半胱氨酸蛋白酶抑制劑s與糖類(lèi)抗原19-9的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（Cystatin?S）與糖類(lèi)抗原19-9（CA199）的聯(lián)合應(yīng)用，具體為Cystatin?S與CA199在制備檢測(cè)大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，本發(fā)明還公開(kāi)了大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，并公開(kāi)了含有標(biāo)志物捕獲劑的試劑盒，本發(fā)明公開(kāi)的試劑盒具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠用于大腸癌或胰腺癌的早期診斷，治療過(guò)程中的療效監(jiān)控以及治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控，可早于臨床癥狀。
【專(zhuān)利說(shuō)明】半胱氨酸蛋白酶抑制劑S與糖類(lèi)抗原19-9的聯(lián)合應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制劑S與糖類(lèi)抗原19-9的聯(lián)合應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，由于生活水平提高，我國(guó)大腸癌發(fā)病率急劇上升，達(dá)到4.2%。我國(guó)大腸癌高發(fā)年齡普遍在50歲-60歲，比西方國(guó)家平均提早10歲。目前，大腸癌的診斷主要通過(guò)大便隱血實(shí)驗(yàn)、血液CA199指標(biāo)、腸鏡篩查等，其中大便隱血實(shí)驗(yàn)不易被民眾接受，其檢測(cè)篩選檢查率低于5%;而腸鏡篩查為侵入性，檢測(cè)痛苦，有出血、穿孔等風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題進(jìn)一步進(jìn)行腸鏡檢查比例更低，低于3% ;血液CA199指標(biāo)準(zhǔn)確度不高。通過(guò)早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，然后進(jìn)行早期干預(yù)大腸癌預(yù)后五年生存率高于90%。因此，如何更早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)干預(yù)，如何實(shí)現(xiàn)療效評(píng)估和監(jiān)測(cè)，如何對(duì)術(shù)后患者進(jìn)行復(fù)發(fā)監(jiān)控，是診斷和監(jiān)控大腸癌亟待解決的問(wèn)題。
[0003]胰腺癌是高致死率腫瘤之一，死亡率與發(fā)病率之比為0.99:1。1991-2000年全國(guó)疾病監(jiān)測(cè)點(diǎn)系統(tǒng)的資料顯示胰腺癌死亡率不斷上升，居惡性腫瘤的第7位。65-84歲年齡段者的死亡率是15-54歲年齡段的5倍，城市死亡率為農(nóng)村的2.42-4.68倍，東北和東部地區(qū)死亡率明顯高于其它地區(qū)。常規(guī)的確診手段為內(nèi)窺鏡逆行胰膽管造影(ERCP)、經(jīng)皮肝穿刺肝膽管造影(PTC)、超聲內(nèi)窺檢查(EUS)、胰管內(nèi)超聲、血管造影等，目前胰腺癌尚無(wú)高特異性、靈敏的檢測(cè)生物標(biāo)志物,用于胰腺癌的血清蛋白標(biāo)志物有CA19-9、CEA、CA50、CA242等，但這些標(biāo)志物常用于晚期胰腺癌輔助診斷、療效評(píng)估、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控等，用于早期預(yù)示胰腺癌普遍靈敏度不夠。因此，急需尋找一種高靈敏度的標(biāo)志物，為早期預(yù)示胰腺癌奠定基礎(chǔ)。
[0004]糖類(lèi)抗原19-9 (CA199)是一種含黏液成分的大分子糖蛋白，可表達(dá)于多種細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞表面。在判斷大腸癌患者臨床分期方面，CA199是比CEA更為敏感的指標(biāo)。CA199與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度相關(guān)，并可與其它指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用提示血源性復(fù)發(fā)。CA199是大腸癌患者獨(dú)立判斷預(yù)后的指標(biāo)，血清中高水平的CA199提示大腸癌患者生存期縮短，但是單獨(dú)使用CA199指標(biāo)準(zhǔn)確度不高。半胱氨酸蛋白酶抑制劑S (Cystatin S)是人類(lèi)Cystatin家族成員，由CST4基因編碼的含141個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為16.4Kda。Cystatin S分子中含有兩個(gè)二硫鍵，為典型的分泌蛋白，分布于體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CST4在胃癌組織中的表達(dá)量高于正常胃粘膜組織，在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)部位與胃癌組織較一致，且表達(dá)率隨細(xì)胞系的分化程度降低而降低，從而提示CST4可能在胃癌的發(fā)生有關(guān)。但迄今為止，未見(jiàn)CST4與其他癌癥相關(guān)的報(bào)道，也為見(jiàn)Cystatin S與CA199聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑S (Cystatin S)和糖類(lèi)抗原19-9 (CA199)在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑；本發(fā)明的目的之三在于提供含有前述捕獲劑的試劑盒；本發(fā)明的目的之四在于提供試劑盒建立計(jì)算診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌閾值的方法。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類(lèi)抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]優(yōu)選的，所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評(píng)估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0009]2.大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，所述標(biāo)志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類(lèi)抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]優(yōu)選的，所述捕獲劑為識(shí)別半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9的特異性抗體。
[0011]3.含有所述捕獲劑的試劑盒。
[0012]優(yōu)選的，所述試劑盒為檢測(cè)血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9濃度的試劑盒。
[0013]優(yōu)選的，所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
[0014]更優(yōu)選的，所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
[0015]更優(yōu)選的，所述單克隆抗體為鼠抗人Cystatin S單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin S多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
[0016]4.利用所述試劑盒建立計(jì)算診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌閾值的方法，用所述試劑盒檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9濃度，利用P=exp (-8.268-0.0919*a+0.312*b) / [1+exp (-8.268-0.0919*a+0.312?)]計(jì)算大腸癌閾值P 或利用 P= [exp (-5.248+0.063*a+0.598*b) / [1+exp (-5.248+0.063*a+0.598*b)]計(jì)算胰腺癌閾值p，當(dāng)P大于或等于0.75時(shí)，為陽(yáng)性；當(dāng)P小于0.75時(shí)，為陰性；
[0017]其中a代表Cystatin S濃度,單位為pg/mL, b代表CA199濃度,單位為ng/mL。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明公開(kāi)了將Cystatin S和CA199聯(lián)合用于制備預(yù)示或診斷大腸癌或胰腺癌的標(biāo)志物，利用兩個(gè)標(biāo)志物共同檢測(cè)大腸癌和胰腺癌的靈敏度高和特異性高于單獨(dú)檢測(cè)一種標(biāo)志物；本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，將捕獲劑于常規(guī)試劑制備檢測(cè)試劑盒，制成試劑盒具有使用方便，重復(fù)性好，便于攜帶等特點(diǎn)，可用于大腸癌或胰腺癌的早期診斷、療效評(píng)估或和移轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)監(jiān)控等，其特異性好、靈敏度高，其中檢測(cè)大腸癌的靈敏度為86.4%，特異性為94.4% ;檢測(cè)胰腺癌的靈敏度為85.2%，特異性為87.2%，并且檢測(cè)結(jié)果早于臨床癥狀，為醫(yī)生提前治療和干預(yù)提供指導(dǎo)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明:
[0020] 圖1為Cystatin S血清檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Cystatin S蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021]圖2為Cystatin S-CA199聯(lián)合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大腸癌ROC曲線。[0022]圖3為Cystatin S-CA199聯(lián)合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胰腺癌ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0024]本發(fā)明使用的試劑如下:Cystatin S單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司(貨號(hào)為:MAB1296);兔抗人Cystatin S多克隆抗體(貨號(hào)為:11542_RP02)、Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào)11542-H08H)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，CA199-ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司(貨號(hào)為:F5905)。
[0025]實(shí)施例1建立Cystatin S血清檢測(cè)反應(yīng)體系及其優(yōu)化
[0026]用濃度為5 μ g/mL鼠抗人Cystatin S單克隆抗體包被ELISA板,于4°C條件下包被過(guò)夜，洗板；然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA中室溫封閉2小時(shí),洗板；將濃度分別為Opg/mL,50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin S 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(編碼Cystatin S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1)和樣品加入封閉板中，于37°C反應(yīng)I小時(shí)，洗板；然后用濃度為0.5 μ g/mL HRP標(biāo)記的兔抗人Cystatin S多克隆抗體，在37°C條件下反應(yīng)I小時(shí)，洗板；再與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)2-3分鐘，最后用濃度為2M的硫酸終止反應(yīng)，并于450nm條件下檢測(cè)OD值(圖1)，由圖1可知，Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒線性范圍為50pg/mL-1600pg/mL，在線性范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品線性相關(guān)系數(shù)r > 0.990，回收率在90%?110%范圍內(nèi)。
[0027]檢測(cè)體系優(yōu)化，比對(duì)分別由美國(guó)R&D，英國(guó)Abcam和美國(guó)NOVUS B10L0GICALS3個(gè)不同公司生產(chǎn)的Cystatin S單克隆抗體、美國(guó)R&D公司和北京義翹神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和R&D公司，英國(guó)Abcam和北京義翅神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Cystatin S多克隆抗體。結(jié)果表明,Cystatin S單抗優(yōu)選R&D公司提供的產(chǎn)品,最佳工作濃度為5 μ g/mL ；Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和Cystatin S多克隆抗體優(yōu)選北京義翅神州生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，最佳工作濃度為0.5 μ g/mL，在最佳條件下，可實(shí)現(xiàn)背景OD值
<0.1，能夠有效區(qū)分陰性組與陽(yáng)性組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0028]固相載體的確定:對(duì)美國(guó)Corning、德國(guó)Greiner、美國(guó)Thermo和丹麥Nunc4個(gè)不同廠家生產(chǎn)的酶標(biāo)板進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，美國(guó)corning公司(貨號(hào)為:9018)和thermo(貨號(hào)為:468667)公司的酶標(biāo)板符合背景OD值< 0.1，且信噪比較高。
[0029]包被液的選擇:根據(jù)抗體包被于固相載體所需要的緩沖體系，ELISA常用包被液為緩沖鹽溶液，分別用磷酸鹽緩沖液(PH7.5)和碳酸鹽緩沖液(pH9.6)檢測(cè)包被環(huán)境對(duì)反應(yīng)體系的影響，結(jié)果顯示碳酸鹽緩沖液(PH9.6)可滿(mǎn)足空白組OD值< 0.1，有效區(qū)分空白組、陰性組和陽(yáng)性組，信噪比較高。
[0030]稀釋劑的選擇:通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比了 2種商品化稀釋劑(分別購(gòu)自天津博美科生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)BMKFO17-1);上海西唐生物科技有限公司(貨號(hào)C0901))和自制稀釋劑的稀釋效果，主要從保護(hù)蛋白能力，自身穩(wěn)定性?xún)煞矫嬖u(píng)價(jià)稀釋劑的稀釋效果。結(jié)果顯示自制稀釋劑的效果最佳，自制稀釋劑各組分的終濃度如下:3mM EDTA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的BSA、1XPBS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween-20和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0031]穩(wěn)定劑的選擇:使用3種穩(wěn)定劑(具體如下:穩(wěn)定劑1:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，體積分?jǐn)?shù)為8%的甘油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%的NaCl ;穩(wěn)定劑I1:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，體積分?jǐn)?shù)為8%的甘油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的EDTA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%的NaCl，穩(wěn)定劑II1:體積分?jǐn)?shù)為68.8%的PBS，體積分?jǐn)?shù)為30%的胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的硫柳汞)分別稀釋單克隆抗體、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和多克隆抗體至濃度為0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用時(shí)按體積比為1:100稀釋。并于第O天、第7天和第14天進(jìn)行檢測(cè)OD值。結(jié)果顯示，穩(wěn)定劑III效果最佳，具體組分為:體積分?jǐn)?shù)為68.8%的PBS、體積分?jǐn)?shù)為30%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%硫柳萊。
[0032]通過(guò)以上研究確定了檢測(cè)體系的主要組分，建立Cystatin S血清檢測(cè)體系。
[0033]實(shí)施例2Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒
[0034]根據(jù)實(shí)施例1中建立Cystatin S血清檢測(cè)體系構(gòu)建Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，具體組分如表1所示:
[0035]表1.Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒組分
【權(quán)利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類(lèi)抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評(píng)估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
3.大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，其特征在于:所述標(biāo)志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類(lèi)抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的捕獲劑，其特征在于:所述捕獲劑為識(shí)別半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9的特異性抗體。
5.含有權(quán)利要求3或4所述捕獲劑的試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為檢測(cè)血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9濃度的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8 所述的試劑盒,其特征在于:所述單克隆抗體為鼠抗人CystatinS單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin S多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
10.利用權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述試劑盒建立計(jì)算診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌閾值的方法，其特征在于:用所述試劑盒檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類(lèi)抗原19-9濃度，利用P=exp (-8.268-0.0919*a+0.312*b) / [1+exp (-8.268-0.0919*a+0.312?)]計(jì)算大腸癌閾值P 或利用 P= [exp (-5.248+0.063*a+0.598*b) / [1+exp (-5.248+0.063*a+0.598*b)]計(jì)算胰腺癌閾值p，當(dāng)P大于或等于0.75時(shí)，為陽(yáng)性；當(dāng)P小于0.75時(shí)，為陰性； 其中a代表半胱氨酸蛋白酶抑制劑S濃度，單位為pg/mL，b代表糖類(lèi)抗原19_9濃度，單位為ng/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103913575SQ201310164990
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】王弢, 秦勇, 渠香云 申請(qǐng)人:上海良潤(rùn)生物醫(yī)藥科技有限公司