甜菜胚珠切割透明制片方法
【專利摘要】甜菜胚珠切割透明制片方法，涉及一種胚珠切割透明制片方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有觀察甜菜胚囊的方法處理量大，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問(wèn)題。方法：一、取樣及固定；二、整體染色；三、用解離液解離，再用蒸餾水沖洗；四、把解離后的甜菜花蕾放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來(lái)，在距胚珠珠孔端1/3處對(duì)胚珠進(jìn)行切割；五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴透明劑，再滴硼砂洋紅染色液，靜置；六、制片。該方法快速省時(shí)，極大的減少了工作量，實(shí)驗(yàn)效果良好，成本低，易于操作。本發(fā)明方法用于觀察甜菜胚囊。
【專利說(shuō)明】甜菜胚珠切割透明制片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種胚珠切割透明制片方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從胚胎學(xué)角度觀察植物胚囊的變化以了解其發(fā)生機(jī)制，是植物學(xué)中常用的方法。被子植物的雌配子體也稱胚囊，甜菜胚囊位于子房及胚珠多層細(xì)胞的包圍之中，甜菜胚珠是厚珠心(6-7層)，給研究大孢子母細(xì)胞發(fā)生發(fā)育的工作帶來(lái)很大的難度。
[0003]石蠟切片法是研究植物胚囊最常用的方法之一，效果好，可是工作量極大且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。該方法包埋材料完整，為了觀察胚囊的發(fā)育情況，找到大孢子母細(xì)胞，需要連續(xù)切片、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往選一張好的制片需要淘汰成千上萬(wàn)張制備好的切片，工作量極大，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了不小的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有觀察甜菜胚囊的方法處理量大，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問(wèn)題，提供一種甜菜胚珠切割透明制片方法。
[0005]本發(fā)明甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0006]一、取樣及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后將甜菜花蕾浸泡在體積濃度為70%的乙醇溶液中，貯存在4°C冰箱中備用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福爾馬林、5mL丙酸和90mL體積濃度為50%的乙醇溶液組成；
[0007]二、整體染色:將步驟一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋紅染色液中進(jìn)行整體染色，染色時(shí)間為4?5d，染色后用溶液A浸泡5?8分鐘，再用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗至呈現(xiàn)透明的紅色；
[0008]三、然后用解離液解離，解離時(shí)間為5?lOmin，再用蒸餾水沖洗2?3次；
[0009]四、把步驟三解離后的甜菜花蕾放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來(lái)，然后在距胚珠珠孔端1/3處對(duì)胚珠進(jìn)行切割，保留珠孔端的1/3部分；
[0010]五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴一滴透明劑，然后在透明劑中滴一滴硼砂洋紅染色液，靜置2?3min ；
[0011]六、制片:胚珠透明染色后蓋上蓋玻片，用記號(hào)筆在蓋玻片上做一標(biāo)記確認(rèn)株孔端的方位，壓片排除蓋玻片內(nèi)的氣泡，在已做過(guò)標(biāo)記的珠孔方向敲擊，即完成制片。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
[0013](I)本發(fā)明方法是利用解剖鏡直接剝離胚囊分離胚珠，并將分離出來(lái)的胚珠進(jìn)行再次切割，只保留珠孔端一小部分進(jìn)行制片，胚珠其余大部分被廢棄掉，大大減少了視野下胚珠體細(xì)胞的數(shù)量，增加了觀察大孢子母細(xì)胞的準(zhǔn)確度，極大的減少了工作量，更易于找到大孢子母細(xì)胞。
[0014](2)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便易行，不用太多儀器設(shè)備，解剖鏡和普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行分離和觀察。[0015](3)本發(fā)明的方法所用的解離液比酶解法用的果膠酶、纖維素酶成本低得多，鹽酸、酒精1:1即可達(dá)到解離目的，且解離效果好，有效降低了實(shí)驗(yàn)成本。
[0016](4)本發(fā)明方法的效果好，易于操作和掌握，降低了制片難度，提高了工作效率，省時(shí)省力。
[0017]此方法也同樣適用于萬(wàn)壽菊(Tagetes erecta L)、矮牽牛(Petunia hybridaVilm)等其它花卉植物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為實(shí)施例中觀察到的甜菜大孢子母細(xì)胞照片；圖2為實(shí)施例中觀察到的甜菜的單核胚囊照片；圖3為實(shí)施例中觀察到的甜菜二核胚囊的早期照片。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0020]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0021]一、取樣及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后將甜菜花蕾浸泡在體積濃度為70%的乙醇溶液中，貯存在4°C冰箱中備用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福爾馬林、5mL丙酸和90mL體積濃度為50%的乙醇溶液組成；
[0022]二、整體染色:將步驟一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋紅染色液中進(jìn)行整體染色，染色時(shí)間為4?5d，染色后用溶液A浸泡5?8分鐘，再用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗至呈現(xiàn)透明的紅色；
[0023]三、然后用解離液解離，解離時(shí)間為5?lOmin，再用蒸餾水沖洗2?3次；
[0024]四、把步驟三解離后的甜菜花蕾放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來(lái)，然后在距胚珠珠孔端1/3處對(duì)胚珠進(jìn)行切割，保留珠孔端的1/3部分；
[0025]五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴一滴透明劑，然后在透明劑中滴一滴硼砂洋紅染色液，靜置2?3min ；
[0026]六、制片:胚珠透明染色后蓋上蓋玻片，用記號(hào)筆在蓋玻片上做一標(biāo)記確認(rèn)株孔端的方位，壓片排除蓋玻片內(nèi)的氣泡，在已做過(guò)標(biāo)記的珠孔方向敲擊，即完成制片。
[0027]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟二所述溶液A的配制方法為:每IOOmL體積濃度為70%的乙醇溶液中加入9?11微升質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是:步驟二所述硼砂洋紅染色液的配制方法為:首先取2?3g洋紅粉末加到IOOmL質(zhì)量濃度為4%的硼砂水溶液中，加熱煮沸30min，靜置3d后用等體積的體積濃度為70%的乙醇溶液稀釋，然后再靜置24h后過(guò)濾備用。其它與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0029]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是:步驟三所述解離液由體積濃度為95%的乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸按體積比1:1混合。其它與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0030]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是:步驟五所述透明劑為乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸餾水組成。其它與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0031]實(shí)施例:
[0032]本實(shí)施例甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0033]一、取樣及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后將甜菜花蕾浸泡在體積濃度為70%的乙醇溶液中，貯存在4°C冰箱中備用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福爾馬林、5mL丙酸和90mL體積濃度為50%的乙醇溶液組成；
[0034]二、整體染色:將步驟一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋紅染色液中進(jìn)行整體染色，染色時(shí)間為5d，染色后用溶液A浸泡5分鐘，再用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗至呈現(xiàn)透明的紅色；
[0035]三、然后用解離液解離，解離時(shí)間為8min，再用蒸餾水沖洗3次；
[0036]四、把步驟三解離后的甜菜花蕾放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來(lái)，然后在距胚珠珠孔端1/3處對(duì)胚珠進(jìn)行切割，保留珠孔端的1/3部分；
[0037]五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴一滴透明劑，然后在透明劑中滴一滴硼砂洋紅染色液，靜置3min ；
[0038]六、制片:胚珠透明染色后蓋上蓋玻片，用記號(hào)筆在蓋玻片上做一標(biāo)記確認(rèn)株孔端的方位，壓片排除蓋玻片內(nèi)的氣泡，在已做過(guò)標(biāo)記的珠孔方向敲擊，即完成制片。
[0039]步驟二所述溶液A的配制方法為:每IOOmL體積濃度為70%的乙醇溶液中加入10微升質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸。
[0040]步驟二所述硼砂洋紅染色液的配制方法為:首先取2g洋紅粉末加到IOOmL質(zhì)量濃度為4%的硼砂水溶液中，加熱煮沸30min，靜置3d后用等體積的體積濃度為70%的乙醇溶液稀釋，然后再靜置24h后過(guò)濾備用。
[0041]步驟三所述解離液由體積濃度為95%的乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸按體積比1:1混合。
[0042]步驟五所述透明劑為乳酚甘油,所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸餾水組成。
[0043]按照本實(shí)施例的方法可以清晰觀察到甜菜胚囊發(fā)育的各個(gè)階段:單核期胚囊(大孢子母細(xì)胞)、二核期胚囊(此時(shí)胚囊中分化出一個(gè)大液泡)、成熟胚囊具有7胞8核:中部含有2個(gè)極核的中央細(xì)胞、株孔端有3個(gè)核組成的卵器、核點(diǎn)端的3個(gè)核形成反足細(xì)胞。成熟胚囊的兩個(gè)極核靠近卵器，反足細(xì)胞分化成多細(xì)胞團(tuán)。
[0044]在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的甜菜大孢子母細(xì)胞如圖1所示，甜菜的單核胚囊如圖2所示，甜菜二核胚囊的早期照片如圖3所示。
[0045]使用本實(shí)施例的方法觀察大孢子母細(xì)胞，快速省時(shí)，極大的減少了工作量，實(shí)驗(yàn)效果良好，成本低，易于操作。
【權(quán)利要求】
1.甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行: 一、取樣及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后將甜菜花蕾浸泡在體積濃度為70%的乙醇溶液中，貯存在4°C冰箱中備用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福爾馬林、5mL丙酸和90mL體積濃度為50%的乙醇溶液組成； 二、整體染色:將步驟一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋紅染色液中進(jìn)行整體染色，染色時(shí)間為4?5d，染色后用溶液A浸泡5?8分鐘，再用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗至呈現(xiàn)透明的紅色； 三、然后用解離液解離，解離時(shí)間為5?lOmin，再用蒸餾水沖洗2?3次； 四、把步驟三解離后的甜菜花蕾放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來(lái)，然后在距胚珠珠孔端1/3處對(duì)胚珠進(jìn)行切割，保留珠孔端的1/3部分； 五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴一滴透明劑，然后在透明劑中滴一滴硼砂洋紅染色液，靜置2?3min ； 六、制片:胚珠透明染色后蓋上蓋玻片，用記號(hào)筆在蓋玻片上做一標(biāo)記確認(rèn)株孔端的方位，壓片排除蓋玻片內(nèi)的氣泡，在已做過(guò)標(biāo)記的珠孔方向敲擊，即完成制片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步驟二所述溶液A的配制方法為:每IOOmL體積濃度為70%的乙醇溶液中加入9?11微升質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步驟二所述硼砂洋紅染色液的配制方法為:首先取2?3g洋紅粉末加到IOOmL質(zhì)量濃度為4%的硼砂水溶液中，加熱煮沸30min，靜置3d后用等體積的體積濃度為70%的乙醇溶液稀釋，然后再靜置24h后過(guò)濾備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步驟三所述解離液由體積濃度為95%的乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸按體積比1:1混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步驟五所述透明劑為乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸餾水組成。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK103868779SQ201410136044
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】劉麗萍, 王艷, 孫元 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)