含胰液成分的試樣的調(diào)制方法、以及含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供調(diào)制含胰液成分的試樣的方法，所述含胰液成分的試樣能夠在室溫下穩(wěn)定地儲(chǔ)存含胰液成分的生物試樣中的蛋白質(zhì)、特別是S100P；和適合于該方法的試劑盒。本發(fā)明的特征在于，通過(guò)向含胰液成分的生物試樣中添加至少一種具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿⒑椭辽僖环N作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，從而調(diào)制直至供于S100P的檢測(cè)為止在室溫下能夠儲(chǔ)存的含胰液成分的試樣。
【專利說(shuō)明】含胰液成分的試樣的調(diào)制方法、以及含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及調(diào)制直至供于檢查為止能夠在室溫下穩(wěn)定地儲(chǔ)存胰液中所包含的S100P的儲(chǔ)存用試樣的方法、以及適合于該方法的、含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]體液是用于知曉臟器狀態(tài)的重要的生物試樣。特別是，胰液是對(duì)于早期難發(fā)現(xiàn)、預(yù)后非常差的胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)重要的生物試樣，應(yīng)用于細(xì)胞診斷、碳酸氫鹽測(cè)定、細(xì)菌檢查、包括蛋白質(zhì)、核酸等的標(biāo)記物的檢查等中。另外，近年來(lái)，對(duì)于解析胰液中的蛋白質(zhì)的研究例如胰腺癌等胰臟相關(guān)疾病的新的標(biāo)記物的探索盛行。
[0003]特別是報(bào)告了，作為SlOO蛋白質(zhì)家族的成員的、糖化最終產(chǎn)物受體(receptor foradvanced glycat1n endproducts:RAGE)的S100P,已確認(rèn)非常多地在胰腺癌中被表達(dá),并且參與胰腺癌的增殖.浸潤(rùn)。例如，非專利文獻(xiàn)I中報(bào)告了，S100P作為胰臟早期的致癌標(biāo)記物是有用的，以及胰液中的S100P濃度解析對(duì)于腫瘤和慢性胰腺炎的識(shí)別是有用的。另夕卜，非專利文獻(xiàn)2中報(bào)告了，正常的胰臟導(dǎo)管上皮中沒(méi)有觀察到S100P的表達(dá)，而胰管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤細(xì)胞的全部待檢體中觀察到了 S100P的表達(dá)。S卩，S100P作為胰腺癌的標(biāo)記物是有用的，可以期待通過(guò)測(cè)定胰液中的S100P量而有助于胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、發(fā)展程度的診斷等。
[0004]另一方面，由于胰液是消化液，包含各種各樣的消化酶。已知，這些消化酶在胰臟內(nèi)以非活性的狀態(tài)存在，排出至十二指腸之后進(jìn)行活化。胰液中的消化酶通過(guò)由十二指腸上皮細(xì)胞分泌的小腸腸激酶進(jìn)行分解的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。已知，通過(guò)小腸腸激酶胰液中所包含的胰蛋白酶原被活化而成為胰蛋白酶，進(jìn)而該胰蛋白酶成為誘因，從而胰凝乳蛋白酶原、酯酶原等各種消化酶(蛋白酶)被活化。通過(guò)這些各種蛋白酶的活化，胰液中所包含的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、細(xì)胞等各種生物分子排出至十二指腸后被分解、變性。因此，將排出至十二指腸的胰液作為生物試樣對(duì)該生物試樣中的S100P進(jìn)行定量時(shí)，存在該生物試樣中的S100P受到蛋白酶的影響，不能正確地測(cè)定的擔(dān)心。因此，重要的是怎樣抑制被排出至十二指腸的胰液中的蛋白酶的活性。
[0005]蛋白酶的活性通常依賴于溫度，所以可以認(rèn)為通過(guò)預(yù)先對(duì)從生物體中采集的胰液、十二指腸液進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存直至供于S100P的檢查為止，能夠某種程度抑制儲(chǔ)存期間中的S100P的分解.變性。但是，實(shí)施S100P的檢查作為臨床檢查的情況下，很難說(shuō)所有的醫(yī)療機(jī)關(guān)、檢查機(jī)關(guān)中待檢體的儲(chǔ)存設(shè)備是充分齊備的，考慮到這一點(diǎn)，從生物體采集的胰液、十二指腸液優(yōu)選在供于檢查為止盡可能地在室溫下儲(chǔ)存。因此，將胰液、十二指腸液在室溫下儲(chǔ)存的情況下，和在室溫的溶液狀態(tài)下，為了能夠穩(wěn)定地儲(chǔ)存這些待檢體中所包含的S100P，都需要充分地抑制來(lái)源于胰液、十二指腸液的蛋白酶的活性。
[0006]作為在室溫下儲(chǔ)存含生物體成分的溶液的方法，例如:在臨床檢查的領(lǐng)域中進(jìn)行酶免疫測(cè)定法、放射線免疫測(cè)定法等免疫測(cè)定時(shí)，對(duì)于包含作為測(cè)定對(duì)象的抗原的試樣，作為在溶液的狀態(tài)下防止該試樣中抗原的失活并穩(wěn)定地儲(chǔ)存的方法，有向該試樣中加入酪蛋白或乳清蛋白的方法(例如，參照專利文獻(xiàn)I)。另外，作為用于在室溫下穩(wěn)定地儲(chǔ)存體液的方法，還有:使目標(biāo)體液浸潰于多孔材料中保持有蛋白酶抑制劑的檢查器具之后，使之干燥的方法(例如，參照專利文獻(xiàn)2)。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)平8-5634號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2003-270237號(hào)公報(bào)
[0011]非專利文獻(xiàn)
[0012]非專利文獻(xiàn)1:才才々予夕' (Ohuchida)、其他9名、夕1J 二力卟寸一.')寸一千(Clinical Cancer Research)、2006 年、第 12 卷、第 18 號(hào)、第 5411 ?5416 頁(yè)。
[0013]非專利文獻(xiàn)2: t 力夕(Nakata)、其他 9 名、匕.^ 一 ^ ^."乂口 'y'— (HumanPathology) >2010 年、第 41 卷、第 824 ?831 頁(yè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0015]專利文獻(xiàn)I所述的方法如免疫測(cè)定中所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液等，對(duì)于蛋白酶等夾雜物非常少的試樣是有效的，但對(duì)于如胰液、十二指腸液這樣含有各種大量的蛋白酶的試樣，則不怎么能期待效果。
[0016]另外，專利文獻(xiàn)2所述的方法由于在干燥狀態(tài)下存儲(chǔ)待檢體，所以對(duì)于檢查對(duì)象為肽等利用比較干燥的處理而難以產(chǎn)生變性的物質(zhì)是某種程度有效的；然而對(duì)于以S100P為代表的蛋白質(zhì)，由于干燥處理而立體結(jié)構(gòu)受到影響，存在變性的擔(dān)心。進(jìn)一步，專利文獻(xiàn)2中雖然記載了大量能夠保持于多孔材料的蛋白酶抑制劑，但并沒(méi)有公開(kāi)用于抑制胰液、十二指腸液中的S100P分解的最優(yōu)化的蛋白酶抑制劑的組合。因此，以臨時(shí)省略了進(jìn)行干燥處理的方式即便施用專利文獻(xiàn)2所述的方法而儲(chǔ)存胰液等，也不能得到充分的S100P的室溫儲(chǔ)存效果。
[0017]本發(fā)明目的在于提供:調(diào)制能夠在室溫下穩(wěn)定地儲(chǔ)存胰液、十二指腸液等含胰液成分的生物試樣中的蛋白質(zhì)中的特別是S100P的含胰液成分的試樣的方法、以及適合于該方法的含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒。
[0018]用于解決問(wèn)題的方案
[0019]本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向含胰液成分的生物試樣中組合添加具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑、和特定種類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，即便在室溫下儲(chǔ)存試樣也能夠穩(wěn)定地儲(chǔ)存該生物試樣中所包含的S100P，至此完成了本發(fā)明。
[0020]S卩，本發(fā)明的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法以及含胰液成分的試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒采用下述(I)?(10)的構(gòu)成。
[0021](I) 一種含胰液成分的試樣的調(diào)制方法,其具有如下調(diào)制含胰液成分的試樣的工序:向含胰液成分的生物試樣中添加至少一種具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿?、和至少一種作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，從而調(diào)制含胰液成分的試樣。
[0022](2)根據(jù)前述⑴的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，在前述調(diào)制含胰液成分的試樣的工序之后，進(jìn)而具有在室溫下儲(chǔ)存該含胰液成分的試樣的工序。
[0023](3)根據(jù)前述⑴所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，前述具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┻x自由PMSF、AEBSF, p_APMSF、4_(氟代磺?；?苯甲酸、3_(氟代磺?；?苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟和4-硝基苯磺酰氟組成的組。
[0024](4)根據(jù)前述⑴或(2)的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，作為前述具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿?，使用選自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組中的兩種以上的化合物。
[0025](5)根據(jù)前述⑴?(3)中的任一項(xiàng)的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，前述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑為TLCK。
[0026](6)根據(jù)前述⑴的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，在前述含胰液成分的試樣的調(diào)制工序中，作為具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿宰罱K濃度分別為ImM以上、4mM以上、2mM以上的方式添加PMSF、AEBSF或p-APMSF ;作為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，以最終濃度為0.1mM以上的方式添加TLCK。
[0027](7)根據(jù)前述⑴?(5)中的任一項(xiàng)的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，前述生物試樣為胰液或十二指腸液。
[0028](8) 一種含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其包括:至少一種具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑；至少一種作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。
[0029](9)根據(jù)前述(8)的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其中，前述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑為選自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組的一種以上的化合物。
[0030](10)根據(jù)前述(8)或(9)的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其中，前述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑為TLCK。
[0031](11)根據(jù)前述⑶?(10)中的任一項(xiàng)的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其進(jìn)而包括儲(chǔ)存用容器，所述儲(chǔ)存用容器具備用于貯存所采集的體液的貯存部；前述貯存部中預(yù)先填充有前述具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖颓笆鲆鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑。
[0032]發(fā)明的效果
[0033]通過(guò)本發(fā)明的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，可以調(diào)制出能夠充分抑制該生物試樣中所包含的S100P的分解?變性并且在室溫下穩(wěn)定地儲(chǔ)存含胰液成分的生物試樣的儲(chǔ)存用試樣。即，可以期待通過(guò)更穩(wěn)定地儲(chǔ)存非常容易被分解的胰液中的蛋白質(zhì)，能夠提供質(zhì)量高的試樣，進(jìn)而有助于加快胰腺癌的研究。特別是，由于能夠調(diào)制在室溫下能夠儲(chǔ)存的試樣，所以本發(fā)明的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法也可以期待廣泛地應(yīng)用于臨床檢查。
[0034]另外，通過(guò)使用本發(fā)明的含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，能夠更簡(jiǎn)便地從由生物體采集的胰液、十二指腸液調(diào)制能夠室溫儲(chǔ)存的S100P檢查用的生物試樣。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為表示PMSF、AEBSF和p-APMSF的化學(xué)式的圖。
[0036]圖2為表示參考例I中各胰酶溶液的蛋白酶活性(相對(duì)值:％ )的結(jié)果的圖。
[0037]圖3為表示參考例2中各試樣溶液中的S100P量的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0038]圖4為表示實(shí)施例1中各試樣溶液中的S100P量的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0039]圖5為表示參考例3中各試樣溶液中的S100P量的測(cè)定結(jié)果的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0040]胰液是指由胰管排出的體液。本發(fā)明和本說(shuō)明書(shū)中，含胰液成分的生物試樣是指包含含有來(lái)源于胰液的成分的體液的試樣。作為含有來(lái)源于胰液的成分的體液，可列舉出:由胰臟通過(guò)導(dǎo)管直接采集的胰液、由十二指腸采集的液體(十二指腸液)等。十二指腸液中除了胰液還包含同樣地被乳頭部排出的膽汁、原本存在于十二指腸的液體、血液等。需要說(shuō)明的是，胰液、十二指腸液可以通過(guò)常規(guī)方法采集。
[0041]<含胰液成分的試樣的調(diào)制方法>
[0042]本發(fā)明的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法(以下，有時(shí)稱為“本發(fā)明的調(diào)制方法”)為調(diào)制含胰液成分的生物試樣的方法，使得即便在室溫下，也能夠抑制該生物試樣中包含的成分中特別是S100P的分解.變性并穩(wěn)定地儲(chǔ)存。即，本發(fā)明的調(diào)制方法的特征在于，其具有如下調(diào)制含胰液成分的試樣的工序:向含胰液成分的生物試樣中添加至少一種具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑、和至少一種作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，從而調(diào)制含胰液成分的試樣；進(jìn)而根據(jù)需要具有在室溫下儲(chǔ)存該試樣直至供于S100P的檢測(cè)為止的工序。
[0043]胰液、十二指腸液等含胰液成分的生物試樣中，除了作為檢查對(duì)象的蛋白質(zhì)(本發(fā)明的調(diào)制方法中，S100P)之外，還包含有大量的蛋白酶，所以在室溫下儲(chǔ)存該生物試樣的情況下，由于蛋白酶的影響，目標(biāo)蛋白質(zhì)分解?變性。因此，對(duì)于室溫儲(chǔ)存后的生物試樣進(jìn)行檢查的情況下，存在如下問(wèn)題:剛從生物體采集后，即便是包含有該蛋白質(zhì)的生物試樣，在檢查中也不能檢測(cè)到該蛋白質(zhì)，檢查精度降低。與此相對(duì)，通過(guò)本發(fā)明的調(diào)制方法調(diào)制含胰液成分的生物試樣，即便在室溫的溶液狀態(tài)下，也能夠有效地抑制來(lái)源于該生物試樣的蛋白酶的活性，能夠飛躍地提高S100P的穩(wěn)定性。即，通過(guò)利用本發(fā)明的調(diào)制方法得到的含胰液成分的試樣即便在室溫儲(chǔ)存后也會(huì)為一向沒(méi)有的高品質(zhì)，適合于要求高的精度的S100P檢查(用于檢測(cè)S100P的檢查)。
[0044]具體而言，本發(fā)明的調(diào)制方法中，向含胰液成分的生物試樣中添加至少一種具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑、和至少一種作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑(以下，有時(shí)稱為“特定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑”。)，從而調(diào)制含胰液成分的試樣。通過(guò)組合使用具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，盡管在室溫的溶液中也能夠有效地抑制S100P的分解.變性。
[0045]如后述參考例I所示，利用對(duì)于TLCK (N-a-甲苯磺酰基_L_賴氨酸氯甲基酮)等胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶具有抑制活性的氨基酸氯甲基酮類的、抑制胰液、十二指腸液中的蛋白酶的活性的效果，只與卡莫司他、FOY是相同程度的，極大地低于亮肽素等其他常用的蛋白酶抑制劑。盡管如此，通過(guò)組合使用具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿?、和TLCK等作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠得到非常優(yōu)異的S100P的室溫穩(wěn)定性提高效果，該效果是組合使用具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┡c亮肽素等其他的蛋白酶抑制劑時(shí)觀察不到的。本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)了應(yīng)令人吃驚的以下發(fā)現(xiàn):組合使用具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖妥鳛榘被崧燃谆惖囊鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑，對(duì)于室溫下的SlOOP的穩(wěn)定性提高是特別有效的。
[0046]本發(fā)明的調(diào)制方法中使用的具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┲灰蔷哂蟹酋；揖哂械鞍酌敢种苹钚缘幕衔铮瑒t沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選為具有與苯環(huán)直接鍵合的結(jié)構(gòu)或者具有通過(guò)碳原子數(shù)I?6的烴基鍵合有氟化磺?；慕Y(jié)構(gòu)的化合物，優(yōu)選為PMSF (苯甲基磺酰氟)、AEBSF (4- (2-氨基乙基)-苯磺酰氟))、p-APMSF (對(duì)脒基苯基甲烷磺酰氟鹽酸鹽)、4-(氟代磺酰基)苯甲酸(CAS號(hào):455-26-5)、3-(氟代磺?；?苯甲酸(CAS號(hào):454-95-5)、2_氨基苯磺酰氟(CAS號(hào):392-86-9)、3_氨基苯磺酰氟(CAS號(hào):368-50-3)、4-氨基苯磺酰氟(CAS號(hào):98-62-4)、2_硝基苯磺酰氟(CAS號(hào):433_98_7)、3_硝基苯磺酰氟(CAS號(hào):349-78-0)或4-硝基苯磺酰氟(CAS號(hào):349_96_2)，更優(yōu)選為PMSF、AEBSF或p-APMSF。圖1中示出PMSF、AEBSF和p-APMSF的化學(xué)式。圖1中，被虛線包圍的官能團(tuán)為氟化磺?；?。
[0047]本發(fā)明的調(diào)制方法中使用的具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┛梢詾镮種，也可以組合使用2種以上。特別還優(yōu)選使用選自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組中的至少I種化合物，更優(yōu)選使用選自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組中的2種以上化合物，還可以使用全部3種。由于胰液中包含活性不同的各種蛋白酶，所以通過(guò)混合使用多種蛋白酶抑制劑，可以期待能夠更切實(shí)地抑制生物試樣中的蛋白酶活性。進(jìn)而，相比于單獨(dú)使用的情況，可以期待能夠通過(guò)以低的濃度組合抑制蛋白酶活性。
[0048]對(duì)于添加至含胰液成分的生物試樣中的具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┑牧?，只要是能發(fā)揮出利用該蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制效果和S100P的室溫穩(wěn)定性提高效果的量，則沒(méi)有特別的限定，可以考慮含胰液成分的生物試樣的種類、使用的蛋白酶抑制劑的種類等適宜調(diào)整。例如，向含胰液成分的生物試樣中只添加作為具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┑腜MSF的情況下，可以以最終濃度為ImM以上、優(yōu)選為5mM以上、更優(yōu)選為1mM以上的方式進(jìn)行添加。另外，只使用作為具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┑腁EBSF的情況下，可以向含胰液成分的生物試樣中添加AEBSF以使最終濃度為4mM以上、優(yōu)選為1mM以上、更優(yōu)選為20mM以上。只使用作為具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┑膒-APMSF的情況下，可以向含胰液成分的生物試樣中添加AEBSF以使最終濃度為2mM以上、優(yōu)選為5mM以上、更優(yōu)選為1mM以上。
[0049]本發(fā)明的調(diào)制方法中所使用的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，只要是氨基酸氯甲基酮類、且對(duì)于以胰蛋白酶為代表的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶具有抑制活性的化合物，則沒(méi)有特別地限定。本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用TLCK。
[0050]對(duì)于添加至含胰液成分的生物試樣中的特定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑的量，只要是利用該蛋白酶抑制劑發(fā)揮出蛋白酶抑制效果和S100P的室溫穩(wěn)定性提高效果的量，則沒(méi)有特別地限定，可以考慮含胰液成分的生物試樣的種類、使用的蛋白酶抑制劑的種類等適宜調(diào)整。例如，向含胰液成分的生物試樣中只添加作為特定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑的TLCK的情況下，可以以最終濃度為0.1mM以上、優(yōu)選為ImM以上、更優(yōu)選為5mM以上、進(jìn)而優(yōu)選為1mM以上的方式進(jìn)行添加。
[0051]本發(fā)明的調(diào)制方法中，向含胰液成分的生物試樣中添加的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑和前述特定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以為粉末狀、顆粒狀等固體狀；也可以為溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液等中的蛋白酶抑制劑溶液。另外，具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖颓笆鎏囟ǖ囊鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑，可以同時(shí)向含胰液成分的生物試樣中添加，也可以先行添加其中的任一者，之后添加另一者。從充分地發(fā)揮本發(fā)明的S100P的室溫穩(wěn)定性提高效果的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選同時(shí)添加具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖颓笆鎏囟ǖ囊鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑。
[0052]本發(fā)明的調(diào)制方法中，可以向含胰液成分的生物試樣中只添加具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖颓笆鎏囟ǖ囊鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑，也可以進(jìn)一步添加其他的蛋白酶抑制劑。作為其他的蛋白酶抑制劑，只要是不有損本發(fā)明的S100P的室溫穩(wěn)定性提高效果的物質(zhì)，則沒(méi)有特別地限定；可列舉出例如:抑肽酶、亮肽素、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性酶抑制劑、抗凝血酶等肽系蛋白酶抑制劑、EDTA等螯合劑、彈性蛋白酶抑制劑(Elastase Inhibitor)、胰蛋白酶抑制劑、大腸桿菌素即Ecotin (E.coli,大腸桿菌)等。另外，也可以使用甲磺酸加貝酯(FOY)、甲磺酸卡莫司他(卡莫司他)、甲磺酸萘莫司他(Futhan)、烏司他丁等胰腺炎治療藥。
[0053]供于本發(fā)明的調(diào)制方法的含胰液成分的生物試樣，只要為包含含有來(lái)源于胰液的成分的體液的試樣即可，可以為只包含含有來(lái)源于胰液成分的體液的試樣，也可以為將該體液用適當(dāng)?shù)木彌_液等稀釋而成的液體，還可以為向該體液或其稀釋液中添加了各種添加劑而成的試樣。作為添加劑，可列舉出:表面活性劑、核酸分解酶抑制劑、pH調(diào)節(jié)劑、pH指示劑等。作為供于本發(fā)明的調(diào)制方法的含胰液成分的生物試樣，優(yōu)選為包含胰液或十二指腸液的試樣。具體而言，可列舉出:胰液、十二指腸液、胰液或十二指腸液的稀釋液、或者向其中加入了前述各種添加劑的液體等。
[0054]本發(fā)明的調(diào)制方法中，也可以向從生物體中采集之后進(jìn)行了儲(chǔ)存等的含胰液成分的生物試樣中添加具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖妥鳛榘被崧燃谆惖囊鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑；然而從生物體中采集含胰液成分的體液的時(shí)刻起至添加這些蛋白酶抑制劑的時(shí)刻為止的間隔優(yōu)選短，特別優(yōu)選在從生物體中剛采集后的胰液或十二指腸液中添加這些蛋白酶抑制劑。這是由于，包含胰液的生物試樣由于所含有的蛋白酶的功能非常強(qiáng)，剛采集后開(kāi)始蛋白質(zhì)的分解加劇，所以優(yōu)選進(jìn)一步縮短采集的生物試樣與前述蛋白酶抑制劑混合為止的時(shí)滯。例如，通過(guò)預(yù)先向設(shè)置于用于從生物體采集胰液或十二指腸液的采集工具的貯存部(用于貯存所采集的體液的容器樣構(gòu)件)內(nèi)填充具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖妥鳛榘被崧燃谆惖囊鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑，由生物體采集的胰液或十二指腸液在回收容器內(nèi)直接與蛋白酶抑制劑混合。另外，采集工具不具有貯存部而采集工具與作為貯存部的儲(chǔ)存用容器連接的情況下，預(yù)先向該儲(chǔ)存用容器內(nèi)填充具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑和作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。
[0055]本發(fā)明的調(diào)制方法中，為了抑制來(lái)源于胰液的成分中的特別是S100P的分解.變性，使用最適的蛋白酶抑制劑的組合，所以通過(guò)該方法調(diào)制的含胰液成分的試樣所包含的S100P,即便在室溫下也能夠前所未有地穩(wěn)定地儲(chǔ)存。由此，通過(guò)利用本發(fā)明的調(diào)制方法調(diào)制的含胰液成分的試樣進(jìn)行S100P檢查，該含胰液成分的試樣即便在室溫下儲(chǔ)存直至供于S100P檢查為止，也能夠得到充分的檢查精度。需要說(shuō)明的是，通過(guò)本發(fā)明的調(diào)制方法調(diào)制的含胰液成分的試樣，通過(guò)室溫儲(chǔ)存能夠充分地發(fā)揮其效果，但也可以進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存、冷藏儲(chǔ)存等。
[0056]對(duì)于通過(guò)本發(fā)明的調(diào)制方法調(diào)制的含胰液成分的試樣進(jìn)行的S100P檢查，只要是以S100P的檢測(cè)或定量為目的的檢查，則沒(méi)有特別地限定?？梢酝ㄟ^(guò)例如:應(yīng)用了 ELISA、免疫層析、二維電泳、免疫印跡(Western blot)、質(zhì)譜分析法等的各種蛋白質(zhì)解析,應(yīng)用了PCR、RT-PCR、使用了探針的雜交等的各種核酸解析，細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)、細(xì)胞診斷這樣的細(xì)胞解析等檢測(cè)SI OOP。
[0057]需要說(shuō)明的是，可以期待本發(fā)明的調(diào)制方法對(duì)于S100P以外的來(lái)源于胰液的成分，也能夠提高室溫穩(wěn)定性。因此，通過(guò)本發(fā)明的調(diào)制方法調(diào)制的含胰液成分的試樣可以作為用于針對(duì)含胰液成分試樣中的、S100P以外的成分的各種檢查的測(cè)定試樣而使用。作為檢查對(duì)象的物質(zhì)，只要是可以期待包含于胰液或十二指腸液的生物體成分，則沒(méi)有特別地限定，可以為蛋白質(zhì)，也可以為DNA、RNA等核酸，還可以為細(xì)胞。例如，該含胰液成分的試樣可以應(yīng)用于:應(yīng)用了 ELISA、免疫層析、二維電泳、免疫印跡、質(zhì)譜分析法等的各種蛋白質(zhì)解析，應(yīng)用了 PCR、RT-PCR、使用了探針的雜交等的各種核酸解析，細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)、細(xì)胞診斷這樣的細(xì)胞解析等中。
[0058]<含胰液成分的生物試樣的儲(chǔ)存用試劑盒>
[0059]本發(fā)明的含胰液成分的生物試樣的儲(chǔ)存用試劑盒(以下，有時(shí)稱為“本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒”)的特征在于，其具有:至少一種具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿⒑椭辽僖环N作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。通過(guò)向含胰液成分的生物試樣中添加該儲(chǔ)存用試劑盒所具備的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑和特定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠在直至供于S100P的檢測(cè)為止的期間內(nèi)，更簡(jiǎn)便地調(diào)制能夠在室溫下儲(chǔ)存的含胰液成分的試樣。
[0060]本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒中所包括的具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┛梢灾挥幸环N，也可以組合兩種以上。本發(fā)明中，優(yōu)選使用選自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組中的一種以上的化合物，更優(yōu)選使用選自由這些化合物組成的組中的兩種以上的化合物。同樣地，本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒所包括的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑可以只使用I種，也可以組合2種以上。本發(fā)明中，優(yōu)選使用TLCK作為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。
[0061]另外，本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒所包括的各種蛋白酶抑制劑可以為冷凍干燥粉末，也可以為將冷凍干燥粉末與適當(dāng)?shù)馁x形劑等一起成型而成的片劑或顆粒劑等，還可以為溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中而成的蛋白酶抑制劑溶液。
[0062]本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒也可以進(jìn)而包括:用于稀釋所采集的體液的緩沖液、其他的蛋白酶抑制劑、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、pH指示劑等。表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、pH指示劑等各種添加劑也可以預(yù)先溶解于稀釋用的緩沖液中。除此之外，本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒也可以包括蓋，所述蓋能夠由填充有該含胰液成分的試樣的容器滴加一定量所調(diào)制的含胰液成分的試樣(向含胰液成分的生物試樣中添加本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒所包括的各種蛋白酶抑制劑、根據(jù)需要添加其他的成分而成的樣品)、且能夠與該容器的開(kāi)口部連接。
[0063]本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒也可以包括儲(chǔ)存用容器，所述儲(chǔ)存用容器具備用于貯存由生物體采集的胰液或十二指腸液等體液的貯存部。該情況下，優(yōu)選該貯存部中預(yù)先包含本發(fā)明的蛋白酶抑制劑。該儲(chǔ)存用容器刻有刻度的情況下，能夠以目視確認(rèn)添加至該儲(chǔ)存用容器中的生物試樣的量(該儲(chǔ)存容器內(nèi)預(yù)先填充有蛋白酶抑制劑的情況下，為生物試樣和蛋白酶抑制劑的總量)，進(jìn)而能夠一眼知道蛋白酶抑制劑的終濃度。
[0064]另外，含胰液成分的生物試樣通常經(jīng)內(nèi)窺鏡采集。因此，作為本發(fā)明的儲(chǔ)存用試劑盒的構(gòu)成品，也可以包括經(jīng)內(nèi)窺鏡采集含胰液成分的生物試樣的采集工具。作為該采集工具，有例如:能夠插入至內(nèi)窺鏡裝置中的導(dǎo)管與注射器組合而成的工具，能夠插入至內(nèi)窺鏡裝置中的前端具備吸收體的探針等。作為能夠插入至內(nèi)窺鏡裝置中的導(dǎo)管，可列舉出例如:日本特開(kāi)2011-5009號(hào)公報(bào)中記載的標(biāo)本采集立方體(cube)等。作為這些采集工具，優(yōu)選具有預(yù)先分注了前述蛋白酶抑制劑的貯存部。另外，該貯存部能夠拆卸的情況下，也可以作為儲(chǔ)存容器使用。
[0065]實(shí)施例
[0066]接著，示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明更具體地說(shuō)明，但本發(fā)明不受以下的實(shí)施例限定。
[0067][參考例I]
[0068]已知，胰液中的消化酶中，作為其分解級(jí)聯(lián)的觸發(fā)物的酶為絲氨酸蛋白酶。因此，首先，篩選對(duì)于胰液中所包含的蛋白酶抑制效果高的絲氨酸蛋白酶抑制劑。
[0069]具體而言，從市售的蛋白酶抑制劑中，尋找以絲氨酸蛋白酶作為靶標(biāo)，對(duì)于胰液抑制效果高的抑制劑。所使用的蛋白酶抑制劑有:抑肽酶(Roche公司制)、亮肽素(Roche公司制)、PMSF (Roche公司制)、AEBSF (Roche公司制)、p_APMSF (SIGMA公司制)、甲磺酸卡莫司他(卡莫司他；和光純藥公司制)、甲磺酸加貝酯(F0Y ;和光純藥公司制)、TLCK(SIGMA公司制)、TPCK(SIGMA公司制)。需要說(shuō)明的是，TPCK為對(duì)于胰凝乳蛋白酶具有抑制活性、而對(duì)于胰蛋白酶沒(méi)有表現(xiàn)出抑制活性的氨基酸氯甲基酮類。
[0070]使用胰酶以活化的狀態(tài)存在的由豬的胰臟制成的消化酶劑即“Pancreatin”作為模擬人工胰液，以最終濃度為制造商建議濃度范圍的方式添加各蛋白酶抑制劑，之后測(cè)定蛋白酶活性。蛋白酶活性使用EnzCheck Protease Assay Kits (Molecular Probes公司制)進(jìn)行測(cè)定。具體而言，向添加了各蛋白酶抑制劑的Pancreatin溶液中添加試劑盒附帶的被熒光標(biāo)記的酪蛋白，在37°C下進(jìn)行2小時(shí)孵育之后，在Ex/Em = 485/535nm的熒光波長(zhǎng)下測(cè)定熒光量。另外，作為對(duì)照，對(duì)于向Pancreatin中添加了直接被熒光標(biāo)記的酪蛋白而成的試樣溶液(無(wú)抑制劑)，也同樣地測(cè)定蛋白酶活性。
[0071]將各Pancreatin溶液的突光量的測(cè)定結(jié)果示于圖2中。縱軸的突光量表示分解了酪蛋白的量，將該值作為蛋白酶活性的值進(jìn)行估算。橫軸表示向各Pancreatin溶液中添加的蛋白酶抑制劑及其最終濃度。由該結(jié)果可知，PMSF、AEBS和p-APMSF與其他的蛋白酶抑制劑相比較，抑制效果非常高。它們均為具有氟化磺?；捻肯祷衔铩?br> [0072][參考例2]
[0073]著眼于由參考例I可知對(duì)于胰液中的消化酶的抑制效果高的砜系化合物，調(diào)查各種砜系化合物對(duì)于作為胰腺癌的標(biāo)記物蛋白質(zhì)已知的S100P(鈣結(jié)合蛋白質(zhì))在胰液中的室溫穩(wěn)定性的效果。即，使用4種人臨床待檢體的胰液，添加了 S100P的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)之后，調(diào)查室溫儲(chǔ)存前后S100P濃度是否變化。
[0074]具體而言，首先，調(diào)制:各人臨床待檢體中混合了 25ng/mL的S100P (標(biāo)準(zhǔn)品)溶液的試樣溶液(試樣溶液1:無(wú)抑制劑)、向試樣溶液I中添加了 AEBSF (最終濃度:4mM)的試樣溶液(試樣溶液2 =AEBSF)、向試樣溶液I中添加了 AEBSF(最終濃度:4mM)和PMSF(最終濃度:lmM)的試樣溶液(試樣溶液3:AEBSF+PMSF)。各試樣溶液使用CircuLex SlOOPELISA Kit (Cyclex公司制、目錄號(hào):CY-8060)附帶的緩沖液進(jìn)行調(diào)制。通過(guò)將這些試樣溶液在25°C下進(jìn)行16小時(shí)孵育而使之反應(yīng)(室溫儲(chǔ)存)。之后，對(duì)于將各試樣溶液使用CircuLex S100P ELISA Kit (Cyclex公司制、目錄號(hào):CY_8060)附帶的緩沖液進(jìn)行了 10倍稀釋的稀釋液，使用CircuLex S100P ELISA KU，進(jìn)行S100P的檢測(cè)。作為對(duì)照，對(duì)于剛調(diào)制后(即，室溫儲(chǔ)存前)的試樣溶液1，也同樣地，進(jìn)行S100P的檢測(cè)。
[0075]將測(cè)定結(jié)果示于圖3中?？v軸表示S100P濃度，橫軸表示試樣溶液I在室溫儲(chǔ)存前(圖中，“室溫儲(chǔ)存前”)、以及試樣溶液I?3的室溫儲(chǔ)存后(圖中，“無(wú)抑制劑”、“AEBSF”、“AEBSF+PMSF”)。通過(guò)室溫儲(chǔ)存，沒(méi)有添加蛋白酶抑制劑的試樣溶液I中，所有的胰液待檢體的S100P幾乎都分解了。與此相對(duì)，添加了蛋白酶抑制劑的試樣溶液2和3中，所有的胰液待檢體均檢測(cè)到S100P ;特別是添加了 AEBSF和PMSF兩者的試樣溶液3中，較高地維持了 S100P濃度。由這些結(jié)果可知，通過(guò)將具有氟化磺?；捻肯祷衔锘旌现辽僖环N以上、優(yōu)選為兩種以上，胰液中的S100P即便在室溫下也會(huì)更穩(wěn)定。
[0076][實(shí)施例1]
[0077]為了檢測(cè)人胰液待檢體中原本含有的S100P而不是人工添加的標(biāo)準(zhǔn)品，只添加具有氟化磺?；捻肯祷衔锸遣怀浞值?。因此，為了以進(jìn)一步提高S100P的儲(chǔ)存性能，通過(guò)具有氟化磺?；捻肯祷衔锱c作為其他砜系化合物的TLCK是否組合使用來(lái)調(diào)查S100P的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是否受到影響。使用7種人臨床待檢體。
[0078]具體而言，調(diào)制:對(duì)各人臨床待檢體添加了 AEBSF(最終濃度:4mM)的試樣溶液(試樣溶液1:AEBSF)，對(duì)各人臨床待檢體添加了 AEBSF(最終濃度:4mM)和PMSF(最終濃度:lmM)的試樣溶液(試樣溶液2:AEBSF+PMSF)，對(duì)各人臨床待檢體添加了 AEBSF (最終濃度:4mM)、PMSF(最終濃度:lmM)和抑肽酶(最終濃度:3μΜ)的試樣溶液(試樣溶液3:AEBSF+PMSF+抑肽酶(Aprotinin))，對(duì)各人臨床待檢體添加了 AEBSF (最終濃度:4mM)、PMSF(最終濃度:lmM)和TPCK(最終濃度:lmM)的試樣溶液(試樣溶液4:AEBSF+PMSF+TPCK)，對(duì)各人臨床待檢體添加了 AEBSF (最終濃度:4mM)、PMSF (最終濃度:ImM)和TLCK (最終濃度:lmM)的試樣溶液(試樣溶液5:AEBSF+PMSF+TLCK)。各試樣溶液使用附屬于CircuLex S100P ELISA Kit (Cyclex公司制、目錄號(hào):CY-8060)的緩沖液進(jìn)行調(diào)制。通過(guò)使這些試樣溶液在25°C下進(jìn)行16小時(shí)孵育使之反應(yīng)之后(室溫儲(chǔ)存后)，與參考例2同樣地進(jìn)行S100P的檢測(cè)。
[0079]另外，作為對(duì)照，代替室溫儲(chǔ)存進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存，除此以外，與上述同樣地，由相同人臨床待檢體調(diào)制試樣溶液I?5，對(duì)于這些試樣溶液，與參考例2同樣地，進(jìn)行S100P的檢測(cè)。
[0080]將測(cè)定結(jié)果示于圖4中?？v軸表示S100P濃度，橫軸表示針對(duì)人胰液待檢體I ?7 的試樣溶液 I ?5(圖中，“AEBSF”、“AEBSF+PMSF”、“AEBSF+PMSF+Aprotinin”、“AEBSF+PMSF+TPCK”、“AEBSF+PMSF+TLCK”)。另外，圖中，分別地，“FT”表示冷凍儲(chǔ)存后并且沒(méi)有室溫儲(chǔ)存情況下的結(jié)果；“25°C、16h”表示在25°C下進(jìn)行16小時(shí)孵育后(室溫儲(chǔ)存后)情況下的結(jié)果。結(jié)果，進(jìn)行了冷凍儲(chǔ)存的試樣溶液，無(wú)論添加的蛋白酶抑制劑的種類，所有的人胰液待檢體中，無(wú)論量的多寡均檢測(cè)到S100P。與此相對(duì)，可知，只添加了 AEBSF的試樣溶液1、添加了 AEBSF和PMSF的試樣溶液2中，盡管所有的人胰液待檢體中均檢測(cè)到了S100P，但與進(jìn)行了冷凍儲(chǔ)存的情況相比較，其量非常少，室溫儲(chǔ)存中大部分的SlOOP發(fā)生分解?變性。與此相對(duì)，添加了 AEBSF、PMSF和TLCK的試樣溶液5中，所有的人胰液待檢體表現(xiàn)了進(jìn)行了冷凍儲(chǔ)存的情況的約70%以上的S100P濃度的剩余率。另一方面，向AEBSF和PMSF中添加了抑肽酶的試樣溶液3、向AEBSF和PMSF中添加了 TPCK的試樣溶液4，都沒(méi)有表現(xiàn)出如添加了 AEBSF、PMSF和TLCK的試樣溶液5那樣高的剩余率。由這些結(jié)果可知，通過(guò)組合使用至少一種以上的具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿?、和TLCK等具有胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制活性的氨基酸氯甲基酮類，即便在室溫下也能夠非常穩(wěn)定地儲(chǔ)存胰液中的S100P。
[0081][參考例3]
[0082]將蛋白酶抑制劑對(duì)于模擬人工胰液中的S100P的儲(chǔ)存穩(wěn)定性、和蛋白酶抑制劑對(duì)于人臨床待檢體中的S100P的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的效果進(jìn)行比較。作為含S100P的模擬人工胰液，使用向胰酶溶液中以成為25ng/mL的方式添加了 S100P (標(biāo)準(zhǔn)品)的溶液。
[0083]具體而言,首先,調(diào)制:實(shí)施例1中使用的人臨床待檢體兩種(人胰液待檢體I和2)和模擬人工胰液中分別混合了 25ng/mL的S100P (標(biāo)準(zhǔn)品)溶液的試樣溶液(試樣溶液1:無(wú)抑制劑)，向試樣溶液I中添加了 AEBSF(最終濃度:4mM)的試樣溶液(試樣溶液2:AEBSF)，向試樣溶液I中添加了 AEBSF (最終濃度:4mM)和PMSF (最終濃度:lmM)的試樣溶液(試樣溶液3:AEBSF+PMSF)，向試樣溶液I中添加了 AEBSF (最終濃度:4mM)、PMSF (最終濃度:lmM)和TLCK (最終濃度:lmM)的試樣溶液(試樣溶液4:AEBSF+PMSF+TLCK)。各試樣溶液使用CircuLex S100P ELISA Kit (Cyclex公司制、目錄號(hào):CY-8060)所附帶的緩沖液進(jìn)行調(diào)制。通過(guò)使這些試樣溶液在25°C下進(jìn)行16小時(shí)孵育使之反應(yīng)之后(室溫儲(chǔ)存后)，與參考例2同樣地進(jìn)行S100P的檢測(cè)。
[0084]另外，作為對(duì)照，對(duì)于與前述同樣調(diào)制的試樣溶液1，代替室溫儲(chǔ)存進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存之后，立即與參考例2同樣地進(jìn)行S100P的檢測(cè)。
[0085]將測(cè)定結(jié)果示于圖5中。縱軸表示S100P濃度；橫軸表示對(duì)應(yīng)于人胰液待檢體1、2、和含S100P模擬人工胰液的試樣溶液I?4(圖中為“無(wú)抑制劑”、“AEBSF”、“AEBSF+PMSF”、“AEBSF+PMSF+TLCK”)。另外，圖中，分別地，“FT”表示冷凍儲(chǔ)存后并且沒(méi)有室溫儲(chǔ)存情況下的結(jié)果；“25°C、16h”表示25°C下進(jìn)行16小時(shí)孵育后(室溫儲(chǔ)存后)情況下的結(jié)果。結(jié)果，冷凍儲(chǔ)存的試樣溶液中，人胰液待檢體與胰酶溶液的任一者均檢測(cè)到添加的S100P。另一方面，對(duì)于室溫儲(chǔ)存后的試樣溶液，無(wú)論是否添加蛋白酶抑制劑、種類，胰酶溶液中完全檢測(cè)不到S100P。另外，對(duì)于人胰液待檢體I和2，添加了 AEBSF或AEBSF和PMSF的試樣溶液2和3，S100P的檢測(cè)量比沒(méi)有添加蛋白酶抑制劑的試樣溶液I多，由于添加的蛋白酶抑制劑，可見(jiàn)S100P的室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性有所改善。與此相對(duì)，人胰液待檢體I和2的兩者，與實(shí)施例1的結(jié)果不同，添加了 AEBSF、PMSF和TLCK的試樣溶液3，S100P的檢測(cè)量比沒(méi)有添加TLCK的試樣溶液2或3明顯少。由這些結(jié)果可知，雖然理由不明確，但通過(guò)組合使用AEBSF等具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖蚑LCK等作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，S100P的室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性效果對(duì)于由生物體采集的胰液、十二指腸液等生物試樣中本來(lái)就含有的S100P(內(nèi)源性的S100P)發(fā)揮出來(lái)了，但是對(duì)于后添加的S100P(外源的S100P)則沒(méi)有發(fā)揮出該效果。
[0086]產(chǎn)業(yè)上的可利用件
[0087]本發(fā)明的調(diào)制方法和本發(fā)明的室溫儲(chǔ)存用試劑盒能夠在室溫下穩(wěn)定地儲(chǔ)存胰液、十二指腸液等生物試樣中的蛋白質(zhì)特別是S100P，所以能夠利用于解析胰液中的S100P的領(lǐng)域、特別是用于胰腺癌的診斷.治療的臨床檢查等領(lǐng)域中。
【權(quán)利要求】
1.一種含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其具有如下調(diào)制含胰液成分的試樣的工序: 向含胰液成分的生物試樣中添加至少一種具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿⒑椭辽僖环N作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，從而調(diào)制含胰液成分的試樣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，在所述調(diào)制含胰液成分的試樣的工序后，進(jìn)而具有在室溫下儲(chǔ)存該含胰液成分的試樣的工序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，所述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑選自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟代磺?；?苯甲酸、3_(氟代磺?；?苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟和4-硝基苯磺酰氟組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，作為所述具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿?，使用選自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組中的兩種以上的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑為TLCK。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，在所述含胰液成分的試樣的調(diào)制工序中，作為具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制劑，以最終濃度分別為ImM以上、4mM以上、2mM以上的方式添加PMSF、AEBSF或p-APMSF ;作為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制齊U，以最終濃度為0.1mM以上的方式添加TLCK。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含胰液成分的試樣的調(diào)制方法，其中，所述生物試樣為胰液或十二指腸液。
8.一種含胰液成分的生物試樣的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其包括: 至少一種具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿?，和 至少一種作為氨基酸氯甲基酮類的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其中，所述具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿檫x自由PMSF、AEBSF和p-APMSF組成的組的一種以上的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的室溫儲(chǔ)存用試劑盒，其中，所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑為TLCK。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的室溫儲(chǔ)存用試劑盒， 其進(jìn)而包括儲(chǔ)存用容器，所述儲(chǔ)存用容器具備用于貯存所采集的體液的貯存部， 所述貯存部中預(yù)先填充有所述具有氟化磺?；牡鞍酌敢种苿┖退鲆鹊鞍酌笜咏z氨酸蛋白酶抑制劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104395749SQ201380032761
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月22日
【發(fā)明者】片岡理惠, 守屋奈緒, 佐貫博美 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社