肺癌中的ros激酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了鑒定哺乳動(dòng)物中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法。在一些實(shí)施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是編碼ROS的多核苷酸和編碼第二(非-ROS)多肽的多核苷酸之間融合的結(jié)果。描述了ROS的三種不同的融合伴侶，即由FIG基因、SLC34A2基因、和CD74基因編碼的蛋白。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了用于確定生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的新方法、用于篩選抑制蛋白的化合物的方法、和用于抑制癌癥(例如，肺癌)進(jìn)展的方法。
【專利說明】肺癌中的ROS激酶
[0001]發(fā)明背景
本發(fā)明總體涉及參與肺癌的蛋白質(zhì)和基因(例如，人肺癌)，以及肺癌的檢測(cè)、診斷和治療。
[0002]許多癌癥的特征在于導(dǎo)致細(xì)胞過程(包括生長(zhǎng)和增殖)的控制異常的細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑的破壞。這些破壞經(jīng)常是由于特定的信號(hào)傳遞蛋白諸如激酶的活性改變引起的。
[0003]蛋白激酶蛋白的異常表達(dá)可以是癌癥的病原因素(和驅(qū)動(dòng)因素)。異常表達(dá)可以由蛋白(或其激酶部分)與第二種蛋白(或其部分)的融合、蛋白的截短部分的表達(dá)或者由全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)的異常調(diào)節(jié)所引起。
[0004]已知導(dǎo)致產(chǎn)生具有異常信號(hào)傳遞活性的激酶融合蛋白的基因易位可以直接導(dǎo)致某些癌癥(參見例如，Mitelman 等人，Nature Reviews Cancer 7: 233 - 245, 2007,Futreal 等人，Nat Rev Cancer 4(3): 177 - 183 (2004),和 Falini 等人，Blood 99 (2):409-426 (2002)。例如，BCR-ABL癌蛋白，一種酪氨酸激酶融合蛋白，是病原因素且驅(qū)動(dòng)人慢性髓性白血病(CML)。在至少90-95%的CML病例中發(fā)現(xiàn)的BCR-ABL癌蛋白是通過9號(hào)染色體上的c-ABL蛋白酪氨酸激酶的基因序列易位到22號(hào)染色體上的BCR序列上產(chǎn)生的，產(chǎn)生所謂的 Philadelphia 染色體。參見例如 Kurzock 等人，Λ Engl.J.Med.319: 990-998(1988)。在急性淋巴性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)病例中也能發(fā)現(xiàn)易位。這些發(fā)現(xiàn)促使FDA批準(zhǔn)甲磺酸伊馬替尼(由Novartis以商標(biāo)Gleevec?銷售)和dasatinig(由Bristol-Mysers Squibb以商標(biāo)Sprycel?銷售)(ABL激酶的小分子抑制劑)用于治療CML和ALL。這些藥物是設(shè)計(jì)用來對(duì)驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳遞通路進(jìn)行干擾的藥物實(shí)例。這些藥物的開發(fā)相對(duì)于CML和ALL的常規(guī)療法(化療和放射)而言代表一種顯著的進(jìn)步，其中常規(guī)療法受到眾所周知的副作用的煩擾并且經(jīng)常具有有限的效果，因?yàn)樗鼈儾荒芴禺愋缘匕邢虬┌Y的根本原因。
[0005]因此，鑒定驅(qū)動(dòng)癌癥的蛋白以便在癌癥更可能對(duì)治療響應(yīng)的早期檢測(cè)癌癥將是有用的。額外地，此類蛋白的鑒定將尤其期望產(chǎn)生新方法來選擇用于靶向治療的患者，以及用于篩選和開發(fā)能抑制此類蛋白且因此治療癌癥的新藥物。
[0006]受體酪氨酸激酶(RTKs)的致癌作用已牽涉在許多類型的實(shí)體瘤(包括肺癌)中。肺癌(其具有幾種亞型，包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌)是全世界男性和女性中由癌癥導(dǎo)致的死亡的最常見原因。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的數(shù)據(jù)，在美國(guó)每14名男性和女性中接近一名將在其人生的某個(gè)點(diǎn)被診斷出肺癌。肺癌的兩種特別致命的形式是小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌。
[0007]不幸的是，肺癌經(jīng)常無法在早期被診斷，并且它經(jīng)常完全不能對(duì)手術(shù)響應(yīng)，甚至當(dāng)與化療或放療組合時(shí)。例如，在美國(guó)，NSCLC是癌癥死亡的主要原因，并且占所有肺癌的約87%。在美國(guó)每年有約151，000個(gè)NSCLC新病例，并且據(jù)估計(jì)僅在美國(guó)每年超過120，000位患者將死于該疾病。參見“Caflcer Facts and Figures 2005, ” American Cancer Society。包括三種不同亞型的NSCLC經(jīng)常僅在它已經(jīng)轉(zhuǎn)移以后被檢測(cè)到，因此在診斷的兩年內(nèi)死亡率是75%。[0008]因此，發(fā)現(xiàn)在早期鑒定肺癌的新方法和治療肺癌的新方法(和新試劑)將是有用的。
[0009]發(fā)明概沭
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)癌癥、特別是肺癌中異常ROS表達(dá)和/或活性。哺乳動(dòng)物肺癌中ROS的異常表達(dá)可能是由于，例如，哺乳動(dòng)物肺癌中全長(zhǎng)ROS激酶的表達(dá)，因?yàn)榻】?、正常肺組織和細(xì)胞不表達(dá)ROS激酶蛋白或ROS激酶活性。哺乳動(dòng)物肺癌中ROS的異常表達(dá)也可能是由于截短ROS (例如，包含ROS激酶的一部分，包括激酶結(jié)構(gòu)域)或本文公開的ROS融合蛋白之一的存在。肺癌中所有公開的ROS的表達(dá)導(dǎo)致ROS激酶結(jié)構(gòu)域的表達(dá)；因此，所有公開的ROS融合多肽具有活性ROS激酶活性。
[0010]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌。該方法包括以下步驟:獲得來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌的生物樣品；并且利用至少一種特異性結(jié)合具有ROS激酶活性的所述多肽的試劑來確定所述多肽是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結(jié)合的檢測(cè)表明所述生物樣品中存在所述多肽。
[0011]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，所述試劑(例如抗體)是可檢測(cè)地標(biāo)記的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑特異性結(jié)合全長(zhǎng)ROS多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑特異性結(jié)合ROS激酶結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑特異性結(jié)合ROS融合多肽(例如，特異性結(jié)合CD74-R0S融合多肽、SLC34A2-R0S (S)多肽、SLC34A2-R0S(L)多肽、SLC34A2-R0S(VS)多肽、FIG-ROS (L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、或FIG-ROS (VL)多肽。
[0012]在本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全長(zhǎng)ROS多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是ROS融合多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述ROS融合多肽選自 CD74-R0S 融合多肽、SLC34A2-R0S(S)多肽、SLC34A2-R0S (L)多肽、SLC34A2-R0S (VS)多肽、FIG-ROS (L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、和FIG-ROS(VL)多肽。在各個(gè)實(shí)施方案中，具有ROS 激酶活性的多肽包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 60,SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 22 的氨基酸序列。
[0013]在一些實(shí)施方案中，以選自流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定、體外激酶測(cè)定、免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定、免疫熒光(IF)測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和Western印跡分析測(cè)定的形式實(shí)施所述方法。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)到所述多肽的激酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑是重同位素標(biāo)記(AQUA)肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重同位素標(biāo)記(AQUA)肽包含含有ROS融合多肽的融合連接的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用質(zhì)譜分析法實(shí)施所述方法。
[0015]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)編碼生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌。該方法包括以下步驟:(a)獲得來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌的生物樣品并且(b)利用特異性結(jié)合編碼具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸的試劑來確定所述多核苷酸是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結(jié)合的檢測(cè)表明所述生物樣品中存在編碼具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸。
[0016]在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含選自SEQ ID N0:2、6、8、23、29、55、57和59的核
苷酸序列。
[0017]在一些實(shí)施方案中，所述試劑是核酸探針。在一些實(shí)施方案中，所述試劑是可檢測(cè)地標(biāo)記的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針是熒光原位雜交(FISH)探針且用FISH測(cè)定實(shí)施所述方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)探針且用PCR測(cè)定實(shí)施所述方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述試劑是可檢測(cè)地標(biāo)記的。
[0018]在本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全長(zhǎng)ROS多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是ROS融合多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述ROS融合多肽選自CD74-R0S 融合多肽、SLC34A2-R0S(S)多肽、SLC34A2-R0S (L)多肽、SLC34A2-R0S (VS)多肽、FIG-ROS(L)多肽、FIG-ROS (S)多肽、和FIG-ROS (VL)多肽。在各個(gè)實(shí)施方案中，具有ROS激酶活性的多肽包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 56、SEQ IDNO: 60、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 22 的氨基酸序列。
[0019]在本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案中，肺癌是人肺癌(例如，非小細(xì)胞肺癌或小細(xì)胞肺癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，生物樣品選自肺活檢樣品、支氣管肺泡灌洗物、腫瘤切除樣品、細(xì)針穿刺物、胸膜滲出液和循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0020]在本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌是非小細(xì)胞肺癌。在各個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌來自人。
[0021]在本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品被診斷為來自由ROS激酶活性驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌可能對(duì)ROS抑制性治療劑響應(yīng)。在各個(gè)實(shí)施方案中，由其獲得所述生物樣品(其中所述試劑特異性結(jié)合所述生物樣品)的患者被診斷為患有由ROS激酶活性驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌。在一些實(shí)施方案中，患者被診斷為可能對(duì)ROS抑制性治療劑響應(yīng)。ROS抑制性治療劑的一個(gè)非限制性實(shí)例為克里唑替尼(也稱為PF-02341066)。ROS抑制性治療劑的額外的非限制性實(shí)例包括 NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CH5424802、CEPl1988、WH1-P131 和 WH1-P154。
[0022]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于抑制表達(dá)具有ROS激酶活性的多肽的哺乳動(dòng)物癌癥或疑似哺乳動(dòng)物癌癥進(jìn)展的方法，所述方法包括在所述哺乳動(dòng)物癌癥或疑似哺乳動(dòng)物癌癥中抑制所述多肽的表達(dá)和/或活性的步驟。
[0023]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于抑制包括編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的哺乳動(dòng)物癌癥或疑似哺乳動(dòng)物癌癥進(jìn)展的方法，所述方法包括在所述哺乳動(dòng)物癌癥或疑似哺乳動(dòng)物癌癥中抑制所述多核苷酸的表達(dá)的步驟。
[0024]在各個(gè)實(shí)施方案中，肺癌或疑似肺癌來自人。在一些實(shí)施方案中，所述多肽或多核苷酸的表達(dá)和/或活性被ROS抑制性治療劑所抑制，所述ROS抑制性治療劑選自 PF-02341066、NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEPl 1988、CH5424802、WH1-P131和 WH1-PI54ο
[0025]在又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對(duì)ROS-抑制性治療劑響應(yīng)的患者的方法,所述方法包括:將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結(jié)合具有ROS激酶活性的多肽的試劑接觸，檢測(cè)所述試劑是否特異性結(jié)合所述生物樣品，其中所述試劑與所述生物樣品的結(jié)合的檢測(cè)將所述患者鑒定為可能對(duì)ROS-抑制性治療劑響應(yīng)的患者。
[0026]在又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有肺癌的患者的方法，所述方法包括:檢測(cè)生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在，所述生物樣品來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺；并且給患者施用治療有效量的ROS抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。
[0027]在又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有肺癌的患者的方法，所述方法包括:檢測(cè)來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺的生物樣品中多肽的存在，所述多肽選自具有ROS激酶活性的多肽和具有ALK激酶活性的多肽；并且給患者施用治療有效量的ALK/R0S抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。
[0028]在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對(duì)ROS-抑制性治療劑響應(yīng)的患者的方法,所述方法包括:將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結(jié)合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結(jié)合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，并且檢測(cè)所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結(jié)合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結(jié)合的檢測(cè)將所述患者鑒定為可能對(duì)ROS-抑制性治療劑響應(yīng)的患者。
[0029]在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對(duì)ALK-抑制性治療劑響應(yīng)的患者的方法,所述方法包括:將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結(jié)合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結(jié)合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，并且檢測(cè)所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結(jié)合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結(jié)合的檢測(cè)將所述患者鑒定為可能對(duì)ALK-抑制性治療劑響應(yīng)的患者。
[0030]在各個(gè)實(shí)施方案中，所述第一試劑特異性結(jié)合全長(zhǎng)ROS激酶蛋白。在各個(gè)實(shí)施方案中，所述第二試劑特異性結(jié)合全長(zhǎng)ALK激酶蛋白。在各個(gè)實(shí)施方案中，所述第一試劑特異性結(jié)合ROS激酶蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域。在各個(gè)實(shí)施方案中，所述第二試劑特異性結(jié)合ALK激酶蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述第一試劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，所述第二試劑是抗體。
[0031]在本發(fā)明所有方面的各個(gè)實(shí)施方案中，患者是人患者且肺癌(或疑似肺癌)來自人。在一些實(shí)施方案中，肺癌是NSCLC或SCLC。在一些實(shí)施方案中，ROS抑制性治療劑或ALK抑制性治療劑是PF-02341066、NVT TAE-684或AP26113。在一些實(shí)施方案中，ROS抑制性治療劑或 ALK 抑制性治療劑是 AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、CH5424802、WH1-P131 和 WH1-P154。
[0032]在各個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品選自肺活檢樣品、支氣管肺泡灌洗物、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、腫瘤切除樣品、細(xì)針穿刺物和胸膜滲出液。
[0033]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于確定化合物是否抑制特征在于具有ROS活性的多肽的表達(dá)的哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌的進(jìn)展的方法，所述方法包括確定所述化合物是否抑制所述多肽在所述癌癥中的表達(dá)的步驟。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于抑制特征在于具有ROS活性的多肽的表達(dá)的哺乳動(dòng)物癌癥或疑似哺乳動(dòng)物癌癥的進(jìn)展的方法，所述方法包括抑制所述多肽在所述哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌中的表達(dá)和/或活性的步驟。在一些實(shí)施方案中，癌癥來自人。[0034]附圖簡(jiǎn)述
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[0035]圖1 -是人NSCLC細(xì)胞系(HCC78)提取物的Western印跡分析，該圖表示了具有比全長(zhǎng)/野生型ROS低很多的分子量的ROS型的表達(dá)。
[0036]圖2 -顯示在人NSCLC細(xì)胞系中siRNA對(duì)突變ROS激酶的抑制作用:小圖A顯示在轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞抑制圖，小圖B是顯示ROS的特異性敲低(knock- down)和增加凋亡(在突變ROS驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞系中)的免疫印跡，且小圖C是顯示ROS下游的信號(hào)傳遞分子活性降低的免疫印跡。
[0037]圖3A-3B -顯示SLC34A2基因和ROS基因分別在染色體4p和6q上的位置(圖3A)，和全長(zhǎng)SLC34A2和ROS蛋白的結(jié)構(gòu)域位置(圖3B)。
[0038]圖3C -是顯示長(zhǎng)SCL34A2-R0S變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1_4與ROS的外顯子32-43相組合。融合連接發(fā)生在ROS的跨膜結(jié)構(gòu)域上游的殘基1750，并且融合連接側(cè)翼的核苷酸和氨基酸殘基(分別為SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13)顯示于圖3C的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和氨基酸殘基為常規(guī)字體，來自ROS的核苷酸和氨基酸殘基為粗體文本)。
[0039]圖3D -是顯示短SCL34A2-R0S變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1_4與ROS的外顯子32-43相組合。融合連接發(fā)生在僅ROS的跨膜結(jié)構(gòu)域上游的殘基1853，并且融合連接側(cè)翼的核苷酸和氨基酸殘基(分別為SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15)顯示于圖3D的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和氨基酸殘基為常規(guī)字體，來自ROS的核苷酸和氨基酸殘基為粗體文本)。
[0040]圖3E -是顯示預(yù)測(cè)的非常短SCL34A2-R0S變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1-4與ROS的外顯子35-43相組合。預(yù)測(cè)融合連接發(fā)生在ROS的跨膜結(jié)構(gòu)域的N-末端邊界處的ROS的殘基1882，并且融合連接側(cè)翼的核苷酸和氨基酸殘基(分別為SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17)顯示于圖3E的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和氨基酸殘基為常規(guī)字體，來自ROS的核苷酸和氨基酸殘基為粗體文本)。
[0041 ] 圖4A -是人SLC34A2-R0S融合蛋白的長(zhǎng)變體的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ IDNO:5)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO:6)(下小圖)；SLC34A2部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結(jié)構(gòu)域的殘基為粗體。
[0042]圖4B -是人SLC34A2-R0S融合蛋白的短變體的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ IDNO:7)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO:8)(下小圖)；SLC34A2部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結(jié)構(gòu)域的殘基為粗體。
[0043]圖5 -是人SLC34A2蛋白的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:3) (SwissProt登錄號(hào)095436)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO:4) (GeneBank登錄號(hào)NM_006424)(下小圖)；參與易位的殘基用下劃線表示。
[0044]圖6A -是人ROS激酶的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:1) (SwissProt登錄號(hào)P08922);參與SLC34A2-R0S(長(zhǎng))變體易位的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與(短)變體易位的殘基，并且用下劃線表示的粗體紅色殘基是參與預(yù)測(cè)的(非常短)變體易位的殘基。[0045]圖6B -是人ROS激酶的編碼DNA序列(SEQ ID NO: 2) (GeneBank登錄號(hào)NM_002944);參與第一 SLC34A2-R0S(長(zhǎng))變體易位的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與第二(短)變體易位的殘基，并且用下劃線表示的粗體大寫殘基是參與(非常短)變體易位的殘基。
[0046]圖7 -是顯示與對(duì)照(泳道I和2)相比SLC34A2-R0S融合蛋白(第一(長(zhǎng))變體)在轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞)中表達(dá)的凝膠圖。
[0047]圖8 -顯示⑶74基因和ROS基因分別在染色體5q和6q上的位置(小圖A)，并且全長(zhǎng)⑶74和ROS蛋白的結(jié)構(gòu)域位置以及在⑶74-R0S融合蛋白中的位置(小圖B和C (其中SEQ ID NO:30顯示在下面的小圖C中))。融合連接發(fā)生在ROS的跨膜結(jié)構(gòu)域上游的殘某 1853。
[0048]圖9 -是人CD74-R0S融合蛋白的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:22)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO: 23)(下小圖)KD74部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結(jié)構(gòu)域的殘基為粗體。
[0049]圖10 -是人CD74蛋白的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO: 24) (SwissProt登錄號(hào)P04233)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO: 25) (GeneBank登錄號(hào)NM_001025159)(下小圖)；參與易位的殘基用下劃線表示。
[0050]圖1lA -是人ROS激酶的氨基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:1) (SwissProt登錄號(hào)P08922);參與⑶74-R0S易位的殘基用下劃線表示。
[0051]圖1lB -是人ROS激酶的編碼的DNA序列(SEQ ID NO:2) (GeneBank登錄號(hào)NM_002944);參與⑶74-R0S易位的殘基用下劃線表示。
[0052]圖12 -是描繪通過RT-PCR檢測(cè)CD74和ROS易位形成的融合基因的凝膠圖；其中顯示了針對(duì)CD74-F1 (頂部)和R0S-GSP3 (底部)的引物序列(分別為SEQ ID NOs: 2627)。
[0053]圖13A-13F -是顯示非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) FFPE腫瘤組織中ROS蛋白和ROS核酸的免疫組織化學(xué)和FISH的照片。ROS蛋白定位的變化顯示如下:(A)彌漫性胞質(zhì)，其中插圖(A)中的黃色箭頭說明通過FISH對(duì)c-ros基因座的平衡易位。(B)腺癌中ROS的強(qiáng)點(diǎn)狀定位，其中插圖放大(即放大圖像)。(C)大細(xì)胞癌中ROS染色的胞質(zhì)定位和小圖E中相應(yīng)的蘇木精和伊紅染色。(D)具有獨(dú)特胞質(zhì)染色和膜定位的腺癌，其中顯示膜染色的插圖進(jìn)行放大。(E)對(duì)應(yīng)于小圖C中的ROS染色的蘇木精和伊紅染色。(F)點(diǎn)狀囊泡染色，其中顯示囊泡染色的插圖放大。
[0054]圖14A和B -是使用雙色斷裂-分離探針(2-color break-a-part probe)通過FISH特異性檢測(cè)ROS融合/易位(在人NSCLC細(xì)胞系中)的圖像。圖14A顯示了 ROS基因上FISH探針雜交的位置，并且圖14B顯示了人NSCLC細(xì)胞系(左)和人NSCLC腫瘤中ROS基因的重排，其導(dǎo)致產(chǎn)生分開的橙色和綠色信號(hào)。
[0055]圖15是顯示2個(gè)探針組的DNA探針與ROS基因和FIG基因雜交的位置的示意圖。兩個(gè)探針組的近端探針(即RP1-179P9)將產(chǎn)生橙色信號(hào)，而所有三個(gè)遠(yuǎn)端探針將產(chǎn)生綠色信號(hào)。探針組I源自c-ros，并且如果發(fā)生平衡易位，則橙色將與綠色分開；然而如果發(fā)生FIG-ROS易位，則綠色信號(hào)將消失。探針組2源自c-ros (橙色RP1-179P9)和fig (綠色RP11-213A17)。[0056]圖16A-16F是顯示HCC78細(xì)胞(小圖A和B)、U118MG細(xì)胞(小圖C和D)和FFPE腫瘤ID 749 (小圖E和F)的FISH分析的結(jié)果的照片。用探針組I (A)和探針組2 (B)探測(cè)的HCC78細(xì)胞顯示了從這些細(xì)胞中存在的SLC34A2-R0S融合體預(yù)測(cè)的結(jié)果。黃色箭頭指向表明HCC78細(xì)胞中的平衡易位的分開信號(hào)，白色箭頭指向完整染色體。用探針組I (C)和探針組2 (D)探測(cè)的U118MG細(xì)胞顯示了從這些細(xì)胞中存在的FIG-ROS融合體預(yù)測(cè)的結(jié)果。用探針組I (E)或探針組2 (F)探測(cè)的FFPE腫瘤749與U118MG細(xì)胞相同。在用探針組I探測(cè)的U-118 MG和腫瘤ID 749兩者中，只有c-ros (橙色)探針退火且缺失區(qū)域(綠色探針)不存在(分別為小圖C和E)。在用探針組2探測(cè)的U-118 MG和腫瘤ID 749 (分別為小圖E和F)中，c-ros (橙色)和fig(綠色)探針走到一起,表明fig-ros融合。
[0057]圖17顯示了來自腫瘤749的ROS融合蛋白的cDNA測(cè)序(在“本序列”行)和其與FIG-ROS(S)核苷酸序列(作為“查詢序列”)的比對(duì)的結(jié)果。
[0058]圖 18 是顯示在 0nM、3nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM 或 1000 nM TAE-684 存在的情況下表達(dá)FIG-ROS (S)的BaF3 (紅色方形)、表達(dá)FIG-ROS (L)的BaF3 (藍(lán)色菱形)、表達(dá)FLT3ITD的BaF3(綠色三角形)、和Karpas 299細(xì)胞(紫色X)的細(xì)胞生長(zhǎng)響應(yīng)的線圖。
[0059]圖19是顯示在TAE-684存在的情況下表達(dá)FIG-ROS (S)或FIG-ROS (L)的BaF3通過細(xì)胞凋亡而死亡的條形圖。
[0060]圖20是顯示TAE-684抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者以及它們的下游信號(hào)傳遞分子的磷酸化的Western印跡分析的描述。
[0061]圖 21 和 21B 是顯示在 0uM、0.01uM、0.03Μ、0.10uM、0.3uM、l.0uM 的 TAE-684(圖21A)或克里唑替尼(圖21Β)存在的情況下用neo-myc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BaF3細(xì)胞(陰性對(duì)照；藍(lán)色菱形)；表達(dá)FIG-ROS (S)的8&?3(紫色乂)、表達(dá)？16-1?05仏)的BaF3 (綠色三角形)、表達(dá)FLT3ITD的BaF3(紅色方形)和Karpas 299細(xì)胞(藍(lán)色星號(hào))的細(xì)胞生長(zhǎng)響應(yīng)的線圖。
[0062]圖22是顯示克里唑替尼抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者以及ALK和其他信號(hào)傳遞分子的磷酸化的Western印跡分析的描述。
[0063]優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
本發(fā)明基于在人肺癌中發(fā)現(xiàn)異常ROS激酶表達(dá)。由于ROS激酶在正常肺組織或細(xì)胞中不表達(dá)，所以預(yù)測(cè)異常ROS激酶活性驅(qū)動(dòng)其中其表達(dá)的肺癌的增殖和存活。此類癌癥可以根據(jù)本文提供的教導(dǎo)進(jìn)行鑒定(例如，診斷)和/或治療。
[0064]基于這些發(fā)現(xiàn)，其肺癌(或疑似肺癌)表達(dá)具有ROS活性的蛋白(例如，全長(zhǎng)ROS蛋白或ROS融合蛋白)的患者(其中健康患者的肺組織不表達(dá)此類具有ROS活性的蛋白)可以有利地對(duì)ROS抑制劑的施用響應(yīng)(例如，與患有相同癌癥的未經(jīng)治療的患者相比，癌癥的生長(zhǎng)可能減緩或停止)。
[0065]本文中提到的公開專利、專利申請(qǐng)、網(wǎng)站、公司名稱和科學(xué)文獻(xiàn)確立了本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的知識(shí)，且完整地通過引用并入本文，其程度等同于各自被特定且單獨(dú)地指示通過引用并入。本文引用的任·何參考文獻(xiàn)和本說明書中的具體教導(dǎo)之間的任何沖突應(yīng)當(dāng)以有利于后者的方式來解決。
[0066]在下文中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和實(shí)施方案。本文中提到的專利、公開申請(qǐng)和科學(xué)文獻(xiàn)確立了本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)，且完整地通過引用并入本文，其程度等同于各自被特定且單獨(dú)地指示通過引用并入。本文引用的任何參考文獻(xiàn)和本說明書中的具體教導(dǎo)之間的任何沖突應(yīng)當(dāng)以有利于后者的方式來解決。同樣，詞或短語的本領(lǐng)域理解的定義和本說明書中具體教導(dǎo)的詞或短語的定義之間的任何沖突應(yīng)當(dāng)以有利于后者的方式來解決。如本文所使用，以下術(shù)語具有所示含義。如本說明書中所使用，單數(shù)形式“一(a) ”、“一 (an) ”和“該(the) ”還具體包括它們所指術(shù)語的復(fù)數(shù)形式，除非內(nèi)容另有清楚指出。術(shù)語“約”在本文中用來指接近，在…區(qū)間中，粗略地或約。當(dāng)術(shù)語“約”連同數(shù)值范圍使用時(shí)，它通過延伸所示數(shù)值的上限和下限而修改范圍。通常，術(shù)語“約”在本文中用來以20%的方差修改所示數(shù)值的上限和下限數(shù)值。
[0067]本文中使用的科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，除非本文另有定義。本文參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和材料。記載抗體和重組DNA技術(shù)的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考著作(所有這些都通過引用整體并入本文)包括Harlow和Lane，Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1988), Ausubel 等人Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,New York, N.Y.(1989和更新直至 2010年9 月)，Sambrook等人，Molecular Cloning: ALaboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989);Kaufman 等人，Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology inMedicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)。記載藥學(xué)的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考著作(所有這些都通過引用整體并入本文)包括Goodman和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics,第 11 版，McGraw Hill Companies Inc., New York (2006)。
[0068]在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌。該方法包括以下步驟:獲得來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌的生物樣品；并且利用至少一種特異性結(jié)合所述具有ROS激酶活性的多肽的試劑來確定所述多肽是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結(jié)合的檢測(cè)表明所述生物樣品中存在所述多肽。
[0069]人ROS激酶蛋白(由ROS`l基因編碼)是2347個(gè)氨基酸長(zhǎng)的受體酪氨酸激酶，其容易發(fā)生異常表達(dá)，從而導(dǎo)致癌癥。全長(zhǎng)人ROS激酶(具有人ROS蛋白的氨基酸序列)的描述可見UniProt登錄號(hào)P08922。如圖1中顯示，ROS的信號(hào)肽、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域可見以下SEQ ID NO:1中的氨基酸殘基:
表1__
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)生物樣品中FIG-ROS融合多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌，所述方法包括以下步驟: (a)獲得哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌的生物樣品；并且 (b)利用至少一種特異性結(jié)合所述多肽的試劑來確定在所述生物樣品中是否存在所述多肽，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結(jié)合的檢測(cè)表明所述生物樣品中存在所述多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物肺癌是人肺癌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽與選自下列的多肽95%相同:FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽(SEQ ID NO: 56)和 FIG-ROS(VL)多肽(SEQ ID NO: 60)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是抗體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法以選自流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定、免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定、免疫熒光(IF)測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定法和Western印跡分析測(cè)定的形式實(shí)施。
6.用于檢測(cè)生物樣品中編碼FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌，所述方法包括以下步驟: (a)獲得哺乳動(dòng)物肺癌或疑似哺乳動(dòng)物肺癌的生物樣品，并且 (b)利用特異性結(jié)合編碼所述多肽的所述多核苷酸的試劑來確定在所述生物樣品中是否存在所述多核苷酸，其中所述特異性結(jié)合所述編碼所述多肽的多核苷酸的試劑與所述生物樣品的特異性結(jié)合 的檢測(cè)表明所述生物樣品中存在所述編碼所述多肽的多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述哺乳動(dòng)物肺癌是人肺癌。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽與選自下列的多肽95%相同:FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽(SEQ ID NO: 56)和 FIG-ROS(VL)多肽(SEQ ID NO: 60)。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述多核苷酸包含選自SEQID NO: 57、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 59的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述試劑是核酸探針。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸探針是熒光原位雜交(FISH)探針，且所述方法用FISH測(cè)定法實(shí)施。
12.權(quán)利要求6的方法，其中所述試劑包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物對(duì)，且所述方法用PCR測(cè)定法實(shí)施。
13.權(quán)利要求1或6的方法，其中所述試劑是可檢測(cè)地標(biāo)記的。
14.物質(zhì)在制備試劑中的用途，所述試劑用于抑制表達(dá)FIG-ROS融合多肽的肺癌的進(jìn)展的方法中，所述方法包括抑制所述多肽在所述癌癥中的表達(dá)和/或活性的步驟。
15.物質(zhì)在制備試劑中的用途，所述試劑用于抑制包含編碼FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的肺癌的進(jìn)展的方法中，所述方法包括抑制所述多核苷酸在所述癌癥中的表達(dá)的步驟。
16.權(quán)利要求14或15的用途，其中所述哺乳動(dòng)物肺癌來自人。
17.權(quán)利要求14的用途，其中所述物質(zhì)是選自PF-02341066、NVTTAE-684和AP26113的治療劑。
18.將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對(duì)ROS-抑制性治療劑響應(yīng)的患者的方法，所述方法包括: 將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結(jié)合FIG-ROS融合多肽的試劑相接觸， 檢測(cè)所述試劑是否特異性結(jié)合所述生物樣品，其中所述試劑與所述生物樣品的結(jié)合的檢測(cè)將所述患者鑒定為可能對(duì)ROS-抑制性治療劑響應(yīng)的患者。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述ROS抑制性治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。
20.ROS-抑制性治療劑在制備試劑中的用途，所述試劑用于治療患者的肺癌的方法中，所述方法包括檢測(cè)來自患有肺癌或疑似患有肺癌的患者的生物樣品中FIG-ROS融合多肽的存在，并且將有效量的所述試劑施用于所述患者。
21.權(quán)利要求20的用途，·其中所述治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103858011SQ201280036118
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月23日
【發(fā)明者】V.M.林庫(kù)納斯, H.哈克, T-L.古, A.郭, A.P.波塞馬托, K.E.克羅斯比, M.A.塔克, C.里弗斯 申請(qǐng)人:細(xì)胞信號(hào)科技公司