓋離心管中，加入15?20mL含0. 05?0. lmol/L鹽酸的水溶液，在 50?80°C下超聲萃取30?60min，冷卻至37°C后加入10?30mg的蛋白酶K，置于漩潤混 合振蕩儀上以1500?2500r/min速度振蕩15?30min，靜置后取上清液經(jīng)0. 22 μ m水相膜 過濾后，得到樣品。
4. 一種煙草中硒形態(tài)的分析方法，其中煙草樣品前處理方法采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng) 所述的提取凈化方法。
5. 權(quán)利要求4的分析方法，包括以下步驟： (1) 采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的提取凈化方法對(duì)煙草樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè) 樣品； (2) 采用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法分析檢測(cè)待測(cè)樣品。
【文檔編號(hào)】G01N30/14GK104155391SQ201410400637
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】蔡國華, 謝衛(wèi), 張建平, 黃朝章, 吳清輝, 黃華發(fā), 鄧其馨, 劉秀彩, 張鼎方 申請(qǐng)人:福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司