專利名稱：融合有v5標簽重組蛋白的elisa定量檢測試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體是涉及一種融合有V5標簽重組蛋白的ELISA定量檢測試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
目前，在重組蛋白的表達中，為了便于重組蛋白的鑒定分析，常常在蛋白中融合一個“蛋白標簽，，，如6XHis tag、V5 tag,GFP tag,GST tag,flag tag、c_myc tag 等。在常見的真核表達載體中，常用的標簽有6XHis tag、V5tag和GFP tag。與6X組氨酸標簽相比，V5 tags在真核蛋白的鑒定分析中具有更好的特異性，由于只有14個氨基酸，V5標簽的插入幾乎對重組蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響。標簽多肽的使用使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以應(yīng)用商品化的標簽抗體快速地鑒定出外源蛋白的表達情況。到目前為止，標簽蛋白及其抗體大多使用在對目的蛋白的定性分析中，很少用于對目的蛋白的定量分析。本發(fā)明建立了一種對溶液中融合有V5標簽重組蛋白的通用、快速、簡便、準確的定量方法，并且提供了應(yīng)用本檢測方法測定目的蛋白的一套試劑系統(tǒng)；與較多使用的“雙抗夾心法”相比，“競爭法”只用一種商業(yè)化抗便可完成對目的蛋白的定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種融合有V5標簽重組蛋白的ELISA定量檢測試劑盒。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種融有V5標簽蛋白的ELISA定量檢測試劑盒，其包括有(A)包被有V5多肽的微孔板，每個微孔包被100 μ L的V5多肽，V5多肽的濃度為 0. 015μ g/mL-2y g/mL ；(B)lmg/mL的抗-V5多肽單克隆抗體的工作濃度的稀釋比例為1 500-64000， 用量為每微孔100 μ L。本發(fā)明的另一目的是提供一種融有V5標簽的蛋白的ELISA檢測方法。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種融有V5標簽的蛋白的檢測方法，包括以下步驟(1)用待測樣品對抗-V5多肽單克隆抗體進行稀釋，得混合液，抗-V5多肽單克隆抗體(lmg/mL)的稀釋比例為1 500-64000 ；混合液4°C孵育過夜；(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100 μ L上述混合液，37°C孵育0. 8-1. 2 小時；所述微孔板每孔包被V5多肽100 μ L，V5多肽的濃度范圍為0. 015 μ g/mL-2 μ g/mL ；(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗體，37°C孵育；清洗后加入TMB底物溶液顯色；(4)于各反應(yīng)孔中加入終止液反應(yīng)，在酶標儀450nm波長下檢測OD值。優(yōu)選地，所述V5多肽的濃度為0. 125 μ g/mL-0. 5 μ g/mL,最優(yōu)選為0. 25 μ g/mL ；所述抗-V5多肽單克隆抗體的工作濃度為0. 25-1 μ g/mL，最優(yōu)選的工作濃度為0. 5 μ g/mL。本發(fā)明的有益效果如下(1)與“雙抗夾心法”相比，僅使用V5多肽標準品及其商品化抗體便可實現(xiàn)對液體中目的蛋白的精確定量，無須使用目的蛋白的特異性抗體；(2)原材料使用少，該方法中商品化多肽及其抗體的使用量較低，如V5多肽包被濃度為0. 25 μ g/mL, V5單抗的使用濃度為0. 5 μ g/mL,對于重組蛋白的定量分析，使用 2. 5μ g的多肽抗體，便可對約80個樣品進行定量分析，試劑盒組裝成本低；(3)分析了細胞上清中其它蛋白成分(FBQ對該檢測方法準確性的影響，發(fā)現(xiàn)不同倍數(shù)稀釋的FBS對標準曲線的建立無影響，重組蛋白所在溶劑中的FBS對V5多肽與其抗體的免疫結(jié)合無影響，同時也說明應(yīng)用V5標簽進行免疫反應(yīng)的特異性較好，這一實驗證明該方法對V5融合蛋白定量分析的準確性和可靠性；(5)可以分析溶液中低至0. 15ng/mL的目的蛋白，可以用于定量分析微量表達的融合蛋白；該試劑盒的檢測范圍是0. 1 2. Ong/mL，線性范圍足以檢測細胞表達上清中目的蛋白的含量。


圖1 “棋盤滴定”法確定最佳的抗原抗體用量；圖2血清對標準曲線干擾的分析；圖3不同樣品稀釋倍數(shù)下的ELISA標準曲線；圖4 ELISA標準曲線。
具體實施例方式本發(fā)明中所用到的包被緩沖液、清洗液、酶標反應(yīng)板、封閉液、TMB底物、羊抗鼠 IgG-HRP抗體等是本領(lǐng)域中ELISA法公知的試劑?？少徺I也可以自己配制。實施例1一、方法與步驟1.應(yīng)用“棋盤滴定”法確定抗原與抗體使用濃度(1)將已精確定量的干粉狀態(tài)的V5多肽(GKPIPNPLLGLDST，Sigma公司產(chǎn)品)稀釋為％ig/mL，再用包被液(包被緩沖液)將濃度為％ig/mL的V5多肽液稀釋為2 μ g/mL, 1 μ g/mL,0. 5 μ g/mL,0. 25 μ g/mL,0. 125 μ g/mL,0. 062 μ g/mL,0. 03 μ g/mL,0. 015 μ g/mL, 共8個濃度梯度，每孔100 μ L橫向加于酶標反應(yīng)板中，4°C包被過夜；(2)傾去包被緩沖液，用清洗液清洗3次，加入100 μ L含5% BSA的PBST溶液(封閉液)，37°C封閉1小時；C3)傾去封閉液，用清洗液再次清洗2次；將Anti_V5 monoclonal antibody(抗V5 多肽單克隆抗體，濃度為lmg/mL，Sigma公司產(chǎn)品)用PBST稀釋為1/500，1/1000，1/2000， 1/4000,1/8000,1/16000,1/32000,1/64000，共8個濃度，每孔100 μ L縱向加于酶標反應(yīng)板中，37°C孵育1小時；(4)清洗液洗滌三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗體100 μ L，37°C孵育1小時；(5)清洗液洗滌三次，于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 μ L，室溫孵育10 20分鐘；(6)終止反應(yīng)，于各反應(yīng)孔中加入2mo 1/L H2S0450 μ L (終止液)；在酶標儀450nm 波長下檢測吸光度OD值，打印結(jié)果；(7)選擇各行OD 450為1. 0左右時V5多肽與anti-V5 antibody的稀釋倍數(shù)做競爭ELISA，取半數(shù)抑制(IC50)最低的V5多肽與anti-V5 antibody的稀釋倍數(shù)為其最佳工作參數(shù)。2.對分泌蛋白的定量分析步驟建立(1) “競爭ELISA”標準曲線的建立用倍比稀釋的標準樣品(V5多肽)繪制競爭ELISA的可測量的線性范圍；同時分析FBS是否影響定量結(jié)果，做了以下分析a.分析“棋盤滴定”數(shù)據(jù)，根據(jù)技術(shù)人員的積累的經(jīng)驗，確定一個最佳的抗原(V5 多肽，最佳值為 0. 25 μ g/mL)和最適的抗體濃度(Anti-V5monoclonal antibody, 0. 5 μ g/ mL)。適量稀釋％ig/mL的V5多肽至0. 25 μ g/mL,按每孔100 μ L滴加于酶標板中，4°C包被過夜；同時用含有不同含量的對照溶劑(即含有10% FBS的細胞培養(yǎng)基或蛋白透析液，用 PBS 稀釋為1/25，1/50，1/100，1/200，1/400)對 ant i-V5monoclonal antibody 進行 2000 倍稀釋，分別用以上溶液稀釋V5多肽標準品，至濃度為(16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、 lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL)，形成 V5-anti-V5antibody、混禾口液。一個濃度的對照溶劑對應(yīng)兩個重復的標準品，4°C預孵育過夜(方法如圖1所示)；b.清洗液(PBST)清洗3次，100 μ L封閉液37°C封閉1小時；c.充分清洗后，將a.中“V5-anti_V5 antibody混和液”按每孔100 μ L加于酶標反應(yīng)板中，37°C孵育1小時；d.清洗液清洗三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗體100 μ L，37°C孵育1小時；清洗三次后，加入TMB底物溶液100 μ L，顯色；e.于各反應(yīng)孔中加入2mo 1/L (終止液)50 μ L終止反應(yīng)，在酶標儀450nm 波長下檢測OD值，記錄結(jié)果。以結(jié)合率Β/Β0 )為縱坐標(B是V5多肽不同標準濃度的 0D450,B0是不加V5多肽的0D450)，以不同濃度V5多肽的值為橫坐標，繪制標準抑制曲線， 進行相關(guān)回歸分析，計算出相關(guān)系數(shù)。(2)競爭性ELISA對分泌蛋白的定量根據(jù)上述分析，確定一個最佳的V5抗原和V5抗體的包被濃度，確定一個最佳的樣品稀釋倍數(shù)或稀釋范圍-25，50，100，200，400倍稀釋樣品，根據(jù)上述操作步驟繪制標準曲線的線性范圍確定融合有V5標簽重組蛋白的濃度值。Office Excel 2003分析結(jié)果。二、結(jié)果分析與應(yīng)用1.最適抗原包被量與最適抗體濃度通過“棋盤滴定”法確定最適的抗原包被量與液相中抗體的稀釋倍數(shù)。不同濃度包被抗原(V5多肽)與不同稀釋倍數(shù)抗體的組合所測OD值如表1。取半數(shù)抑制(IC50)最低的V5多肽與anti-V5 antibody的稀釋倍數(shù)為其最佳工作參數(shù)，根據(jù)表中數(shù)據(jù)分布，本試驗選擇0D450 = 1. 815處對應(yīng)的抗原抗體稀釋值作為最佳參數(shù)(優(yōu)選的參數(shù))V5多肽包被濃度為 0. 25 μ g/mL, anti-V5 antibody 稀釋倍數(shù)為 2000 (濃度為 0. 5 μ g/mL)。表1 “棋盤滴定”法確定最佳的抗原包被量與抗體稀釋倍數(shù)*
權(quán)利要求
1.一種融有V5標簽蛋白的ELISA定量檢測試劑盒，其特征是，包括有(A)包被有V5多肽的微孔板，每個微孔包被100μ L的V5多肽，V5多肽的濃度為 0. 015μ g/mL-2y g/mL ；(B)lmg/mL的抗-V5多肽單克隆抗體的工作濃度的稀釋比例為1 500-64000，用量為每微孔100 μ L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融有V5標簽的蛋白的ELISA定量檢測試劑盒，其特征是，所述V5多肽的包被濃度為0. 125 μ g/mL-0. 5 μ g/mL,所述抗-V5多肽單克隆抗體的工作濃度為 0.25-1 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融有V5標簽的蛋白的ELISA定量檢測試劑盒，其特征是，所述V5多肽的包被濃度為0. 25 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的融有V5標簽的蛋白的ELISA定量檢測試劑盒，其特征是，所述抗-V5多肽單克隆抗體的工作濃度為0. 5 μ g/mL。
5.一種融有V5標簽的蛋白的檢測方法，其特征是，包括以下步驟(1)用待測樣品對抗-V5多肽單克隆抗體進行稀釋，得混合液，lmg/mL的抗-V5多肽單克隆抗體稀釋比例為1 500-64000 ；混合液4°C預孵育過夜；(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μ L上述混合液，37°C孵育0. 8-1. 2小時；所述微孔板每孔包被V5多肽100 μ L，V5多肽的濃度為0. 015 μ g/mL-2 μ g/mL ；(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗體，37°C孵育；清洗后加入TMB底物溶液顯色；(4)于各反應(yīng)孔中加入終止液反應(yīng)，在酶標儀450nm波長下檢測OD值。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征是，所述V5多肽的包被濃度為0.25 μ g/mLo
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征是，所述抗-V5多肽單克隆抗體的工作濃度為 0. 5 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合有V5標簽重組蛋白的ELISA檢測試劑盒和方法，該方法用待測樣品對抗-V5單克隆抗體進行稀釋，得混合液，抗-V5單克隆抗體的工作濃度為1∶500-64000；在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μl上述混合液，孵育；所述微孔板每孔包被V5多肽100μL，V5多肽的濃度為0.015μg/mL-2μg/mL 0.25μg/mL；清洗；檢測OD值。所述ELISA方法的具有快速、簡便、能準確的定量的優(yōu)點，所述試劑盒檢測范圍可達0.1～2.0ng。
文檔編號G01N33/68GK102445545SQ20111028398
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者徐曉鵬, 李中圣, 王霞, 陳孝明 申請人:廣東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團研究院有限公司