用于診斷阿耳茨海默氏病(ad)的方法
【專(zhuān)利摘要】公開(kāi)了一種用于診斷阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中檢測(cè)懷疑具有AD的人的生物學(xué)樣品中的Aβ特異性抗體，其包括下列步驟：-使所述樣品與Aβ聚集體或與具有Aβ聚集體樣表面的顆粒接觸，并且容許所述Aβ特異性抗體結(jié)合所述Aβ聚集體，并-通過(guò)單一顆粒檢測(cè)技術(shù)(single?particle?detection?technique)，優(yōu)選通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選(FACS)檢測(cè)與所述Aβ聚集體結(jié)合的所述Aβ特異性抗體；且其中與已知AD狀態(tài)的樣品中的量比較檢出的Aβ特異性抗體的量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于診斷阿耳茨海默氏病(AD)的方法
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體及的方法，尤其與阿耳茨海默氏病(Alzheimer，s disease, AD)有關(guān)及用于診斷阿耳茨海默氏病。
[0002]AD是一種復(fù)雜的進(jìn)行性病癥，其牽涉使病理學(xué)級(jí)聯(lián)，包括腦中的淀粉狀蛋白-β聚集和斑形成，tau蛋白的超磷酸化(hyperphosphorylation)與神經(jīng)元內(nèi)纏結(jié)的形成相互作用。伴隨這些腦蛋白質(zhì)的聚集和超磷酸化，炎性過(guò)程促成突觸完整性的喪失和進(jìn)行性神經(jīng)變性。
[0003]淀粉狀蛋白β肽(Αβ或A-beta)從具有主要為alpha-螺旋或無(wú)規(guī)卷曲二級(jí)結(jié)構(gòu)的可溶性形式轉(zhuǎn)化成具有beta-片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的聚集形式(其最終在腦中形成淀粉狀蛋白斑)代表AD病理學(xué)的第一標(biāo)志之一。Αβ的幾種形式，即C及N端截短的或經(jīng)修飾的肽促成腦中的Aβ斑形成。Αβ的三種主要C端變體包括肽Aβ 1-40(由40個(gè)氨基酸(aa)組成，Val-40為最后一個(gè)aa), Αβ 1-42,和Αβ 1-43。除了 C端截短肽的這些主要形式外,還存在不太頻繁出現(xiàn)的其它截短形式，即Αβ 1-37，Αβ 1-38，和Αβ 1-39。Αβ的N端變體由Αβ 3-40/42/43和Αβ 11-40/42/43組成。在所有這些N端截短形式中，谷氨酸占據(jù)第一個(gè)位置。此aa不是穩(wěn)定的，而是經(jīng)歷變化以建立焦谷氨酸(pE)，導(dǎo)致形成Αβ P (E) 3-40/42和A β P (E) 11-40/42。ρΕ殘基自發(fā)形成或者通過(guò)稱(chēng)為谷氨酰基環(huán)化酶的酶酶促形成。
[0004]直到最近，AD的診斷是完全臨床診斷，其基于至少兩個(gè)領(lǐng)域(例如認(rèn)識(shí)，功能)的認(rèn)知缺陷的逐漸發(fā)生，這在沒(méi)有另一種可辨別原因(例如血管)的情況中負(fù)面影響患者的日常生活。AD的臨床診斷的限制是誤診的高比率(專(zhuān)家為80%診斷特異性)和如下的實(shí)情，即僅可以在疾病已經(jīng)停止導(dǎo)致功能性缺陷的實(shí)質(zhì)性神經(jīng)元喪失的晚期時(shí)間點(diǎn)時(shí)做出診斷。
[0005]基于經(jīng)過(guò)過(guò)去20年搜集的知識(shí),診斷AD的方式在快速變化。一組由B.Dubois(巴黎)領(lǐng)導(dǎo)的研究人員第一次整合數(shù)據(jù)，其已經(jīng)從調(diào)查出現(xiàn)AD根本的病理學(xué)，出現(xiàn)診斷性算法(Dubois等，Lancet Neurol.9 (2010): 1118-1127)。依照作者，AD的診斷基于特定的認(rèn)知缺陷(情景記憶的變化)，其必須與疾病特異性生物標(biāo)志物的變化(如通過(guò)結(jié)構(gòu)MRI評(píng)估的海馬萎縮；AD典型的腦脊液標(biāo)簽(signature)(低A42,高總tau,高磷酸Tau);陽(yáng)性淀粉狀蛋白成像；限定的遺傳風(fēng)險(xiǎn))組合發(fā)生。最近，NIH-NINCDS工作組已經(jīng)很大程度上采用此病理生理學(xué)驅(qū)動(dòng)的診斷算法(McKhann 等，Alzheimer’ s&Dementia7 (2011): 263-269)。主要出于實(shí)際目的，NIH NINCDS工作組保留AD型的MCI (輕度認(rèn)知損傷)為AD的早期階段的診斷。
[0006]由國(guó)立老齡化研究所(NationalInstitute of Aging) (NIA, NIH, USA)和阿爾茨海默協(xié)會(huì)(Alzheimer Association)任命的工作組已經(jīng)采用如下的觀(guān)念，即依靠反映疾病病理學(xué)的生物標(biāo)志物增強(qiáng)AD的臨床診斷。通過(guò)這樣做，AD不再是通過(guò)排除進(jìn)行的診斷，而是開(kāi)始為正面診斷。NIA和AA沒(méi)有完全遵循由Dubois及同事提出的生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的算法的實(shí)情反映目前可用的生物標(biāo)志物的限制。AD腦脊液(CSF)標(biāo)簽可以作為一個(gè)例子討論。AD患者的CSF顯示典型的樣式，即Αβ 1-42的降低和總Tau(tTau)和磷酸Tau(pTau)的升高。標(biāo)簽存在于AD患者中，但是沒(méi)有隨時(shí)間檢出變化。實(shí)際上，在有AD風(fēng)險(xiǎn)的患者(即MCI患者)群體中，其鑒定出繼續(xù)形成臨床癥狀的人。已經(jīng)處于所述階段，CSF顯示與在充分發(fā)展的AD患者中相同的表達(dá)樣式和變化量。如此，雖然不可能限定Αβ 1-42、tTau和pTau的正常范圍，但是沒(méi)有定義轉(zhuǎn)折點(diǎn)，即給定患者中例如Aβ生理學(xué)從正常轉(zhuǎn)化成病理學(xué)的時(shí)刻。任何目前遵循但尚未確認(rèn)的生物標(biāo)志物也就是如此。這點(diǎn)的主要原因是僅有幾項(xiàng)評(píng)估此問(wèn)題的縱向研究，因?yàn)橛捎谒鼈儗?duì)患者造成的風(fēng)險(xiǎn)和/或與其關(guān)聯(lián)的成本而不可能容易地重復(fù)CSF、MR1、淀粉狀蛋白成像檢查。
[0007]如此，仍然缺乏可以以低風(fēng)險(xiǎn)和成本重復(fù)應(yīng)用的可靠生物標(biāo)志物。由于至今開(kāi)發(fā)基于血液的生物標(biāo)志物耗費(fèi)的全部努力失敗，情況尤其如此(Hampel等，Nat.Rev.DrugDiscov.9 (2010):560-574)。此類(lèi)生物標(biāo)志物的利用度對(duì)于疾病緩解療法的開(kāi)發(fā)會(huì)是最重要的。此類(lèi)療法施用得越早，成功的機(jī)會(huì)越大。而且，可以將此類(lèi)努力限于借助于特定生物標(biāo)志物鑒定的真正AD病例。
[0008]至今，已經(jīng)在AD和MCI (AD的癡呆前階段)中評(píng)估了 A β (測(cè)試的各種A β種類(lèi)和聚集體狀態(tài))。最近的發(fā)現(xiàn)顯示了存在有AD患者和健康對(duì)照的血漿和腦脊液中含有的IgG和 IgM 的抗促淀粉狀變(amyloidogenic)活性(O’Nuallain 等，J.Clin.1mmunol.30(2010)Suppl.1: S37-S42; Marcel1 等,J Neural.Transm.116 (2009): 913-920)。通過(guò)評(píng)估對(duì)各種A β形式/聚集狀態(tài)特異性的IgG和/或IgM的ELISA或免疫沉淀測(cè)定法獲得的結(jié)果顯示了 AD和MCI患者比健康對(duì)照展現(xiàn)出更低水平的血清Αβ自身抗體。雖然這些研究顯示了自身抗體濃度的差異，使用的方法缺乏靈敏性和特異性，其對(duì)于使用它們作為以高選擇性和特異性鑒定AD或MCI患者的預(yù)測(cè)性診斷工具會(huì)是必需的。至今使用的大多數(shù)方法基于ELISA技術(shù)。為了提高這些測(cè)定法的靈敏性，一些方法使用A β 1-42肽的放射性標(biāo)記。用經(jīng)氯胺T標(biāo)記的Αβ 1-42使用免疫沉淀測(cè)定法來(lái)測(cè)量健康對(duì)照和AD患者之間的差異，Brettschneider等,(Brettschneider等,Biol.Psychiatry57(2005):813-817)的 ROC (接收器工作特性)分析在靈敏性設(shè)置為81.3%時(shí)達(dá)到46.7%的特異性。比較而言，Bayer等(W02010/128139Al;Marcello 等，JNeural.Transm.116(2009):913-920)使用基于ELISA 的方法，其中將焦谷氨酸-Αβ片段在板上包被。在此情況中，用抗IgM-HRP抗體檢測(cè)健康對(duì)照和AD患者中的抗A β特異性IgM-自身抗體顯示了在靈敏性設(shè)置為80%時(shí)特異性是60%。至今，這些方法無(wú)一滿(mǎn)足會(huì)使它們符合作為AD的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物(>80%特異性)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0009]不知道這兩組患者中降低的Αβ特異性抗體血清濃度的原因。有兩種一般且非互相排斥的解釋:降低的生成(疾病特異性對(duì)一般免疫衰老)和再分布(抗體在例如腦中存在的淀粉狀蛋白沉積物中包載)。關(guān)于這些Αβ同源性(自身)抗體的潛在功能的支持來(lái)自最近的研究，其證明了商品化血液產(chǎn)品，即從源自健康供體的血漿提取的合并IgG級(jí)分已經(jīng)顯示為含有對(duì)Αβ肽特異性的抗體。兩家不同公司的兩種此類(lèi)產(chǎn)品，即靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)制劑目前在進(jìn)行臨床測(cè)試以評(píng)估其干擾或預(yù)防AD病理學(xué)的潛力。
[0010]另一個(gè)未答復(fù)的問(wèn)題是Αβ特異性抗體的水平在疾病實(shí)體中是否降低，所述疾病實(shí)體在其病理生理學(xué)，即帕金森氏癡呆(PDD)、癡呆伴路易體(DLB)、腦淀粉樣血管病(CAA)、慢性頭部創(chuàng)傷(例如拳擊)中具有Αβ組分。這些疾病中A β聚集體特異性抗體水平的調(diào)查可以添加至對(duì)導(dǎo)致AD中Αβ聚集體特異性抗體的血清濃度降低的過(guò)程的目前了解。具有這些疾病的患者的血清的調(diào)查可以澄清如下的問(wèn)題，該問(wèn)題關(guān)于AD是否源自特定的免疫缺陷(在Αβ特異性抗體滴度僅在AD中而不在以Aβ病理學(xué)為特征的其它疾病中降低的情況中)或者降低的Aβ特異性抗體水平是否源自由于廣泛的Aβ病理學(xué)所致的再分布。在前一種情況中，測(cè)試會(huì)是高度疾病特異性的生物標(biāo)志物，并且因此應(yīng)當(dāng)有助于區(qū)別AD與前述疾病實(shí)體。假設(shè)第二種情況，測(cè)試可以適合于鑒定疾病由Αβ病理學(xué)驅(qū)動(dòng)的患者。
[0011]在W02010/128139A1中，公開(kāi)了用于診斷AD的生物標(biāo)志物和方法，尤其是針對(duì) pGlu A β 的抗體。Funke 等(Curr.Alz.Res., 6 (3) (2009): 285-289)討論 了 體液中Αβ聚集體的檢測(cè)是否是適合于AD早期診斷的方法。Maetzler等(J.Alz.Dis.26 (I)(2011):171-179)報(bào)告了針對(duì)淀粉狀蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)衍生的抗原的自身抗體在路易體關(guān)聯(lián)癡呆的血清和腦脊液中升高。Funke等(Rejuv.Res.13(2-3) (2010):206-209)公開(kāi)了用于Αβ 聚集體的單一顆粒檢測(cè)系統(tǒng)。Fukumoto 等(Faseb J.，I (24) (2010):2716-2726)公開(kāi)了高分子量β -淀粉狀蛋白寡聚體在AD患者的腦脊液中升高。
[0012]本發(fā)明的目的是提供用于改善AD的診斷，尤其是用于追蹤疾病的早期階段及用于觀(guān)察用于治療AD的藥物的臨床試驗(yàn)發(fā)展的方法。別的目的是提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中，尤其是人AD患者或懷疑具有AD或有風(fēng)險(xiǎn)形成AD的人個(gè)體中的抗Αβ抗體的可靠工具。本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中，尤其是人AD患者或懷疑具有或者有風(fēng)險(xiǎn)形成AD的人個(gè)體的樣品中的抗Αβ抗體的手段。
[0013]因此，本發(fā)明提供了用于診斷阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中檢測(cè)懷疑具有AD的人的生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體，其包括下列步驟:
[0014]-使所述樣品與Aβ聚集體或與具有A β聚集體樣表面的顆粒接觸，并且容許A β特異性抗體結(jié)合Aβ聚集體，并
[0015]-通過(guò)單一顆粒檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)選通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選(FACS)檢測(cè)與Αβ聚集體結(jié)合的Αβ特異性抗體；
[0016]且其中與已知AD狀態(tài)的樣品中的量比較檢出的Αβ特異性抗體的量。
[0017]本發(fā)明，公開(kāi)了檢測(cè)A β特異性自身抗體的新方法，用作對(duì)診斷AD并監(jiān)測(cè)AD的形成非常有用的診斷工具。本方法基于如下的發(fā)明，不僅使用單一 Αβ肽作為Αβ特異性抗體的捕捉工具，而是取而代之，使用Aβ聚集體，且由此使用單一顆粒檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)生成的抗體-Αβ聚集體復(fù)合物，且此類(lèi)抗體的量與AD的形成相關(guān)聯(lián)。通過(guò)本方法檢出的量越低，就AD而言的疾病狀態(tài)越晚期。簡(jiǎn)言之，例如通過(guò)過(guò)夜溫育生成Aβ聚集體(源自不同Αβ截短的和經(jīng)修飾的型式)。隨后，將Αβ聚集體與源自健康供體(HD)或AD患者的血清樣品一起溫育以容許本抗體(IgG和IgM兩者)的結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何合適的方法，例如通過(guò)使用識(shí)別與Αβ聚集體結(jié)合的Αβ特異性抗體的經(jīng)標(biāo)記的二抗檢測(cè)與Αβ聚集體結(jié)合的抗體。例如，可以使用經(jīng)藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的二抗。此后，使用單一顆粒檢測(cè)技術(shù)，諸如FACS (熒光活化細(xì)胞分選)分析(又稱(chēng)為流式細(xì)胞術(shù))測(cè)量包含與A β聚集體結(jié)合的Aβ特異性抗體(和任選一種或多種檢測(cè)劑，諸如二抗)的免疫復(fù)合物。使用依照本發(fā)明的方法，可以顯示與健康受試者相比，AD患者含有較少的Αβ特異性免疫球蛋白，其對(duì)依照本發(fā)明提供的Αβ聚集體(游離的Αβ特異性免疫球蛋白)有反應(yīng)性。此夕卜，使用依照本發(fā)明的方法，可以顯示源自AD患者的Αβ特異性免疫球蛋白(針對(duì)依照本發(fā)明提供的Αβ聚集體)的反應(yīng)性可以通過(guò)稱(chēng)為解蔽(從自身抗體除去潛在結(jié)合的Αβ抗原)的方法提高。這與來(lái)自健康受試者(其中在以特殊方式處理這些血清后不能檢出針對(duì)Αβ聚集體的反應(yīng)性的此類(lèi)升高)的Αβ特異性免疫球蛋白的反應(yīng)性形成對(duì)比。另一方面，解蔽(=血清中已經(jīng)結(jié)合的A β解離)后IgM抗體的反應(yīng)性揭示了 AD患者中升高的IgM水平。另外，還測(cè)定具有和沒(méi)有解蔽情況下IgG水平之間的差(delta(A)值)。與健康對(duì)照相比,此參數(shù)在AD患者中也是升高的,顯示在疾病的病理學(xué)狀態(tài)中Αβ對(duì)抗體的較高抗體占據(jù)。此外，憑借本發(fā)明，提供了數(shù)據(jù)，其顯示了與至今公開(kāi)的方法相比，本方法具有高得多的檢測(cè)Αβ特異性抗體的能力，如此具有高得多的診斷AD的能力。鑒于這些實(shí)情，依照本發(fā)明的方法滿(mǎn)足預(yù)測(cè)性診斷工具鑒定AD及追蹤給定患者對(duì)治療的臨床響應(yīng)的理論前提。
[0018]本發(fā)明開(kāi)發(fā)用于分析人樣品中的Αβ特異性抗體。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案是檢測(cè)人Αβ特異性抗體,優(yōu)選人IgG或IgM抗體,尤其是人IgG抗體。如已經(jīng)提及的,人中Aβ特異性抗體的檢測(cè)原則上是本領(lǐng)域中已知的；然而，不能證實(shí)作為可能的生物標(biāo)志物的作用。如用本發(fā)明顯示的，這也是由于本領(lǐng)域中可用的檢測(cè)方法的分析不足所致。由于依照本發(fā)明的方法的優(yōu)越性，實(shí)現(xiàn)人樣品中的這些抗體作為生物標(biāo)志物的利用度。因此，本發(fā)明特別適合于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的自身抗體。因而，在本方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，要檢測(cè)和量化的Αβ特異性抗體是自身抗體。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)方法形成對(duì)比，本方法使用A β聚集體作為探針用于結(jié)合來(lái)自樣品的Αβ特異性抗體。雖然此類(lèi)聚集體原則上是本領(lǐng)域中已知的，但是沒(méi)有認(rèn)識(shí)到在分析Αβ特異性抗體(尤其在人樣品中)中使用此類(lèi)聚集體可以顯著改善還與單一顆粒檢測(cè)技術(shù)，諸如FACS組合的此類(lèi)方法。由于使用此類(lèi)聚集體，用單一顆粒檢測(cè)技術(shù)(其是多個(gè)不同領(lǐng)域中且用于不同問(wèn)題的建立技術(shù))的檢測(cè)對(duì)于分析人樣品(諸如血液)中的Αβ特異性抗體是可能的，所述人樣品通常是非常復(fù)雜且難以處理的。
[0020]優(yōu)選地，要依照本發(fā)明使用的聚集體的尺寸經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行分析使用。這可以通過(guò)在生成聚集體期間建立某些參數(shù)完成。根據(jù)生成聚集體期間應(yīng)用的條件，可以調(diào)節(jié)聚集體的大小。依照本發(fā)明的A β聚集體的優(yōu)選大小是50nm至15 μ m,優(yōu)選IOOnm至10 μ m,尤其是200nm至5μπι(以聚集體的長(zhǎng)度(即最常的延伸)限定)。
[0021]提供適合于本發(fā)明的聚集體的優(yōu)選方法包括如下的步驟，即于2至9的pH將A β ~1~42妝，A β -1~43妝，A β -3-42或A β -p (E) 3-42妝或不太優(yōu)選C端截短的A β妝,諸如Αβ-1-40肽溫育至少20分鐘，優(yōu)選至少I(mǎi)小時(shí)，尤其是至少4小時(shí)。溫育的持續(xù)時(shí)間是調(diào)節(jié)聚集體大小的參數(shù)之一:溫育越長(zhǎng)，聚集體越大。典型的溫育時(shí)間是10分鐘至24小時(shí)。較短的溫育時(shí)間通常導(dǎo)致僅非常短的聚集體和少量的聚集體；在顯著長(zhǎng)于48小時(shí)的溫育時(shí)間的情況中生成的聚集體通常不是本方法中優(yōu)選的。當(dāng)然，也可以將聚集體分選并“篩選”以達(dá)到期望的大小(若想要的話(huà))，例如通過(guò)分級(jí)離心和類(lèi)似的技術(shù)進(jìn)行。
[0022]依照本方法，使其中要檢測(cè)Αβ特異性抗體的樣品與Αβ聚集體接觸以實(shí)現(xiàn)樣品中可能存在的A β特異性抗體(和反應(yīng)性相對(duì)A β聚集體)結(jié)合。因此，必須調(diào)節(jié)A β聚集體的濃度以提供對(duì)于抗體足夠的結(jié)合位置。因而，優(yōu)選地，用于結(jié)合樣品中的抗體的Αβ聚集體的濃度在0.001至I μ Μ，優(yōu)選0.01至0.1 μ M的范圍中。最佳濃度還依賴(lài)于要結(jié)合的抗體的性質(zhì)，樣品的性質(zhì)，計(jì)劃的接觸時(shí)間和聚集體的大小。
[0023]本方法主要用于對(duì)人樣品應(yīng)用。因此，優(yōu)選的是，生物學(xué)樣品是人血液或源自人血液的樣品，優(yōu)選人血清或人血漿；人腦脊液或人淋巴。憑借此類(lèi)樣品來(lái)源，還可以建立連續(xù)且常規(guī)的測(cè)試(尤其對(duì)于源自血液的樣品)。[0024]容許樣品中的抗體與聚集體適當(dāng)結(jié)合的優(yōu)選接觸時(shí)間是至少10分鐘(例如10分鐘至48小時(shí))，優(yōu)選15分鐘至24小時(shí)，尤其是30分鐘至2小時(shí)。
[0025]若生物學(xué)樣品沒(méi)有特別預(yù)處理，則具有對(duì)A β聚集體的結(jié)合能力的A β特異性抗體會(huì)在與Αβ聚集體接觸期間被結(jié)合。依照本發(fā)明的方法不會(huì)檢出樣品中遮蔽的Αβ特異性抗體(即那些已經(jīng)與結(jié)合配偶(例如包含A β的結(jié)構(gòu)，或內(nèi)源A β肽)結(jié)合的抗體)(缺乏此類(lèi)特定樣品預(yù)處理)。雖然僅反應(yīng)性抗體的鑒定和量化在許多情況中會(huì)是足夠且期望的，但是可以有如下的情況或診斷問(wèn)題，其中應(yīng)當(dāng)檢測(cè)樣品中Αβ特異性抗體的總量(反應(yīng)性和非反應(yīng)性)或全部的、反應(yīng)性Αβ特異性抗體，非反應(yīng)性(“遮蔽”)的數(shù)目和Αβ特異性抗體的總數(shù)。
[0026]因此，依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將樣品解蔽，即在與依照本發(fā)明的Αβ聚集體接觸前將Αβ特異性抗體從對(duì)樣品中存在的結(jié)合配偶的任何結(jié)合“釋放”。這容許檢測(cè)樣品中的所有Αβ特異性抗體而不僅僅檢測(cè)那些沒(méi)有與樣品中的結(jié)合配偶結(jié)合的抗體(“游離的”或“反應(yīng)性”抗體)。在本發(fā)明的過(guò)程中，在本發(fā)明的過(guò)程中，確定了反應(yīng)性Αβ特異性抗體，尤其是反應(yīng)性Αβ特異性IgG的量是用于AD診斷和形成的關(guān)鍵標(biāo)志物。如上文所述，本方法還適合于測(cè)定樣品中的Αβ特異性抗體總體量，即游離的(或“反應(yīng)性”)抗體及那些在樣品中已經(jīng)(例如與Αβ結(jié)構(gòu))結(jié)合的抗體。這可以有助于建立樣品中反應(yīng)性對(duì)非反應(yīng)性抗體的差(△)，即對(duì)于AD診斷也有重大意義的參數(shù)。雖然此類(lèi)差在具有就AD而言的“健康狀態(tài)”的人中不存在(或較低)，此差對(duì)于AD中的標(biāo)志物功能(關(guān)于Αβ特異性IgG和Αβ特異性IgM)是至關(guān)重要的。為了使用Αβ特異性IgM作為用于AD診斷的參數(shù)，實(shí)施本方法前的解蔽步驟是特別優(yōu)選的，如此樣品中反應(yīng)性對(duì)非反應(yīng)性抗體的差(△)會(huì)限定并用作相關(guān)參數(shù)。
[0027]依照本發(fā)明的方法應(yīng)用單一顆粒檢測(cè)技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)容許鑒定并量化(“計(jì)算”)Αβ特異性抗體對(duì)Αβ聚集體的“陽(yáng)性”結(jié)合結(jié)果的數(shù)目和計(jì)數(shù)。此技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是FACS，其是一種在本領(lǐng)域中建立的技術(shù)。要用于檢測(cè)與Αβ聚集體結(jié)合的抗體的其它檢測(cè)方法是例如Luminex或質(zhì)譜術(shù)。
[0028]依照Luminex技術(shù)，可以如材料和方法中描述的那樣實(shí)施樣品制備。在樣品制備后，可以通過(guò)與熒光染色的微球偶聯(lián)的二抗檢測(cè)由特異性Aβ特異性抗體識(shí)別的Αβ聚集體，所述熒光染色的微球可以在多重檢測(cè)系統(tǒng)，例如Luminex閱讀器中檢測(cè)(Binder等，Lupusl5(2005):412-421)。
[0029]若使用質(zhì)譜術(shù)作為單一顆粒檢測(cè)技術(shù)，則也可以如在下文實(shí)施例部分的材料和方法中描述的那樣實(shí)施樣品制備。如描述的那樣完成樣品制備。在樣品制備后，可以通過(guò)與過(guò)渡元素的穩(wěn)定同位素偶聯(lián)的二抗檢測(cè)由特異性抗體識(shí)別的Αβ聚集體，所述過(guò)渡元素的穩(wěn)定同位素可以通過(guò)原子質(zhì)譜術(shù)檢測(cè)。然后，可以將樣品噴霧到加熱至溫度>5，500Κ的充滿(mǎn)氬等離子體的感應(yīng)線(xiàn)圈。將樣品蒸發(fā)并離子化成其原子組成，并且通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜術(shù)量化有同位素標(biāo)簽的抗體的數(shù)目(Janes等，Nat.Biotechnol.29(2011):602-604)。
[0030]或者，也有可能應(yīng)用單一顆粒檢測(cè)技術(shù)，其中一個(gè)結(jié)合配偶(Αβ聚集體或抗體/血清)是固定化的，但是在流動(dòng)條件下測(cè)量結(jié)合。例子是Hybcell技術(shù)和表面等離振子共振技術(shù)。在本發(fā)明中使用Hybcell技術(shù),可以將血清樣品定位于Hybcell (旋轉(zhuǎn)圓筒)表面上，并且可以與直接熒光標(biāo)記的預(yù)溫育的Aβ聚集體或備選與經(jīng)熒光標(biāo)記的單克隆Aβ特異性二抗一起實(shí)施溫育。用激光檢測(cè)與Αβ聚集體結(jié)合的抗體(Ronacher, AnagnosticsTechnical Note ANA-TN-005 (2010))。若在依照本發(fā)明的方法中使用表面等離振子共振，可以應(yīng)用相反設(shè)置:可以在芯片表面上固定化預(yù)溫育的Αβ聚集體?？梢酝ㄟ^(guò)芯片表面上質(zhì)量增加檢測(cè)來(lái)自血清的Aβ特異性抗體對(duì)芯片上Αβ聚集體的結(jié)合，因此結(jié)合配偶的無(wú)標(biāo)記是必需的。為了提高靈敏性或者測(cè)定IgG亞型，抗IgG-AB的連續(xù)注射是有可能的(Cannon等，Anal.Biochem.328 (2004): 67-75)。代替對(duì)芯片表面直接固定化A β聚集體，可以使用捕捉抗體。對(duì)于此設(shè)置，將Αβ特異性抗體在芯片表面上固定化，接著注射預(yù)溫育的Αβ聚集體。在捕獲聚集體后，將血清注射，并通過(guò)質(zhì)量增加測(cè)量反應(yīng)性。
[0031]可以通過(guò)已知的任何合適的方法，例如熒光分光術(shù)實(shí)施檢測(cè)Αβ特異性抗體對(duì)依照本發(fā)明的Αβ聚集體的結(jié)合(Missailidis等，Methods in MolecularBiology248 (2003):431 _ 441),所述突光分光術(shù)用于通過(guò)二抗(例如經(jīng)標(biāo)記的抗IgG或抗IgM 二抗)檢測(cè)與Αβ聚集體結(jié)合的Αβ特異性抗體。
[0032]還可以使用特異性結(jié)合抗體的底物，諸如蛋白A或蛋白G實(shí)施與聚集體結(jié)合的自身抗體的檢測(cè)。另一種可能性是使用Αβ聚集體沉淀Αβ聚集體特異性自身抗體，清洗復(fù)合物，并將抗體生物素化。隨后，然后可以使用鏈霉抗生物素蛋白作為第二步試劑。
[0033]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，具有A β聚集體樣表面的顆粒是具有在其表面上固定化的Αβ聚集體的珠，尤其是磁珠。
[0034]已知AD狀態(tài)的樣品可以是任何樣品值，其容許分類(lèi)通過(guò)依照本發(fā)明的方法評(píng)估的樣品。它可以是具有已知AD狀態(tài)(例如沒(méi)有AD的健康人，或AD患者，尤其是具有已知疾病狀態(tài)的AD患者(例如通過(guò)簡(jiǎn)短精神狀態(tài)檢查(MMSE)測(cè)定))的人的真實(shí)的物理樣品或比較數(shù)值，諸如校正曲線(xiàn)。優(yōu)選的校正曲線(xiàn)包括AD狀態(tài)校正曲線(xiàn)，尤其是麗SE曲線(xiàn)中同一類(lèi)型的樣品(例如血液樣品)中Αβ特異性抗體的比較量。在標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)定系統(tǒng)中，依照本發(fā)明檢測(cè)的Αβ特異性抗體的絕對(duì)量可以與AD狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)給定患者的Αβ特異性抗體的降低量指示疾病的進(jìn)展。
[0035]還有可能為限定疾病狀態(tài)(例如“健康”，輕度AD，晚期AD，或依照麗SE量表)限定樣品中Αβ特異性抗體的某些閾值數(shù)值。閾值數(shù)值當(dāng)然取決于樣品和精確的檢測(cè)系統(tǒng)，但是可以開(kāi)發(fā)用于實(shí)施本發(fā)明的任何標(biāo)準(zhǔn)化方式。健康人的血清中的Αβ特異性IgG濃度通常介于1000和5000ng/ml之間，而AD患者的IgG濃度通常低得多，例如范圍為250至1500ng/ml。大多數(shù)AD患者具有小于1000ng/ml。因此，依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，樣品中低于閾值水平的A β特異性抗體量的檢出指示AD，其中閾值水平是1500ng/ml或更低，優(yōu)選1000ng/ml或更低，尤其是750ng/ml或更低。另一方面，在AD治療(尤其是通過(guò)免疫療法的AD治療)過(guò)程中此IgG濃度的上升指示成功的免疫療法。例如，若水平從在750ng/ml下上升至超過(guò)1000ng/ml或甚至超過(guò)1500ng/ml,則這會(huì)指示成功的免疫療法。
[0036]優(yōu)選地，Αβ特異性抗體的檢出量與從人取得樣品同時(shí)同一人的麗SE結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
[0037]依照本發(fā)明的方法特別適合于在疾病形成方面監(jiān)測(cè)給定的AD患者，尤其是用于將依照本發(fā)明的診斷結(jié)果與用于測(cè)定AD狀態(tài)和/或用于監(jiān)測(cè)治療性干預(yù)的效率的其它診斷工具聯(lián)系起來(lái)。因而，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)在不同時(shí)間取得的同一患者的樣品實(shí)施所述方法至少兩次。優(yōu)選地，將Αβ特異性抗體的檢出量與從患者取得樣品同時(shí)同一患者的麗SE結(jié)果聯(lián)系起來(lái)。為了監(jiān)測(cè)給定患者中AD的形成，優(yōu)選的是以定期時(shí)間間隔實(shí)施依照本發(fā)明的方法，例如每6個(gè)月至少一次，優(yōu)選每3個(gè)月至少一次，尤其是每個(gè)
月至少一次。
[0038]因此，本方法特別適合于隨時(shí)間以監(jiān)測(cè)方式與AD診斷結(jié)合使用。憑借本發(fā)明，提供人患者中的Αβ特異性自身抗體作為AD狀態(tài)的標(biāo)志物。在其血液中具有“正?！?Αβ特異性抗體水平的人就AD而言是“健康的”。若此水平在具有AD的患者或有風(fēng)險(xiǎn)形成AD或懷疑具有AD的受試者中是修飾的，則此類(lèi)修飾水平與AD相關(guān)聯(lián)?！靶揎椀摹彼娇梢允铅ˇ绿禺愋钥贵w的絕對(duì)數(shù)目修飾或Aβ特異性抗體(例如給定類(lèi)別的Αβ特異性抗體(IgG，IgM，等))的總數(shù)的反應(yīng)性的修飾。例如，降低的反應(yīng)性Αβ特異性IgG與AD相關(guān)聯(lián)，并且是AD的標(biāo)志物。另一方面，在IgM的情況中，(非反應(yīng)性；即結(jié)合的或遮蔽的)Αβ特異性IgM的水平改變?yōu)槠渌较蚓虯D而言具有標(biāo)志功能。憑借本方法，在反應(yīng)性A β特異性IgG的“健康”水平設(shè)置為100%時(shí)，反應(yīng)性A β特異性IgG的顯著降低，例如降低至70%和更低，至50%或更低或至30%和更低，指示AD形成。另一方面，在反應(yīng)性A β特異性IgM的“健康”水平設(shè)置為100%時(shí)，血液樣品中總IgM(反應(yīng)性+非反應(yīng)性)增加至少30%，例如至少50%或至少100%指示AD的形成。
[0039]因而，本發(fā)明的用途的一個(gè)優(yōu)選領(lǐng)域是診斷阿耳茨海默氏病(AD)。然而，本發(fā)明可用于與Αβ聯(lián)系或相關(guān)的所有病理學(xué)(“Αβ病理學(xué)”)，特別是疾病過(guò)程中出現(xiàn)Αβ沉積物的病理學(xué)而言，本發(fā)明還可用于免疫療法。關(guān)于此類(lèi)Αβ病理學(xué)的例子是帕金森氏癡呆(TOD)，癡呆伴路易體(DLB)，腦淀粉樣血管病(CAA)，包含體肌炎(IBM ;尤其是散發(fā)性IBM(sIBM))，或慢性頭部創(chuàng)傷(例如拳擊)。
[0040]由于本發(fā)明提供了用于AD及甚至用于AD形成的標(biāo)志物，有可能使用此方法以觀(guān)察疾病的形成和可能的治療方法的性能，尤其是治療方法是否使得能夠建立Αβ特異性抗體，尤其是IgG或IgM的“健康”或“健康者”水平。
[0041]因此，優(yōu)選地，使用本方法來(lái)監(jiān)測(cè)AD患者，尤其是用治愈或改善AD的藥物治療的AD患者。可以成功應(yīng)用本方法以在AD疫苗(例如用依照W02004/062556A，W02006/005707A, W02009/149486A 和 W02009/149485A 的 AD 模擬位；或用依照 W099/27944A 的 A β 衍生的疫苗)或Αβ靶向性疾病緩解藥物的臨床試驗(yàn)中觀(guān)察患者。
[0042]也可以使用依照本發(fā)明的方法來(lái)評(píng)估形成AD的風(fēng)險(xiǎn)或檢測(cè)早期階段AD。憑借本發(fā)明，原則上有可能就Αβ特異性自身抗體而言在比認(rèn)知損傷顯著更早時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)患者的免疫學(xué)設(shè)置變化。若在常規(guī)測(cè)試形式中建立，則這就大得多的群體部分而言可以容許AD早期診斷的顯著改善。這使患者適合AD的早期階段治療方案和/或預(yù)防(或延遲)策略，尤其是疫苗接種。
[0043]依照另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于實(shí)施依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其包含:
[0044]-A β聚集體，和
[0045]-樣品容器，尤其是用于人樣品(例如血液，血清，血漿)。
[0046]優(yōu)選地，依照本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步含有用于檢測(cè)與Αβ特異性抗體結(jié)合的Αβ聚集體的手段，優(yōu)選二抗，尤其是經(jīng)標(biāo)記的二抗，例如抗IgG或抗IgM抗體)。其它組分可以是標(biāo)準(zhǔn)品樣品，陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照，使用說(shuō)明書(shū)和合適的包裝手段(例如穩(wěn)固的盒，有色的管形瓶，等等)。[0047]附圖簡(jiǎn)述
[0048]本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步例示，但是不限于此。
[0049]圖1顯示了使用FACS分析進(jìn)行的Αβ聚集體大小測(cè)定?？梢允褂昧魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)硫磺素(Thioflavin)T陽(yáng)性Αβ 1-42聚集體，并且其描繪為斑點(diǎn)印跡中FLl-FITC A(對(duì)數(shù)分度(log-scale))和FSC-A(對(duì)數(shù)分度)通道中的同質(zhì)群體。使用商品化經(jīng)校正的大小珠(1、2、4、6、104Ρ15μπι)測(cè)定Αβ聚集體的大小分布(以FCS-A信號(hào)限定)，如FSC-A直方圖(B)中顯示的。
[0050]圖2顯示了使用基于FACS的測(cè)定法檢測(cè)對(duì)Αβ聚集體的單克隆抗體反應(yīng)性。Αβ 1-42單克隆抗體3Α5特異性結(jié)合Aβ 1_42聚集體(A)，但是不與Aβ p (E) 3_42聚集體(C)相互作用。比較而言，八^出)3-42特異性抗體0129結(jié)合Αβ P (E) 3-42而非Αβ 1-42聚集體(B+D)。在FL2-PE通道中使用抗免疫球蛋白-經(jīng)PE標(biāo)記的二抗測(cè)定反應(yīng)性。如B和C中顯示的熒光強(qiáng)度代表背景染色，如在將聚集體與單獨(dú)的經(jīng)PE標(biāo)記的二抗一起溫育時(shí)看到的。
[0051]圖3顯示了三種不同方法的測(cè)定靈敏性的比較。㈧將Αβ 1-42聚集體與IVIG稀釋系列一起溫育，并且使用流式細(xì)胞術(shù)在FL-2通道中測(cè)定反應(yīng)性。(B)于ρΗ9.2用Αβ1-42包被過(guò)夜的Maxisorp ELISA板上的IVIG滴定。(C)使用表面等離振子共振(BiaCore)對(duì)與SA-芯片上固定化的主要生物素化的Αβ 1-42相互作用的不同濃度IVIG的無(wú)標(biāo)記物檢測(cè)。請(qǐng)注意為了比較，所有結(jié)果以倍數(shù)背景信號(hào)給出。
[0052]圖4顯示了測(cè)定指定血清樣品中Αβ特異性IgG自身抗體反應(yīng)性。將來(lái)自健康供體(年齡為30至50歲)的 對(duì)照血清，或源自AD患者的血清進(jìn)行描述的FACS測(cè)定法。在FL2-PE通道中評(píng)估Αβ聚集體的熒光強(qiáng)度，并且以中值熒光強(qiáng)度(MFI)表示。圖5Β顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。比較來(lái)自源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgM特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。
[0053]圖5顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。比較源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgG特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。
[0054]圖6顯示了 IgG反應(yīng)性與簡(jiǎn)短精神狀態(tài)檢查(MMSE)得分的關(guān)聯(lián)。對(duì)24名AD患者檢查MMSE狀態(tài)，并且將那些患者的血清進(jìn)行描述的FACS測(cè)定法，并且測(cè)定中值FI。在結(jié)果和前圖中顯示了收集數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)。
[0055]圖7顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。比較源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgG特異性抗A β 3-42反應(yīng)性。
[0056]圖8顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。比較源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgG特異性抗A β P (E) 3-42反應(yīng)性。
[0057]圖9Α顯示了測(cè)定指定血清樣品中Αβ特異性IgM自身抗體反應(yīng)性。將來(lái)自健康供體的對(duì)照血清，或源自AD患者的血清進(jìn)行描述的FACS測(cè)定法。在FL2-PE通道中評(píng)估A β聚集體的熒光強(qiáng)度，并且以中值熒光強(qiáng)度(MFI)表示。圖9Β顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。比較來(lái)自源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgM特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。
[0058]圖10顯示了抗體解蔽后指定血清樣品中Aβ特異性IgM自身抗體反應(yīng)性的測(cè)定。將來(lái)自健康供體(HI)的對(duì)照血清，或源自AD患者的血清進(jìn)行描述的解蔽方法和隨后的FACS測(cè)定法。在FL2-PE通道中評(píng)估Αβ聚集體的熒光強(qiáng)度，并且以中值熒光強(qiáng)度(MFI)表/Jn ο
[0059]圖11顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。在自身抗體解蔽后比較來(lái)自源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgM特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。
[0060]圖12顯示了 ROC曲線(xiàn)分析。在抗原解離之前和之后分析源自AD患者的血清和源自健康個(gè)體的血清的IgG特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。使用Delta值，計(jì)算ROC曲線(xiàn)。
[0061]圖13顯示了代表用AFFIT0PE疫苗處理的患者中在疫苗接種之前，期間和之后A β聚集體特異性IgG抗體的絕對(duì)MFI值。顯示了源自在具有(患者Α)和沒(méi)有明礬(患者B)的情況中免疫的患者的血清的A β 1-42反應(yīng)性。在FL2-PE通道中評(píng)估A β聚集體的熒光強(qiáng)度，并且以MFI表示。
[0062]圖14顯示了在具有和沒(méi)有明礬的情況中用AFFIT0PE疫苗免疫的患者的以中值MFI數(shù)值表示的針對(duì)A β 1-42聚集體的免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由于有佐劑組中的一個(gè)極值，實(shí)施Mann-Whitney檢驗(yàn)(非正態(tài)分布)(A)在除去極值后,給出正態(tài)分布,并且實(shí)施Student t檢驗(yàn)(B)。這兩種檢驗(yàn)都是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p〈0, 05)。
實(shí)施例
[0063]材料和方法
[0064]使用表面等離振子共振(SPR-BIAcore)檢測(cè)Ag特異性抗體
[0065]Biacore系統(tǒng)提供可以用于固定化的多種芯片。對(duì)于此實(shí)驗(yàn)，使用經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白(SA)包被的芯片。為了避免配體經(jīng)由側(cè)鏈對(duì)芯片表面的非特異性結(jié)合，使用C端生物素化的Aβ肽(購(gòu)自Anaspec)。由于生物素-鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物是非常穩(wěn)定的，它最適合于延長(zhǎng)的連續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了優(yōu)化芯片的穩(wěn)健性及因此可再現(xiàn)性，將最大的響應(yīng)單位(約1500RU)固定化至流動(dòng)池上，而流動(dòng)池I保持為空，并用作參照。為了避免芯片表面上的非特異性結(jié)合，使用游離的生物素來(lái)飽和所有4個(gè)流動(dòng)池上的游離的SA結(jié)合位點(diǎn)。測(cè)量人樣品(已經(jīng)在HBS ρΗ7.4中以1:10至1:100稀釋)和范圍為lmg/ml至10 μ g/ml的IVIG稀釋系列(也在HBS pH7.4中稀釋)。在每次樣品注射后用IOmM甘氨酸-HCl (pHl.8)再生芯片表面。將所有實(shí)驗(yàn)于25°C實(shí)施。使用標(biāo)準(zhǔn)化方案進(jìn)行注射，以結(jié)合相200秒開(kāi)始，接著是解離相600秒。Rmax值定義為樣品注射結(jié)束時(shí)的響應(yīng)水平(以RU測(cè)量)。對(duì)于信號(hào)評(píng)估，使用集成的BIA評(píng)估軟件測(cè)定Rmax值。
[0066]使用ELISA檢測(cè)A g特異性抗體
[0067]將不同A β 肽(購(gòu)自 rPeptide)在 IOOmM NaHC03 (ρΗ9.2)中以濃度 5 μ g/ml 稀釋?zhuān)⒃贛aXisorp96孔板上包被過(guò)夜。為了防止非特異性結(jié)合，使用1%BSA/PBS于37°C將板封閉I小時(shí)。將ELISA用人血清樣品的連續(xù)稀釋(以1:10稀釋開(kāi)始)或通過(guò)添加結(jié)合緩沖液(PBS/0.l%BSA/0.l%Tween20)中稀釋的范圍為lmg/ml下至10 μ g/ml的濃度的IVIG于37°C實(shí)施I小時(shí)。在用PBS/0.l%Tween20重復(fù)清洗步驟(3次)后，于37°C添加抗人IgHRP (0.5 μ g/ml)檢測(cè)二抗I小時(shí)。將樣品再清洗3次，并添加ABTS (在0.1M檸檬酸ρΗ4.3中的0.68mM) 30分鐘以推進(jìn)測(cè)定法,之后以波長(zhǎng)405nm在讀板儀(Biotek_Gen5Program)上測(cè)量0D。
[0068]使用FACS分析檢測(cè)Ag特異性抗體
[0069]在分析前，將凍干的β -淀粉狀蛋白肽進(jìn)行解聚方法。出于此目的，將凍干的A β種類(lèi)在1%ΝΗ40Η(ρΗ11)中溶解。隨后，將溶解的Αβ肽等分取樣，并于-20°c貯存。為了誘導(dǎo)聚集體的形成，將不同Αβ種類(lèi)以濃度20 μ M在水溶液(ρΗ5)中于37°C在搖動(dòng)器(350rpm)上在Eppendorf管中溫育過(guò)夜?？梢酝ㄟ^(guò)FACS (FSC/FL1)中的硫磺素T (ThT)染色確認(rèn)A β聚集體的形成。將聚集的A β種類(lèi)在無(wú)菌過(guò)濾的0.5%BSA中稀釋至0.15 μ Μ，并且在終體積95 μ I中在96孔板中預(yù)溫育30分鐘。將5 μ I預(yù)稀釋的人血漿或抗體(在0.5%BSA/PBS中)添加至95 μ I Αβ聚集體溶液。血漿的最終稀釋范圍為1:1000上至1:10.000。對(duì)于單克隆抗體，使用低于0.5 μ g/ml的濃度。于室溫(RT)在搖動(dòng)器(350rpm)上45或60分鐘溫育后，將200 μ 10.5%BSA/PBS在每個(gè)孔中添加，并且以3000rpm(96孔板離心機(jī))離心5分鐘。將上清液除去，并且用200 μ 10.5%BSA/PBS將清洗步驟再次重復(fù)。在第二次清洗后，棄去SN，并且將團(tuán)粒在含有1:1000稀釋的經(jīng)標(biāo)記的抗IgG (H+L) -PE或1:500稀釋的抗IgM, Fc5 μ 二抗(都是 Jackson Tmmuno Research)的 100 μ 10.5%BSA/PBS 中重懸。將樣品于RT在搖動(dòng)器(350rpm)上再溫育45或60分鐘，并在裝備有高通量取樣器(HTS)的FACSCanto上測(cè)量。將聚集體在FSC/SSC中門(mén)控，并且分別意味著使用FACS Diva軟件，在FL2-PE通道中測(cè)量并評(píng)估中值熒光強(qiáng)度(MFI)，及在FLl-FITC通道中測(cè)量并評(píng)估ThT對(duì)A β聚集體的反應(yīng)性。
[0070]臟
[0071]為了破壞Αβ特異性自身抗體對(duì)患者血清中可能存在的Αβ的結(jié)合且因此防止通過(guò)基于抗原的方法(如ELISA或FACS)檢出與自身抗體結(jié)合的這些A β，將血清在IOmM甘氨酸ρΗ2.6中以稀釋1:16.7預(yù)稀釋5分鐘。
[0072]為了破壞A β抗原對(duì)自身抗體的潛在結(jié)合，將血清在IOmM甘氨酸ρΗ2.6中以稀釋1:16.7預(yù)稀釋5分鐘。然后，將5 μ I酸化的血清與3 μ I A β 1-42 (100 μ g/ml)再溫育5分鐘。然后，通過(guò)添加92 μ 10.5%BSA/PBS中和混合物，并溫育20至60分鐘。如上文對(duì)非解蔽的血清描述的，實(shí)施清洗步驟和與二抗一起溫育。
[0073]結(jié)果
[0074]Αβ聚集體:宴聚化和原纖(fibril)形成
[0075]最近幾年中已經(jīng)在多種條件下廣泛調(diào)查了從單體A β形成Αβ聚集體(包括Αβ寡聚物，原纖和原纖聚集體)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 Αβ肽的聚集非常多地依賴(lài)于不同條件，包括pH、溫度、緩沖劑組成和蛋白質(zhì)濃度。聚集開(kāi)始于從單體形成β_發(fā)夾，生成可溶性寡聚物。對(duì)平行β_片層的構(gòu)象轉(zhuǎn)變導(dǎo)致然后導(dǎo)致形成原纖和原纖聚集體，其可以通過(guò)離心沉淀。最近的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)顯示了于ΡΗ7.4生成的Aβ 40和Αβ 42聚集體包含具有5nm寬細(xì)絲的原纖，該細(xì)絲具有側(cè)向結(jié)合成束(15至25nm寬的細(xì)絲)的微小趨勢(shì)。此類(lèi)單一原纖的長(zhǎng)度位于亞微米(50-100nm)上至10-15 μ m的范圍中，如通過(guò)透射電子顯微術(shù)測(cè)定的。這些Αβ原纖的一個(gè)特征在于它們與熒光染料硫磺素T(ThT) —起特異性插入。
[0076]依照本發(fā)明，生成不同Aβ肽變體(Αβ 1-42、Αβ3-40、和Αβρ(Ε)3-40)(其與ThT一起插入)的Αβ聚集體?？梢允褂肍ACS分析檢測(cè)這些A β聚集體。出于此目的，如麗中描述的，將無(wú)核(seedless)可溶性Αβ肽以濃度20 μ M于37°C溫育20小時(shí)。如圖1A(上部小圖)中顯示的，清楚的ThT陽(yáng)性同質(zhì)群體(測(cè)量為FLl (FITC)陽(yáng)性信號(hào))，依照本發(fā)明開(kāi)發(fā)的FACS測(cè)定法容許分析體外生成的A β聚集體。使用范圍為I至15 μ m的校正大小珠(Molecular probes的流式細(xì)胞術(shù)大小校正試劑盒(產(chǎn)品目錄編號(hào)F-13838))(圖1底部小圖)分析Αβ聚集體的大小分布(通過(guò)前向散射FSC-A限定)。使用此分析，顯示了預(yù)期的，生成的A β聚集體的大小范圍為亞微米范圍上至10 μ m，其中大多數(shù)生成的聚集體范圍為約200nm上至3μm。
[0077]單抗與Ag聚集體的反應(yīng)性
[0078]為了限定A β聚集體是否容許A β特異性抗體結(jié)合并且測(cè)定此類(lèi)相互作用是否可以使用本文描述的基于FACS的測(cè)定法監(jiān)測(cè)，進(jìn)行另一組實(shí)驗(yàn)。出于此目的，生成A β 1-42及A β P (E) 3-42聚集體，并將其與對(duì)A β 1-42 (3Α5)特異性或?qū) β p (E) 3-42 (D129)特異性的單克隆抗體一起溫育。如圖2中的FACS直方圖中顯示的，單克隆抗體3Α5僅僅結(jié)合A β 1_42聚集體，而單抗D129僅與N端截短的焦谷氨酸化的A β種類(lèi)相互作用。這顯示了描述的基于FACS的測(cè)定法容許以特定方式檢測(cè)A β特異性抗體。
[0079]限定使用IVIG進(jìn)行的人自身抗體的Αβ結(jié)合的不同檢測(cè)方法的靈敏性
[0080]IVIG(靜脈內(nèi)免疫球蛋白)是一種商品化血液產(chǎn)品。它含有自源自健康供體的血漿(來(lái)自至少1000名供體的人血漿)提取的合并的IgG級(jí)分。已經(jīng)顯示了 IVIG制劑含有對(duì)Αβ肽特異性的天然存在的抗體(自身抗體)。
[0081]此實(shí)驗(yàn)的目的是限定并比較用于IVIG(IVIG_Subcuvia,購(gòu)自Baxter, Austria)的Αβ反應(yīng)性的三種獨(dú)立檢測(cè)方法(Biacore、ELISA和基于FACS的測(cè)定法)的檢測(cè)限。因此，將Αβ 1-42固定化至芯片表面上或Maxisorp微量滴定板上，分別用于SPR或ELISA測(cè)定?；蛘撸葾 β 1-42聚集體以進(jìn)行FACS分析。隨后，將不同IVIG稀釋液應(yīng)用于各個(gè)系統(tǒng)，并且限定Rmax值(在SPR的情況中)，OD值(在ELISA的情況中)或熒光強(qiáng)度(MFI值)(在FACS測(cè)定法的情況中)。出于比較原因，對(duì)所有IVIG濃度評(píng)估信噪比，并且信號(hào)以倍數(shù)背景信號(hào)(xBG)表示(圖3)。在SPR測(cè)量的情況中，IVIG濃度無(wú)一給出高于背景的信號(hào)(圖3C)。與此形成對(duì)比，對(duì)照抗體3Α5給出強(qiáng)信號(hào)，指示A β 1-42成功固定化至芯片表面，且Αβ肽原則上可以在芯片表面上被抗體識(shí)別。使用ELISA作為檢測(cè)方法，1000 μ g/mlIVIG給出高于背景的清楚信號(hào)(BG的7倍)，而由lOOyg/ml IVIG誘導(dǎo)的信號(hào)僅是背景的2倍。10 μ g/ml IVIG沒(méi)有產(chǎn)生大于背景的信號(hào)(圖3B)。如圖3A中描繪的，基于FACS的測(cè)定法提供了比由其它兩種檢測(cè)方法投遞的信號(hào)高得多的信號(hào)。不僅1000 μ g/ml (BG的24倍)，或100 μ g/ml (BG的11倍)，而且還有10 μ g/ml (BG的5倍)，和I μ g/ml (BG的幾何2倍)IVIG稀釋液產(chǎn)生明顯高于背景的信號(hào)。這指示檢測(cè)Αβ特異性自身抗體的新開(kāi)發(fā)的基于FACS的測(cè)定法比常規(guī)測(cè)定法諸如ELISA或Biacore靈敏至少100倍。
[0082]限定源自健康供體和AD患者的人血液中的抗beta淀粉狀蛋白抗體
[0083]a.1gG 對(duì) A β 1-42 的反應(yīng)性
[0084]如上文描述的，使用A β聚集體和FACS分析對(duì)源自健康個(gè)體(η=13，約30至50歲齡)或AD患者(η=48，約70歲齡)的血清樣品分析天然存在的A β特異性抗體內(nèi)容物。如圖4中顯示的，在測(cè)試的所有樣品中檢測(cè)對(duì)Αβ聚集體特異性的天然存在的抗體。然而，在與源自健康受試者的血清樣品相比時(shí)，此類(lèi)抗體的濃度在源自AD患者的血液樣品中顯著較低。
[0085]為了限定本FACS測(cè)定法鑒定患有AD的人的靈敏性和特異性，將圖4中指示的IgG對(duì)血清的A β 1-42聚集體的反應(yīng)性重復(fù)兩次，并且已經(jīng)在ROC曲線(xiàn)中匯總結(jié)果(圖5)。此ROC曲線(xiàn)分析顯示了在靈敏性是81%時(shí)，特異性是100%，且在特異性是77%時(shí)靈敏性是100%,曲線(xiàn)下面積(AUC)為O, 9679。
[0086]試圖限定認(rèn)知和免疫學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，將測(cè)量的IgG對(duì)AD患者血清(n=24)的Αβ聚集體的反應(yīng)性與血清取樣時(shí)患者的簡(jiǎn)短精神狀態(tài)檢查(MMSE)的得分聯(lián)系起來(lái)。此關(guān)聯(lián)揭示了具有弱測(cè)試表現(xiàn)的患者顯示降低的IgG反應(yīng)性的趨勢(shì)，如圖4中描繪的。因此，Αβ特異性IgG反應(yīng)性的此降低反映AD進(jìn)展。
[0087]試圖限定認(rèn)知和免疫學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，將AD患者血清(η=24)的測(cè)量的IgG反應(yīng)性與來(lái)自簡(jiǎn)短精神狀態(tài)檢查(MMSE)的結(jié)果聯(lián)系起來(lái)。此測(cè)試通常用于篩選認(rèn)知損傷和癡呆，并且評(píng)估在給定時(shí)間點(diǎn)時(shí)個(gè)體中認(rèn)知損傷的嚴(yán)重性。MFI與MMSE得分的關(guān)聯(lián)揭示了具有弱測(cè)試表現(xiàn)的患者顯示降低的IgG反應(yīng)性的趨勢(shì)，如圖4中描繪的。
[0088]b.1gG 對(duì) A β 3-42 和 A β p (E) 3-42 的反應(yīng)性
[0089]在限定AD患者和健康受試者的血清中天然存在的免疫球蛋白對(duì)A β 1-42聚集體的反應(yīng)性外，還針對(duì)Aβ 3-42以及針對(duì)Αβ P (E) 3-42限定這些血清的反應(yīng)性。圖7和圖8中描繪了源自這些分析的ROC曲線(xiàn)。在Αβ 3-42的情況中(圖7)，ROC曲線(xiàn)分析顯示了在靈敏性是77%時(shí)特異性是92%，曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.859。
[0090]在A β P (E) 3-42的情況中(圖8)，ROC曲線(xiàn)分析顯示了在靈敏性是93%時(shí)特異性是85%，曲線(xiàn)下面積(AUC)為O, 928。
[0091]c.1gM對(duì)不同A β聚集體的反應(yīng)性
[0092]在下一組實(shí)驗(yàn)中，使用與上文的描述相同的血清，在源自健康個(gè)體或AD患者的血清樣品中限定Αβ聚集體特異性IgM反應(yīng)性。如圖9Α中可以看到的，在測(cè)試的所有樣品中檢出對(duì)Αβ聚集體特異性的IgM同種型的天然存在的抗體。但是與IgG反應(yīng)性形成對(duì)比，源自健康對(duì)照的血清樣品沒(méi)有表現(xiàn)為比源自AD患者的血清樣品具有更高的IgM對(duì)Αβ聚集體的反應(yīng)性。因此，ROC曲線(xiàn)分析沒(méi)有產(chǎn)生描繪靈敏性或特異性的曲線(xiàn)(圖9Β)。
[0093]d.解蔽后IgG和IgM對(duì)A β聚集體的反應(yīng)性
[0094]在先前的研究中，已經(jīng)顯示了 Αβ特異性自身抗體(主要是IgM同種型的)可以用Αβ抗原占據(jù)以建立免疫復(fù)合物，其是穩(wěn)定的并且在人血液中循環(huán)(W02010/128139Α1;Marcel1 等，2009;Lindhagen-Persson 等，PLoS0NE5(2010):el3928) 0為了限定與自身抗體潛在結(jié)合的A β抗原是否可以阻斷這些抗體對(duì)體外生成的A β聚集體的反應(yīng)性，將個(gè)體血清進(jìn)行解蔽方法，如材料和方法中描述的。使用低pH，潛在的免疫復(fù)合物被破壞，導(dǎo)致從抗體結(jié)合域除去A β抗原(抗原解離)。如此，若免疫復(fù)合物存在于血清樣品中，則解蔽方法可以在基于FACS的測(cè)定法中產(chǎn)生較高的自身抗體信號(hào)。令人感興趣地，如圖10中描繪的，與未處理的血清相比，AD患者血清的IgM反應(yīng)性在解蔽后顯著升高，而健康對(duì)照血清的反應(yīng)性沒(méi)有變化(比較圖9Α)。這與在IgG對(duì)Αβ聚集體的反應(yīng)性的情況中測(cè)量的情況形成對(duì)比。如圖4中顯示的，源自健康個(gè)體的血清比源自AD患者的血清(在此情況中尚未用低pH處理血清)顯示了更高的IgG對(duì)Αβ聚集體的反應(yīng)性。
[0095]在圖11中，已經(jīng)在ROC曲線(xiàn)中匯總了圖10中描繪的結(jié)果。此ROC曲線(xiàn)分析顯示了在靈敏性是78%時(shí)，特異性是84%，曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.822。
[0096]為了完成此組實(shí)驗(yàn)，還實(shí)施解蔽實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)IgG亞型的自身抗體是否也可以被Αβ抗原占據(jù)。出于此目的，再次用低pH處理所有血清以破壞潛在的免疫復(fù)合物，隨后分析針對(duì)Αβ聚集體的血清的IgG反應(yīng)性。如先前在IgM解蔽實(shí)驗(yàn)中顯示的,在此實(shí)驗(yàn)中針對(duì)源自健康受試者的血清的Αβ聚集體的IgG反應(yīng)性在未處理的和解蔽的血清之間也沒(méi)有差異。與此形成對(duì)比，源自AD患者的血清再次顯示了解蔽方法后A β反應(yīng)性的顯著升高。比較抗原解離之前和之后源自血清IgG自身抗體對(duì)A β聚集體(在此情況中為A β 1-42)的結(jié)合的信號(hào)。源自不同測(cè)量(未處理對(duì)解蔽)的MFI值間的差定義為解離delta(A)。在圖11中，在ROC曲線(xiàn)中匯總了源自健康對(duì)照的血清的Δ數(shù)值和源自AD患者的血清的Λ數(shù)值。如可以看出的，源自IgG反應(yīng)性的Λ數(shù)值也可以用作參數(shù)以鑒定AD患者。此ROC曲線(xiàn)分析顯示了在靈敏性是79%時(shí)特異性是85%，曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.862。
[0097]結(jié)論
[0098]基于這些結(jié)果，可以說(shuō)明依照本發(fā)明的FACS-聚集測(cè)定法的較高靈敏性與Αβ 1-42的不同聚集狀態(tài)直接相關(guān)聯(lián)。對(duì)于BIAcore分析，使用新鮮溶解且生物素化的Αβ 1-40以在鏈霉抗生物素蛋白芯片上固定化。此方法有利于在芯片表面上單體Aβ 1-42的結(jié)合，因?yàn)殡脑跊](méi)有預(yù)溫育的情況中立即固定化，并且生物素-標(biāo)簽還減速聚集體的形成。Maxisorp板上于ρΗ9的Αβ 1-42包被似乎也有利于Aβ的單體形式，盡管不能排除一些聚集體的包被。在這些測(cè)定法中，抗體和Αβ 1-42肽之間的親和力造成檢測(cè)限。
[0099]與這兩種用于依照本發(fā)明的基于FACS的測(cè)定法的方法形成對(duì)比，將Αβ -1-42聚集體特異性誘導(dǎo)，并且用于檢測(cè)IVIG中存在的對(duì)Αβ特異性的抗體。這些較大的分子提供多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。所得的親合力效應(yīng)(多種協(xié)同低親和抗體-抗原相互作用的總和)可以造成此測(cè)定法的較高靈敏性，且通過(guò)導(dǎo)致IVIG級(jí)分內(nèi)低親和抗體的檢出進(jìn)行。IVIG對(duì)Αβ聚集體的反應(yīng)性也可以通過(guò)僅存在于Αβ聚集形式上的表位的存在解釋。
[0100]實(shí)施例清楚顯示了本發(fā)明比本領(lǐng)域中目前可用的方法的優(yōu)越性，尤其就分析特性，諸如特異性和選擇性而言。
[0101]用依照ΕΡ1583774Β1和ΕΡ1679319Β1的樽擬物瘡苗的臨床研究。
[0102]在含有兩個(gè)分支的臨床研究中測(cè)試如EP I 583 774 BI和EP I 679 319 BI中要求保護(hù)的AFFIT0PE-疫苗，其能夠誘導(dǎo)特異性靶向Αβ肽的抗體。將分組I的患者用含有佐劑的AFFIT0PE疫苗免疫，且將分組2中的患者用缺乏作為免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的佐劑的AFFIT0PE疫苗免疫。與無(wú)佐劑的疫苗(其中不能預(yù)期A β特異性IgG抗體的增加)形成對(duì)t匕，有佐劑的疫苗應(yīng)當(dāng)具有誘導(dǎo)靶向Aβ的抗體的能力。
[0103]為了評(píng)估依照本發(fā)明的基于FACS的測(cè)定法在臨床研究的過(guò)程里監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)的IgG抗體的能力，將源自疫苗接收者的血清進(jìn)行此測(cè)定法。分析源自每位單一患者的I份免疫前血清(在開(kāi)始免疫方法前收集)和3份免疫后血清。對(duì)血清樣品的不同等分試樣完成每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和患者兩次單獨(dú)的測(cè)量。各位患者中Αβ聚集體特異性IgG抗體隨時(shí)間的增加會(huì)指示FACS測(cè)定法可以適用于隨時(shí)間監(jiān)測(cè)免疫治療性干預(yù)的效力，且此外，此類(lèi)結(jié)果會(huì)也會(huì)指示成功的疫苗接種。
[0104]應(yīng)用依照本發(fā)明的基于FACS的測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)所有研究參與者的免疫前血清已經(jīng)含有Αβ聚集體特異性IgG，如預(yù)期的。這與最近的出版物一致，其顯示了體液諸如血液(血漿/血清)和CSF含有A β聚集體特異性IgM和IgG抗體。
[0105]圖13中顯示的數(shù)值描繪了隨時(shí)間的兩次測(cè)量的均值數(shù)值。在此圖中，例示性地，描繪了源自分組I的患者(患者Α)和用缺乏佐劑的疫苗免疫的患者(分組2-患者B)中的Αβ特異性IgG抗體應(yīng)答的形成。如圖13中可以看出的，來(lái)自患者A的免疫血清2和3的MFI信號(hào)顯著高于源自前血清的熒光信號(hào)，指示增加的Αβ特異性IgG。與此形成對(duì)比，源自患者B的免疫血清沒(méi)有產(chǎn)生升高的熒光信號(hào)。這些結(jié)果對(duì)于各自組是代表性的。
[0106]為了限定個(gè)體患者中Αβ 1-42反應(yīng)性的升高，已經(jīng)計(jì)算最后一次免疫血清與相應(yīng)的前血清的兩次獨(dú)立測(cè)量的均值MFI值的差。在圖14中，可以看出使用FACS測(cè)定法分析免疫血清導(dǎo)致這兩組間的明顯差異。來(lái)自用有佐劑的疫苗免疫的患者的免疫血清一致顯示Αβ特異性IgG的增加。
[0107]為了評(píng)估接受有佐劑的或無(wú)佐劑的疫苗接種的患者的中值FI值間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)施兩項(xiàng)不同檢驗(yàn)。在包括所有患者數(shù)據(jù)時(shí)，由于有佐劑的組中的一個(gè)極值，在兩組間沒(méi)有給出正態(tài)分布。在此前置條件(precondition)下,實(shí)施Mann-Whitney檢驗(yàn),這產(chǎn)生0.0473的P值(圖14)。為了還在正態(tài)分布條件下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從數(shù)據(jù)集除去外層(out-layer),并計(jì)算student t檢驗(yàn)。此分析還產(chǎn)生0.0089的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性p值(圖14)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于診斷阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中檢測(cè)懷疑具有AD的人的生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體，其包括下列步驟: -使所述樣品與A β聚集體或與具有A β聚集體樣表面的顆粒接觸，并且容許所述A β特異性抗體結(jié)合所述Aβ聚集體，并 -通過(guò)單一顆粒檢測(cè)技術(shù)(single particle detection technique),優(yōu)選通過(guò)突光活化細(xì)胞分選(FACS)檢測(cè)與所述A β聚集體結(jié)合的所述A β特異性抗體； 且其中將檢出的Αβ特異性抗體的量與已知AD狀態(tài)的樣品中的量比較。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述Aβ特異性抗體是人抗體，優(yōu)選人IgG或IgM抗體,特別是人IgG抗體。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述Aβ特異性抗體是自身抗體。
4.依照權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其特征在于所述Αβ聚集體具有50nm至15 μ m,優(yōu)選IOOnm至10 μ m,尤其是200nm至5 μ m的大小。
5.依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述Aβ聚集體已經(jīng)通過(guò)于2至9的pH將A β -1-42肽，A β +43肽，A β -3-42,或A β -p (E) 3-42肽溫育至少20分鐘，優(yōu)選至少I(mǎi)小時(shí),尤其是至少4小時(shí)制備。
6.依照權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述Aβ聚集體以0.001至I μ Μ，優(yōu)選0.01至0.1 μ M的 量存在，用于使所述樣品與A β聚集體接觸。
7.依照權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生物學(xué)樣品是人血液或自人血液衍生的樣品，優(yōu)選人血清或人血漿；人腦脊液或人淋巴。
8.依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使所述Aβ聚集體與所述樣品接觸至少10分鐘，優(yōu)選10分鐘至24小時(shí)，尤其是20分鐘至2小時(shí)。
9.依照權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于在使所述樣品與Aβ聚集體接觸前對(duì)所述樣品中的所述Αβ特異性抗體實(shí)施解蔽步驟，尤其在檢測(cè)IgM抗體時(shí)。
10.依照權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述具有Αβ聚集體樣表面的顆粒是具有在其表面上固定化的A β聚集體的珠，尤其是磁珠。
11.依照權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述已知AD狀態(tài)的樣品是具有AD的患者的樣品或健康人的樣品。
12.依照權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述已知AD狀態(tài)的樣品是AD狀態(tài)校正曲線(xiàn)，尤其是簡(jiǎn)短精神狀態(tài)檢查(MMSE)曲線(xiàn)。
13.依照權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中檢出低于閾值水平的所述樣品中Αβ特異性抗體的量指示AD,其中所述閾值水平是1500ng/ml或更低,優(yōu)選1000ng/ml或更低，尤其是750ng/ml或更低。
14.依照權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法，其中Aβ特異性抗體的檢出量與從所述人取得所述樣品同時(shí)同一人的MMSE結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
15.依照權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)不同時(shí)間時(shí)取得的同一人的樣品至少兩次實(shí)施所述方法，且其中優(yōu)選地，A β特異性抗體的檢出量與從所述人取得所述樣品同時(shí)同一人的麗SE結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
16.依照權(quán)利要求15的方法，其中每6個(gè)月至少一次，優(yōu)選每3個(gè)月至少一次，尤其是每個(gè)月至少一次實(shí)施所述方法。
17.依照權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法用于監(jiān)測(cè)AD患者，尤其是用治愈或改善AD的藥物治療的AD患者的用途。
18.依照權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法用于評(píng)估形成AD的風(fēng)險(xiǎn)或用于檢測(cè)早期階段AD的用途。
19.依照權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法用于診斷帕金森氏癡呆(Parkinson’sdementia, PDD)、癡呆伴路易體(Dementia with Lewy Bodies, DLB)、腦淀粉樣血管病(Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA)、包含體肌炎(Inclusion body myositis, IBM)、或慢性頭部創(chuàng)傷 (chronic head trauma)的用途。
20.用于實(shí)施依照權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，其包含: -A β聚集體，和 -樣品容器。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103842825SQ201280049131
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月4日
【發(fā)明者】G.斯塔夫勒, A.梅爾霍弗, A.施內(nèi)伯格, M.盧特羅瓦, W.施密特, F.馬特納 申請(qǐng)人:阿費(fèi)里斯股份公司