專利名稱：一種亞麻籽產(chǎn)品中有益及有害成分的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別指一種亞麻籽產(chǎn)品中有益及有害成分的檢測方法。
背景技術(shù)：
亞麻(linum usitatissimun L.)亦稱胡麻,是世界十大油料作物之一。亞麻種子-亞麻籽中含有α-亞麻酸和木脂素等多種對健康有益的成分。亞麻籽木脂素-裂環(huán)異落葉松脂素雙糖苷(secoisolariciresinol diglucoside, SDG)經(jīng)體內(nèi)代謝活性化后具有改善婦女更年期癥狀、防治乳腺癌等功效[張才煜，張本剛，楊秀偉.亞麻子化學成分及其藥理作用研究進展.中國新藥雜志，2005，14 (5) :525-530]。另一方面，亞麻籽中也含有生氰糖苷類化合物-亞麻氰苷和新亞麻氰苷。生氰糖苷在酶或消化道酸和微生物的作用下會分解釋放出毒性很強的氫氰酸，因此大量食用含有生氰糖苷的亞麻籽產(chǎn)品會引起食物中 毒[周小潔，車向榮，于霏.亞麻籽及其餅柏的營養(yǎng)學和毒理學研究進展.飼料工業(yè)，2005，26(19) :46-50]。準確快速的生氰糖苷和木脂素檢測方法對確保亞麻籽產(chǎn)品的食用安全以及指導高質(zhì)量亞麻籽產(chǎn)品的生產(chǎn)非常重要。迄今為止，亞麻籽及其產(chǎn)品中生氰糖苷的檢測方法主要有硝酸銀滴定法、氰離子選擇電極法、比色法和高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)等，其中高效液相色譜法有重復性好、回收率高的優(yōu)點[周小潔，車向榮，于霏.亞麻籽及其餅柏的營養(yǎng)學和毒理學研究進展.飼料工業(yè)，2005，26 (19) :46-50]。然而，由于亞麻籽中的生氰糖苷缺乏共軛雙鍵，紫外吸收不強，影響了紫外檢測定量的靈敏度。近年發(fā)展起來的質(zhì)譜檢測可以很好得彌補紫外檢測的不足，特別是質(zhì)譜(MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)模式，在定量化合物時不僅考慮了保留時間，還考慮了化合物的母離子及子離子，大大提高了定量分析的分辨率和準確度。近年雖有個別高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)檢測亞麻籽生氰糖苷的報道[Park, Eun-Ryong ；Hong, Jin-Hwan ；Lee, Dong-Ha ；Han, Sang-Bae ；Lee, Kang-Bong ；Park, Jae-Seok ；Chung, Hyung-ffook ;Hong, Kyung-Hyun ；Kim, Myung-Chul.Analysis and decrease of cyanogenic glucosides in flaxseed. Korea Food and DrugAdministration. (2005)，34 (6)，875-879]，但還沒有使用定量方面更有優(yōu)勢的MRM模式檢測法的報道。另外，對亞麻籽木脂素SDG及亞麻氰苷和新亞麻氰苷的同時定量方法還沒見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種亞麻籽產(chǎn)品中有益及有害成分的檢測方法。本檢測方法采用含內(nèi)標化合物的甲醇溶液對亞麻子產(chǎn)品進行提取和前處理，之后通過U/HPLC-MS的MRM模式對亞麻氰苷、新亞麻氰苷及亞麻籽木脂素SDG這三種成分進行定性定量分析。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題由如下方案實現(xiàn)一種亞麻籽產(chǎn)品中有益及有害成分的檢測方法，步驟特征是(I)內(nèi)標溶液配制配制含內(nèi)標化合物濃度固定在O. 1-500 μ g/mL的甲醇溶液；(2)配制標準曲線用溶液用步驟(I)所述內(nèi)標溶液溶解亞麻籽純成分得到濃度為O. 5-500 μ g/mL的標準品儲存液，用步驟(I)所述內(nèi)標溶液稀釋所述標準品儲存液得到系列濃度的標準溶液；(3)亞麻籽油樣品處理取50-5000 μ L亞麻籽油加O. I-IOmL的步驟(I)所述內(nèi)
標溶液進行萃取，靜置或離心分層，取上清液做液-質(zhì)聯(lián)用分析；(4)亞麻籽固體樣品處理取15-1500mg亞麻籽固體樣品加O. I-IOmL的步驟(I)所述內(nèi)標溶液進行提取，靜置或離心分層，取上清液做液-質(zhì)聯(lián)用分析；(5)液-質(zhì)聯(lián)用分析高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定量分析色譜柱填料為反相硅膠0DS，流動相為AB兩相梯度洗脫，其中A為含酸的水溶液；B為乙腈或甲醇，采用負離子模式·多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜定量；(6)待測物濃度計算步驟(2)的標準溶液用步驟(5)的方法來分析，求出Y軸為響應(yīng)因子，X軸為成分濃度的標準曲線，其中響應(yīng)因子為成分峰面積與內(nèi)標峰面積之比，上述步驟(3)和步驟(4)的樣品經(jīng)步驟(5)的方法分析可得出亞麻籽樣品中成分的響應(yīng)因子，再用標準曲線計算出待測物濃度。整個計算過程可用相應(yīng)計算機軟件或(超)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀所帶軟件完成。首先選定結(jié)構(gòu)性質(zhì)與待測成分相近的化合物為內(nèi)標物。然后固定內(nèi)標化合物的濃度，配置一系列濃度的亞麻氰苷、新亞麻氰苷及SDG的標準溶液，用LC-MS的MRM模式測定。根據(jù)標準品的濃度和化合物與內(nèi)標物面積之比繪制標準曲線，求出橫軸為化合物濃度，縱軸為化合物與內(nèi)標物面積之比的線性回歸方程。用含同樣濃度內(nèi)標的甲醇溶液提取樣品，LC-MS的MRM模式測定面積，將化合物與內(nèi)標物面積之比代入回歸方程計算化合物的濃度。計算過程可用各種定量軟件完成。測得加標回收率為85. 3 112. 3%，說明該方法準確度符合實驗要求，結(jié)果可靠。本發(fā)明的優(yōu)點是選用了性質(zhì)與化合物相近的內(nèi)標化合物，并在提取樣品時既加入內(nèi)標化合物，在整個樣品前處理與分析過程中內(nèi)標化合物與待測化合物共存，從而盡可能地抵消了提取率不全及分析過程中的誤差。本檢測方法具有快速、準確、重現(xiàn)性好，能同時測定亞麻籽有益成分和有害成分等優(yōu)點。


圖I為亞麻氰苷、新亞麻氰苷及SDG的化學結(jié)構(gòu)式。圖2為亞麻木脂素(SDG)的標準曲線。圖3為本檢測方法的流程圖。
具體實施例方式如圖3所示的實施例和步驟僅為一例，但內(nèi)標化合物不限于例中所用化合物，也可選其它和待測物結(jié)構(gòu)相近的化合物作為內(nèi)標，如蘆丁等其它酚類成分、海藻糖等其它碳水化合物?？墒褂靡环N內(nèi)標，也可分別針對于SDG和生氰糖苷使用兩種內(nèi)標化合物。在原理相同的情況下具體步驟和樣品提取的料液比例可適當調(diào)整。
①配制內(nèi)標溶液配制內(nèi)標物(相思子素-2 " -O-芹菜糖甙，Abrusin2 " -O- β -apioside)濃度為 10 μ g/mL 的甲醇溶液。②配制標準曲線用溶液配制含50μ g/mL的亞麻氰苷、新亞麻氰苷及SDG和10 μ g/mL內(nèi)標化合物的甲醇溶液，用上述內(nèi)標溶液按照I :3:3:3:3:3:3:3:3比例稀釋得系列濃度的標準溶液。③亞麻籽油樣品處理取500 μ L亞麻子油加ImL上述含內(nèi)標溶液超聲提取IOmin后再震搖lmin，如此反復3次，靜置分層，取上清液過O. 22微米濾膜后，得樣品溶液做液-質(zhì)聯(lián)用分析。④亞麻籽固體樣品處理取150mg固體樣品加ImL上述內(nèi)標溶液超聲提取IOmin后震搖lmin，如此反復3次，然后IOOOOrmp離心2. 5min，取上清液過O. 22微米濾膜后，得樣品溶液做液-質(zhì)聯(lián)用分析。
⑤液-質(zhì)聯(lián)用分析超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定量分析用色譜柱為AgilentZORBAX Eclipse Plus C18(2. ImmX 50mm ;粒徑 I. 8 μ m)，柱溫保持在 30°C。流動相為 AB 兩相梯度洗脫，其中A為含O. I % (v/v)甲酸的水溶液，B為乙腈。洗脫程序為0min，2%B;3min, 20 % B ；3. 5min, 40 % B ；5min, 50 % B ；5. 5min, 100 % B ；7min, 100% B0 流速 0. 4mL/min ;樣品注射量為2 μ L。質(zhì)譜毛細管電壓4kV，離子源溫度350°C，采用負離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)定量，參數(shù)設(shè)置如表I所示。表I亞麻籽成分及內(nèi)標物的MRM測定條件
化合物母離子子離子駐留時裂解電碰撞能加速器能極性
___間壓量量
亞麻氰408323,80 160 77負
苷(I)[M-H]'179
新亞麻422323,80 170 5I負
氰苷 C2)[M-H]-179___
SDG (3)720.8684.8，80 155 20，7負
__[M+C1]·522.825
內(nèi)標607354，80 200 35，7負 __[M-H]·32545其中亞麻氰苷的裂解電壓可以為5-500，優(yōu)選140-180 ;新亞麻氰苷的裂解電壓可以為5-500，優(yōu)選150-190 ；SDG的裂解電壓可以為5-500，優(yōu)選120-180。所有化合物的碰撞能量可以為5-200,優(yōu)選表中所不數(shù)值±10。表2例舉了目標及內(nèi)標化合物的名稱、保留時間和最低定量限等參數(shù)。最低定量限定義為信噪比為10時的濃度。標準曲線方程中的X為被測物濃度，Y為響應(yīng)因子(被測物與內(nèi)標峰的峰面積之比)。
⑥待測物濃度計算通過將樣品溶液中目標物的響應(yīng)因子代入標準曲線方程求出其濃度，進而引入提取溶劑的用量及稀釋倍數(shù)計算出各目標化合物在樣品中的含量。表2亞麻籽成分定量的有關(guān)參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種亞麻籽產(chǎn)品中有益及有害成分的檢測方法，步驟特征是 (1)內(nèi)標溶液配制配制含內(nèi)標化合物濃度固定在O.1-500 μ g/mL的甲醇溶液； (2)配制標準曲線用溶液用步驟(I)所述內(nèi)標溶液溶解亞麻純成分得到濃度為O.5-500 μ g/mL的標準品儲存液，用步驟(I)所述內(nèi)標溶液稀釋所述標準品儲存液得到系列濃度的標準溶液； (3)亞麻籽油樣品處理取50-5000μ L亞麻籽油加O. I-IOmL的步驟⑴所述內(nèi)標溶液進行萃取，靜置或離心分層，取上清液做液-質(zhì)聯(lián)用分析； (4)亞麻籽固體樣品處理取15-1500mg亞麻籽固體樣品加O.I-IOmL的步驟(I)所述內(nèi)標溶液進行提取，靜置或離心分層，取上清液做液-質(zhì)聯(lián)用分析； (5)液-質(zhì)聯(lián)用分析高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定量分析色譜柱填料為反相硅膠ODS，流動相為AB兩相梯度洗脫，其中A為含酸的水溶液；B為乙腈或甲醇，采用負離子模式多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜定量； (6)待測物濃度計算步驟(2)的標準溶液用步驟(5)的方法來分析，求出Y軸為響應(yīng)因子，X軸為成分濃度的標準曲線，其中響應(yīng)因子為成分峰面積與內(nèi)標峰面積之比，上述步驟(3)和步驟(4)的樣品經(jīng)步驟(5)的方法分析可得出亞麻籽樣品中成分的響應(yīng)因子，再用標準曲線計算出待測物濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種亞麻籽產(chǎn)品中有益及有害成分的檢測方法。主要步驟是配制含固定濃度內(nèi)標化合物的內(nèi)標溶液，用內(nèi)標溶液配制系列濃度的待測成分的標準溶液，用液-質(zhì)聯(lián)用MRM模式分析，繪制X軸為濃度；Y軸為成分峰面積與內(nèi)標峰面積之比的標準曲線，用內(nèi)標溶液提取亞麻籽樣品并對該提取液進行液-質(zhì)聯(lián)用MRM模式分析，從標準曲線或其回歸方程中求出亞麻籽產(chǎn)品中的有益成分(亞麻木脂素，SDG)及有害成分(亞麻氰苷和新亞麻氰苷)的含量。本檢測方法有快速、準確、重現(xiàn)性好，所用時間短等優(yōu)點，是亞麻籽產(chǎn)品質(zhì)量控制和生產(chǎn)條件的重要監(jiān)測手段。
文檔編號G01N30/06GK102914601SQ201210341719
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者馬超美, 王雅麗, 麻劍南, 劉治君, 劉強 申請人:內(nèi)蒙古大學