產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙單抗夾心ELISA檢測方法，該檢測方法是采用原核表達的α毒素蛋白為免疫原，利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體作為檢測抗體和捕獲抗體，通過試驗優(yōu)化反應(yīng)條件，以系列含量的α毒素蛋白作為標準制作標準曲線，建立了雙單抗夾心ELISA方法，并對該方法各項指標進行驗證。具體包括以下步驟：（1）α毒素原核表達；(2)抗α毒素單克隆抗體的制備；(3)雙單抗夾心ELISA方法的建立；(4)標準曲線的建立；（5）對該雙單抗夾心ELISA方法進行性能評價。該方法特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好，快速、簡便，且能有效地定量檢測A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中α毒素，為α毒素提供了高效的檢測工具。
【專利說明】產(chǎn)氣莢膜梭菌Cl毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法。
(二)發(fā)明背景
[0002]產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犢、仔豬、家兔、雛雞等的壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病，發(fā)病急、死亡率高，是嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病，給各國畜牧業(yè)發(fā)展帶來巨大經(jīng)濟損失。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素(CPA)，因此α毒素是診斷魏氏梭菌病的重要依據(jù)，亦是判定食品安全的重要指標。
[0003]檢測α毒素的經(jīng)典方法包括動物試驗、毒素中和試驗、卵磷脂分解試驗等，但操作繁瑣、敏感性較低。近年隨著生物技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外對α毒素的檢測方法已有很大進展，Naylor等建立了多抗基礎(chǔ)上的ELISA方法，Hale等建立了捕獲抗體ELISA，McCourt等用雙夾心ELISA檢測α毒素。但是這些方法靈敏度不是特別高，且在國內(nèi)可操作性欠缺，而國外可購買的檢測試劑盒價格昂貴亦無法定量和大批量檢測，難以在國內(nèi)推廣，因此為了彌補此方法在國內(nèi)α毒素檢測中的空白，急切需要建立快速、靈敏、特異并能定量和大批量檢測的ELISA方法，本方法的建立也為產(chǎn)氣莢膜梭菌病早期診斷、后續(xù)研究提供有效工具。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明建立了特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好，快速、簡便，高效檢測α毒素的雙抗體夾心ELISA方法。該 方法檢測速度快、操作簡單、可定量檢測和大批量檢測，能大大縮短檢測周期，為α毒素的早期檢測和魏氏梭菌的傳播預(yù)防提供有效檢測工具。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0006]一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，具體操作步驟是:
[0007]I產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的原核表達，得到純化的重組α毒素蛋白；
[0008]2抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體的制備:
[0009]選擇與骨髓瘤細胞Sp2/0同源的純系雌性BALB/c小鼠(4_6周齡)作為免疫動物，免疫方案:首免為純化后的重組α毒素蛋白(步驟I中得到)與等體積弗式完全佐劑完全乳化后，IOOyg/只腹腔注射；二免、三免分別于首免后二周和五周將重組α毒素蛋白與等體積弗式不完全佐劑完全乳化后，100 μ g/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐劑的重組α毒素蛋白50~100 μ g/只,注射后3-5天取效價最高小鼠脾細胞用于細胞融合。
[0010]取生長狀態(tài)良好的骨髓瘤細胞SP2/0與上述ELISA檢測效價最高小鼠脾細胞利用PEG1500進行化學(xué)法融合，運用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，并采用有限稀釋法進行3~5次亞克隆，得到抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雜交瘤細胞株CP Π2;利用CP Π2制備單克隆抗體F12。
[0011]3抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體的制備:
[0012]選取新西蘭大白兔作為免疫動物，首免為純化的重組α毒素蛋白與等體積弗式完全佐劑完全乳化后背部皮下多點注射Img/只，首免后弗式不完全佐劑與等體積純化的重組α毒素蛋白完全乳化，間隔兩周免疫一次，三免后兩周用不加佐劑的純化的重組α毒素蛋白加強免，15d后兔心臟采血獲得血清，利用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，得到多克隆抗體。
[0013]4雙抗體夾心ELISA定量檢測方法及標準曲線的建立
[0014](I)用抗原包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)將多克隆抗體(包被抗體)稀釋至3 μ g/mL。100 μ L/孔包被96孔酶標板，4°C過夜；
[0015](2)用 PBST 溶液(含 0.05%Tween-20 的 PBS 溶液:NacL8g/L、KCL0.2g/L,Na2HPO4.12Η203.58g/L、KH2PO40.27g/L，pH7.4)洗滌 3 次，加入含 5%脫脂奶粉的 PBST 溶液作為封閉液200 μ L/孔，4°C封閉過夜；
[0016](3)用PBST溶液洗滌3次后加入待檢樣品，100 μ L/孔，同時設(shè)置陰陽性和空白對照，陽性對照為步驟I得到的純化重組α毒素蛋白，陰性對照分別為按常規(guī)方法制備的大腸桿菌培養(yǎng)上清和PBS緩沖液(含NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4.12H203.58g/L、KH2PO40.27g/L)，空白對照為不加任何樣品，37°C孵育Ih ；
[0017](4) 3次PBST溶液洗滌后，將雜交瘤細胞株CP f 12制備的單克隆抗體F12用PBS緩沖液稀釋至0.2 μ g/mL, 100 μ L/孔，37°C反應(yīng)Ih
[0018](5)用PBST溶液洗滌3次，加入用PBS緩沖液1:10000體積比稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih，PBST溶液洗滌3次；
[0019](6)最后加入可溶性TMB底物顯色液100 μ L/孔，室溫條件避光反應(yīng)15min，用2MH2SO4溶液終止反應(yīng)，450nm處讀取吸光值。
[0020](7)以α毒素蛋白稀釋濃度為橫坐標，OD45tlnm值為縱坐標繪制曲線圖；根據(jù)曲線圖，選擇最佳線性范圍，以濃度的自然對數(shù)LN(X)為橫坐標，OD45tlnm值為縱坐標繪制標準曲線，通過標準曲線計算待測樣品中α毒素濃度。
[0021]4結(jié)果判定標準的確定
[0022]計算陰性樣品平均值(X)與標準差(SD)，求得1+3SD為陽性臨界值，1+2SD為陰性臨界值。運用建立的DAS-ELISA測定OD45tlnm, 0D4M?>X+3SD為陽性，0D45tel〈X+2SD為陰性，X+2SD <0D4Mm<X+3SD 為可疑樣品。
[0023]本發(fā)明制備得到的抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雜交瘤細胞株，命名為CP Π2，分類命名:抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雜交瘤細胞株；已于2014年I月14日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，保藏號:CGMCC8770。
[0024]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0025](I)特異性強:與重組α毒素蛋白(步驟I中原核表達蛋白)和天然α毒素有較強的反應(yīng)性，β毒素、大腸桿菌培養(yǎng)上清、其他無關(guān)蛋白等為抗原進行ELISA檢測，表明無交叉反應(yīng)。
[0026](2)靈敏度高:通過試驗和標準曲線得知，線性范圍5.86?375ng/mL即為該方法的有效檢測范圍；平均值與2倍標準差之和(OD45tol),在標準曲線中對應(yīng)的濃度為4.57ng/mL，即為此方法最低檢測線。[0027](3)重復(fù)性好:在線性范圍內(nèi)選擇375、93.75、11.72ng/mL3個濃度點，在一次試驗中每個濃度測10孔，計算批內(nèi)變異次數(shù)；連續(xù)測10個批次，計算批間變異系數(shù)。該方法批內(nèi)變異系數(shù)為2.59%?5.02%，批間變異系數(shù)為2.67%?5.86%，兩者均小于10%，說明同一樣品在同批和不同批試驗中變異程度很小，表明該方法具有較好的精密度。
[0028](4)回收率測定:在10次試驗中，對3個濃度點的蛋白樣品測量得到的回收率在97.22%?102.85%范圍內(nèi)，證明該方法準確性較高。
(四)說明書附圖:
[0029]圖1產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法曲線圖。由圖得知，以α毒素蛋白稀釋濃度為橫坐標，OD45tlnm值為縱坐標繪制成曲線圖，可知α毒素蛋白在
5.86?375ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
[0030]圖2產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法標準曲線。濃度的自然對數(shù)LN(X)與OD45tol值呈顯著線性關(guān)系，回歸方程為y=0.2533x-0.2047，相關(guān)系數(shù)R2=0.9935。
(五)【具體實施方式】:
[0031]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0032]實施例中所用的試劑及其來源:表達載體pET28a購自德國Novagen公司；PMD18-T購自大連寶生物公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自美國OMEGABio-Tek 公司；限制性內(nèi)切酶 Bam HI 和 Hind III 購自 Fermentas 公司；High AffinityN1-1DA Resin購自南京金斯瑞公司；弗式完全佐劑與弗式不完全佐劑、IPTG、Tween20均購自美國Sigma公司；ant1-His Tag兔多抗、羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；96孔酶標板購自Solarbio公司；厭氧肉肝湯、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基購自青島海博生物；融合劑PEG1500購自德國Roche公司；BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；Sp2/0骨髓瘤細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)；可溶性TMB底物顯色液購自天根生化科技有限公司；其他所用化學(xué)試劑均為分析純。
[0033]實施例1產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的原核表達
[0034]根據(jù)primmer5軟件設(shè)計特異性的引物:
[0035]上游引物:5’-GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，如 SEQ N0.1 所示；
[0036]下游引物:5’-GCGGCGAAGCTTTTATTTTATATTATAAGTT-3’，如 SEQ N0.2 所示；
[0037]選取標準菌種NCTC528增菌后，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，利用PCR擴增產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因片段，擴增條件:94°C 5min、94°C lmin、54°C lmin、72°C 70s，共進行32個循環(huán)，72°C延伸7min。將經(jīng)DNA純化回收試劑盒純化的目的產(chǎn)物與PMD18-T連接，測序。測序正確的重組質(zhì)粒與載體pET-28a分別用EcoR I和Xho I雙酶切處理，連接后轉(zhuǎn)入表達感受態(tài)細胞BL21中，將菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基(Nacllg，蛋白胨Ig,酵母提取物0.5g，瓊脂粉1.5g,用IOOmL去離子水溶解后高壓滅菌)，挑取單菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中(卡那霉素終濃度為100 μ g/mL)，37°C培養(yǎng)3h至OD6tltol為0.4-0.6時，加入IPTG (異丙基硫代半乳糖苷，終濃度lmmol/L)誘導(dǎo)表達6h，菌體超聲破碎后，經(jīng)High Affinity N1-changed Resin純化制備的α毒素重組蛋白；利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)驗證純化后的α毒素重組蛋白的純度和免疫原性，用于后續(xù)動物免疫實驗和檢測實驗。
[0038]實施例2抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體的制備
[0039]選擇與骨髓瘤細胞Sp2/0同源的純系雌性BALB/c小鼠(4_6周齡)作為免疫動物，免疫方案:首免為步驟I中制備的重組α毒素蛋白與等體積弗式完全佐劑完全乳化后，IOOyg/只腹腔注射；二免、三免分別于首免后二周和五周將重組α毒素蛋白與等體積弗式不完全佐劑完全乳化后，100 μ g/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐劑的重組α毒素蛋白50?100 μ g/只，注射后3-5天取效價最高小鼠脾細胞用于下步細胞融合。期間每次免疫后第7d采血通過間接ELISA檢測抗體水平，以便時刻檢測抗體水平，選擇效價最優(yōu)的小鼠用于后續(xù)試驗。
[0040]取生長狀態(tài)良好的骨髓瘤細胞SP2/0與上述ELISA檢測效價最高小鼠脾細胞利用PEG1500進行化學(xué)法融合，運用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，并采用有限稀釋法進行3?5次亞克隆后，得到2株抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的雜交瘤細胞株CP fl2(已提交中國微生物菌種保藏中心保藏)、CP bl2。選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠20只，分為2組，腹腔注射弗式不完全佐劑0.5mL/只致敏，一周后第一組注射陽性雜交瘤細胞株CP Π2，第二組注射陽性雜交瘤細胞株CP bl2，0.5-1 X IO6個/只，7-10天后分別收集2組小鼠腹水，分別得到大量單克隆抗體F12、B12，經(jīng)間接ELISA方法檢測腹水效價。腹水經(jīng)正辛酸_硫酸銨方法純化后，SDS-PAGE檢測純化效果；蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)用于單抗特性鑒定:驗證單克隆抗體的特異性、鑒定單抗與α毒素的反應(yīng)性。
[0041]實施例3抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體的制備:
[0042]選取5只2_3Kg新西蘭大白兔，首免為純化的重組α毒素與等體積弗式完全佐劑完全乳化后背部皮下多點注射Img/只，以后弗式不完全佐劑與等體積純化的重組α毒素完全乳化，間隔2周免疫一次,3免后2周用不加佐劑的純化的重組α毒素加強免，15d后兔心臟采血獲得血清。利用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，得到抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體，通過間接ELISA法檢測抗體效價，SDS-PAGE電泳檢測純度。
[0043]實施例4雙抗夾心ELISA定量檢測方法的建立
[0044]通過方陣滴定實驗確定包被抗體及檢測抗體(單克隆抗體F12、Β12)的最佳配對，以及包被抗體的最佳包被濃度和檢測抗體的最佳稀釋濃度，并對ELISA條件進行摸索和優(yōu)化，最終確定如下體系:
[0045](I)配對抗體的選擇及最佳濃度確定
[0046]初步選擇實施例3制備的抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體作為捕獲抗體，由雜交瘤細胞株CP H2、CP bl2制備的單克隆抗體F12、B12分別作為檢測抗體，通過方陣實驗進行最佳抗體配對的選擇。將捕獲抗體用抗原包被液按體積比1:100稀釋加入96孔酶標板第一行，并用抗原包被液向下1:2倍比稀釋至第八行，IOOuL /孔，4°C包被過夜，PBST洗滌3次，每次3min，拍干。每孔加封閉液200 μ L，4°C封閉過夜，PBST洗滌3次，每次3min，拍干。每孔加入重組α毒素蛋白IOOyL /孔(用PBS稀釋毒素蛋白濃度至4μ g / mL)，37°C孵育lh，PBST洗滌3次，每次3min，拍干。將檢測抗體用PBS緩沖液按體積比1:100稀釋加入96孔酶標板第一列、第二列，并用PBS緩沖液做1、3、5、7、9、11列1:2倍比稀釋，2、4、6、8、10、12列同理做1:2倍比稀釋，IOOyL /孔，37°C孵育lh，PBST溶液洗滌3次，每次3min，拍干。加入可溶性TMB底物顯色液，避光顯色15min，每孔加入50 μ L2M H2SO4終止反應(yīng)，在450nm處用酶標儀測定每孔OD值。以P / N值作為選擇最佳配對抗體和最佳稀釋濃度的依據(jù)。
[0047]最終確定捕獲抗體為抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體，最佳工作濃度為3 μ g/mL ;檢測抗體為雜交瘤細胞株CP fl2制備的單克隆抗體F12，最佳工作濃度為0.2 μ g/mL。
[0048](2)最佳包被條件的確定
[0049]96孔酶標板第一、二列用0.01mol/L碳酸鹽緩沖液包被捕獲抗體，第三、四列用
0.05mol/L碳酸鹽緩沖液包被捕獲抗，第五、六列用0.lmol/L碳酸鹽緩沖液包被捕獲抗體，第一、二行包被時間為37°C2h，第三、四行包被時間4°C 12h，第五、六行包被時間為370C lh+4°C 12h，進行方陣滴定實驗，根據(jù)P/N值確定最佳包被條件。
[0050]最終確定最佳包被條件為0.lmol/L碳酸鹽緩沖液包被捕獲抗體，4°C 12h條件最佳。
[0051](3)最佳封閉條件的確定
[0052]以捕獲抗體最佳包被濃度包被96孔酶標板，以最佳工作濃度稀釋檢測抗體，分別用5%脫脂奶粉、5%胎牛血清、1%BSA作為封閉液,選取5份重組α毒素蛋白抗原,5份陰性抗原，測定其在450nm處的OD值，根據(jù)P / N值確定合適的封閉液。
[0053]最終確定的最佳封閉條件為5%脫脂奶粉。
[0054](4)檢測抗體最佳作用時間的確定
[0055]最佳包被條件下，加入重組α毒素蛋白和陰性樣品各10份，以檢測抗體最佳工作濃度0.2 μ g/mL稀釋檢測抗體，置37°C分別反應(yīng)30min、60min、90min、120min，進行ELISA試驗，根據(jù)P/N值確定檢測抗體的最佳作用時間。
[0056]最終確定檢測抗體的最佳作用時間為lh。
[0057](5)利用方陣滴定實驗對ELISA檢測條件進行優(yōu)化，最終確定如下反應(yīng)體系:
[0058]①用抗原包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)將作為捕獲抗體的多克隆抗體稀釋至2 μ g/mL。100 μ L/孔包被96孔酶標板，4°C過夜；
[0059]②用PBST 溶液(含 0.05%Tween-20 的 PBS 溶液:NacL8g/L、KCL0.2g/L,Na2HPO4.12Η203.58g/L、KH2PO40.27g/L，pH7.4)洗滌 3 次，加入含 5%脫脂奶粉的 PBST 溶液作為封閉液200 μ L/孔，4°C封閉過夜；
[0060]③用PBST溶液洗漆3次后,前5行加入待檢樣品,第6行加純化重組α毒素蛋白作為陽性對照，第7行加入按常規(guī)方法制備的大腸桿菌培養(yǎng)上清，第8行加入PBS緩沖液(含 NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4.12H203.58g/L、KH2PO40.27g/L)，第 7 行和第 8 行作為陰性對照，100 μ L/孔；空白對照為不加任何樣品，37°C孵育Ih ；
[0061]④3次PBST溶液洗滌后，將雜交瘤細胞株CP f 12制備的單克隆抗體F12用PBS緩沖液稀釋至0.2 μ g/mL, 100 μ L/孔，37°C反應(yīng)Ih ；
[0062]⑤用PBST溶液洗滌3次，加入用PBS緩沖液1:10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG, 37°C孵育Ih，PBST洗滌液洗滌3次；
[0063]⑥最后加入可溶性TMB底物顯色液100 μ L/孔，室溫條件避光反應(yīng)15min，用2MH2SO4終止反應(yīng)，450nm處讀取吸光值。[0064]實施例5:雙抗體夾心ELISA方法標準曲線的建立
[0065]根據(jù)已建立好的雙單抗夾心ELISA定量檢測方法操作程序，對重組的α毒素蛋白標準品從1500ng/mL起兩倍系列稀釋至0.73ng/mL、陰性樣品和空白孔分別進行檢測，反應(yīng)完畢后測定OD45tlnm值。以α毒素蛋白稀釋濃度為橫坐標，OD45tlnm值為縱坐標繪制曲線圖；根據(jù)曲線圖，選擇最佳線性范圍，以濃度的自然對數(shù)LN(X)為橫坐標，OD45tlnm值為縱坐標繪制標準曲線。該曲線線性范圍較理想，可根據(jù)標準曲線計算待測樣品中α毒素濃度。
[0066]實施例6:雙抗體夾心ELISA方法性能評價
[0067](I)特異性試驗運用建立好的雙抗體夾心ELISA方法，檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素陽性樣品30份，大腸桿菌培養(yǎng)上清等陰性樣品20份，其他無關(guān)蛋白10份，并設(shè)置空白對照。結(jié)果顯示除與重組α毒素蛋白和α毒素反應(yīng)呈陽性外，其他均為陰性，表明無交叉反應(yīng)。
[0068](2)靈敏度分析根據(jù)上述試驗中得到的X+2SD的值，從標準曲線中找出對應(yīng)濃度，
即為此方法的檢測限。根據(jù)標準曲線的線性范圍確定有效檢測范圍。
[0069](3)精密度分析在線性范圍內(nèi)選擇375、93.75、IL 72ng/mL3個濃度點，在一次試驗中每個濃度測10個孔，計算批內(nèi)變異次數(shù)；連續(xù)測10個批次，計算批間變異系數(shù)。該方法批內(nèi)變異系數(shù)為2.59%?5.02%，批間變異系數(shù)為2.67%?5.86%，兩者均小于10%，說明同一樣品在同批和不同批試驗中變異程度很小，表明該方法具有較好的精密度。
[0070](4)回收率測定在空白檢測基質(zhì)中加入不同濃度(375、93.75、11.72ng/mL)重組α毒素蛋白，按標準檢測程序測定，根據(jù)實測值/理論值*100%求得平均回收率。在10次試驗中，對3個濃度點的蛋白樣品測量得到的回收率在97.22%?102.85%范圍內(nèi)，證明該方法準確性較高。
[0071]實施例7:以表達的重組α毒素蛋白和提取的天然α毒素為檢測材料
[0072](I)重組α毒素蛋白和提取的天然α毒素的制備
[0073]①α毒素原核表達方法制備重組α毒素蛋白
[0074]根據(jù)primmer5軟件設(shè)計特異性的引物:
[0075]上游引物:5’-GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，如 SEQ N0.1 所示；
[0076]下游引物:5’-GCGGCGAAGCTTTTATTTTATATTATAAGTT-3’，如 SEQ N0.2 所示；
[0077]選取標準菌種NCTC528增菌后，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，利用PCR擴增產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因片段，擴增條件:94°C 5min、94°C lmin,54°C lmin、72°C 70s，共進行32個循環(huán)，72°C延伸7min。將經(jīng)DNA純化回收試劑盒純化的目的產(chǎn)物與PMD18-T連接，測序。測序正確的重組質(zhì)粒與載體pET-28a分別用EcoR I和Xho I雙酶切處理，連接后轉(zhuǎn)入表達感受態(tài)細胞BL21中，涂布于固體LB培養(yǎng)基(Nacl lg，蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，瓊脂粉1.5g,用IOOmL去離子水溶解后高壓滅菌)，挑取單菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中(卡那霉素終濃度為100 μ g/mL)，37°C培養(yǎng)3h至OD6tltlnm為
0.4-0.6時，加入IPTG (異丙基硫代半乳糖苷，終濃度lmmol/L)誘導(dǎo)表達6h，菌體超聲破碎后，經(jīng)High Affinity N1-changed Resin純化制備的α毒素重組蛋白；利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)驗證純化后的α毒素重組蛋白的純度和免疫原性，用于后續(xù)動物免疫實驗和檢測實驗。
[0078]②將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株(NCTC756)接種血平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)36_48h后，接入液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)增菌培養(yǎng)后，接種厭氧肉肝湯40°C厭氧震蕩培養(yǎng)6h ；
[0079]③8000r, 15min離心取上清；
[0080]④上清經(jīng)飽和硫酸銨法純化，得到天然α毒素；大腸桿菌(ATCC11775)培養(yǎng)上清及未接種厭氧肉肝湯均作為陰性對照
[0081]2、雙抗體夾心ELISA方法檢測
[0082]①用抗原包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，ρΗ9.6)通過方陣試驗確定作為捕獲抗體的多克隆抗體稀釋至3 μ g/mL, 100 μ L/孔包被96孔酶標板，4°C過夜。
[0083]②用PBST溶液(0.05%Tween20,pH7.4PBST)洗滌3次，加入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)200 μ L/孔，4°C封閉過夜；
[0084]③用PBST溶液洗滌3次后前3行加入上述制備好的重組α毒素蛋白，第4_6行加入制備的天然α毒素，IOOyL/孔，第7、8行分別加入陰性對照(PBS、大腸桿菌(ATCC11775)培養(yǎng)上清及未接種菌的厭氧肉肝湯均)和空白對照(不加樣品)；37°C孵育Ih ；
[0085]④3次PBST溶液洗滌后，加入制備的作為檢測抗體的單克隆抗體F12(用PBS緩沖液稀釋至0.2 μ g/mL)，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)Ih ；
[0086]⑤用PBST洗滌3次，加入用PBS緩沖液按體積比1:10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠 IgG, 37°C孵育 Ih ；
[0087]⑥最后加入可溶性TMB底物顯色液100 μ L/孔，室溫條件避光反應(yīng)15min，用2MH2SO4終止反應(yīng)，450nm處讀取吸光值。
[0088]3、結(jié)果
[0089]由圖1得知，本實施例標準品的濃度與可檢測到吸光度呈顯著的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9935，線性方程為y=0.2533χ-0.2047，線性范圍5.86?375ng/mL，此方法最低檢測線為4.57ng/mL。本實施例測得的回收率在97.22%?102.85%范圍內(nèi)，滿足要求。結(jié)果說明本方法能有效地檢測α毒素。
[0090]實施例8:以A?E型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清為檢測材料
[0091]1、Α-Ε型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清的制備
[0092]①相同培養(yǎng)條件下，將標準菌種A型(NCTC756)、B型(NCTC8533)、C型(NCTC3180)、D型(NCTC8504)、E型(NCTC6719)接種血平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)36_48h后，接入液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)增菌培養(yǎng)后；
[0093]②接種厭氧肉肝湯40°C厭氧震蕩培養(yǎng)6h ；
[0094]③8000r，15min離心取上清，大腸桿菌(ATCC11775)培養(yǎng)上清及未接種的厭氧肉肝湯作均為陰性對照。
[0095]2、雙抗體夾心ELISA方法檢測
[0096]①用抗原包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)將通過方陣試驗確定作為捕獲抗體的多克隆抗體稀釋至3 μ g/mL, 100 μ L/孔包被96孔酶標板，4°C過夜。
[0097]②用PBST溶液(含0.05%Tween20, pH7.4的PBS)洗滌96孔酶標板3次，拍干后加入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)200 μ L/孔，4°C封閉過夜；
[0098]③用PBST溶液洗滌96孔酶標板板3次后，前5行分別加入上述制備的各型產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)上清，第6行加入陽性對照重組α毒素蛋白、第7、8行分別加入陰性對照(常規(guī)方法制備的大腸桿菌培養(yǎng)上清、未接種菌的厭氧肉肝湯、PBS緩沖液)，100 μ L/孔，以及空白對照(不加樣品)，37°C鮮育Ih ；
[0099]④3次PBST溶液洗滌后，加入制備的作為檢測抗體的單克隆抗體F12(用PBS緩沖液稀釋至0.2 μ g/mL)，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)Ih ；
[0100]⑤用PBST溶液洗滌3次，加入用PBS緩沖液按體積比1:10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;
[0101]⑥最后加入可溶性TMB底物顯色液100 μ L/孔，室溫條件避光反應(yīng)15min，用2MH2SO4終止反應(yīng)，450nm處讀取吸光值。
[0102]3、結(jié)果
[0103]經(jīng)過樣品、陽性和陰性對照的多次平行測定，得到A?E型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中α毒素檢測值均為陽性，且根據(jù)450nm處吸光值運用回歸方程計算出其在標準曲線對應(yīng)濃度，得到A?E型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株產(chǎn)生的α毒素量的平均值和標準差分別為 103.29±4.13ng/mL、29.20±1.21ng/mL、16.15±0.97ng/mL、10.46±0.58ng/mL、7.05±0.47ng/mL，符合產(chǎn)氣莢膜梭菌各型中均有α毒素的理論，且能有效地定量檢測A?E型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中α毒素。
[0104]結(jié)果說明本方法在制備單克隆抗體基礎(chǔ)上建立的雙抗體夾心ELISA，可用于大批量樣品檢測、α毒素的初步定量檢測和早期結(jié)果的獲得，為預(yù)防畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌的傳播及研究提供了更快速、有效的工具，并為疫苗質(zhì)量和食品安全監(jiān)測的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟: 1)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的原核表達，得到純化的重組α毒素蛋白； 2)抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體的制備: 選擇與骨髓瘤細胞Sp2/0同源的純系雌性BALB/c小鼠作為免疫動物:首免為步驟I)中得到的純化的重組α毒素蛋白與等體積弗式完全佐劑完全乳化后，IOOyg/只腹腔注射；二免、三免分別于首免后二周和五周將重組α毒素蛋白與等體積弗式不完全佐劑完全乳化后，1OOyg/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐劑的重組α毒素蛋白50~.100 μ g/只，注射后3-5天取效價最高小鼠脾細胞用于細胞融合； 取生長狀態(tài)良好的骨髓瘤細胞SP2/0與上述ELISA檢測效價最高小鼠脾細胞利用PEG1500進行化學(xué)法融合，運用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，并采用有限稀釋法進行3~5次亞克隆，得到抗產(chǎn)氣 莢膜梭菌α毒素雜交瘤細胞株CP Π2 ;利用CP Π2制備單克隆抗體F12 ； 3)抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體的制備: 選取新西蘭大白兔作為免疫動物，首免為純化的重組α毒素蛋白與等體積弗式完全佐劑完全乳化后背部皮下多點注射Img/只；，首免后將弗式不完全佐劑與等體積純化的重組α毒素蛋白完全乳化每間隔兩周免疫一次，三免后兩周用不加佐劑的步驟I)得到的純化的重組α毒素加強免，15d后采集兔血清，利用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，得到多克隆抗體； 4)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法及標準曲線的建立 (1)用抗原包被液將多克隆抗體即包被抗體稀釋至3μ g/mL ；100 μ L/孔包被96孔酶標板，4°C過夜；所述的抗原包被液組分為0.1M碳酸鹽緩沖液，其pH9.6 ； (2)用PBST溶液洗滌3次，加入含5%脫脂奶粉的PBST溶液作為封閉液200μ L/孔，4°C封閉過夜；所述PBST溶液組分為:含0.05%Tween-20的PBS溶液:NacL8g/L、KCL0.2g/UNa2HPO4.12Η203.58g/L、KH2PO40.27g/L, pH7.4 ； (3)用PBST溶液洗滌3次后加入待檢樣品，100μ L/孔，同時設(shè)置陰陽性和空白對照，陽性對照為步驟I)得到的純化的重組α毒素蛋白，陰性對照分別為按常規(guī)方法制備的大腸桿菌培養(yǎng)上清和PBS緩沖液，所述PBS緩沖液組分為:含NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4.12H203.58g/L、KH2PO40.27g/L ;空白對照為不加任何樣品，37°C孵育 Ih ； (4)3次PBST溶液洗滌后，將雜交瘤細胞株CPΠ2制備的單克隆抗體F12用PBS緩沖液稀釋至 0.2 μ g/mL, 100 μ L/ 孔，37°C 反應(yīng) Ih ； (5)用PBST溶液洗滌3次，加入用PBS緩沖液1:10000體積比稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih，PBST溶液洗滌3次； (6)最后加入可溶性TMB底物顯色液100μ L/孔，室溫條件避光反應(yīng)15min，用2Μ H2SO4溶液終止反應(yīng)，450nm處讀取吸光值； (7)以α毒素蛋白稀釋濃度為橫坐標，OD45tol值為縱坐標繪制曲線圖；根據(jù)曲線圖，選擇最佳線性范圍，以濃度的自然對數(shù)LN(X)為橫坐標，OD45tlnm值為縱坐標繪制標準曲線，通過標準曲線計算待測樣品中α毒素濃度； 5)結(jié)果判定標準的確定計算陰性樣品平均值(又)與標準差(SD)，求得X+3SD為陽性臨界值，3T+2SD為陰性臨界值；運用建立的DAS-ELISA測定OD4stal, 0D_> X+3SD為陽性，0D--<X+2SD為陰性，X +2SD <0D?m< X +3SD 為可疑樣品。
【文檔編號】G01N33/577GK103941004SQ201410036188
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月25日
【發(fā)明者】王海榮, 孫佳芝, 柴同杰, 李課, 陳勇, 逄偉 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)