專利名稱：一種采用BD-液體³¹P NMR測定土壤磷組分的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及土壤磷組分的浸提及測定，具體為一種采用BD-液體31P NMR測定土壤磷組分的方法。
背景技術：
磷(P)作為植物體能量轉化(ATP)、細 胞結構(磷脂)、新陳代謝和信號傳導的中心物質，是植物生長發(fā)育所必需的一種營養(yǎng)元素，了解土壤中的磷組分特征并加以控制利用，在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡中起著重要的作用。土壤中的磷可分為有機磷和無機磷兩大組分，由于土壤中有機磷化合物的測定相對比較困難，因此其測定方法的研究比無機磷分組要晚，發(fā)展也較為緩慢。Bowman和Cole (1978)提出的土壤有機磷分級體系將土壤有機磷分為活性(易礦化，易被植物吸收)、中活性(較易礦化，較易被植物吸收)、中穩(wěn)性(較難礦化，較難被植物吸收)和高穩(wěn)性(很難礦化，基本不被植物吸收)有機磷4種形態(tài)。該方法能夠用來表示土壤有機磷對植物有效性的高低。但該方法測定的活性有機磷中未包含土壤微生物磷，且先酸后堿的提取過程使穩(wěn)定性有機磷測定值偏低。IvanofT等(1998)把全部土壤有機磷分成活性有機磷、中活性和非活性有機磷，在活性有機磷組分中包括了微生物磷，但中活性和非活性有機磷的提取順序仍為先酸后堿。Hedley等(1982)利用一種連續(xù)浸提的技術把有機磷分在七個組分中，包括樹脂交換態(tài)磷、NaHCO3提取態(tài)磷、微生物細胞磷、NaOH溶性磷、土壤團聚體內磷、磷灰石型磷和殘留磷。Hedly等的方法被認為是比較合理的磷組分分級方法，在于其兼顧了土壤有機磷和無機磷組分的分級提取。但該法不能提取固持較緊密的磷酸鹽和微生物量磷，且對實驗室儀器設備要求較高。1980年，Newman和Tate首次將31P NMR技術應用于新西蘭草場土壤的磷化合物分析。1985年，Cohn等在連續(xù)波譜儀上，第一次得到了 ATP的31PNMR波譜，從而開始了 31P NMR波譜應用于生物領域研究的新階段。目前，31PNMR測定有機磷組分主要有液體核磁和固體核磁兩種方法，其中液體核磁可以通過磷化合物的鍵連接較準確的檢測到多數(shù)環(huán)境中的磷組分。然而在對土壤中的磷組分進行測定時仍存在土壤磷浸提率偏低，譜圖分辨率較低，化學位移偏差較大導致譜圖準確性較差等問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種采用BD-液體31P NMR測定土壤磷組分的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術方案為一種采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于采用NaOH-EDTA溶液將待測土壤溶解，溶解液離心得土壤磷浸提液，浸提液中加入碳酸氫鈉連二亞硫酸鹽緩沖液后進行冷凍干燥處理；冷凍后所得粉末重溶解，最后應用31PNMR進行測定，即可定量及定性的得到待測土壤磷組分的組成。將待測土壤溶解于強堿液NaOH以及具有較強的螯合配位體的EDTA溶液中于15-25°C振蕩浸提12-16h,而后在以10000*g下離心25_40min后,使土壤中的磷溶于上清液中從而被浸提出來。
所述采用50mLNa0H-EDTA溶液將待測土壤2. 5g溶解；所述NaOH-EDTA溶液為濃度O. OSmoir1的Na2EDTA溶液和濃度O. 25molL_1的NaOH溶液混合液(NaOH-EDTA溶液配制方法稱取IOg NaOH溶于600mL的去離子水中，再加入18. 612g Na2EDTA,最后定容至IOOOmL)。所述浸提液中加入浸提液體積4-5%的碳酸氫鈉連二亞硫酸鹽緩沖液混合，然后用旋凍器在-30到_50°C條件下冷凍20-30分鐘，再用冷凍干燥機抽真空冷凍至粉末狀。所述碳酸氫鈉連二亞硫酸鹽緩沖 液為濃度O. I Imoir1的NaHCO3和濃度O. I Imoir1的Na2S2O4混合液(碳酸氫鈉-連二亞硫酸鹽緩沖液配制方法稱取1. 8482g NaHCO3與
3.8309g Na2S2O4用去離子水定容至200mL)。將上述冷凍后所得粉末重溶解于重溶液中，重溶解后于600M核磁(J0ELECA600)的31PNMR進行測定；其中重溶液為O. Iml濃度lOmolL—1的NaOH和O. 5mlD20混合(重溶液配制方法0. 04gNa0H加入O. ImL去離子水與O. 5mLD20)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點I.本發(fā)明對土壤磷浸提液進行BD液處理后冷凍干燥，降低了有機磷在浸提液中的水解過程，且BD液的添加降低了核磁測定過程中順磁性物質對31PNMR譜圖分辨率的影響。2.本發(fā)明采用NaOH和EDTA混合液對土壤磷組分進行提取，EDTA能夠螯合順磁性離子，提高土壤磷的浸提比例，且在浸提液中添加BD溶液能夠降低鐵、錳等順磁性物質在譜圖測定中的干擾，從而提高譜圖分辨率，增加了土壤磷的浸提比例，提高了土壤磷組分分析時的準確性。3.本發(fā)明通過對液體31P NMR測定時相關參數(shù)的確定，提高了譜圖的分辨率，增加了譜圖解析時的準確性。


圖I為本發(fā)明實施例提供的不同土地利用方式下BD-液體31P NMR譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明采用NaOH - EDTA浸提離心的方法將土壤中的磷浸提出來，得到土壤磷浸提液；然后在浸提液中加入BD溶液后進行冷凍干燥處理，得到粉末樣品；將干燥后的粉末用O. ImlIOmolL-1NaOH和O. 5mlD20重溶解后進行31P NMR上機測試，即可得到土壤磷組分的
相關信息。具體方法詳述如下I) 土壤磷上機樣品的獲取2. 5g風干土樣，倒入IOOml離心管中，加入50mlNaOH-EDTA混合液浸提(配制方法稱取IOg NaOH溶于600mL的去離子水中，再加入18. 612gNa2EDTA,最后定容至IOOOmL),在15_25°C條件下振蕩12_16h，震蕩后將浸提液在10000*g下離心25-40min，離心時保持溫度為低于20°C條件。迅速將離心后的上清液取約40ml，倒入冷凍干燥瓶中，然后往冷凍干燥瓶中加入相當于浸提液4-5%體積的碳酸氫鈉-連二亞硫酸鹽緩沖液(配制方法稱取I. 8482g NaHCO3與3. 8309g Na2S2O4用去離子水定容至200mL)，搖勻后，迅速將其用旋凍器在-30到_50°C條件下旋轉冷凍約20-30分鐘，讓浸提液均勻的凍結在冷凍干燥瓶的瓶底。迅速將凍勻的冷凍干燥瓶轉移到冷凍干燥儀上繼續(xù)抽真空冷凍干燥，直至呈干燥的粉末狀(注在冷凍干燥過程中要保持-30到_50°C的條件，使樣品一直處于冷凍狀態(tài))。將冷凍干燥瓶小心取下，將其中的干燥粉末狀樣品裝入提前預備好的樣品袋中，混勻，備用。2)磷組分的液體31P NMR測定將步驟I)得到的土壤磷浸提液的凍干粉末稱取100-300mg重溶解于O. ImllOmolL 1NaOH和O. 5mlD20 (用于鎖定信號)后移入5mm核磁管中，用600M核磁(JOEL ECA 600)在243MHz，5. 2 μ s脈沖(45° )，延遲時間I. Os，收集時間
I.077s，化學位移50ppm范圍 條件下進行掃描2. 3萬次，時間約15h左右，即可得土壤磷組分的液體31P NMR譜圖。實施例I取不同土地利用方式下(玉米地、水稻田、林地和撂荒地)過2mm篩的風干土壤樣品各2. 5g，加入50ml NaOH-EDTA(配制方法稱取IOg NaOH溶于600mL的去離子水中，再加入18. 612g Na2EDTA,最后定容至IOOOmL)混合液震蕩后，在10000*g下離心30分鐘。浸提液離心后的上清液每重復取5-10ml，使總體積達到40ml左右后立即進行冷凍干燥。在冷凍干燥前，將浸提液中加入浸提液體積的5%的碳酸氫鈉-連二亞硫酸鹽緩沖液(配制方法稱取I. 8482gNaHC03與3. 8309gNa2S204用去離子水定容至200mL)中搖勻后，迅速將其用旋凍器在低于_40°C條件下旋轉冷凍約20分鐘，讓浸提液均勻的凍結在冷凍干燥瓶的瓶底。迅速將凍勻的冷凍干燥瓶轉移到冷凍干燥儀上繼續(xù)抽真空冷凍干燥，直至呈干燥的粉末狀。將冷凍干燥瓶小心取下，將其中的干燥粉末狀樣品裝入提前預備好的樣品袋中，混勻，備用。然后稱取冷凍干燥后的粉末200mg重溶解于O. Iml濃度IOmoir1的NaOH和O. 5ml的D2O后移入5mm核磁管中，對樣品進行31P NMR上機測定。測定時用600M核磁(JOEL ECA600)在243MHz, 5. 2 μ s脈沖(45。)，延遲時間I. Os,收集時間I. 077s, 50ppm條件下每個樣品均掃描2. 6萬次，時間約15h，即可得到土壤磷組分的液體31P NMR譜圖。利用600M核磁(JOEL ECA 600)測定的實施例I中不同土地利用方式下的土壤樣品31P NMR譜圖(見圖I),采用微軟公司NMR實用轉換軟件(Utility Transform Software,NUTSXAcorn NMR, Livermore, CA)，16 - Hz線寬對譜圖進行分析的數(shù)據(jù)(見表I和表2)。由圖I、表I和表2可知，四種土地利用方式條件下的磷組分均是以正磷酸鹽和單酯為主，且均有少量的焦磷酸鹽存在，二酯含量均較低，且二酯中的DNA只在玉米地和水稻田中檢測到。各處理下譜圖均較清晰，雜峰較少，化學位移表達較準確，表明其譜圖準確性以及分辨率較高，質量較好。表IBD-液體31P NMR測定土壤NaOH - EDTA浸提液中的磷組分及其化學位移
權利要求
1.一種采用BD-液體31P NMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于采用NaOH-EDTA溶液將待測土壤溶解，溶解液離心得土壤磷浸提液，浸提液中加入碳酸氫鈉連二亞硫酸鹽緩沖液后進行冷凍干燥處理；冷凍后所得粉末重溶解，最后應用31P NMR進行測定，即可定量及定性的得到待測土壤磷組分的組成。
2.按權利要求I所述的采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于將待測土壤溶解于強堿液NaOH以及具有較強的螯合配位體的EDTA溶液中于15_25°C振蕩浸提12-16h，而后在以10000*g下離心25-40min后，使土壤中的磷溶于上清液中從而被浸提出來。
3.按權利要求I或2所述的采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于所述NaOH-EDTA溶液為濃度O. 05molL_1的Na2EDTA溶液和濃度O. 25molL_1的NaOH溶液混合液。
4.按權利要求I所述的采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于所述浸提液中加入浸提液體積4-5%的碳酸氫鈉連二亞硫酸鹽緩沖液混合，然后用旋凍器在-30到_50°C條件下冷凍20-30分鐘，再用冷凍干燥機抽真空冷凍至粉末狀。
5.按權利要求I或4所述的采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于所述碳酸氫鈉連二亞硫酸鹽緩沖液為濃度O. Ilmoir1的NaHCO3和濃度O. Ilmoir1的Na2S2O4混合液。
6.按權利要求I所述的采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法，其特征在于將上述冷凍后所得粉末重溶解于重溶液中，重溶解后于600M核磁(J0ELECA600)的31PNMR進行測定；其中重溶液為O. Iml濃度lOmolL—1的NaOH和O. 5mlD20混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及土壤磷組分的浸提及測定，具體為一種采用BD-液體31PNMR測定土壤磷組分的方法。采用NaOH–EDTA溶液將待測土壤溶解，溶解液離心得土壤磷浸提液，浸提液中加入碳酸氫鈉–連二亞硫酸鹽緩沖液后進行冷凍干燥處理；冷凍后所得粉末重溶解，最后應用31PNMR進行測定，即可定量及定性的得到待測土壤磷組分的組成。本發(fā)明采用物理、化學相結合的方法對土壤中的磷進行浸提、測定，提高了31PNMR譜圖的分辨率以及準確性，適于土壤磷組分的鑒定分析。
文檔編號G01N1/28GK102818813SQ201210275629
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權日2012年8月3日
發(fā)明者張艾明, 陳振華, 陳利軍, 梁文舉 申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所