一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和應用。所述微腔陣列質(zhì)譜靶板包括基片、在所述基片上形成的粘附層和在所述粘附層上形成的導電層，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的有導電層的一側(cè)設有與表面等離子體共振成像檢測區(qū)域相一致的微腔區(qū)域，所述微腔區(qū)域位置的基片上蝕刻有微腔，所述微腔開口于所述導電層并排列成陣列。本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板可篩選和富集“一珠一物”多肽文庫中的陽性靶標，并將其直接進行原位基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜檢測；并可與表面等離子體共振成像聯(lián)用，進行原位親和力鑒定，實現(xiàn)對多肽文庫的高效、高通量篩選和檢測。
【專利說明】一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微陣列芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和在組合化學多肽文庫的篩選中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]芯片實驗室(Lab on a chip)已發(fā)展成為當今世界上最前沿的科技領(lǐng)域之一(Sens.Actutors, B, 1990, I, 244-248.)。微芯片技術(shù)是把化學和生物學等領(lǐng)域所涉及的前處理、加樣、反應、分離、分析等基本操作單元集成或基本集成到方寸大小的芯片之上，以取代常規(guī)化學或生物實驗室各種功能的技術(shù)平臺。
[0003]組合化合物庫的合成方法有液相組合合成和固相組合合成兩種。由于固相合成所得產(chǎn)物較易純化，可使用過量反應試劑，較易實現(xiàn)自動化，成為最為廣泛的多肽文庫構(gòu)建方法。在固相合成過程中，通過對樹脂微珠的多次混合與均分，使每個樹脂微珠上帶有唯一一種隨機多肽序列，稱之為“一珠一物”肽庫。如Lam等在Nature上首先報道了以聚苯乙烯樹脂珠為載體合成的“一珠一物”五肽庫，將受體蛋白偶聯(lián)至熒光素上，放入多肽固相化合物庫中，通過可結(jié)合受體蛋白的多肽微珠顏色變化尋找親和多肽序列。在傳統(tǒng)方法中，需要將篩選后的數(shù)百萬個樹脂微珠置于顯微鏡下，用微鑷將產(chǎn)生光學信號的陽性微珠挑出，并逐個分配至相應的裂解容器中進行測序和鑒定。整個過程都需要人工完成，十分耗時費力。
[0004]常見的生物芯片是指一種不含微通道，沒有流體流動，以生物分子間靜態(tài)雜交和高密度點陣為特征的芯片。這種芯片先于微流控芯片問世，專一地應用于某些生物領(lǐng)域。狹義上的生物芯片即指微點陣芯片。微點陣生物芯片往往在一層基片上加工出一系列面積非常小的活性區(qū)域，生物分子可以固定于表面。利用固定的生物分子與樣品中被分析物的特異性結(jié)合可對樣品進行檢測。微點陣芯片往往集成了若干相同的操作單元，其最顯著的特征是高通量，可以利用微點陣芯片的這一特點進行高通量多肽篩選與檢測。
[0005]微點陣芯片體系對于高通量肽庫篩選具有獨特優(yōu)勢。然而，這些微點陣芯片平臺仍然存在不足，主要表現(xiàn)在:基于微點陣芯片肽庫篩選的通量一般不超過104，篩選容量有限；微點陣肽庫制備和篩選過程需要電敏、光敏等特殊的試劑和極為復雜的軟件、硬件平臺，造價昂貴。而目前的微流控芯片只能將高通量肽庫篩選本身在線完成，而更為重要的測序和鑒定則要離線完成，篩選效率偏低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和在組合化學多肽文庫的篩選中的應用。本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板可篩選和富集“一珠一物”多肽文庫中的陽性靶標，并將其直接進行原位基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜檢測；并可與表面等離子體共振成像聯(lián)用，進行原位親和力鑒定，實現(xiàn)對多肽文庫的高效、高通量篩選和檢測。
[0007]在第一方面，本發(fā)明提供一種微腔陣列質(zhì)譜靶板，包括基片、在所述基片上形成的粘附層和在所述粘附層上形成的導電層，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的有導電層的一側(cè)設有與表面等離子體共振成像檢測區(qū)域相一致的微腔區(qū)域，所述微腔區(qū)域位置的基片上蝕刻有微腔，所述微腔開口于所述導電層并排列成陣列。
[0008]本發(fā)明中，所述微腔的形狀可以人為設計，例如可以設計成半球形、圓柱體形、正方體形或棱臺形，所述棱臺形如正四棱臺形或正六棱臺形，優(yōu)選為正方體形或棱臺形。
[0009]本發(fā)明中，作為正方體形或棱臺形的微腔的邊長寬度優(yōu)選為30?300微米，例如40微米、50微米、80微米、120微米、150微米、180微米、250微米、280微米或290微米；深度優(yōu)選為30?300微米，例如40微米、50微米、80微米、120微米、150微米、180微米、250微米、280微米或290微米。
[0010]本發(fā)明中，每個微腔僅能容納一個多肽微珠；其中，所述多肽微珠的粒徑優(yōu)選為100?300微米，例如110微米、120微米、150微米、180微米、200微米、230微米、250微米或270微米，更優(yōu)選為120?250微米，特別優(yōu)選為150?180微米。
[0011]本發(fā)明中，所述微腔區(qū)域的微腔個數(shù)優(yōu)選為4?900個，例如4個、9個、16個、25個、36個、64個、144個、225個、400個、625個或784個。優(yōu)選地，所述微腔排列成正方形陣列。
[0012]本發(fā)明中，所述微腔區(qū)域的面積優(yōu)選為0.5?4cm2,例如0.54cm2>0.58cm2、
0.62cm2、0.78cm2、0.82cm2、0.90cm2、1.20cm2、1.50cm2、1.80cm2、1.96cm2、2.04cm2、2.58cm2、2.82cm2、3.32cm2 >3.64cm2 >3.78cm2 或 3.98cm2。
[0013]本發(fā)明中，所述基片的材料優(yōu)選為硅。優(yōu)選地，所述基片的厚度為200微米?I毫米，例如210微米、240微米、270微米、330微米、350微米、500微米、700微米、820微米、880微米、920微米或970微米。
[0014]本發(fā)明中，所述粘附層的材料優(yōu)選為鈦。優(yōu)選地，所述粘附層的厚度為10?100納米，例如12納米、15納米、17納米、22納米、24納米、28納米、40納米、70納米、88納米、92納米、95納米或98納米。
[0015]本發(fā)明中，所述導電層的材料優(yōu)選為金、銀或鉬，更優(yōu)選為銀。優(yōu)選地，所述導電層的厚度為100?500納米，例如120納米、130納米、150納米、170納米、210納米、250納米、280納米、320納米、380納米、410納米、450納米、470納米、480納米或498納米。
[0016]在第二方面，本發(fā)明提供一種制作第一方面所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板的方法，所述方法采用目前比較成熟的光刻技術(shù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)第一方面對所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板特征的描述，設計出待制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板的規(guī)格和尺寸，然后用光刻技術(shù)實現(xiàn)其制作。
[0017]具體地，所述方法可以包括如下步驟:
[0018](I)打印預先設計的微腔陣列圖，形成掩膜；
[0019](2)利用光刻膠將所述掩膜轉(zhuǎn)移到基片上；
[0020](3)通過曝光、顯影和去膠得到微腔陣列圖；
[0021](4)蝕刻所述基片，并去除剩余的光刻膠和氧化層，得到微腔陣列；
[0022](5)分別濺射粘附層和導電層；
[0023](6)按照預先設計的規(guī)格劃片得到所述微腔陣列質(zhì)譜靶板。
[0024]在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供了一種以硅片為基片的微腔陣列質(zhì)譜靶板的制作方法，包括如下步驟:
[0025](I)掩膜設計:繪制芯片設計圖(可以利用L-edit或Adobe illustrator等軟件繪制)，用激光排照機打印掩膜(其具有高分辨率);
[0026](2)甩膠:將硅片置于甩膠機上，在硅片中央滴加光刻膠(適量)，將甩膠機轉(zhuǎn)速設為600?2000r/min進行旋涂，旋涂時間為10?80s ；
[0027](3)前烘:在加熱平臺上以5?10°C /min的速率由室溫升至75?105°C，在最高溫度保持5?15min，之后緩慢降至室溫；
[0028](4)曝光:紫外曝光，時間為10?30s ；
[0029](5)后烘:在加熱平臺上以5?10°C /min的速率由室溫升至75?105°C，在最高溫度保持5?15min，之后緩慢降至室溫；
[0030](6)顯影:將硅片在顯影液(廠家配套)中浸泡10?50s并輕輕搖晃，使照到光的部分溶解；
[0031](7)堅膜:在100?120°C，硬烤堅膜20?40min，使光刻膠能堅固的依附在硅片
表面；
[0032](8)去底膠:在刻蝕之前用氧等離子體轟擊硅片表面3?5min，以去除在顯影過程中被顯影液洗掉的區(qū)域殘留的一層底膠；
[0033](9)干法刻蝕:采用Bosch工藝進行刻蝕(Plasmalab Systeml00ICP180),參數(shù)設置:沉積/刻蝕時間:7_9s ;氣體壓強:30-40mT ;上電極射頻功率:700-750w ;下電極射頻功率:5-15w ;載片臺溫度:30-45°C ;沉積氣體=C4F8 ;刻蝕氣體=SF6 ；
[0034](10)去膠:把硅片放入發(fā)煙硝酸中，超聲清洗20?30min，去除剩余的光刻膠；
[0035](11)去除氧化層:在濺射金屬之前，用氬等離子體轟擊硅片表面(功率:800w，時間:3min)，去除表面氧化層，以提高金屬與硅片的粘附性；
[0036](12)濺射:將硅片放入金屬濺射儀，抽真空，分別濺射鈦作為粘附層以及濺射金、銀或鉬等作為導電層；
[0037](13)劃片:將硅片放入劃片機中，按照預先設計的規(guī)格將整片硅片劃成相應規(guī)格，以適合質(zhì)譜儀靶托。
[0038]需要說明的是，上述具體實施方案只是一種優(yōu)選實施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)其具有的專業(yè)知識和具體需要，調(diào)整相應的步驟、工藝和參數(shù)。
[0039]在第三方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板在組合化學多肽文庫的篩選中的應用。
[0040]本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板的一個具體應用情形如下:通過“混合裂分”合成組合化學多肽文庫，庫容量可為IO3?106，選用Fmoc合成策略使得只有在堿性溶液六氫吡啶條件下才能將氨基保護基脫除，從而進行固相多肽合成循環(huán)，C-端首位偶聯(lián)甲硫氨酸可以使得使多肽側(cè)鏈保護基團脫除(使用三氟乙酸)的同時而不與固相載體裂解，用于肽珠富集和篩選，在N-端偶聯(lián)半胱氨酸；而使用特異性識別甲硫氨酸的試劑溴化氰(CNBr)則可將多肽從微珠上裂解成為游離肽，從而進行質(zhì)譜測定；選取目標蛋白，利用生物素標記試劑使得目標蛋白具有生物素信號；選取磁性微珠，粒徑在0.1?5微米之間,在磁性微珠表面標記親和素或鏈霉親和素；將多肽微珠、目標蛋白與磁性微珠進行相互作用，通過親和素或鏈霉親和素與生物素之間的特異性高親和相互作用，陽性多肽微珠被上述磁性微珠包裹而具有磁性可被磁場富集；被富集后的陽性多肽微珠懸浮于溶液中，逐滴加入至所述微腔陣列芯片中；通過輕刮使得陽性肽珠進入所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的微腔之中，保證每個微腔只能容納一個陽性多肽微珠；在上述微腔陣列質(zhì)譜靶板原位加入多肽裂解液(或通過紫外光裂解)；將上述微腔陣列質(zhì)譜靶板導入質(zhì)譜儀進行檢測；將上述微腔陣列質(zhì)譜靶板與表面等離子體共振成像金片面對面貼合，使得一部分多肽轉(zhuǎn)移至表面等離子體共振成像金片上來，通過半胱氨酸的巰基與金表面特異性共價相連，從而可進行表面等離子共振成像檢測。
[0041]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板能夠?qū)﹃栃噪闹樽詣踊饌€捕獲，避免了傳統(tǒng)方法中多次分選、多次轉(zhuǎn)移造成的肽庫信息缺失。在集成微流控分選和微點陣捕獲的基礎上，將分布有陽性肽珠的微腔陣列質(zhì)譜靶板進行原位基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜鑒定和分析；并可與表面等離子體共振成像聯(lián)用，進行原位親和力鑒定，實現(xiàn)對多肽文庫的高效、高通量篩選和檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為本發(fā)明實施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板結(jié)構(gòu)示意圖。
[0043]圖2為本發(fā)明實施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板捕獲區(qū)域(微腔區(qū)域)的設計規(guī)格平面示意圖。
[0044]圖3為本發(fā)明實施例2中利用微腔陣列質(zhì)譜靶板對多肽微珠進行捕獲的示意圖。
[0045]圖4為本發(fā)明實施例2中微腔陣列質(zhì)譜靶板(按照實施例1制作)與表面等離子共振成像芯片通過接觸而進行陣列復制以及進行表面等離子共振成像檢測的情景示意圖。
[0046]圖5為本發(fā)明實施例2中通過高通量肽庫篩選獲得陽性多肽的質(zhì)譜圖。
[0047]圖6為本發(fā)明實施例2中通過高通量肽庫篩選獲得陽性多肽與蛋白之間的相互作用的表面等離子體共振曲線圖。
[0048]附圖標記說明:
[0049]1-微腔陣列質(zhì)譜靶板，2-基片，3-粘附層，4-導電層，5-微腔，6_校正微腔，7_陽性肽珠，8-表面等離子體共振成像芯片，9-反應腔室，10-復制陣列，11-入射光源，12-濾光片，13-棱鏡，14-出射光，15-檢測器。
【具體實施方式】
[0050]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應視為限定本發(fā)明的范圍。
[0051]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0052]實施例1:微腔陣列質(zhì)譜靶板的制作
[0053]如圖1所示，本實施例提供的微腔陣列質(zhì)譜靶板1，包括基片2、在所述基片2上形成的粘附層3和在所述粘附層3上形成的導電層4，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板I的有導電層4的一側(cè)設有與表面等離子體共振成像檢測區(qū)域相一致的微腔區(qū)域(圖1中的陣列所在的區(qū)域)，所述微腔區(qū)域位置的基片2上蝕刻有微腔5，所述微腔5開口于所述導電層4并排列成陣列。為校正需要，還可包括標準樣品校正微腔6。[0054]如圖2所示，微腔5設計為正方體(圖中示出微腔5的俯視圖)，其邊長為250 μ m，相鄰微腔5之間的距離也是250 μ m。上述規(guī)格的微腔陣列質(zhì)譜靶板的微腔區(qū)域與表面等離子體共振成像檢測區(qū)域正好吻合。
[0055]本實施例通過以下步驟實現(xiàn)具有上述特征的微腔陣列質(zhì)譜靶板的制作:
[0056](I)掩膜設計:利用Adobe illustrator軟件繪制芯片設計圖,用激光排照機打印高分辨率光掩膜；
[0057](2)甩膠:將4寸硅片置于甩膠機上，用滴管在硅片中央滴加適量AZ1640光刻膠，根據(jù)光刻膠使用手冊，將甩膠機前后兩個轉(zhuǎn)速設為600r/min、40s和2000r/min、40s進行旋涂;
[0058](3)前烘:實驗中在加熱平臺上以5°C /min的速率由室溫升至95°C，在95°C保持15min，之后緩慢降至室溫；
[0059](4)曝光:紫外曝光，時間為30s ；
[0060](5)后烘:實驗中在加熱平臺上以5°C /min的速率由室溫升至95°C，在95°C保持lOmin，之后緩慢降至室溫；
[0061](6)顯影:將硅片在廠家配套的顯影液中浸泡約40s并輕輕搖晃，使照到光的部分溶解；
[0062](7)堅膜:在120°C，30min硬烤堅膜，使光刻膠能堅固的依附在硅片表面；
[0063](8)去底膠:在顯影過程中，被顯影液洗掉的區(qū)域會殘留一層很薄的底膠；在刻蝕之前用氧等離子體轟擊硅片表面3min去除底膠；
[0064](9)干法刻蝕:采用Bosch工藝進行刻蝕(Plasmalab Systeml00ICP180),參數(shù)設置:沉積/刻蝕時間:7s ;氣體壓強:30mT ;上電極射頻功率:700w ;下電極射頻功率:10w ；載片臺溫度:35°C (氦氣背冷輔助冷卻)；沉積氣體(C4F8) /刻蝕氣體(SF6)；
[0065](10)去膠:把硅片放入盛有發(fā)煙硝酸的燒杯中，超聲清洗30min，去除剩余光刻膠；
[0066](11)去除氧化層:在濺射金屬之前，為提高金屬與硅片的粘附性，用氬等離子體轟擊硅片表面(功率:800w，時間:3min)，去除表面氧化層；
[0067](12)濺射:將硅片放入金屬濺射儀，抽真空，濺射鈦作為粘附層，并濺射銀作為導電層；
[0068](13)劃片:將硅片放入劃片機中，按照設計將硅片劃成75毫米X25毫米的兩片。
[0069]實施例2:利用實施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板進行多肽文庫的篩選
[0070](I)多肽文庫的構(gòu)建
[0071]選取血凝素蛋白九肽片段HA作為模型多肽(序列為YPYDVPDYA)。選取HA抗體AHA作為能與之特異結(jié)合的受體蛋白，建立包含HA的模型八肽文庫。肽庫構(gòu)建方法采用氨基修飾的TentaGel (溶脹粒徑可為200微米)樹脂作為固相載體，在合成首個氨基酸之前，在C-端首位偶聯(lián)甲硫氨酸。利用Fmoc合成策略進行混合均分合成，選取構(gòu)成HA九肽的四種氨基酸Y、P、D、V作為反應單元，經(jīng)過六輪合成，構(gòu)建庫容量為46的肽庫，多肽以“一珠一物，，隨機均勻分布，合成冗余量為3倍，即微珠數(shù)量約為IO5個。
[0072](a)稱取80mg Tentagel-S-NH2樹脂，按照固相多肽合成程序循環(huán),依次加入160mgMet、Ala、Tyr> Asp進行反應四個循環(huán)；[0073](b)待反應完成后,把樹脂均分為4份，向每管分別加入40mg Tyr> Pro、Asp、Val與等量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)進行偶聯(lián)，待偶聯(lián)完畢后，把4管樹脂混合，脫保護；再把樹脂均分為4份；
[0074](C)重復5次步驟b;
[0075](d)經(jīng)過脫保護和收縮步驟，真空抽干，得到偶聯(lián)有肽庫的干燥樹脂備用。
[0076](2)蛋白的前處理
[0077]通過以下步驟進行蛋白的前處理:
[0078](a)準備標記緩沖液和磷酸緩沖液(PBS)各L 5mL ；
[0079](b)擰緊取下過濾柱的底部并松開蓋子；
[0080](c)將每個過濾柱放入一個1.5mL離心管中離心(1500g，Imin)；
[0081](d)取出過濾柱，倒掉離心管中的廢液(不要扔掉收集管)；
[0082](e)標記過濾柱中樹脂斜面所在位置；
[0083](f)在過濾柱蓋子上分別標記A和B ;
[0084](g)加入300yL標記緩沖液(ρΗ=8.0)到A柱中，300yL PBS到B柱中;
[0085](h)將柱子放入收集管中離心(1500g, lmin),去除收集液并重復洗2次；
[0086](i)洗脫完后將A柱轉(zhuǎn)入一新的收集管中；
[0087](j)用標記緩沖液溶解蛋白樣品至總體積100 μ L倒入A柱中離心(1500g, 2min),把濾過液體收集到離心管，標記為A。
[0088](k)倒掉B柱濾過液，再向B柱加入300 μ L PBS，保持樹脂濕潤備用。
[0089](3) 二喹啉甲酸法測定蛋白濃度
[0090]通過以下步驟測定蛋白濃度:
[0091](a)取5mL二喹啉甲酸定量試劑盒(Pierce)中試劑A至15mL離心管中再加100 μ LBCA試劑B混合得到工作液；
[0092](b)取10 μ L AHA樣品，用去離子水稀釋至20 μ L，同時將標準白蛋白依次稀釋成濃度分別為 2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0μ g/mL 的溶液，各取 20 μ L 滴加到酶標板的孔中，每孔再滴加200 μ L工作液，37°C孵育30min ；
[0093](c)將酶標板放入酶標儀檢測標準白蛋白和AHA吸光度(波長:450nm)，繪制標準曲線，將HA抗體吸光度(0.2864)代入標準曲線，得到AHA濃度(1.48mg/mL)。
[0094](4)蛋白的生物素標記
[0095]通過以下步驟進行蛋白的生物素標記:
[0096](a) 100 μ L無水N，N- 二甲基甲酰胺懸浮溶解固體生物素粉末；
[0097](b)加入2.32 μ L生物素至90 μ L蛋白溶液中，室溫反應2小時；
[0098](c)反應結(jié)束前，將含有PBS的B柱與用水配平的A柱離心(1500g, lmin),棄濾過液；
[0099](d)在新收集管中將上一步蛋白反應液加入B柱中，配平A柱離心(1500g, 2min),收集B柱濾過的蛋白樣品；
[0100](5)多肽微珠與蛋白和磁珠的相互作用
[0101]通過以下步驟進行多肽微珠與蛋白和磁珠的相互作用
[0102](a )用PBS把肽庫微珠清洗3次；[0103](b )用5%的脫脂牛奶在混旋儀上對肽珠混合封閉(37 °C，2h );
[0104](c)用 PBS 清洗 3 次；
[0105](d)用溶于PBS的5%脫脂牛奶按1:1000稀釋生物素標記的AHA，然后與陽性HA肽珠在混旋儀上混合孵育^了！:，〗!!)；
[0106](e)用 PBS 清洗 3 次；
[0107](f)用過量鏈酶親和素標記的磁珠與肽庫微珠在混旋儀上混合孵育(37°C，lh)。
[0108](6)利用微腔陣列質(zhì)譜靶板進行原位檢測
[0109]通過以下步驟利用實施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板進行原位檢測:[0110](a)用移液槍將篩選后的陽性肽珠移至微腔陣列質(zhì)譜靶板左端，緩慢滑動玻璃蓋片使陽性肽珠掉入微腔陣列，用培養(yǎng)皿收集未掉入微腔中的陽性肽珠，加入少量PBS，用移液槍吸取培養(yǎng)皿中的陽性肽珠，重新移至微腔陣列質(zhì)譜靶板左端，重復上述過程，直至全部陽性肽珠掉入微腔陣列中。如圖3所示，每個微腔5的大小設計成僅能容納一個陽性肽珠7，因此眾多陽性肽珠7在所述微腔陣列質(zhì)譜靶板I的陣列狀的微腔5內(nèi)形成陣列分布，便于高效、高通量地篩選、檢測和分析。
[0111](b)把微腔陣列質(zhì)譜祀板暴露在紫外燈下(波長:340nm,時間:5min),使一部分多肽從陽性肽珠上裂解下來，用表面等離子體共振成像芯片輕輕蓋在上面，使被裂解下來的陽性多肽粘到表面等離子體共振成像芯片表面。如圖4所示，微腔陣列質(zhì)譜靶板I上的微腔區(qū)域中的陽性多肽被粘到表面等離子體共振成像芯片8的檢測區(qū)域(成為復制陣列10)；然后通過表面等離子體共振成像儀(包括入射光源11、濾光片12、棱鏡13、出射光14和檢測器15)進行表面等離子體共振成像分析。
[0112](c)將微腔陣列質(zhì)譜靶板導入質(zhì)譜儀進行檢測。
[0113](d)在質(zhì)譜的顯微觀察窗口中選取相應的多肽微珠所處的微腔進行原位質(zhì)譜檢測，獲得相應質(zhì)譜譜圖。其中一個陽性多肽微珠的質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖5所示。
[0114](e)使用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)的TOF-TOF模式，進行二級質(zhì)譜的檢測與鑒定，獲得相應的二級質(zhì)譜譜圖。
[0115](7)表面等離子體共振成像檢測
[0116]首先進行芯片前處理:(a)孵育:在多肽被轉(zhuǎn)到到表面等離子體共振成像芯片上后，將表面等離子體共振成像芯片在4°C孵育過夜(12小時)；(b)清洗:考慮到粘到表面等離子體共振成像芯片上的多肽是過量的，因此用10XPBS輕輕沖洗，然后將芯片依次放入盛有10XPBSUXPBS和去離子水(兩次)的培養(yǎng)皿在搖床上清洗IOmin ; (c)封閉:將芯片在5%牛奶的PBS溶液中封閉過夜(4°C，12小時)；(d)重復步驟(b)的清洗步驟。
[0117]然后，(e)將芯片裝入表面等離子體共振成像儀進行檢測；(f)配置IOM的磷酸作為洗脫液，分別配置 I XPBS,2 XPBS 以及 0.625mg/mL (0.004M)、1.25mg/mL (0.008M)、
2.5mg/mL (0.017M)、5mg/mL (0.033M)和 lOmg/mL (0.067M)溶于 PBS 的蛋白作為反應試劑。樣品流速設為2 μ L/s,結(jié)合時間200s，解離時間200s。獲得圖6所示的陽性多肽與蛋白之間的相互作用的表面等離子體共振曲線圖。
[0118] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細特征以及詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細特征以及詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細特征以及詳細方法才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種微腔陣列質(zhì)譜靶板，包括基片、在所述基片上形成的粘附層和在所述粘附層上形成的導電層，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的有導電層的一側(cè)設有與表面等離子體共振成像檢測區(qū)域相一致的微腔區(qū)域，所述微腔區(qū)域位置的基片上蝕刻有微腔，所述微腔開口于所述導電層并排列成陣列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述微腔的形狀為正方體或棱臺形； 優(yōu)選地，所述微腔邊長寬度為30?300微米、深度為30?300微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，每個微腔僅能容納一個多肽微珠； 優(yōu)選地，所述多肽微珠的粒徑為100?300微米，優(yōu)選120?250微米，更優(yōu)選150?180微米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述微腔區(qū)域的微腔個數(shù)為4?900個。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述微腔區(qū)域的面積為0.5?4cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述基片的材料為硅； 優(yōu)選地，所述基片的厚度為200微米?I毫米。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述粘附層的材料為鈦； 優(yōu)選地，所述粘附層的厚度為10?100納米。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述導電層的材料為金、銀或鉬，優(yōu)選為銀； 優(yōu)選地，所述導電層的厚度為100?500納米。
9.一種制作權(quán)利要求1-8任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板的方法，包括如下步驟: (1)打印預先設計的微腔陣列圖，形成掩膜； (2)利用光刻膠將所述掩膜轉(zhuǎn)移到基片上； (3)通過曝光、顯影和去膠得到微腔陣列圖； (4)蝕刻所述基片，并去除剩余的光刻膠和氧化層，得到微腔陣列； (5)分別濺射粘附層和導電層； (6)按照預先設計的規(guī)格劃片得到所述微腔陣列質(zhì)譜靶板。
10.一種權(quán)利要求1-8任一項所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板在組合化學多肽文庫的篩選中的應用。
【文檔編號】G01N27/64GK103868982SQ201410100307
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】王蔚芝, 李夢林, 魏澤文, 胡志遠 申請人:國家納米科學中心