一種食品中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種食物中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟：制備捕獲探針、制備信號(hào)探針、對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理、使用血糖儀進(jìn)行檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明通過酶的催化作用將信號(hào)轉(zhuǎn)化為血糖儀可以檢測(cè)的葡萄糖信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了非糖物質(zhì)的血糖儀現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有高穩(wěn)定性、較低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍，且檢測(cè)成本低，檢測(cè)程序簡(jiǎn)單，檢測(cè)效果好，尤其是一般人員即可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，避免了現(xiàn)有技術(shù)中必須專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室操作的嚴(yán)苛要求。
【專利說明】—種食品中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到物質(zhì)的檢測(cè)分析方法，具體指一種食品中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]萊克多巴胺屬于β -興奮劑，能使動(dòng)物體內(nèi)的營養(yǎng)成分由脂肪向肌肉轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出營養(yǎng)再分配效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物體的物質(zhì)代謝，增強(qiáng)脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，顯著提高胴體瘦肉率和飼料報(bào)酬。但是，它們的濫用及在動(dòng)物性食物中的殘留嚴(yán)重危害著人們的健康和生命安全，并嚴(yán)重影響了我國畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易。世界上大多數(shù)國家都明文禁止萊克多巴胺用作飼料添加劑。
[0003]對(duì)于萊克多巴胺的檢測(cè)，目前應(yīng)用比較成熟的方法和技術(shù)，例如質(zhì)譜分析、色譜法、光譜和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，能夠達(dá)到高準(zhǔn)確度、靈敏的定量檢測(cè)，但它們大都非常昂貴，需要復(fù)雜的儀器和精細(xì)的操作，需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，不適合應(yīng)用于日常的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中。從實(shí)用角度來說，盡量降低成本、簡(jiǎn)化程序、能夠進(jìn)行定量分析對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)非常重要。尤其是對(duì)于現(xiàn)代分析系統(tǒng)而言，側(cè)重的焦點(diǎn)漸漸轉(zhuǎn)向家庭或現(xiàn)場(chǎng)的便攜式快速食物檢測(cè)?，F(xiàn)有的萊克多巴胺已經(jīng)不適合這種檢測(cè)方向的轉(zhuǎn)變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀提供一種檢測(cè)成本低、檢測(cè)程序簡(jiǎn)單且可現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的食品中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種食品中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟:
[0006]⑴制備捕獲探針:
[0007]取0.08-0.12g平均粒徑為I μ m的Fe3O4磁珠分散在60_100mL乙醇和15_25mL水的混合液中，在35-53HZ下超聲8-12min，加入0.8-1.2mL濃度為26_30wt%的氨水；隨后，逐滴加入1.5-2.5ml正硅酸乙酯，180-220rpm機(jī)械攪拌，室溫下反應(yīng)10_14h ；
[0008]通過磁性分離得到的納米粒子用水和乙醇依次清洗3-5次，清洗干凈溶液中不能被磁鐵吸附的懸浮微粒，然后在50-70°C下真空干燥，得到包裹有二氧化硅層的Fe3O4磁珠Fe3O4QSiO2 ；
[0009]向180-220mL 無水甲苯中加入 0.4-0.6g Fe3O4OSiO2 和 1.8-2.2mL3_ 氨丙基三乙氧基硅烷，在100-140°C下攪拌10-14h，得到氨基化的Fe3O4OSiO2 ；
[0010]向40-60ml ρΗ7_7.5的PBS磷酸鹽緩沖溶液中加入0.4-0.6g羧甲基化的β -環(huán)糊精、0.15-0.25gl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、0.15-0.25g N-羥基琥珀酰亞胺和上述得到的氨基化的Fe3O4OSiO2，攪拌10-14h進(jìn)行活化，得到Fe3O4OSiO2-CD捕獲探針；
[0011]⑵制備信號(hào)探針:[0012]將0.8-1.2ml濃度為0.08-0.12mg/ml的萊克多巴胺抗體Ab加入到0.8-1.2mlEnvision試劑(該名詞在網(wǎng)絡(luò)上查詢不到，在教科書上有類似的名詞嗎)中，3_5°C下250-350rpm攪拌0.5_lh，得到復(fù)合物溶液；
[0013]取0.08-0.12ml上述復(fù)合物溶液加入到2_3ml膠體金溶液(濃度？)中，3_5°C下攪拌4.5-5.5h，11000-13000rpm離心10_15min后，棄去上清液，將沉淀分散在0.8-1.2mlPH7-7.5的PBS緩沖液中，得到Envision試劑(上述上溶液，這里是試劑，是否可統(tǒng)一為試齊[J)-抗體-膠體金復(fù)合物；
[0014]向0.8-1.2ml上述合成的Envision試劑-抗體-膠體金溶液中加入450-550 μ L濃度為8_12mg/ml的鹿糖酶溶液,于3_5°C下攪拌5_7h, 11000-13000rpm離心10_15min后，棄去上清液，所得沉淀分散到0.8-1.2ml含有0.8-1.2wt%牛血清蛋白的pH為7-7.5的PBS緩沖液中，得到Envision試劑-抗體-膠體金-酶復(fù)合物，即為信號(hào)探針；
[0015]⑶萊克多巴胺的檢測(cè):
[0016]按常規(guī)方法處理待測(cè)樣品，氮?dú)獯蹈珊笥?.8-1.2mL pH7_7.5的PBS緩沖液重分散得到待測(cè)樣品溶液；
[0017]將捕獲探針Fe3O4OSiO2-CD分散在含有濃度為0.8-1.2wt%的牛血清蛋白、pH7_7.5的PBS緩沖液，制備成濃度為0.8-1.2mg/mL的捕獲探針分散液；
[0018]吸取0.8-1.2mL所述分散液加入到所述的混合溶液中，室溫下振搖1.5-2.5h進(jìn)行吸附，磁性分離后用PBS緩沖液沖洗2-5次；之后加入80-120 μ LEnvision試劑-抗體-膠體金-酶復(fù)合物，室溫下振蕩反應(yīng)25-35min，磁性分離后所得沉淀物用緩沖液清洗后，加入45-55 μ L蔗糖溶液，室溫下反應(yīng)1.5-2.5h后，磁性分離出沉淀后吸取上層清液用血糖儀檢測(cè)，記錄血糖儀的讀數(shù)；
[0019](4)將得到的讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，即可得知所檢測(cè)物質(zhì)中萊克多巴胺的濃度。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明選用環(huán)糊精制備捕獲探針，環(huán)糊精是七個(gè)葡萄糖單位組成的低聚糖，環(huán)形結(jié)構(gòu)具有疏水內(nèi)腔和親水表面，能夠選擇性的吸附各種客體分子，在疏水空腔內(nèi)形成穩(wěn)定的主客體絡(luò)合物。此外，β_環(huán)糊精是環(huán)保的，具有水溶性，能夠提高功能性材料的溶解度和穩(wěn)定性，對(duì)目標(biāo)分子的強(qiáng)識(shí)別性和富集功能，價(jià)格低廉，僅為抗體價(jià)格的萬分之一。而制備信號(hào)探針?biāo)褂玫腅nvision試劑是一種枝椏樣的鏈狀復(fù)合物，本身結(jié)合有第二抗體和HRP酶；EnviSion試劑的鏈狀結(jié)構(gòu)使得它的負(fù)載量增加，從而達(dá)到信號(hào)放大的效果。本發(fā)明結(jié)合β_環(huán)糊精主客體反應(yīng)，對(duì)樣品中的待測(cè)物萊克多巴胺進(jìn)行富集；用Envision試劑偶聯(lián)吸附了鹿糖酶的金納米粒子作為信號(hào)探針,利用Envision的鏈狀結(jié)構(gòu)增加蔗糖酶的負(fù)載量，達(dá)到信號(hào)放大的效果，之后通過Envision試劑上的第二抗體結(jié)合萊克多巴胺抗體，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)將信號(hào)探針與待測(cè)物抗原結(jié)合；利用信號(hào)探針上的蔗糖酶將蔗糖溶液水解成葡萄糖進(jìn)行血糖儀檢測(cè)，測(cè)得的葡萄糖濃度與待測(cè)物濃度成正比。
[0021]本發(fā)明采用β_環(huán)糊精的主客體反應(yīng)來捕獲和富集樣品中的萊克多巴胺，經(jīng)過抗原抗體反應(yīng)將信號(hào)探針和待測(cè)物結(jié)合，利用信號(hào)探針上的蔗糖酶將蔗糖水解成葡萄糖來進(jìn)行血糖儀定量檢測(cè)；從而提供了一種萊克多巴胺含量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，利用主客體反應(yīng)對(duì)萊克多巴胺進(jìn)行富集，可快速簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的富集；通過酶的催化作用將信號(hào)轉(zhuǎn)化為血糖儀可以檢測(cè)的葡萄糖信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了非糖物質(zhì)的血糖儀現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有高穩(wěn)定性、較低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍，且檢測(cè)成本低，檢測(cè)程序簡(jiǎn)單，檢測(cè)效果好，尤其是一般人員即可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，避免了現(xiàn)有技術(shù)中必須專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室操作的嚴(yán)苛要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0024]準(zhǔn)備工作:制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]將萊克多巴胺加入到PBS緩沖液中，制備成不同重量濃度的萊克多巴胺的、pH為
7.4的混合溶液；同時(shí)，還配置一個(gè)不含萊克多巴胺的空白樣品。
[0026]⑴制備捕獲探針:
[0027]取0.1g Fe3O4磁珠(平均粒徑I μ m)分散在80mL乙醇和20mL水的混合液中，35Hz超聲IOmin,加入ImL濃度為28wt%的氨水；隨后,逐滴加入2ml正娃酸乙酯,200rpm機(jī)械攪拌，室溫下反應(yīng)12h ；
[0028]通過磁性分離得到的納米粒子用水和乙醇依次清洗3次，直至溶液中不能被磁鐵吸附的懸浮微粒被清洗干凈后，60°C真空干燥，得到包裹有二氧化硅層的Fe3O4磁珠Fe3O4OSiO2 ；
[0029]向200mL無水甲苯中加入0.5g Fe3O4OSiO2和2mL3_氨丙基三乙氧基娃燒，在120°C下攪拌12h，得到氨基化的Fe3O4OSiO2 ；
[0030]向50ml pH7.2的PBS磷酸鹽緩沖溶液中加入0.5g羧甲基化的β-環(huán)糊精(CM-0-CD)、0.2gl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、0.2g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和上述得到的氨基化的Fe3O4OSiO2，混合物攪拌12h進(jìn)行活化，得到Fe3O4OSiO2-⑶捕獲探針；
[0031]⑵制備信號(hào)探針:
[0032]將Iml0.lmg/ml萊克多巴胺抗體Ab加入到Iml Envision溶液中，4°C下300rpm攪拌lh，得到復(fù)合物溶液；
[0033]0.01wt%氯金酸(IOOmL) 200rpm攪拌下加熱煮沸后，快速加入2.5mLlwt%的朽1檬酸鈉，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，待溶液變?yōu)榫萍t色，得到膠體金溶液；
[0034]取0.1ml上述復(fù)合物溶液加入到2.5ml膠體金溶液中，4°C下攪拌5h，12000rpm離心IOmin后,棄去上清液,將沉淀分散在Iml pH7.4的PBS緩沖液中，得到Envision試劑-抗體-膠體金復(fù)合物；
[0035]Iml上述合成的Envision試劑-抗體-膠體金溶液中加入500 μ L10mg/ml鹿糖酶溶液，于4°C下攪拌6h，12000rpm離心IOmin后，棄去上清液，所得沉淀分散到Iml含有1%牛血清蛋白的pH為7.4的PBS緩沖液中，得到Envision試劑-抗體-膠體金-酶復(fù)合物(Au-Envision-Ab-酶)，即為信號(hào)探針；
[0036]⑶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
[0037]將上述捕獲探針Fe3O4OSiO2-⑶分散在含有濃度為lwt%的牛血清蛋白、pH7.4的PBS緩沖液，制備成濃度為lmg/mL的捕獲探針分散液；[0038]向每個(gè)不同濃度的萊克多巴胺混合溶液中分別加入ImL分散液，室溫下振搖2h進(jìn)行吸附，磁性分離后得到的沉淀物用緩沖液沖洗3次；之后加入IOOyLAu-Envision-Ab-酶復(fù)合物,室溫下振蕩反應(yīng)30min,磁性分離后所得沉淀物用緩沖液清洗后，加入50 μ L蔗糖溶液，室溫下反應(yīng)2h后，磁性分離沉淀后吸取上層溶液用血糖儀檢測(cè)，記錄血糖儀的讀數(shù)；
[0039]以萊克多巴胺的量為橫坐標(biāo)，血糖儀的讀數(shù)為縱坐標(biāo)，制備萊克多巴胺-血糖儀讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
[0040]實(shí)施例1
[0041]檢測(cè)豬肉中萊克多巴胺的含量
[0042]從當(dāng)?shù)爻匈徺I不同的豬肉和肝臟樣本，按常規(guī)方法分別進(jìn)行處理。處理方法簡(jiǎn)述如下:
[0043]將樣品絞碎后，取1.0克均勻分散在2mL的3%三氯乙酸中，用渦旋儀渦動(dòng)至均勻后再加入ImL乙腈并充分搖勻。隨后，以4000rpm離心10分鐘，收集上層清液。之后，將收集的上清液用10wt%碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值為9.8±0.2，然后加入0.8克氯化鈉。隨后，用2mL乙酸乙酯充分振蕩混勻萃取兩次，4000rpm離心10分鐘。取上層液體于50?60°C下氮?dú)饬鞔蹈?，加入Iml PBS緩沖液充分振蕩搖勻，用于檢測(cè)。
[0044]本實(shí)施例中的豬肉樣品共制備了十份，豬肝樣品制備了十份。
[0045]取五份豬肉樣品進(jìn)行如下處理:豬肉樣品I不做任何處理，按下述方法處理后直接進(jìn)行檢測(cè)；向豬肉樣品2至5中分別加入一定量的萊克多巴胺，具體加入濃度詳見表I所示，然后按下述方法處理后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表I所示。
[0046]取五份豬肝樣品進(jìn)行如下處理:對(duì)豬肝樣品I和樣品2不做任何處理，按下述方法處理后進(jìn)行檢測(cè)，向豬肝樣品3至5中分別加入一定量的萊克多巴胺，具體加入濃度詳見表
2所示。然后按下述方法處理后進(jìn)行檢測(cè)。
[0047]樣品的處理方法為:
[0048]免疫復(fù)合物的夾心反應(yīng):將Fe3O4OSiO2-CD分散在含有1%BSA的pH7.4PBS中，制備成lmg/mL的分散液。向ImL上述樣品溶液中分別加入ImL上述分散液,室溫下振搖2h進(jìn)行吸附，磁性分離后用緩沖液沖洗3次；之后加入100 μ L Au-Envision-Ab-酶復(fù)合物，振蕩混勻室溫下反應(yīng)30min，磁性分離后用緩沖液清洗去未結(jié)合的復(fù)合物，得到夾心免疫復(fù)合物。
[0049]使用血糖儀對(duì)萊克多巴胺的檢測(cè):向上述夾心免疫復(fù)合物中加入50 μ L蔗糖溶液，室溫下反應(yīng)2h后，吸取上層溶液用血糖儀檢測(cè)，記錄相應(yīng)的讀數(shù)。
[0050]將該讀數(shù)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到萊克多巴胺濃度。根據(jù)該濃度計(jì)算豬肉和肝臟中萊克多巴胺的含量。每個(gè)濃度做三個(gè)平行。檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD都小于6%，檢測(cè)
重復(fù)率良好。
[0051]表I為豬肉樣品及萊克多巴胺加標(biāo)豬肉樣品的檢測(cè)試驗(yàn)。
[0052]表I
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種食物中萊克多巴胺含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟: ⑴制備捕獲探針: 取0.08-0.12g平均粒徑為I μ m的Fe3O4磁珠分散在60_100mL乙醇和15_25mL水的混合液中，在35-53HZ下超聲8-12min，加入0.8-1.2mL濃度為26_30wt%的氨水；隨后，逐滴加入1.5-2.5ml正硅酸乙酯，180-220rpm機(jī)械攪拌，室溫下反應(yīng)10_14h ； 通過磁性分離得到的納米粒子用水和乙醇依次清洗3-5次，清洗干凈溶液中不能被磁鐵吸附的懸浮微粒，然后在50-70°C下真空干燥，得到包裹有二氧化硅層的Fe3O4磁珠Fe3O4OSiO2 ； 向180-220mL無水甲苯中加入0.4-0.6g Fe3O4OSiO2和1.8-2.2mL3_氨丙基三乙氧基硅燒，在100-140°C下攪拌10-14h，得到氨基化的Fe3O4OSiO2 ； 向40-60ml pH7-7.5的PBS磷酸鹽緩沖溶液中加入0.4-0.6g羧甲基化的β -環(huán)糊精、.0.15-0.25gl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、0.15-0.25g N-羥基琥珀酰亞胺和上述得到的氨基化的Fe3O4OSiO2，攪拌10-14h進(jìn)行活化，得到Fe3O4OSiO2-CD捕獲探針；⑵制備信號(hào)探針: 將0.8-1.2ml濃度為0.08-0.12mg/ml的萊克多巴胺抗體Ab加入到0.8-1.2mlEnvision試劑(該名詞在網(wǎng)絡(luò)上查詢不到，在教科書上有類似的名詞嗎)中，3-5°C下250-350rpm攪拌0.5_lh，得到復(fù)合物溶液； 取0.08-0.12ml上述復(fù)合物溶液加入到2_3ml膠體金溶液(濃度？)中，3_5°C下攪拌4.5-5.5h，11000-13000rpm離心10_15min后，棄去上清液，將沉淀分散在0.8-1.2mlPH7-7.5的PBS緩沖液中，得到Envision試劑(上述上溶液，這里是試劑，是否可統(tǒng)一為試齊[J)-抗體-膠體金復(fù)合物； 向0.8-1.2ml上述合成的Envision試劑-抗體-膠體金溶液中加入450-550 μ L濃度為8-12mg/ml的鹿糖酶溶液,于3-5°C下攪拌5-7h, 11000-13000rpm離心10_15min后,棄去上清液，所得沉淀分散到0.8-1.2ml含有0.8-1.2wt%牛血清蛋白的pH為7-7.5的PBS緩沖液中，得到Envision試劑-抗體-膠體金-酶復(fù)合物，即為信號(hào)探針； ⑶萊克多巴胺的檢測(cè): 按常規(guī)方法處理待測(cè)樣品，氮?dú)獯蹈珊笥?.8-1.2mL pH7-7.5的PBS緩沖液重分散得到待測(cè)樣品溶液； 將捕獲探針Fe3O4OSiO2-CD分散在含有濃度為0.8-1.2wt%的牛血清蛋白、pH7_7.5的PBS緩沖液，制備成濃度為0.8-1.2mg/mL的捕獲探針分散液； 吸取0.8-1.2mL所述分散液加入到所述的混合溶液中，室溫下振搖1.5-2.5h進(jìn)行吸附，磁性分離后用PBS緩沖液沖洗2-5次；之后加入80-120 μ LEnvision試劑-抗體-膠體金-酶復(fù)合物，室溫下振蕩反應(yīng)25-35min，磁性分離后所得沉淀物用緩沖液清洗后，加入.45-55 μL蔗糖溶液，室溫下反應(yīng)1.5-2.5h后，磁性分離出沉淀后吸取上層清液用血糖儀檢測(cè)，記錄血糖儀的讀數(shù)； (4)將得到的讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，即可得知所檢測(cè)物質(zhì)中萊克多巴胺的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N33/02GK103792328SQ201410015040
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】干寧, 陳思, 曹玉廷, 胡富陶, 李天華, 崔煥 , 張佳斌, 王德, 熊萍 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)