利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法，包括如下步驟：利用納米等離子體激元材料和核酸適體制備納米等離子體激元探針；處理基底并利用該基底獲取潛指紋；將所述納米等離子體激元探針滴加于已獲取潛指紋的基底上，使得所述潛指紋與所述納米等離子體激元探針結(jié)合；利用暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供的指紋分析方法不僅能夠?qū)撝讣y進(jìn)行成像，而且能夠同時(shí)檢測(cè)指紋中所攜帶的化學(xué)分析物。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的是一種簡(jiǎn)單快速的方法，可以對(duì)指紋樣品進(jìn)行直接的無(wú)損分析。
【專利說(shuō)明】利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及指紋分析檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]指紋分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域中。但迄今為止，在實(shí)際應(yīng)用中，由于潛指紋不易被肉眼所見(jiàn)，但卻是在犯罪現(xiàn)場(chǎng)留下的極為重要、有效的證據(jù)，因而在法醫(yī)調(diào)查中具有重要意義。但到目前為止，指紋分析技術(shù)僅僅局限于以指紋特征來(lái)確認(rèn)個(gè)人身份這一環(huán)節(jié)。而由于對(duì)潛指紋的處理程序復(fù)雜而條件嚴(yán)苛，所需儀器體積龐大且價(jià)值貴重，直接檢測(cè)人的潛指紋中所攜帶的爆炸物、麻醉藥品等化學(xué)分析物還停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。因此，發(fā)展一種簡(jiǎn)單的、快速的、直接的、無(wú)損的、便攜的、廉價(jià)的方法，能夠同時(shí)進(jìn)行指紋成像并且檢測(cè)指紋中所攜帶的分析物，顯得尤為重要。
[0003]現(xiàn)在潛指紋成像的方法眾多，目前發(fā)展起來(lái)并被法醫(yī)研究領(lǐng)域所采用的指紋成像技術(shù)主要包括:光學(xué)成像法、粉末法、茚三酮法、碘熏法、502膠熏法和真空金屬沉積法等，它們分別適用于不同的指紋性質(zhì)與檢測(cè)條件，并且各有缺點(diǎn)。
[0004]光學(xué)檢測(cè)法基本上不用對(duì)指紋進(jìn)行處理，不會(huì)造成指紋的破壞，是多種方法中的首選。但是該方法對(duì)潛指紋顯現(xiàn)的增強(qiáng)能力有限，并且所需儀器設(shè)備較為龐大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜昂貴，無(wú)法廣泛普及，并且不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。粉末法因操作簡(jiǎn)單、成本低廉、適用范圍廣而成為較為成熟的一種顯現(xiàn)方法，但是容易對(duì)指紋紋線造成破壞，而且粉末顆粒懸浮于空氣中，容易進(jìn)入呼吸道對(duì)工作者造成較大的毒副作用。茚三酮法操作簡(jiǎn)單，并且能較好的顯現(xiàn)紙張表面的潛指紋，也是鑒定工作者目前廣泛采用的方法。但是該方法在指紋中氨基酸含量較少時(shí)顯現(xiàn)效果較差，需要進(jìn)一步后續(xù)處理。碘熏法是一種無(wú)損顯現(xiàn)方法，可重復(fù)多次顯現(xiàn)，尤其適合油脂類潛指紋。但該方法顯色淺淡易受背景色干擾，拍照提取時(shí)困難。而且碘易升華，對(duì)人體也有一定毒害作用。502膠熏染法是處理非多孔表面上的潛指紋的有效方法。但該方法處理后指紋與背景的對(duì)比度是一個(gè)問(wèn)題，所以還需要一些后處理。真空金屬沉積法是處理非多孔表面上的潛指紋的另一種重要技術(shù)。但是儀器較為昂貴，操作繁瑣，給現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)帶來(lái)很大障礙。
[0005]在已商業(yè)化并廣泛應(yīng)用的技術(shù)之外，近些年發(fā)展起來(lái)的技術(shù)還有:熒光法，以稀土材料、量子點(diǎn)或熒光染料結(jié)合到指紋上，借助熒光顯微鏡觀察，但是所需材料對(duì)操作者有毒害作用。電化學(xué)法，主要有掃描電化學(xué)顯微鏡法、電化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)-表面等離子體共振法，有些方法能夠檢測(cè)指紋中的分析物，但需要貴重的大型儀器才能實(shí)現(xiàn)。質(zhì)譜法，能夠檢測(cè)指紋中微量的分析物，但需要將指紋樣品溶解或提取，是一種對(duì)指紋有完全破壞性的方法，而且需要大型的質(zhì)譜儀。振動(dòng)光譜法，主要指紅外光譜和拉曼光譜，也能夠檢測(cè)出指紋中的分析物，缺點(diǎn)也是需要購(gòu)置大型儀器，而且需要長(zhǎng)時(shí)間操作。目前這些方法有很多可以做到檢測(cè)指紋中攜帶的分析物，但各自的弱勢(shì)也很明顯。
[0006] 總之，現(xiàn)有的已被法醫(yī)領(lǐng)域采用的技術(shù)中分別有其缺點(diǎn)，而且最重要的是不能在成像之外檢測(cè)其中的化學(xué)分析物；近些年發(fā)展的先進(jìn)技術(shù)有些能夠檢測(cè)分析物，但是不能實(shí)現(xiàn)無(wú)損分析，而且需要復(fù)雜貴重的大型儀器，不利于廣泛普及與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；另外，將暗場(chǎng)顯微鏡用于指紋分析領(lǐng)域的研究與應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法，首次將暗場(chǎng)顯微鏡應(yīng)用于指紋分析的同時(shí)，對(duì)化學(xué)分析物進(jìn)行檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明所述的利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法，包括如下步驟:S1，利用納米等離子體激元材料和核酸適體制備納米等離子體激元探針；S2，處理基底并利用該基底獲取潛指紋；S3，將所述納米等離子體激元探針滴加于已獲取潛指紋的基底上，使得所述潛指紋與所述納米等離子體激元探針結(jié)合；S4，利用暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供了一種新型的基于核酸適體的納米等離子體激元探針在暗場(chǎng)顯微鏡下對(duì)潛指紋成像，并同時(shí)檢測(cè)指紋中攜帶的化學(xué)分析物的通用方法。其中，核酸適體指的是經(jīng)體外篩選技術(shù)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段，是一類單鏈核酸分子的總稱。納米等離子體激元探針是指用尺寸在納米級(jí)的等離子體激元材料做成的探針。
[0009]優(yōu)選地，所述納米等離子體激元材料為納米金。由于納米金本身具有良好的生物相容性，使得本發(fā)明所提供的納米等離子體激元探針具有良好的生物相容性，從而使得本發(fā)明所提供的探針對(duì)操作者沒(méi)有任何毒害作用。其中，所謂等離子體激元是常規(guī)概念，指的是光和納米金屬表面電子相互作用引起的電磁波模式，具有這種性質(zhì)的納米材料稱為納米等離子體激元材料。納米金的制備可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的已知的方法進(jìn)行。
[0010]優(yōu)選地,所述納米金為直徑40~60nm的球形金納米顆粒,或邊長(zhǎng)40~60nm的立方體形金納米顆粒。實(shí)際上，該納米金可以是任何尺寸、形狀的金納米顆粒，上述40~60nm的數(shù)值僅作為優(yōu)選實(shí)施例示出。
[0011]優(yōu)選地，所述核酸適體是可卡因、溶菌酶、三磷酸腺苷、可天寧、嗎啡或大麻酚的核酸適體。應(yīng)該理解，本發(fā)明提供的方法具有普適性，只需要按照本發(fā)明的精神首先選擇與分析物相應(yīng)的核酸適體即可。當(dāng)所述核酸適體是可卡因核酸適體時(shí)，可卡因的最低檢測(cè)限優(yōu)選為在約1.5~2cm2的指紋面積上的90ng可卡因。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟SI包括首先將核酸適體切割為兩條單鏈DNA，從而使得所述納米等離子體激元探針具有兩種類型。采用兩種類型的探針的原因在于:在沒(méi)有分析物的時(shí)候，這兩種類型的探針不會(huì)結(jié)合在一起，是單顆粒的分散狀態(tài)，在顯微鏡下顯綠色；當(dāng)存在分析物的時(shí)候，這兩種類型的探針能夠結(jié)合在一起，是數(shù)個(gè)顆粒的聚集狀態(tài)，在顯微鏡下顯橙色或紅色。更優(yōu)選地，該兩條單鏈DNA的3’端或5’端分別添加若干T堿基，例如10個(gè)。同時(shí)，該兩條單鏈DNA分別被3’端巰基修飾或5’端巰基修飾。
[0013]優(yōu)選地，每種所述納米等離子體激元探針上結(jié)合有不與所述潛指紋結(jié)合的無(wú)關(guān)序列。在將兩條單鏈DNA分別組裝到納米等離子體激元材料上時(shí)，還包括將一條無(wú)關(guān)序列的單鏈DNA同時(shí)組裝到納米等離子體激元材料上。從理論上講，堿基數(shù)小于10的任何單鏈DNA都可以用來(lái)作為無(wú)關(guān)序列DNA，該無(wú)關(guān)序列DNA的作用是合理控制該兩條DNA的組裝密度。在兩種類型的納米等離子體激元探針上組裝的分別是一條DNA單鏈與該無(wú)關(guān)序列以及另一條DNA單鏈與該無(wú)關(guān)序列。當(dāng)單鏈DNA的3’端或5’端添加有若干T喊基并疏基修飾時(shí)，該無(wú)關(guān)序列為該若干T喊基疏基修飾的DNA,例如該無(wú)關(guān)序列為3’端疏基修飾的10個(gè)T堿基。
[0014]優(yōu)選地，所述基底是用于暗場(chǎng)顯微鏡觀察的載玻片或氧化銦錫導(dǎo)電玻璃片。事實(shí)上，在本發(fā)明使用氧化銦錫導(dǎo)電玻璃片的原因之一是為了用于掃描電子顯微鏡觀察確認(rèn)金納米顆粒的聚集。進(jìn)一步地，該基底還可以是硬塑料板、有機(jī)玻璃等平整透明的材料。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟S2包括將封閉劑覆蓋到已獲取潛指紋的基底上。封閉劑溶液被滴到玻片表面，因此封閉劑可以將玻片表面完全包裹，探針要么吸附在指紋上，要么就與封閉劑直接接觸，而不能與玻片接觸。探針與封閉劑接觸，不會(huì)吸附到封閉劑上。如果探針與玻片接觸，會(huì)吸附到玻片上，無(wú)法與吸附到指紋上的探針區(qū)分，就無(wú)法成像。該封閉劑可以降低背景，提高信噪比，從而提高成像與檢測(cè)的靈敏度及特異性。所述步驟S2中對(duì)基底的處理包括利用肥皂水、丙酮、乙醇和去離子水對(duì)基底進(jìn)行清洗，以除去玻片表面的灰塵和有機(jī)物，及其他影響觀察及成像效果的雜質(zhì)。
[0016]優(yōu)選地，所述封閉劑是含有與所述納米等離子體激元探針無(wú)任何非特異性結(jié)合的蛋白溶液。
[0017]優(yōu)選地，所述封閉劑為酪蛋白溶液。該酪蛋白溶液的濃度優(yōu)選0.1%~2%(w/v，質(zhì)量體積比),更加優(yōu)選為1%。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟S3包括利用磷酸鹽緩沖液和去離子水沖洗，以除去未結(jié)合的所述納米等離子體激元探針。所述步驟S3還包括在基底上滴加同濃度的兩種探針。優(yōu)選地，兩種探針的濃度優(yōu)選為均為0.1~0.5nM，更優(yōu)選為0.2nM。 [0019]優(yōu)選地，所述步驟S4包括利用倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡進(jìn)行觀察。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的暗場(chǎng)顯微鏡是采用倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡(其數(shù)值孔徑(NA)的范圍為0.8<NA<0.95)以及不同放大倍數(shù)(60倍及4倍(NA=0.8))的物鏡，并采用鹵素?zé)?100W)作為白光光源，采用彩色電荷耦合元件(CCD)為成像元件，轉(zhuǎn)接到計(jì)算機(jī)上顯示，并用軟件控制與處理成像。
[0020]實(shí)際上，目前還沒(méi)有任何利用暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行指紋成像的報(bào)道，暗場(chǎng)顯微鏡一般用來(lái)觀察布朗運(yùn)動(dòng)。其中應(yīng)當(dāng)注意的是，由于布朗運(yùn)動(dòng)的被觀測(cè)物是動(dòng)態(tài)的，而本發(fā)明目的在于對(duì)指紋進(jìn)行成像，這就要求被觀測(cè)物不能隨意移動(dòng)。本發(fā)明利用指紋中的分析物與納米等離子體激元探針(修飾了具有特異性識(shí)別功能的核酸適體的金納米顆粒)之間的相互作用，使探針固定在基底上，從而達(dá)到成像與檢測(cè)的目的。此外，考慮到探針與基底分別的電荷性質(zhì)，非特異性的靜電吸附不可避免，而這會(huì)嚴(yán)重影響成像效果與檢測(cè)靈敏度及特異性。所以，這是本發(fā)明操作過(guò)程中無(wú)法回避的難點(diǎn)，本發(fā)明提供的方法——在基底表面覆蓋一層封閉劑層成功地解決了這一難題。最后，本發(fā)明相比于其他借助熒光顯微鏡觀察的光致發(fā)光的潛指紋成像方法的優(yōu)勢(shì)在于探針的發(fā)光強(qiáng)度高且光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并且對(duì)操作者沒(méi)有毒害作用。
[0021 ] 本發(fā)明提供的指紋分析方法不僅能夠?qū)撝讣y進(jìn)行成像，而且能夠同時(shí)檢測(cè)指紋中所攜帶的化學(xué)分析物。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的是一種簡(jiǎn)單快速的方法，可以對(duì)指紋樣品進(jìn)行直接的、無(wú)損的分析。本發(fā)明中主要使用的金納米顆粒具有良好的生物相容性，其他所需化學(xué)、生物材料也均無(wú)人體毒害性。本發(fā)明所需試劑藥品以及儀器設(shè)備相對(duì)廉價(jià)便攜，易于標(biāo)準(zhǔn)化、商業(yè)化及大量推廣。因此本發(fā)明為潛指紋的成像與分析物的檢測(cè)及其實(shí)際應(yīng)用提供了一種新的思路及技術(shù)支撐。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1是實(shí)施例1中潛指紋成像的低倍率暗場(chǎng)顯微鏡照片結(jié)果；
[0023]圖2是實(shí)施例1中以高倍率暗場(chǎng)顯微鏡觀察指紋中攜帶不同質(zhì)量的可卡因時(shí)指紋成像的定性結(jié)果；
[0024]圖3是實(shí)施例1中高倍率暗場(chǎng)顯微鏡觀察指紋成像光點(diǎn)以半定量檢測(cè)指紋中攜帶不同質(zhì)量可卡因的結(jié)果；
[0025]圖4是實(shí)施例1中以高倍率暗場(chǎng)顯微鏡觀察指紋中攜帶可卡因的特異性檢測(cè)時(shí)指紋成像的定性結(jié)果；
[0026]圖5是實(shí)施例1中以高倍率暗場(chǎng)顯微鏡觀察指紋中攜帶可卡因的特異性檢測(cè)時(shí)指紋成像光點(diǎn)的半定量結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并予以詳細(xì)描述。
[0028]實(shí)施例1:基于核酸適體的納米等離子體激元探針在暗場(chǎng)顯微鏡下對(duì)顯微鏡載玻片上的潛指紋成像并同時(shí)檢測(cè)指紋中攜帶的可卡因
[0029](I)納米等離子體激元探針的制備:150mL檸檬酸三鈉水溶液(2.2mM)加熱至沸15min,加入ImL氯金 酸水溶液(25mM)反應(yīng)15min。降溫至95°C,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)30min，重復(fù)兩次。而后取出55mL樣品，并補(bǔ)加53mL水與2mL檸檬酸三鈉水溶液(60mM)。重復(fù)加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)長(zhǎng)大的步驟6次,得到直徑50nm的球形金納米顆粒Au NPs (該方法還可以制備直徑40~60nm的球形金納米顆粒,只需改變最后一步加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)長(zhǎng)大步驟的重復(fù)次數(shù))。將5 μ L的濃度為100 μ M的單鏈 DNAl (ss-DNAl，序列為 5’ -GTTCTTCAATGAAGTGGGACGACATTTTTTTTTT-SH-3’)或單鏈DNA2 (ss-DNA2，序列為 5’ -GGGAGTCAAGAACTTTTTTTTTT-SH-3’)與 5 μ L 的濃度為 100 μ M的單鏈DNA3 (ss-DNA3，序列為5’ -TTTTTTTTTT-SH-3’ )加入到400 μ L上述的金納米顆粒溶液(0.2ηΜ)中室溫孵育(其中ss-DNAl和ss-DNA2是可卡因的核酸適體被切割后的兩條DNA, ss-DNA3是一條無(wú)關(guān)序列的DNA)。加入磷酸緩沖液(PB)至10mM，氯化鈉(NaCl)溶液至0.1Μ，ρΗ7.0，孵育40小時(shí)。在4°C下于12000轉(zhuǎn)離心20min，棄去上清，洗滌3次后分散于400 μ L磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)中。
[0030](2)指紋基底的處理及潛指紋的獲取:將暗場(chǎng)顯微鏡的載玻片分別在肥皂水、丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封閉，將200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小時(shí)，并在4°C下孵育12小時(shí)，而后水洗吹干。手指洗干凈后負(fù)載不同質(zhì)量的可卡因，而后輕輕地在玻片上按壓采集指紋。
[0031](3)指紋處理過(guò)程:分別在玻片上滴加45 μ L兩種不同的納米等離子體激元探針(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，兩種探針的濃度均為0.2ηΜ,，室溫下孵育30min。用PBS和去離子水沖洗并吹干，以除去未結(jié)合的探針。
[0032](4)暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè):倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡(其數(shù)值孔徑(NA)的范圍為0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物鏡(ΝΑ=0.8)，白光光源為100W的鹵素?zé)簦上裨椴噬?XD，并轉(zhuǎn)接顯示到計(jì)算機(jī)上。
[0033]采用暗場(chǎng)顯微鏡上4倍物鏡觀察潛指紋的暗場(chǎng)彩色照片結(jié)果見(jiàn)附圖1。事實(shí)上，由于指紋的尺寸遠(yuǎn)大于聚光鏡產(chǎn)生的暗場(chǎng)視野，此照片來(lái)自于多張不同指紋區(qū)域的暗場(chǎng)彩色照片拼接的結(jié)果。本圖表明在明亮的指紋凸起與黑暗的基底之間對(duì)比，此結(jié)果提供了一個(gè)清晰可辨的指紋輪廓。并且除了指紋凸起的花樣(指紋的第一層次的分辨)之外，還可以清楚地識(shí)別出指紋第二層次(包括末端、交叉、雙叉和島等)以及第三層次(汗孔)。這表明本發(fā)明提供的方法能給出輪廓清晰、分辨率高、對(duì)比度高的成像結(jié)果。其中，紅圈表示指紋第二層次(包括末端、交叉、雙叉和島等)，綠圈表示指紋第三層次(汗孔)。
[0034]負(fù)載有不同質(zhì)量的可卡因的指紋在高分辨率的暗場(chǎng)顯微鏡下觀察得到的暗場(chǎng)彩色照片如附圖2ο從a至Ij h,可卡因的負(fù)載量分別為Ong, 150ng, 300ng, 750ng, 1.5 μ g, 3 μ g,15μg和30μg。結(jié)果顯示隨著可卡因的負(fù)載量的增加，高分辨率圖像整體上逐漸從綠色向紅色變化，也就是說(shuō)綠色的光點(diǎn)逐漸減少而橙紅色的光點(diǎn)逐漸增多。我們已經(jīng)證明橙色、紅色的光點(diǎn)來(lái)自于可卡因誘導(dǎo)的金納米顆粒聚集，因此，我們隨機(jī)選取了指紋凸起的區(qū)域中300個(gè)光點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)了其中橙色和紅色的光點(diǎn)所占的百分比，結(jié)果見(jiàn)附圖3?？梢钥吹酱税俜直扰c可卡因質(zhì)量的對(duì)數(shù)之間有很好的線性關(guān)系。計(jì)算(空白樣品的信號(hào)值加上3倍的空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)差為最低檢測(cè)限)得出可卡因負(fù)載量的最低檢測(cè)限為90ng。
[0035]采用此種分析 方法對(duì)可卡因的兩種代謝產(chǎn)物苯甲酰愛(ài)康寧(benzoyl ecgonine,BE)與愛(ài)康寧甲基酯(ecgonine methyl ester, ΕΜΕ)進(jìn)行檢測(cè)。這兩種物質(zhì)與可卡因化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，我們以此作為可卡因的類似物證明可卡因檢測(cè)特異性。負(fù)載有相同質(zhì)量的可卡因及其類似物的指紋在高分辨率的暗場(chǎng)顯微鏡下觀察得到的暗場(chǎng)彩色照片如附圖4，從a到d分別為空白組、BE組、EME組和可卡因組。以我們的半定量方法得到的特異性檢測(cè)結(jié)果如附圖5。兩種類似物得到的結(jié)果與可卡因得到的結(jié)果之間有巨大差別，幾乎相當(dāng)于空白樣本。以上結(jié)果表明，本發(fā)明中基于核酸適體的納米等離子體激元探針在暗場(chǎng)顯微鏡下檢測(cè)指紋中攜帶的可卡因的靈敏性及特異性方面均表現(xiàn)出更好的檢測(cè)性能。
[0036]實(shí)施例2:基于核酸適體的納米等離子體激元探針在暗場(chǎng)顯微鏡下對(duì)顯微鏡載玻片上的潛指紋成像并同時(shí)檢測(cè)指紋中攜帶的可卡因
[0037](I)納米等離子體激元探針的制備:將氯金酸加入到IOmL的十六烷基三甲基氯化銨水溶液(0.1M)中，至其濃度為0.25mM。加入0.45mL的硼氫化鈉水溶液(20mM)，30°C反應(yīng)I小時(shí)，作為種子溶液。配置兩瓶生長(zhǎng)液:將320mg十六烷基三甲基氯化銨加入9.605mL去離子水中，依次加入0.25mL氯金酸水溶液(IOmM), 0.01mL溴化鈉水溶液(10mM)，0.09mL抗壞血酸水溶液(40mM)。反應(yīng)30min，重復(fù)兩次。而后取出55mL樣品，并補(bǔ)加53mL水與2mL檸檬酸三鈉水溶液(60mM)。一瓶生長(zhǎng)液中加入0.45mL上述種子溶液并振蕩5秒，然后從中取出0.45mL轉(zhuǎn)入另一瓶生長(zhǎng)液。充分混合10秒，于30°C反應(yīng)15分鐘，離心濃縮至lmL，得到邊長(zhǎng)45nm的立方體形金納米顆粒(Au NPs)(該方法還可以制備直徑40~60nm的立方體形金納米顆粒，只需改變最后一步加入種子溶液的體積)。將5 μ L的濃度為100 μ M的單鏈 DNAl (ss-DNAl，序列為 5’-GTTCTTCAATGAAGTGGGACGACATTTTTTTTTT-SH-3’)或單鏈 DNA2(ss-DNA2，序列為 5’ -GGGAGTCAAGAACTTTTTTTTTT-SH-3’)與 5 μ L 的濃度為 100 μ M 的單鏈DNA3 (ss-DNA3，序列為5’-TTTTTTTTTT-SH_3’)加入到400 μ L上述的金納米顆粒溶液中室溫孵育(其中ss-DNAl和SS-DNA2是可卡因的核酸適體被合理的切割后的兩條DNA，ss-DNA3是一條無(wú)關(guān)序列的DNA)。加入磷酸緩沖液(PB)至IOmM,氯化鈉(NaCl)溶液至0.1Μ,ρΗ7.0,孵育40小時(shí)。在4°C下于12000轉(zhuǎn)離心20min，棄去上清，洗滌3次后分散于400 μ L磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)中。
[0038](2)指紋基底的處理及潛指紋的獲取:將暗場(chǎng)顯微鏡的載玻片分別在肥皂水、丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封閉，將200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小時(shí)，并在4°C下孵育12小時(shí)，而后水洗吹干。手指洗干凈后負(fù)載不同質(zhì)量的可卡因，而后輕輕地在玻片上按壓采集指紋。
[0039](3)指紋處理過(guò)程:分別在玻片上滴加45 μ L兩種不同的納米等離子體激元探針(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，濃度均為0.2ηΜ,優(yōu)選范圍為0.1~0.5ηΜ),室溫下孵育30min。用PBS和去離子水沖洗并吹干。
[0040](4)暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè):倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡(其數(shù)值孔徑(NA)的范圍為
0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物鏡(NA=0.8)，白光光源為100W的鹵素?zé)?，成像元件為彩?XD，并轉(zhuǎn)接顯示到計(jì)算機(jī)上。
[0041]實(shí)施例3:基于核酸適體的納米等離子體激元探針在暗場(chǎng)顯微鏡下對(duì)顯微鏡載玻片上的潛指紋成像并同時(shí)檢測(cè)指紋中攜帶的三磷酸腺苷[0042](I)納米等離子體激元探針的制備:150mL檸檬酸三鈉水溶液(2.2mM)加熱至沸15min,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)15min。降溫至95°C,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)30min，重復(fù)兩次。而后取出55mL樣品，并補(bǔ)加53mL水與2mL檸檬酸三鈉水溶液(60mM)。重復(fù)加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)長(zhǎng)大的步驟6次，得到直徑50nm的球形金納米顆粒(Au NPs)(該方法還可以制備直徑40~60nm的球形金納米顆粒,只需改變最后一步加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)長(zhǎng)大步驟的重復(fù)次數(shù))。將5μ L的濃度為100 μ M 的單鏈 DNAI’ (ss-DNAl’，序列為 5’ -HS-TTTTTTTTTTACCTGGGGGAGTAT-3’)或單鏈DNA2’ (ss-DNA2’，序列為 5’ -HS-TTTTTTTTTTTGCGGAGGAAGGT-3’)與 5 μ L 的濃度為 100 μ M的單鏈DNA3’(ss-DNA3’，序列為5’ -TTTTTTTTTT-SH-3’)加入到400 μ L上述的金納米顆粒溶液(0.2ηΜ)中室溫孵育(其中ss-DNAl’和ss_DNA2’是三磷酸腺苷的核酸適體被合理的切割后的兩條DNA，SS-DNA3’是一條無(wú)關(guān)序列的DNA)。加入磷酸緩沖液(PB)至10禮，氯化鈉(NaCl)溶液至0.1Μ，ρΗ7.0，孵育40小時(shí)。在4°C下于12000轉(zhuǎn)離心20min，棄去上清，洗滌3次后分散于400 μ L磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)中。
[0043](2)指紋基底的處理及潛指紋的獲取:將暗場(chǎng)顯微鏡的載玻片分別在肥皂水、丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封閉，將200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小時(shí)，并在4°C下孵育12小時(shí)，而后水洗吹干。手指洗干凈后負(fù)載不同質(zhì)量的三磷酸腺苷，而后輕輕地在玻片上按壓采集指紋。
[0044](3)指紋處理過(guò)程:分別在玻片上滴加45 μ L兩種不同的納米等離子體激元探針(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，濃度均為0.2ηΜ,優(yōu)選范圍為0.1~0.5ηΜ),室溫下孵育30min。用PBS和去離子水沖洗并吹干。
[0045](4)暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè):倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡(其數(shù)值孔徑(NA)的范圍為
0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物鏡(NA=0.8)，白光光源為IOOW的鹵素?zé)?，成像元件為彩?XD，并轉(zhuǎn)接顯示到計(jì)算機(jī)上。[0046]實(shí)施例4:基于核酸適體的納米等離子體激元探針在暗場(chǎng)顯微鏡下對(duì)氧化銦錫導(dǎo)電玻璃上的潛指紋成像并同時(shí)檢測(cè)指紋中攜帶的可卡因
[0047](1)納米等離子體激元探針的制備:150mL檸檬酸三鈉水溶液(2.2mM)加熱至沸15min,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)15min。降溫至95°C,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)30min，重復(fù)兩次。而后取出55mL樣品，并補(bǔ)加53mL水與2mL檸檬酸三鈉水溶液(60mM)。重復(fù)加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)長(zhǎng)大的步驟6次，得到直徑50nm的球形金納米顆粒(Au NPs)(該方法還可以制備直徑40~60nm的球形金納米顆粒,只需改變最后一步加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反應(yīng)長(zhǎng)大步驟的重復(fù)次數(shù))。將5μ L的濃度為100 μ M 的單鏈 DNAl (ss-DNAl，序列為 5’-GTTCTTCAATGAAGTGGGACGACATTTTTTTTTT-SH-3’ )或單鏈 DNA2 (ss-DNA2，序列為 5’ -GGGAGTCAAGAACTTTTTTTTTT-SH-3’)與 5 μ L 的濃度為100 μ M 的單鏈 DNA3 (ss-DNA3，序列為 5’ -TTTTTTTTTT-SH-3’ )加入到 400 μ L 上述的金納米顆粒溶液中室溫孵育(其中ss-DNAl和ss-DNA2是可卡因的核酸適體被合理的切割后的兩條DNA, ss-DNA3是一條無(wú)關(guān)序列的DNA)。加入磷酸緩沖液(PB)至IOmM,氯化鈉(NaCl)溶液至0.1Μ，ρΗ7.0，孵育40小時(shí)。在4°C下于12000轉(zhuǎn)離心20min，棄去上清，洗滌3次后分散于400 μ L磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)中。
[0048](2)指紋基底的處理及潛指紋的獲取:將氧化銦錫導(dǎo)電玻璃片分別在肥皂水、丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封閉，將200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小時(shí)，并在4°C下孵育12小時(shí)，而后水洗吹干。手指洗干凈后負(fù)載不同質(zhì)量的可卡因，而后輕輕地在玻片上按壓采集指紋。
[0049](3)指紋處理過(guò)程:分別在玻片上滴加45 μ L兩種不同的納米等離子體激元探針(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，濃度均為0.2ηΜ,優(yōu)選范圍為0.1~0.5ηΜ),室溫下孵育30min。用PBS和去離子水沖 洗并吹干。
[0050](4)暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè):倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡(其數(shù)值孔徑(NA)的范圍為
0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物鏡(NA=0.8)，白光光源為100W的鹵素?zé)簦上裨椴噬?XD，并轉(zhuǎn)接顯示到計(jì)算機(jī)上。
[0051]以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.利用暗場(chǎng)顯微鏡同時(shí)進(jìn)行指紋識(shí)別與分析物檢測(cè)的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: Si，利用納米等離子體激元材料和核酸適體制備納米等離子體激元探針； S2，處理基底并利用該基底獲取潛指紋； S3，將所述納米等離子體激元探針滴加于已獲取潛指紋的基底上，使得所述潛指紋與所述納米等離子體激元探針結(jié)合； S4，利用暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米等離子體激元材料為納米金。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述納米金為直徑40~60nm的球形金納米顆粒,或邊長(zhǎng)40~60nm的立方體形金納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸適體是可卡因、溶菌酶、三磷酸腺苷、可天寧、嗎啡或大麻酚的核酸適體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟SI包括首先將核酸適體切割為兩條單鏈DNA，從而使得所述納米等離子體激元探針具有兩種類型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，每種所述納米等離子體激元探針上結(jié)合有不與所述潛指紋結(jié)合的無(wú)關(guān)序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述基底是用于暗場(chǎng)顯微鏡觀察的載玻片或氧化銦錫導(dǎo)電玻璃片。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2包括將封閉劑覆蓋到已獲取潛指紋的基底上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述封閉劑是含有與所述納米等離子體激元探針無(wú)任何非特異性結(jié)合的蛋白溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述封閉劑是酪蛋白溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3包括利用磷酸鹽緩沖液和去離子水沖洗，以除去未結(jié)合的所述納米等離子體激元探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S4包括利用倒置顯微鏡裝配上暗場(chǎng)聚光鏡進(jìn)行觀察。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103735271SQ201310633293
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】樊春海, 李迪, 李昆 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所