專利名稱：用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其檢測方法，尤其是涉及一種基于生物條形碼模式構(gòu)建的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴重威脅人類健康的疾病之一，具有高發(fā)病率和高死亡率，隨著人們生活水平日漸提高，癌癥早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷已成關(guān)注焦點和研究熱點。腫瘤標志物是這樣一類物質(zhì),在腫瘤細胞的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產(chǎn)生,或者由機體對腫瘤細胞的反應(yīng)而產(chǎn)生，分泌并釋放到血液、細胞、體液中，可直接、有效反應(yīng)腫瘤細胞在體內(nèi)的產(chǎn)生、發(fā)展和治療效果等情況。顯然，檢測腫瘤標志物是實現(xiàn)癌癥早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的重要手段。目前，國內(nèi)外也已對此做了大量的研究工作，已有少量腫瘤標志物被應(yīng)用于臨床檢測。但總體而言，現(xiàn)有方法靈敏度有限，難以實現(xiàn)對癌前病變、早期患者體內(nèi)極低濃度腫瘤標志物的檢測。因此，開發(fā)高靈敏度的腫瘤標志物檢測方法仍是迫切需求。免疫傳感器是利用抗體與抗原之間的特異性識別與結(jié)合而研制成的一類生物傳感器，響應(yīng)速度快、特異性強、選擇性好、重現(xiàn)性好。電化學(xué)發(fā)光免疫分析是電化學(xué)發(fā)光和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物，具有快速、穩(wěn)定、選擇性強、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活多樣的優(yōu)點。基于納米粒子的生物條形碼技術(shù)是一種有效的信號放大和檢測技術(shù)，該方法通過目標蛋白第一抗體標記的磁性微球、目標蛋白、目標蛋白的第二抗體和條形碼DNA同時標記的納米金顆粒形成夾心式免疫復(fù)合物，磁場分離后，經(jīng)去雜交將條形碼DNA釋放，再通過下游檢測方法如PCR擴增、生物芯片法等檢測條形碼DNA數(shù)量以檢測目標蛋白濃度。該方法靈敏度超高，比常規(guī)ELISA高IO6倍，是目前報道的唯一一種具有聚合酶鏈擴增反應(yīng)靈敏度而又不需要酶放大的檢測體系。因具有超高靈敏度，生物條形碼技術(shù)自2003年問世以來，越來越受到科學(xué)家關(guān)注，但至今未見生物條形碼技術(shù)在免疫傳感器構(gòu)建方面的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于生物條形碼模式的檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其兼具生物條形碼技術(shù)的超高靈敏度和電化學(xué)發(fā)光免疫分析快速、穩(wěn)定、選擇性強、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活多樣的優(yōu)點，可以實現(xiàn)對超低濃度腫瘤標志物的檢測，達到對腫瘤疾病早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的目的，本發(fā)明還提供了上述檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，所述的工作電極為表面依次修飾有半胱胺、戊二醛、腫瘤標志物第一抗體、腫瘤標志物、以及腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的金電極，以牛血清白蛋白封閉非特異性活性位點。所述的參比電極為Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極，所述的對電極是鉬電極。所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物。一種制備用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的方法，包括以下步驟: (O固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極的制備
a.將直徑為3 5mm的金電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二招拋光處理，超聲2 min，超純水沖洗干凈后，置于0.5 M的H2SO4中，在O 1.6 V的電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定；
b.將步驟(a)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在0.1 mol/L的半胱胺溶液中，4°C下反應(yīng)10 h ；
c.將步驟(b)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在2.5%戊二醛水溶液中，4 °C下反應(yīng)I h ;
d.將步驟(c)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50μ g/mL的腫瘤標志物第一抗體中，4 °C下反應(yīng)12 18 h ; e.將步驟(d)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白中，4 °C下封閉I 2 h，即得固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極；
(2)腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的合成
a.導(dǎo)電納米球的合成:在干凈的燒杯中加入90 100mL的由乙醇、水及濃氨水組成的混合液，磁力攪拌30 min ;待溶液混合均勻后，磁力攪拌的同時，緩慢滴加5mL正硅酸四乙酯(TEOS);滴加完畢后，用封口膜密封燒杯口，反應(yīng)10 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在超純水中形成10 mg/mL的第一懸浮液；取2 mL第一懸浮液至離心管中，加入
0.18 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)后，室溫下混勻攪拌7 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在乙醇中形成0.5 mg/mL的第二懸浮液；取20 mL第二懸浮液至干凈的燒杯中，然后加入10 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4溶液超聲混勻；然后緩慢滴加3 mL的20 mM的檸檬酸三鈉溶液，磁力攪拌1 h，4000 rpm離心洗滌，沉淀物即粒徑約為80 100 nm的導(dǎo)電納米球，4 1:儲存?zhèn)溆茫?br> b.取1 2mg導(dǎo)電納米球，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)1 h，4000 rpm離心洗滌；
c.取步驟(b)所得的沉淀物，加入0.5 1 mL的0.001 M的電化學(xué)發(fā)光標記物溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)1 h，4000 rpm離心洗滌；
d.取步驟(c)所得的沉淀物，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反1 h ；
e.取3 5Pg腫瘤標記物第二抗體加入到步驟(d)所得的懸浮液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌，即可得到腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球，4 °C下儲存?zhèn)溆茫?br> (3)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝
a.將固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極，浸泡在含腫瘤標志物的溶液中，4 °C下溫育 50 min ；
b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h;
c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物。步驟(2)的(a)步驟中所述的乙醇、所述的水和所述的濃氨水的混合體積比為87:7:1。一種用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測腫瘤標志物的方法，具體步驟如下:
(O電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝
a.配制一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液，將權(quán)利要求2中制備得到的固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極，分別浸泡在不同濃度的腫瘤標志物的溶液中，4 °C下溫育50min ；
b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL的權(quán)利要求2中制備得到的腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h ；
c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器；
(2)標準曲線建立
將電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器放入含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液，啟動電化學(xué)反應(yīng)，測量電化學(xué)發(fā)光強度，獲得一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強度值，建立電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系；
(3)樣品測定
根據(jù)上述步驟獲得待測樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中腫瘤標志物的準確濃度。所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的魯米諾及其衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含I 3 mM的H2O2的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為9 11。所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含0.03 2 mM的2- (二丁基胺)乙醇(DBAE)的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為7 9。所述的腫瘤標志物為甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、堿性磷酸酶(ALP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE )、人絨毛膜促性腺激素(hCG )和J L茶酚胺類物質(zhì)。發(fā)明原理:現(xiàn)行電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中，電化學(xué)發(fā)光標記物直接標記在第二抗體上，一個腫瘤標志物抗原一般對應(yīng)于一個第二抗體，而一個第二抗體至多可以標記20個左右的電化學(xué)發(fā)光標記物，否則失去免疫活性，這就意味著一個腫瘤標志物抗原至多對應(yīng)于20個左右電化學(xué)發(fā)光標記物；本發(fā)明創(chuàng)新標記手段，采用生物條形碼模式，將電化學(xué)發(fā)光標記物不直接標記于第二抗體，而是和第二抗體一起固載到導(dǎo)電納米球之上，這樣，一個腫瘤標志物抗原對應(yīng)于一個導(dǎo)電納米球，而一個導(dǎo)電納米球表面可以標記數(shù)萬個電化學(xué)發(fā)光標記物，這就意味著，一個腫瘤標志物抗原可以對應(yīng)于數(shù)萬個電化學(xué)發(fā)光標記物，靈敏度大幅提高是必然的?？偠灾搶?dǎo)電納米球比表面積大，且具有導(dǎo)電表面，既不影響電化學(xué)發(fā)光標記物與電極之間的能量、電子傳遞，大幅度提高有效的電化學(xué)發(fā)光探針數(shù)目至傳統(tǒng)標記方法的千倍以上，又不會影響第二抗體活性，最終實現(xiàn)大幅度提高檢測靈敏度的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(O高靈敏度，本發(fā)明的檢測限達到10_3 10_4 pg/mL，而目前傳統(tǒng)的檢測方法檢測限最高也只有0.1 I pg/mL。(2)高選擇性，常見其他蛋白對本檢測體系均無干擾。原因在于:本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，是基于抗體與抗原之間的特異性識別與結(jié)合構(gòu)建的，干擾蛋白不是腫瘤標志物第一抗體和第二抗體的目標物，因此待測液中的干擾蛋白并不能與腫瘤標志物第一抗體和第二抗體結(jié)合，故對本檢測體系無干擾。(3)結(jié)果準確，回收率達到91% 110%。(4)操作簡單。綜上所述，本發(fā)明擬制備一種基于生物條形碼模式的檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，兼具生物條形碼技術(shù)的超高靈敏度和電化學(xué)發(fā)光免疫分析快速、穩(wěn)定、選擇性強、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活多樣的優(yōu)點，可以實現(xiàn)對超低濃度腫瘤標志物的檢測，達到對腫瘤疾病早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的目的。


圖1為腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的制備過程流程 圖2為基于生物條形碼模式構(gòu)建的檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備過程流程 圖3為一系列的電化學(xué)阻抗圖，阻抗的變化表明了電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的層層組裝制備過程(電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的層層組裝制備過程中的阻抗變化圖)。a:裸電極；b:組裝半胱胺后的金電極；c:組裝腫瘤標志物第一抗體后的金電極；d:組裝牛血清白蛋白后的金電極；e:組裝腫瘤標志物后的金電極；f:組裝復(fù)合功能化納米球后的金電極。實驗條件:50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)，含 5 mmol/L Fe (CN) 64_/3_ 溶液；
圖4為一系列的電化學(xué)發(fā)光行為圖，表明電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器層層組裝制備過程中電化學(xué)發(fā)光行為的變化。(電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器層層組裝制備過程中的電化學(xué)發(fā)光行為圖)a:裸電極；b:組裝半胱胺后的金電極；c:組裝腫瘤標志物第一抗體后的金電極；d:組裝牛血清白蛋白后的金電極；e:組裝腫瘤標志物后的金電極；f:組裝復(fù)合功能化納米球后的金電極。實驗條件:0.05 M碳酸鹽緩沖液(含I mM的H2O2),電位范圍O 1.0 V，掃速0.1 V/s ；
圖5中A為檢測一系列不同濃度(a g，4X 10_8 4X 10_6 ng/mL)腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)的電化學(xué)發(fā)光行為圖。B為不同濃度腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)的ECL信號一濃度線性圖。實驗條件:0.05 M碳酸鹽緩沖液(含ImM的H2O2),電位范圍O
1.0 V，掃速 0.1 V/s。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。具體實施例一
腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的合成，其具體步驟如下:
(a)導(dǎo)電納米球的合成:在干凈的燒杯中加入90 100 mL的由乙醇、水及濃氨水組成的混合液(Vi醇:V*:V濃氨水=87:7:1為宜)，磁力攪拌30 min ;待溶液混合均勻后，磁力攪拌的同時，緩慢滴加5 mL正硅酸四乙酯(TEOS)；滴加完畢后，用封口膜密封燒杯口，反應(yīng)10h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在超純水中形成10 mg/mL的第一懸浮液；取2 mL第一懸浮液至離心管中，加入0.18 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)后，室溫下混勻攪拌7 h ；4000 rpm離心洗漆,然后將沉淀物分散在乙醇中形成0.5 mg/mL的第二懸浮液；取20 mL第二懸浮液至干凈的燒杯中，然后加入10 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4溶液超聲混勻；然后緩慢滴加3 mL 20 mM的檸檬酸三鈉溶液，磁力攪拌I h，4000 rpm離心洗滌，所得沉淀物即粒徑約為80 100 nm的導(dǎo)電納米球，4°C儲存?zhèn)溆谩?b)取I 2 mg導(dǎo)電納米球，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌；
(c)取步驟(b)所得的沉淀物,加入0.5 I mL的0.001 M的電化學(xué)發(fā)光標記物(含氨基官能團的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物)溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h,4000 rpm離心洗漆；
(d)取步驟(c)所得的沉淀物，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h ；
(e)取3 5μg腫瘤標記物第二抗體加入到步驟(d)所得的溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，即可得到腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球，4 °C下儲存?zhèn)溆?。具體實施例二
半胱胺組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將直徑為3 5 mm的金電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，將金電極用超純水沖洗干凈，在超純水中超聲2 min，然后置于0.5 M的H2SO4中，在O 1.6 V的電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定；將該金電極用超純水沖洗干凈后 ，浸泡在0.1 mol/L的半胱胺溶液中4 °C下反應(yīng)10 h，用超純水沖洗干凈，即可得到半胱胺修飾的金電極。這一過程可用交流阻抗法進行監(jiān)測。如圖3所示，未修飾半胱胺之前的裸電極阻抗很小(曲線a)，修飾了半胱胺之后的金電極阻抗大大增加(曲線b)，表明半胱胺成功地組裝到金電極上。
具體實施例三 戊二醛、腫瘤標志物第一抗體組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將實施例二中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在含有2.5%的戊二醛水溶液中4°C下反應(yīng)I h;將該金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50 Pg/mL的腫瘤標志物第一抗體中4°C下反應(yīng)12 18 h，用超純水沖洗干凈，即可得到戊二醛、腫瘤標志物第一抗體修飾的金電極。這一過程可用交流阻抗法進行監(jiān)測。如圖3所示，修飾了戊二醛、腫瘤標志物第一抗體之后的金電極阻抗大大增加(曲線C)，表明戊二醛、腫瘤標志物第一抗體成功地組裝到金電極上。具體實施例四
牛血清白蛋白組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將實施例三中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白中4 °C下封閉I 2 h，用超純水沖洗干凈，即可得到牛血清白蛋白固載的金電極。這一過程可用交流阻抗法進行監(jiān)測。如圖3所示，組裝了牛血清白蛋白之后的金電極阻抗大大增加(曲線d)，表明牛血清白蛋白成功地組裝到金電極上。具體實施例五
腫瘤標志物組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將該實施例四中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在含腫瘤標志物的溶液中4 °〇下溫育50 min;用超純水沖洗干凈，即可得到腫瘤標志物組裝的金電極。這一過程可用交流阻抗法進行監(jiān)測。如圖3所示，組裝了腫瘤標志物之后的金電極阻抗大大增加(曲線e)，表明腫瘤標志物成功地組裝到金電極上。具體實施例六
腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將實施例五中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50 Pg/mL腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球溶液中4 °C下反應(yīng)I h;用超純水沖洗干凈，即可得到腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球組裝的金電極。這一過程可用交流阻抗法進行監(jiān)測。如圖3所示，修飾了腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球之后的金電極阻抗大大減小(曲線f)，因為制備腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球中用的新型吸附載體是導(dǎo)電納米球，所以組裝上腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球后阻抗大大減小，表明腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球成功地組裝到金電極上。具體實施例七
構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及腫瘤標志物的檢測，其具體步驟如下:
將實施例六中的金電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光標記物，選擇合適的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液。將上述的三支電極，放入合適的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液，啟動電化學(xué)反應(yīng)，測量電化學(xué)發(fā)光強度。配制一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液，按照前述步驟獲得一系列的對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強度值，建立電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)上述步驟獲得待測樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中腫瘤標志物的準確濃度。具體實施例八
以前列腺特異性抗原(PSA)為例檢測電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器組裝過程的電化學(xué)發(fā)光行
為
按照實施例一的操作步驟完成導(dǎo)電納米球、復(fù)合功能化納米球的制備。然后按照實施例二至六層層組裝金電極，在0.05 M碳酸鹽緩沖液(含I mM的H202)、電位范圍O 1.0 V、掃速0.1 V/s的實驗條件下，測試并記錄如下電極的電化學(xué)發(fā)光行為:a:裸電極(圖4.a)；b:組裝半胱胺后的金電極(圖4.b)；c:組裝腫瘤標志物第一抗體后的金電極(圖4.c)；d:組裝牛血清白蛋白后的金電極(圖4.d)；e:組裝腫瘤標志物后的金電極(圖4.e)；f:組裝復(fù)合功能化納米球后的金電極(圖4.f)。由圖4可以得出，a e均無發(fā)光信號，只有f有顯著的發(fā)光信號，是因為裸電極、半胱胺、腫瘤標志物第一抗體、牛血清白蛋白、腫瘤標志物均無標記電化學(xué)發(fā)光標記物，而復(fù)合功能化納米球標記有電化學(xué)發(fā)光標記物，所以只有在組裝上復(fù)合功能化納米球后，本發(fā)明的傳感器才會有電化學(xué)發(fā)光行為。本發(fā)明建立電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系后，可以由待測物的電化學(xué)發(fā)光信號強度直接得出腫瘤標志物的濃度。具體實施例九 本發(fā)明的靈敏度及線性范圍
以檢測腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)為例，按照發(fā)明內(nèi)容中的具體實驗步驟構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，在實驗條件:0.`05 M碳酸鹽緩沖液(含I mM的H2O2),電位范圍O 1.0 V,掃速0.1 V/s下測試電化學(xué)發(fā)光。如圖5所不，電化學(xué)發(fā)光信號隨著腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)濃度(4X 10_8 4X 10_6 ng/mL)的增加而增加，腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)濃度的對數(shù)與電化學(xué)發(fā)光強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為:1=4004.59 + 416.46*1呢(:，線性相關(guān)系數(shù)為0.9986。該公式中I是電化學(xué)發(fā)光強度，C是腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)的濃度。具體實施例十
其他蛋白對本發(fā)明構(gòu)建的傳感器的影響
本發(fā)明具有高選擇性，常見的牛血清白蛋白、小雞白蛋白、血漿蛋白、免疫球蛋白或者非目標腫瘤標志物等蛋白質(zhì)，對本發(fā)明的檢測應(yīng)用無干擾。為了確定本發(fā)明構(gòu)建的傳感器的特異性，以腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)作為目標腫瘤標志物，選擇小雞白蛋白、牛血清白蛋白、血漿蛋白、CEA、AFP、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原作為對照蛋白進行測定。按照發(fā)明內(nèi)容中傳感器制備步驟構(gòu)建對照蛋白的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，然后進行電化學(xué)發(fā)光行為測試，測試結(jié)果顯示，本電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器只對腫瘤標志物前列腺特異性抗原(PSA)有強的響應(yīng)，其他蛋白的電化學(xué)發(fā)光信號可以忽略，進一步驗證了本發(fā)明的高選擇性。具體實施例1^一 人唾液中腫瘤標志物的檢測
準確移取人唾液空白樣品，進行加標回收檢測，按照發(fā)明內(nèi)容中實施例一至實施例八的具體實驗步驟構(gòu)建傳感器并進行檢測，檢測結(jié)果見表I。表I人唾液中多種腫瘤標志物的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，其特征在于:所述的工作電極為表面依次修飾有半胱胺、戊二醛、腫瘤標志物第一抗體、腫瘤標志物、以及腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的金電極，以牛血清白蛋白封閉非特異性活性位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征在于:所述的參比電極為Ag/AgCl電極或者甘汞電極，所述的對電極是鉬電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物。
4.一種制備權(quán) 利要求1所述的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的方法，其特征在于包括以下步驟: (O固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極的制備 a.將直徑為3 5mm的金電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二招拋光處理，超聲2 min，超純水沖洗干凈后，置于0.5 M的H2SO4中，在O 1.6 V的電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定； b.將步驟(a)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在0.1 mol/L的半胱胺溶液中，4°C下反應(yīng)10 h ； c.將步驟(b)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在2.5%戊二醛水溶液中，4 °C下反應(yīng)I h ; d.將步驟(c)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50μ g/mL的腫瘤標志物第一抗體中，4 °C下反應(yīng)12 18 h ; e.將步驟(d)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白中，4 °C下封閉I 2 h，即得固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極； (2)腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的合成 a.導(dǎo)電納米球的合成:在干凈的燒杯中加入90 100mL的由乙醇、水及濃氨水組成的混合液，磁力攪拌30 min ;待溶液混合均勻后，磁力攪拌的同時，緩慢滴加5 mL正硅酸四乙酯；滴加完畢后，用封口膜密封燒杯口，反應(yīng)10 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在超純水中形成10 mg/mL的第一懸浮液；取2 mL第一懸浮液至離心管中，加入0.18 mL3-氨丙基三乙氧基硅烷后，室溫下混勻攪拌7 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在乙醇中形成0.5 mg/mL的第二懸浮液；取20 mL第二懸浮液至干凈的燒杯中，然后加入10mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4溶液超聲混勻；然后緩慢滴加3 mL的20 mM的檸檬酸三鈉溶液，磁力攪拌I h,4000 rpm離心洗漆,沉淀物即粒徑約為80 100 nm的導(dǎo)電納米球,4 °C儲存?zhèn)溆茫? b.取I 2mg導(dǎo)電納米球，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌； c.取步驟(b)所得的沉淀物，加入0.5 I mL的0.001 M的電化學(xué)發(fā)光標記物溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌； d.取步驟(c)所得的沉淀物，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h ；e.取3 5 Pg腫瘤標記物第二抗體加入到步驟(d)所得的懸浮液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌，即可得到腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球，4 °C下儲存?zhèn)溆茫? (3)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝 a.將固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極，浸泡在含腫瘤標志物的溶液中，4°C下溫育 50 min ； b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h; c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(2)的(a)步驟中所述的乙醇、水和濃氨水的混合體積比為87:7:1。
7.—種利用權(quán)利要求4 6中任一項所述的用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測腫瘤標志物的方法，其特征在于具體步驟如下: (O電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝 a.配制一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液，將權(quán)利要求2中制備得到的固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極，分別浸泡在不同濃度的腫瘤標志物的溶液中，4 °C下溫育50min ； b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL的權(quán)利要求2中制備得到的腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h ； c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器； (2)標準曲線建立 將電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器放入含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液，啟動電化學(xué)反應(yīng)，測量電化學(xué)發(fā)光強度，獲得一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強度值，建立電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系； (3)樣品測定 根據(jù)上述步驟獲得待測樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標志物溶液濃度之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中腫瘤標志物的準確濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測腫瘤標志物的方法，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的魯米諾及其衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含I 3 mM的H2O2的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為9 11。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測腫瘤標志物的方法，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標記物為含氨基官能團的三聯(lián)吡啶釕衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含0.03 2 mM的2- (二丁基胺)乙醇的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為7 9。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測腫瘤標志物的方法，其特征在于:所述的腫瘤標志物為甲胎蛋白、癌胚抗原、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原、堿性磷酸酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、人絨毛膜促性腺激素和兒茶酚 胺類物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測腫瘤標志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用，該免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，所述的工作電極為表面依次修飾有半胱胺、戊二醛、腫瘤標志物第一抗體、腫瘤標志物、以及腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的金電極，以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點；其制備方法包括固載有腫瘤標志物第一抗體的金電極的制備步驟；腫瘤標志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標記物同時標記的復(fù)合功能化納米球的合成步驟；最后將得到的金電極和復(fù)合功能化納米球組裝成電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的步驟，優(yōu)點是靈敏度高、分析速度快、穩(wěn)定、選擇性強、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活。
文檔編號G01N33/574GK103116023SQ20131003229
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者杜書平, 郭智勇, 郝婷婷, 陳貝貝, 王澤波 申請人:寧波大學(xué)