專利名稱：一種測定食品釀造谷物類原料結合態(tài)香氣物質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定食品釀造谷物類原料香氣物質的方法，特別是一種結合態(tài)香氣物質的方法。
背景技術：
在中國傳統(tǒng)釀造產品中，例如白酒、醋、醬油等，其獨特的風味被認為是特有微生物的作用，其風味的研究主要集中在原酒、成品酒以及大曲、酒醅上，卻缺少了原料分析這一方面。古人云:水，酒之血；曲，酒之骨；糧，酒之肉。足以看出糧食原料的重要性，糧食原料除了提供微生物生長所需的能量外，其自身香氣物質不容忽視。香氣物質分為游離態(tài)和結合態(tài)兩種存在形式，只有游離態(tài)的才具有香氣效果，結合態(tài)的需要釋放變?yōu)橛坞x態(tài)才是有效的香氣物質，而結合態(tài)香氣物質可達游離態(tài)香氣物質的8倍，因此結合態(tài)香氣物質的研究是重中之重。目前原料中結合態(tài)香氣物質的研究并不清楚，方法的限制是一個重要的原因，因此需要建立方法去深入研究原料中香氣物質的貢獻。關于谷物類糧食的香氣物質有相關學者進行過研究:楊潔等人通過100°C水浴加熱的方法研究過大米中的香氣物質；金邦荃等人將玉米速凍研磨后研究速凍甜玉米的香氣物質；練順才等人也研究過高粱蒸煮時產生的香氣。但是上述的研究并沒有考慮當糧食作為釀造原料時對產品風味的貢獻，僅僅是對全部香氣物質的檢測，更沒有將香氣物質分為游離態(tài)和結合態(tài)的物質。在果酒尤其是葡萄酒的研究中，果實自身的香氣物質占了很大一部分，結合態(tài)香氣物質的主要的提取方法就是將水果榨汁后，通過樹脂柱的吸附作用將糖苷類物質吸附，然后再用洗脫劑洗脫得到結合態(tài)香氣物質的前體，經水解之后香氣物質得以釋放。但是，干態(tài)類原料無法榨汁，因此上述方法不適合對干態(tài)類原料結合態(tài)香氣物質前體的提取，需要探索新的 方法。本專利的發(fā)明，提供了一種提取釀造谷物類原料中結合態(tài)香氣物質的提取方法。該方法不是直接去檢測無風味的結合態(tài)香氣前體物質，而是通過水解處理使結合態(tài)的香氣物質以游離態(tài)的形式釋放出來。本方法的建立，使得原料香氣物質分析的體系更加完善，能夠抓住關鍵的結合態(tài)香氣物質進行分析，對提高釀造產品的品質也有重要意義；另外，提取得到的前體物質可以應用到生產過程中，提高相應香氣物質的含量。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種提取谷物類原料中結合態(tài)香氣物質的結合態(tài)前體，對其進行處理后檢測香氣物質，并將該方法應用于釀造食品領域中。為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案為:A:谷物類原料中結合態(tài)香氣物質前體的提取:①原料的預處理:將所研究的原料晾干，于研磨機中碾碎。②前體物質的提取:取10 50g原料于錐形瓶中，加入100 500mL的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨或按不同比例配比的溶劑浸泡12 36h,超聲0.5 Ih后離心(8000rpm,15min)取上清液，殘渣再次用100 500mL的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨或按不同比例配比的溶劑浸泡12 36h，超聲0.5 Ih后離心(8000rpm，15min)取上清液，合并清液，在30 4011C下減壓蒸懼至干,用100 500mL的磷酸鹽緩沖液(pH4 9)溶解。③除雜:將上述溶液置于分液漏斗中，用20 IOOmL的乙醚、戊烷、二氯甲烷、乙酸乙酯單獨或按不同比例配比的有機溶劑反復萃取2 5次，以去除溶解在水中游離態(tài)香氣物質，將最后得到的溶液放在_20°C條件下備用。④純化:將上述溶液20 IOOmL以2 10mL/min的流速通過Sep-Pak C18ECI IOg, 6mL 60mL)固相萃取預裝柱,然后用2 6倍柱體積的超純水以2 10mL/min沖洗雜質，最后用I 3倍柱體積的甲醇(色譜純)以0.5 5mL/min的流速將結合態(tài)物質洗脫并接收，在30 40°C下減壓旋蒸至干后用pH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解。B:結合態(tài)香氣物質的釋放:物化處理:用鹽酸調節(jié)上述溶液pH為I 3，將IOmL前體物質溶液裝入安瓿瓶中密封，沸水浴加熱0.5 5h左右，待其冷卻后打破安瓿瓶，調節(jié)pH為7。酶處理:在安瓿瓶中加入IOmL前體物質溶液，然后加入β _D_葡萄糖苷酶，使得終濃度為5 10U/mL，密封后置于25 35°C條件下震蕩24 48h，反應完后加入I 5%的CaCL2抑制酶活。C:香氣物質的檢測:采用HS-SPME-GC -MS方法，在15mL頂空瓶中加入8mL澄清溶液，3 5g氯化鈉，加入內標，進行頂空固相微萃取。頂空固相微萃取的條件為:三相(Car/DVB/PDMS)萃取頭，60°C預熱5 15min,萃取吸附35 55min, GC解吸5 15min。將未知成分的質譜與NIST05a.L Datebase中的質譜比對,進行初步定性,然后通過色譜圖計算得到保留指數RI，與相應釀造產品(如白酒)中的常規(guī)成分的標準品的保留指數進行比對，進行最后的確定；制作待測物質的標準曲線，經GC-MS檢測后將待測物質和內標物質峰面積比代入相應的標準曲線方程計算出待測物質的含量。所有實驗重復三次或以上，取平均值做最終結果。本發(fā)明首次將谷物中結合態(tài)香氣物質作為研究對象，豐富了原料香氣物質的研究。本發(fā)明所建立的方法簡便有效:既能排除自身游離態(tài)香氣物質的影響，又可以有效的提取谷物類原料中的結合態(tài)香氣物質前體并防止其分解；采用的酸解或酶解的方法可以有效的使結合態(tài)的香氣物質釋放出來變成揮發(fā)性物質。該發(fā)明的有益效果還有:提取得到的結合態(tài)物質可以用在工業(yè)生產過程，提高相應香氣物質的含量；本發(fā)明完善了釀造產品風味分析體系，用于原料品質評價以及原料等級分類，對提高釀造產品的品質有重要意義。


圖1:物化處理玉米中結合態(tài)香氣物質氣相色譜2:酶處理小麥中結合態(tài)香氣物質氣相色譜圖
具體實施例方式實施例1:高粱中結合態(tài)香氣物質前體物質的提取以純化
將高粱晾干后粉碎，取IOg于錐形瓶中，加入20mL的乙腈/乙醇(v/v3:7)，常溫下浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中，在4°C下8000rpm離心15min，保存上清液，將殘渣再次用20mL乙腈/甲醇(v/v3:7)浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中，在4°C下8000rpm離心15min，將得到上清液與上一步得到的清液合并一起，裝于500mL的旋蒸瓶中，于旋蒸裝置上減壓蒸發(fā)至干，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH7)溶解，然后將溶液置于250mL分液漏斗中，用20mL的重蒸乙醚/戊烷/ 二氯甲烷(v/v/v:1/1/3)重復萃取3次，以去除揮發(fā)性的香氣物質。取20mL得到的溶液以5mL/min的流速通過Sep-Pak C18E (lg, 6mL)固相萃取預裝柱,用20mL的超純水以5mL/min的流速沖洗雜質，然后用IOmL的甲醇(色譜純)洗脫，在30°C下減壓旋蒸至干后，用20mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH7)溶解。實施例2:豌豆中結合態(tài)香氣物質前體物質的提取及純化將豌豆晾干后粉碎，取IOg于錐形瓶中，加入20mL的丙酮/乙醇(v/v3:7)，常溫下浸泡12h,超聲0.5h后,將浸提液裝在50mL離心管中，后在4°C下8000rpm離心15min,保存上清液，將殘渣再次用20mL丙酮/乙腈(v/v3:7)浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中,在4°C下8000rpm離心15min,將得到上清液與前一步得到的清液合并一起，裝于500mL的旋蒸瓶中，于旋蒸裝置上減壓蒸發(fā)至干，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解，然后將溶液置于250mL分液漏斗中，用20mL的重蒸乙醚/戊烷/乙酸乙酯(v/v/v:1/1/3)重復萃取3次，以去除揮發(fā)性的香氣物質。取20mL得到的溶液以5mL/min的流速通過Sep-PakC18E (lg, 6mL)固相萃取預裝柱,用20mL的超純水以5mL/min的流速沖洗雜質，然后用IOmL的甲醇(色譜純)洗脫，在30°C下減壓旋蒸至干后，用20mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解。實施例3:物化處理檢 測玉米中的結合態(tài)香氣物質將玉米晾干后粉碎，取IOg于錐形瓶中，加入20mL的乙腈/乙醇(v/v3:7)，常溫下浸泡12h,超聲0.5h后,將浸提液裝在50mL離心管中，后在4°C下8000rpm離心15min,保存上清液，將殘渣再次用20mL乙腈/甲醇(v/v3:7)浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中,在4°C下8000rpm離心15min,將得到上清液與前一步得到的清液合并一起，裝于500mL的旋蒸瓶中，于旋蒸裝置上減壓蒸發(fā)至干，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解，然后將溶液置于250mL分液漏斗中，用20mL的重蒸乙醚/戊烷/ 二氯甲烷(v/v/v:1/1/3)重復萃取3次，以去除揮發(fā)性的香氣物質。將得到的IOOmL溶液以10mL/min的流速通過Sep-Pak C18E (10g,60mL)固相萃取預裝柱,用200mL的超純水以10mL/min的流速沖洗雜質，然后用60mL的甲醇(色譜純)洗脫，在30°C下減壓旋蒸至干后，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解。將得到的結合態(tài)前體物質溶液用鹽酸調節(jié)pH為1，裝入安瓿瓶中密封，沸水浴加熱0.5h，迅速冷卻后打破安瓿瓶，調節(jié)pH為5，加8mL的澄清液于15mL的頂空瓶中，再加入3g氯化鈉以及內標，設定程序通過HS-SPME-GC-MS檢測。頂空固相微萃取的條件為:三相(Car/DVB/PDMS)萃取頭，60°C預熱5min，萃取吸附30min，GC解吸lOmin。其結果見表I。表I物化處理玉米中結合態(tài)香氣物質

權利要求
1.一種測定食品釀造谷物類原料結合態(tài)香氣物質的方法，其特征在于包括如下步驟:I)首先將谷物磨碎，然后通過有機溶劑的反復浸提，旋蒸至干去除有機相以及揮發(fā)性香氣物質；2)用pH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解，并進一步分離揮發(fā)性香氣物質后，通過固相微萃取最終得到結合態(tài)香氣物質的前體物質；3)旋蒸至干后，再次用pH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解，通過物化作用或者酶解作用使結合態(tài)香氣物質釋放；4)然后通過HS-SPME-GC-MS測定香氣物質的成分，并進行定性定量分析。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述原料為高粱、豌豆、大麥、玉米、大米、糯米、香米、小麥、黑麥、蕎麥、黃米、粳米、麩皮。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于有機溶劑浸提方法為，先用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨或其復配的溶劑浸泡原料12 36h后，超聲處理0.5 lh，離心后取上清，然后再將殘渣用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨或其復配的溶劑浸泡浸泡12 36h后，超聲處理0.5 lh，離心后取上清，合并兩次上清液備用。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于旋蒸至干去除有機相以及揮發(fā)性香氣物具體條件為在常溫和減壓的條件下進行的，既可以除去易揮發(fā)的物質，又保證了結合態(tài)物質前體不會分解。
5.如權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于進一步分離揮發(fā)性香氣物質采用有機溶劑乙醚、戊烷、二氯甲烷、乙酸乙酯單獨或復配反復萃取2 5次，以盡可能完全的將揮發(fā)性的香氣物質萃取 來，排除揮發(fā)性香氣物質的干擾。
6.如權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于固相微萃取的工藝為將初步得到的結合態(tài)香氣物質前體溶液通過Sep-Pak C18E固相萃取預裝柱，用2 6倍柱體積的超純水沖洗后，在用I 3倍柱體積的甲醇將結合態(tài)物質洗脫并接收，在30 40°C下減壓旋蒸至干后用PH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于固相微萃取參數為:樣品流速為2 IOmL/min,超純水的流速為2 10mL/min,甲醇的流速為0.5 5mL/min。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于物化方法為:用鹽酸調節(jié)pH為I 3，密閉處理后在80 100°C下水浴0.5 5h。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于酶解方法為添加β-D-葡萄糖苷酶，使得終濃度為5 10U/mL，密閉處理后，在25 45°C條件下緩慢振蕩I 5d。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特在于HS-SPME-GC-MS定性定量分析的方法為:通過將未知物質的質譜與NIST05a.L Datebase中的質譜進行比較，對相似度達70%以上且峰形較好的物質進行初步的定性，然后通過色譜圖計算得到初步定性物質的保留指數，與相應釀造產品中的常規(guī)成分的標準品的保留指數進行比對進行定性。對已定性的物質進行定量分析:先配置最大濃度的待測物質的混合標樣，然后梯度稀釋為12 16個濃度，取每種濃度的混標加到15mL頂空瓶中，加入內標，再加入氯化鈉飽和處理，進行HS-SPME-GC-MS的測定，利用標準品物質和內標物質峰面積比為橫坐標、濃度比為縱坐標制作標準曲線，將待測樣品中物質與內標物質的峰面積比值代入相應的標準曲線方程計算出待測物質的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定食品釀造谷物類原料中結合態(tài)香氣物質的方法，將釀造過程中應用的高粱、豌豆、大麥、小麥、玉米、大米、糯米等，通過研磨、浸提、旋蒸、溶解、液液萃取除去游離態(tài)香氣物質，然后通過固相微萃取最終得到結合態(tài)香氣物質的前體物質，再次經過旋蒸、溶解后通過高溫酸處理或者β-D-葡萄糖苷酶處理使其水解，從而使香氣物質得到釋放，最后通過頂空固相微萃取技術與氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(HS-SPME-GC-MS)，對其中香氣物質進行定性定量分析。本方法中結合態(tài)前體的提取在常溫下進行，既能排除原料自身游離態(tài)香氣物質的影響，又能避免結合態(tài)香氣物質的損失，從而實現結合態(tài)香氣物質的準確測定。
文檔編號G01N30/02GK103235058SQ20131015596
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權日2013年4月28日
發(fā)明者徐巖, 吳群, 朱偉岸 申請人:江南大學