負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，屬于微球測定【技術領域】。該方法包括以下步驟：1)樣品準備：將微球以固定液固定后，加入染色劑結合微球中的蛋白、多肽類藥物；2)納米計算機斷層掃描：將待測微球樣品置于Nano-CT斷層掃描設備中，對微球進行掃描，獲得微球的二維投影圖像；3)數(shù)據(jù)分割：通過重建，得到微球不同截面的圖像，以預設的灰度閾值，將微球分割為蛋白、多肽類藥物部分和微球骨架部分；4)三維結構構建：以微球的截面圖像進行三維重構，得到負載蛋白、多肽類藥物微球的三維結構，并計算出微球的結構參數(shù)。采用該方法，能夠得到微球內的三維立體結構。
【專利說明】負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微球測定方法，特別是涉及一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法。
【背景技術】
[0002]近年來，蛋白質多肽類藥物在診斷、治療艾滋病、癌癥、肝炎、糖尿病等疾病，或疫苗預防疾病等方面發(fā)揮著重要的作用。但由于蛋白質多肽類藥物的體內外穩(wěn)定性差，注射給藥后，藥物很快失活，為達到療效往往需要頻繁、大劑量給藥，導致毒副作用及耐受性的產生，嚴重限制了其在臨床上的應用。
[0003]而用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)等生物可降解聚合物，將生物大分子藥物包被成緩釋肌注微球(microsphere),可提高藥物的生物利用度,實現(xiàn)藥物控釋或緩釋，具有提高藥效、降低毒副作用、提高病人順應性與耐受性的優(yōu)點。
[0004]微球在研發(fā)的過程中，局限于以載藥量、包封率、粒徑等作為評價指標，再采用體內外釋放結果來指導和調整制備工藝因素，并且進行體內外釋放行為的考察后才能驗證處方的優(yōu)劣，往往出現(xiàn)前期篩選各項指標良好，但后期釋藥行為不理想的現(xiàn)象。因此，缺乏關于微球制備工藝、處方因素、微球理化性質及釋藥性能之間廣泛深入的理論支持，導致了負載蛋白、多肽類藥物的PLGA微球科研效率低、周期長，成功率低。
[0005]許多研究表明微球結構的改變會影響藥物的釋放，如在復乳化溶劑揮發(fā)法的基礎上，加入致孔劑可使制得微球內部結構疏松，突釋現(xiàn)象明顯，釋放增快。此類研究包括在內水相加入滲透劑，發(fā)泡劑；或在有機相加入油酯，成球后溶劑洗滌除去。而在連續(xù)相(即外水相)中加入滲透劑，得到的微球內部結構致密，藥物不易突釋，相應緩釋時間延長。其采用不同方法的目的是使微球表面的多孔結構愈合，阻礙原本經孔道釋放的藥物，降低藥物突釋?？傊缥⑶蚪Y構變得疏松，則藥物突釋增加、釋放增快；如微球結構變得致密，則突釋減少，緩釋周期延長。另外，改變微球的制備方法可以使蛋白分布更為均勻，能夠成功避免微球的藥物突釋。且大量研究表明微球的結構和微球的降解、藥物的釋放之間關系極為密切。因此，研究微球骨架及藥物在空間上的三維分布，對藥物釋放數(shù)學模型建立及發(fā)展，建立高效的篩選平臺，縮短微球研發(fā)周期，提高研發(fā)效率有極為重大的意義及研究前景。
[0006]而常規(guī)的表征微球空隙結構的方法具有一定局限性，難以分析微球內部的結構參數(shù)。如:水銀或氣體孔隙度測定法，氮氣脫附吸附法用于測定微球內部孔隙的分布，但無法測量密閉的孔隙，且過高的壓力可能會破壞微球的原有的結構；而掃描電子顯微鏡(SEM)可用于定性分析微球結構，其分辨率較高，但僅能觀察到微球表面，無法對微球的內部整體結構進行分析；另有共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)和傅里葉變換紅外光譜可用于定性或半定量觀察微球內的藥物分布，但分辨率較低，不能滿足定量分析微球內藥物分布的詳細信息。
[0007]Nano-CT (Nano computed tomography,納米計算機斷層掃描技術)，屬于無損檢測的技術范疇。Nano-CT主要由X射線成像系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)兩部分組成。Nano-CT掃描時，由X射線成像系統(tǒng)中的微焦點X光機產生X射線并垂直透過被測試物體，衰減后的X射線被探測器所采集，通過模數(shù)轉換，在監(jiān)視器上顯示掃描后所獲得的圖像；由計算機系統(tǒng)對掃描得到的圖像進行重建，生成高密度分辨率的橫截面圖像。具有高空間和時間分辨率(可達納米級)、高穿透性、豐富的襯度機制、友好的成像環(huán)境以及線性吸收等特點。在微電子產業(yè)、生命科學、能源和環(huán)境科學、材料科學等各種領域有著非常廣闊的應用。

【發(fā)明內容】

[0008]基于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，采用該方法，能夠得到微球的立體形態(tài)空間分布等立體結構信息。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案:
[0010]一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，包括以下步驟:
[0011]I)樣品準備
[0012]將微球置于容器中，加入固定液，靜置，使固定液完全滲透微球；棄去固定液，以磷酸鹽緩沖液清洗微球，棄去磷酸鹽緩沖液；加入乙醇清洗，脫去微球中的水；然后加入含染色劑的乙醇溶液，靜置，確保染色劑完全浸透微球，并與微球中負載的蛋白、多肽類藥物結合，再以磷酸鹽緩沖液將未與蛋白、多肽類藥物結合的染色劑清洗去除，得到待測微球樣品;
[0013]2)Nano_CT 斷層掃描
[0014]將待測微球樣品置于Nano-CT斷層掃描設備中，調節(jié)光子能量為5_12keV，采用大視場模式掃描，設置單幅曝光時間為15-25秒，并以0.2° -0.8°的步長在-90° -+90°的角度內采集微球二維投影圖像；
[0015]3)數(shù)據(jù)分割
[0016]對上述得到的微球二維投影圖像進行重建，得到微球的不同截面圖像，以預設的灰度閾值，將微球分割為蛋白、多肽類藥物部分和微球骨架部分；
[0017]4)三維結構構建
[0018]以微球的截面圖像進行三維重構，得到負載蛋白、多肽類藥物微球的三維結構，并計算出微球的結構參數(shù)。
[0019]本發(fā)明的一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，運用納米計算機斷層掃描技術(Nano-CT)對完整的負載蛋白、多肽類藥物微球個體進行無損的掃描。
[0020]得到數(shù)百張連續(xù)的微球二維投影圖像，進而可對得到的二維投影圖像數(shù)據(jù)進行重建，如采用濾波反投影法、反投影法、傅里葉變換或卷積反投影法，得到反映微球不同層面的截面圖像。并利用染色劑與微球中的蛋白質結合后，能顯著增加蛋白質對X射線的吸收和相移能力的特性，從而增強蛋白質的相位襯度，因此可以分辨出蛋白質部分與微球骨架載體的分布。并進行三維重構，得到微球內外結構的三維結構參數(shù)，以及其三維立體結構圖。
[0021]在其中一個實施例中，步驟I)樣品準備中，所述固定液為中性甲醛溶液、戊二醛溶液、等滲甲醛醋酸溶液或堿性醋酸鋁溶液。[0022]在其中一個實施例中，步驟I)樣品準備中，所述染色劑為醋酸鈾、檸檬酸鉛或四氧化鋨。上述染色劑能夠使蛋白質具有適宜的相位襯度，既能將蛋白質部分完全顯示出來，又不干擾微球骨架部分的成像。優(yōu)選地，所述染色劑為醋酸鈾。優(yōu)選地，所述染色劑的體積百分含量為1.5% -2.5%。使用該染色劑可以對蛋白質進行均勻且濃度適宜的染色。
[0023]在其中一個實施例中，步驟I)樣品準備中，所述固定液為體積百分比含量為1.0% -4.0 %的戊二醛水溶液；所述脫去微球中的水的方法為加入體積百分含量為10% -100%的乙醇溶液進行梯度清洗；所述染色劑為百分含量為1.5% -2.5%的醋酸鈾，按每克微球0.8-1.2mL醋酸鈾的加入量對蛋白質進行染色。選用上述的樣品準備方法，為后續(xù)納米計算機斷層掃描提供了較好的掃描基礎。
[0024]在其中一個實施例中，所述梯度清洗按照下述方法進行:依次加入30%、50%、70%,80%,95%, 100%乙醇溶液，分別將微球重新混懸并靜置后，棄去上清液。以梯度洗脫的方式逐步將微球中的水份除去，避免溶劑轉換過快導致蛋白質變性。
[0025]在其中一個實施例中，所述微球以聚乳酸類或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物類材料為骨架。
[0026]在其中一個實施例中，步驟2) Nano-CT斷層掃描中，所述光子能量為6_10keV，所述單幅曝光時間為18-22秒，所述CT成像投影數(shù)據(jù)的采集步長為0.4-0.6°。圖像采集步長越小，雖然獲取的信息越全面，但同時會由于數(shù)據(jù)過多導致三維重構過程的困難；如果步長太大，則會導致獲取二維數(shù)據(jù)太少，三維重構時信息量不足。步長在上述范圍內時，可以兼顧三維重構準確性與三維重構的計算難度。以上述參數(shù)對微球進行掃描，能獲得清晰度和分辨率最佳的微球骨架以及蛋白分布的CT圖像。
[0027]在其中一個實施例中，步驟3)數(shù)據(jù)分割中，對微球二維投影圖像進行重建的方法為濾波反投影算法。能獲得更為準確的微球立體結構。同樣的，根據(jù)具體需求，可視化重建時，也可采用反投影法、傅里葉變換法和卷積反投影法重建。
[0028]在其中一個實施例中，步驟3)數(shù)據(jù)分割中，所述灰度閾值為35-45，具體分割方法為:如灰度值小于等于該灰度閾值，則分割為蛋白、多肽類藥物部分，如灰度值大于該灰度閾值，則分割為微球骨架部分。采用上述灰度閾值，能夠更好的將蛋白、多肽類藥物部分和微球骨架部分進行分割，使二者的分割更加準確、清晰。
[0029]在其中一個實施例中，步驟4)三維結構構建中，所述微球的結構參數(shù)為孔隙、孔隙率、孔隙連通率、蛋白、多肽類藥物體積、藥物體積占微球總體積的百分率、多肽類藥物連通率、平均孔徑及分布、平均孔徑與微球直徑比、閉合連通率、有效表面積中的至少一種。該結構參數(shù)還可根據(jù)需要靈活調整，以表征微球在不同方面的特性。
[0030]其中，孔隙為蛋白、多肽類藥物以及該蛋白、多肽類藥物包裹的空隙所占的體積?？紫堵蕿榭紫端嫉捏w積與微球所占總體積的比值?？紫哆B通率為與微球表面相連通的孔隙與總孔隙的比值。蛋白、多肽類藥物連通率為與微球表面相連通的蛋白、多肽類藥物與蛋白、多肽類藥物體積的比值。平均孔徑及分布是描述孔隙的平均孔徑及其多分散系數(shù)。平均孔徑與微球直徑比是描述孔隙的平均孔徑與微球直徑的比值。閉合連通率是微球內部與其他孔隙相獨立的孔隙所占的體積與總孔隙的比值。有效表面積是微球外表面積以及微球內部與微球表面連通孔隙的內表面積之和。
[0031]在其中一個實施例中，步驟2)納米計算機斷層掃描中，所述微球的二維投影圖像通過CXD圖像傳感器捕獲，CXD圖像傳感器的像素優(yōu)選1024像素X 1024像素。以CXD圖像傳感器能夠獲得分辨率較高的微球二維圖像。
[0032]本發(fā)明的原理為:當一束X射線穿過被檢測的微球時，衰減的射線強度與微球的材料、密度、尺寸等信息有關，特別是當微球中蛋白、多肽類藥物經染色后，穿過藥物的X射線能量的衰減明顯高于穿透周圍的射線，采用平板探測器從不同角度采集衰減后的X射線能量，生成二維投影圖像，按照一定的圖像重構算法即可獲得微球截面圖像，再通過三維圖像重構，即可重建得到微球骨架結構以及其中蛋白、多肽類藥物的三維分布以及形貌等信肩、O
[0033]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0034]本發(fā)明的一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，采用Nano-CT對負載蛋白、多肽類藥物微球進行掃描，可以直觀的由二維或三維重構圖像中觀察到微球的結構，并通過染色劑的使用，將蛋白、多肽類藥物部分和微球骨架部分進行分割，并通過分析計算，得到微球的各項結構參數(shù)及其立體形態(tài)結構圖。
[0035]該構建方法具有分辨率高、成像直觀，且不受微球載體材料種類、微球形狀結構影響的優(yōu)點。
[0036]通過該方法得到微球中蛋白、多肽類藥物以及微球骨架的三維形貌、孔徑尺寸及空間分布特征，并且能夠分辨與表面連通的蛋白、多肽類藥物與微球表面連通情況等常規(guī)方法難以得到的重要信息，進而可通過微球的結構對其藥物釋放行為進行準確的預測，特別是對突釋等方面的預測具有極其重要的意義。并可根據(jù)微球的結構和微球的降解、藥物的釋放之間的關系，由微球骨架及蛋白、多肽類藥物在空間上的三維分布，建立藥物釋放數(shù)學模型，進而建立高效的篩選平臺，最終達到縮短微球研發(fā)周期，提高研發(fā)效率的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為實施例1中測定得到的微球截面圖；
[0038]圖2為將圖1的微球截面圖以不同顏色表示不同部分的示意圖；
[0039]圖3為實施例1中得到的微球中所包載的BSA立體結構示意圖；
[0040]圖4為實施例1中得到的微球中孔隙的立體結構示意圖；
[0041]圖5為對比例I中測定得到的微球截面圖；
[0042]圖6為對比例2中得到的微球截面SEM圖；
[0043]圖7為對比例4中得到的微球內部孔體積隨孔徑分布曲線；
[0044]圖8為對比例5中得到的微球共聚焦激光掃描顯微鏡圖。
【具體實施方式】
[0045]以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0046]實施例1
[0047]一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其中蛋白、多肽類藥物為牛血清白蛋白(BSA)，微球骨架為聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)，通過復乳化溶劑揮發(fā)制備得到該微球。該測定方法包括以下步驟:
[0048]I)樣品準備[0049]①固定:稱取20mg微球放置于1.5ml的離心管中，每管加入lml2.5%的戊二醛固定液，靜置4小時，確保固定液能完全滲透微球。
[0050]②清洗:吸棄固定液，使用PBS緩沖液將微球清洗3次。
[0051]③乙醇清洗脫水--第3次清洗后，用移液器將上清液吸出，以梯度的乙醇溶液清洗，脫去微球中的水份。首先加入體積百分含量為30%的乙醇溶液，將微球重新混懸后，靜置10分鐘，吸棄上清液，再加入下一濃度的乙醇溶液，重復以上步驟，具體每次所用乙醇濃度和靜置時間如下:
[0052]30%乙醇10分鐘
[0053]50%乙醇10分鐘
[0054]70%乙醇10分鐘
[0055]80%乙醇10分鐘
[0056]95%乙醇10分鐘
[0057]100%乙醇10分 鐘
[0058]④染色:每離心管加入lml2%醋酸鈾的乙醇溶液，靜置4小時，確保染色液能完全滲透微球，與微球中負載的蛋白、多肽類藥物結合。
[0059]⑤清洗:使用PBS緩沖液清洗3次，將未與蛋白、多肽類藥物結合的染色劑清洗去除，得到待測微球樣品。
[0060]2)納米計算機斷層掃描
[0061]將待測微球樣品置于Nano-CT斷層掃描設備中，進行預校準后，調節(jié)光子能量為8keV，采用大視場模式掃描，設置單幅曝光時間為20秒，對微球進行掃描，使用1024像素X 1024像素的CXD圖像傳感器捕獲微球的二維圖像，并以0.5°的步長在-90° -+90°的角度內采集二維投影圖像。
[0062]3)數(shù)據(jù)分割
[0063]對上述得到的微球二維投影圖像以濾波反投影算法進行重建，得到微球不同截面的圖像，設定灰度閾值為40，具體分割方法為，如灰度值小于等于該灰度閾值，則分割為BSA蛋白藥物部分，如灰度值大于該灰度閾值，則分割為PLGA微球骨架部分。將微球分割為BSA、PLGA骨架以及BSA包裹的空隙，如圖1_2所示。
[0064]圖2中，BSA蛋白以灰色顯示，微球骨架以白色顯示，蛋白、多肽類藥物包裹的空隙以黑色顯示。
[0065]4)三維結構構建:
[0066]以微球的截面圖像進行三維重構，得到負載蛋白、多肽類藥物微球的三維結構，如圖3-4所示。圖3為微球中所包載的BSA立體結構，圖4為微球中的孔隙的立體結構。并通過對同一處方的多個微球的三維結構進行定量分析，獲得一系列微球的結構參數(shù)，如藥物體積、孔隙率、孔隙連通率、藥物連通率等。
[0067]將不同處方制備得到的微球以上述測定方法進行測定，獲得一系列結構參數(shù)，并將該不同處方制備得到的微球按照藥典規(guī)定的方法做體外釋放度試驗，
[0068]結果如下表1所示。
[0069]表1微球結構參數(shù)及其與微球釋放度之間的關系
[0070]
【權利要求】
1.一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)樣品準備 將微球置于容器中，加入固定液，靜置，使固定液完全滲透微球；棄去固定液，以磷酸鹽緩沖液清洗微球，棄去磷酸鹽緩沖液；加入乙醇清洗，脫去微球中的水；然后加入含染色劑的乙醇溶液，靜置，確保染色劑完全浸透微球，并與微球中負載的蛋白、多肽類藥物結合，再以磷酸鹽緩沖液將未與蛋白、多肽類藥物結合的染色劑清洗去除，得到待測微球樣品； 2)Nano-CT斷層掃描 將待測微球樣品置于Nano-CT斷層掃描設備中，調節(jié)光子能量為5_12keV，采用大視場模式掃描，設置單幅曝光時間為15-25秒，并以0.2° -0.8°的步長在-90° -+90°的角度內采集微球二維投影圖像； 3)數(shù)據(jù)分割 對上述得到的微球二維投影圖像進行重建，得到微球的不同截面圖像，以預設的灰度閾值，將微球分割為蛋白、多肽類藥物部分和微球骨架部分； 4)三維結構構建 以微球的截面圖像進行三維重構，得到負載蛋白、多肽類藥物微球的三維結構，并計算出微球的結構參數(shù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的負載蛋白、多肽類藥物的微球三維結構的構建方法，其特征在于，步驟I)樣品準備中，所述固定液為中性甲醛溶液、戊二醛溶液、等滲甲醛醋酸溶液或堿性醋酸鋁溶液。
3.根據(jù)權利要求1所述的負載蛋白、多肽類藥物的微球三維結構的構建方法，其特征在于，步驟I)樣品準備中，所述染色劑為醋酸鈾、檸檬酸鉛或四氧化鋨。
4.根據(jù)權利要求1所述的負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，步驟I)樣品準備中，所述固定液為體積百分比含量為1.0% -4.0%的戊二醛水溶液；所述脫去微球中的水的方法為加入體積百分含量為10% -100%的乙醇溶液進行梯度清洗；所述染色劑為百分含量為1.5% -2.5%的醋酸鈾，按每克微球0.8-1.2mL醋酸鈾的加入量對蛋白質進行染色。
5.根據(jù)權利要求1所述的負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，所述微球以聚乳酸類或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物類材料為骨架。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項所述的負載蛋白、多肽類藥物的微球三維結構的構建方法，其特征在于，步驟2)Nano-CT斷層掃描中，所述光子能量為6_10keV，所述單幅曝光時間為18-22秒，所述CT成像投影數(shù)據(jù)的采集步長為0.4-0.6°。
7.根據(jù)權利要求6所述的負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，步驟3)數(shù)據(jù)分割中，對微球二維投影圖像進行重建的方法為濾波反投影算法。
8.根據(jù)權利要求7所述的負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，步驟3)數(shù)據(jù)分割中，所述灰度閾值為35-45，具體分割方法為:如灰度值小于等于該灰度閾值，則分割為蛋白、多肽類藥物部分，如灰度值大于該灰度閾值，則分割為微球骨架部分。
9.根據(jù)權利要求1所述的負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，步驟4)三維結構構建中，所述微球的結構參數(shù)為孔隙、孔隙率、孔隙連通率、蛋白、多肽類藥物體積、藥物體積占微球總體積的百分率、多肽類藥物連通率、平均孔徑及分布、平均孔徑與微球直徑比、閉合連通率、有效表面積中的至少一種。
10.根據(jù)權利要求1所述的負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態(tài)及分布的測定方法，其特征在于，步驟2)Nano-CT斷層掃描中，所述微球的二維投影圖像通過CXD圖像傳感器捕獲。
【文檔編號】G01N23/04GK104020182SQ201410228503
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權日:2014年5月27日
【發(fā)明者】張永明, 羅宇燕, 黎吶, 郭喆霏, 鐘晨 申請人:中山大學附屬第三醫(yī)院