專利名稱：一種核苷酸檢測(cè)序列及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中病毒的檢測(cè)方法，特別是丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生難題，目前全球約有1. 7億人感染HCV，我國(guó)進(jìn)行的全國(guó)HCV血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)一般人群抗-HCV 陽性率約為3. 2%，全國(guó)共約4000萬人感染HCV，HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。約50% -80%的HCV感染者會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥净颊?，而大約20%的患者會(huì)在 20年內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不Ｒ坏┺D(zhuǎn)為肝硬化，每年將會(huì)有1 % -5%的病人發(fā)展成為肝癌，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。如圖1所示，為HCV基因結(jié)構(gòu)圖。HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)9. 61Λ，含有一個(gè)開放的編碼區(qū)，可編碼一個(gè)多聚蛋白前體，由宿主和病毒的信號(hào)肽酶剪接成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋El (Core、El、E2)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、 NS4B、NS5A、NS5B)。HCV C蛋白由191個(gè)氨基酸殘基組成，是HCV基因組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域。5' UTR區(qū)最為保守，而3' UTR對(duì)于HCV RNA的正常復(fù)制是不可缺少的。肝臟是HCV的主要存在場(chǎng)所。HCV是嗜肝病毒，主要在肝內(nèi)復(fù)制，每克感染肝組織 HCV RNA含量高于每毫升血清的IO2至IO4拷貝，HCV血癥水平與肝組織中HCV復(fù)制活躍程度相關(guān)。因此，檢測(cè)肝組織HCV RNA含量更能準(zhǔn)確反映HCV在人體內(nèi)的復(fù)制程度。HCV感染不但侵襲肝臟組織，而且侵襲體內(nèi)各種肝外組織和器官，還能并發(fā)各種與丙肝病原學(xué)無關(guān)的疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道在丙型肝炎患者的腎、心、胰、腸、精液、唾液、乳液、尿液、汗液中均檢出 HCV0骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞是T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞組成的集合體，在清除HCV感染和HCV持續(xù)感染過程中扮演雙重角色。HCV感染早期，PBMC 發(fā)揮著呈抗原、清除病毒作用，HCV持續(xù)感染期又可能成為病毒潛伏、復(fù)制的肝外場(chǎng)所。人體難以清除HCV的一個(gè)主要原因是其具有高度異質(zhì)性，即HCV通過自身的變異達(dá)到逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的目的。在HCV RNA陽性者中，骨髓PBMC中HCV陽性率為36. 4%, B細(xì)胞陽性率為27. 2%, T細(xì)胞陽性率也為27. 2% ；外周血中也基本與骨髓中細(xì)胞陽性率相近，只是T 細(xì)胞陽性率比較低0. 9% )。血漿(或血清)中的HCVRNA的含量與肝組織HCV RNA呈正相關(guān)(r = 0. 85，P < 0. 01)。目前臨床上大多采用血漿(或血清)HCV RNA定量檢測(cè)，可直接反映丙型肝炎的病毒血癥水平，對(duì)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)干擾素治療效果有重要作用?，F(xiàn)在HCV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括抗-HCV的檢測(cè)和HCV-RNA的檢測(cè)?？?HCV的檢測(cè)是最早出現(xiàn)的HCV檢測(cè)技術(shù)，其檢測(cè)方法包括間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(間接ELISA)、雙抗原夾心ELISA、重組免疫印跡法(RIBA)、免疫層析法以及蛋白芯片檢測(cè)法。其中重組免疫印跡法(RIBA)是抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，而ELISA是應(yīng)用最廣的抗體檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)在廣泛使用的是第三代抗-HCV ELISA檢測(cè)試劑。第三代抗-HCV ELISA檢測(cè)試劑大多采用間接ELISA，特異性94% -100%，但由于丙肝患者“窗口期”的存在，仍有一定的漏檢率。HCV-RNA的檢測(cè)由于HCV RNA的檢測(cè)即是檢測(cè)HCV病毒本身，故認(rèn)為HCV RNA陽性即提示血中有HCV存在，是HCV確診的標(biāo)志。在血清ALT升高時(shí)和HCV抗體產(chǎn)生前檢出血中HCV RNA0有利于HCV感染的早期診斷，如經(jīng)治療后陰轉(zhuǎn)，則是治療有效的標(biāo)志，因此開展 HCV RNA檢測(cè)具有重要意義。感染者在感染2個(gè)星期內(nèi)血清中可檢測(cè)到HCV RNA，在感染自然恢復(fù)前血清中HCV RNA將達(dá)到一個(gè)高峰，但HCV RNA在達(dá)到峰值或重新出現(xiàn)前數(shù)天或數(shù)周內(nèi)偶爾也可能檢測(cè)不到。在大多數(shù)向慢性轉(zhuǎn)化的感染者中，HCV RNA含量降低速度逐漸減慢，最后趨于穩(wěn)定， 晚期肝病患者的HCVRNA水平很低，甚至無法測(cè)出，HCV RNA易被血細(xì)胞中的RNA酶降解，因此如果被檢標(biāo)本保存不當(dāng)(例如反復(fù)凍融)將影響檢測(cè)結(jié)果；HCV RNA還受進(jìn)食的影響，易與血中脂質(zhì)及脂蛋白結(jié)合，降低檢出率。因此在一定程度上影響了 NAT檢測(cè)。近年來發(fā)展的HCV核心抗原定性檢測(cè)方法表明，外周血中HCV核心抗原和HCV RNA 有良好的相關(guān)性，HCV核心抗原(HCVcAg)特異性99. 5%，敏感性94. 5%，可以明顯地縮短 HCV窗口期，適用于HCV感染的普查。對(duì)HCV感染者定量檢測(cè)HCV核心抗原可以準(zhǔn)確反映 HCV復(fù)制情況。在丙肝的診斷中HCV RNA和/或HCV核心抗原可能有互補(bǔ)的作用。聯(lián)合應(yīng)用這兩種標(biāo)志物可以提高對(duì)丙肝病人的病毒血癥和病毒復(fù)制的診斷率。在慢性丙肝抗病毒治療中，干擾素持續(xù)應(yīng)答與HCV核心抗原低于檢測(cè)水平、HCV RNA國(guó)際單位降低2個(gè)對(duì)數(shù)單位以上有顯著相關(guān)性。在單劑干擾素或聯(lián)合治療持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答中，治療1月后，83. 2% HCV 核心抗原低于檢測(cè)水平，HCV RNA國(guó)際單位降低2個(gè)對(duì)數(shù)單位以上，近年發(fā)展起來的HCV核心抗原檢測(cè)有可能在一定程度上替代核酸的檢測(cè)。由于HCV核心抗原檢測(cè)相對(duì)HCV RNA費(fèi)用較低，可能更有利于丙肝病人抗病毒治療效果的監(jiān)測(cè)。綜上所述，建立高靈敏度丙肝病毒核心抗原檢測(cè)技術(shù)，以及研制相應(yīng)的檢測(cè)試劑變得很迫切。生物條形碼檢測(cè)技術(shù)(bio-bar codes assay, BCA)是美國(guó)西北大學(xué)Mirkin教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組于2003年首次報(bào)道的一種新型標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，其突出特點(diǎn)是具有極高的靈敏度，可達(dá)常規(guī)ELISA方法的IO6倍。如圖2所示，普通生物條形碼檢測(cè)示意圖。圖中表示，BCA技術(shù)的基本原理是利用被檢物單抗標(biāo)記的磁性微球探針(magnetic microparticles, MMPs)和被檢物多抗及特異 DNA雙鏈標(biāo)記的金納米顆粒探針(nanoparticle，NP)，通過形成MMP-被檢物-NP三明治復(fù)合物后再利用去雜交將NP探針上標(biāo)記的特異DNA鏈釋放出來，通過常規(guī)PCR方法或芯片檢測(cè)方法(金標(biāo)銀染法)鑒定這些釋放的DNA鏈就可確定被檢物的存在。NP探針即是金納米顆粒包被有雙鏈DNA和抗被檢物的多克隆抗體，雙鏈DNA其中的一條和膠體金顆粒通過Au-S鍵相連，另一條和前者互補(bǔ)是用來指示被檢物的條形碼 DNA ；MMP探針即是對(duì)應(yīng)于分選磁場(chǎng)的直徑約為1 μ m的磁性微球探針，其表面包被有抗被檢物的單克隆抗體。從BCA技術(shù)的檢測(cè)程序可以看出，其基本原理幾乎等同于ELISA檢測(cè)中雙抗體夾心法高度特異地捕獲抗原(被檢物)，通過檢測(cè)條形碼DNA而實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢物的間接檢測(cè)，由于PCR反應(yīng)和芯片檢測(cè)的放大效應(yīng)，使檢測(cè)靈敏度得到極大提高。生物條形碼檢測(cè)過程可以分為條形碼DNA的獲取和條形碼DNA的檢測(cè)兩大方面。條形碼DNA的獲取過程包括三步，第一步抗原抗體作用。先用抗被檢物的單抗功能化的 MMP探針特異性地結(jié)合標(biāo)本中可能的被檢物，加上磁場(chǎng)固定MMP探針，用PBS溶液反復(fù)沖洗， 除去未連結(jié)的被檢物和不相關(guān)的雜質(zhì)；第二步洗脫和去雜交。加入被雙鏈DNA和抗被檢物的多抗修飾的NP探針，將被檢物夾在中間，形成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，接著加上磁場(chǎng)，用磁鐵固定MMP探針的同時(shí)，反復(fù)沖洗，除去未連接的NP探針；第三步DNA分離。此步是一個(gè)去雜交步驟，三明治結(jié)構(gòu)被磁場(chǎng)固定，在高溫低鹽條件下，NP探針上結(jié)合的數(shù)以百計(jì)的條形碼DNA 釋放到溶液中，接著對(duì)條形碼DNA鏈進(jìn)行定量，從而間接檢測(cè)被檢物。條形碼DNA鏈的檢測(cè)現(xiàn)在有兩種方式一是對(duì)獲取的條形碼DNA鏈作普通的PCR擴(kuò)增，然后凝膠電泳檢測(cè)；二是通過芯片檢測(cè)，芯片檢測(cè)系統(tǒng)需要三種不同作用的核酸1)與固相支持物(玻片等)連接的捕獲探針(捕獲DNA修飾的玻片)；2)產(chǎn)生信號(hào)的檢測(cè)探針ONA修飾的膠體金)；3)靶核酸(條形碼DNA)，靶核酸在這個(gè)體系中起連接捕獲探針和信號(hào)檢測(cè)探針的作用。如體系中存在上述三種成分，靶核酸能與上述兩種核苷酸雜交，洗脫去除雜質(zhì)后能得到一個(gè)清晰的檢測(cè)信號(hào)，如果靶核酸不與上述兩種探針雜交，則信號(hào)探針無法連接在固相物上，洗脫后固相物上無信號(hào)應(yīng)答，得到的信號(hào)可以用普通的平板掃描儀進(jìn)行分析。BCA技術(shù)已在某些病原標(biāo)志物的檢測(cè)上取得了很好的進(jìn)展。Nam等人首先利用 BCA技術(shù)對(duì)前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)進(jìn)行了檢測(cè)，利用BCA 技術(shù)檢測(cè)PSA的檢測(cè)下限可達(dá)3a mol/L,檢測(cè)下限比現(xiàn)有的傳統(tǒng)ELISA方法低6個(gè)數(shù)量級(jí)；Georganopoulou等人利用BCA技術(shù)對(duì)β -淀粉樣蛋白源性播散性配基(amyloid β -derived diffusible ligands, ADDL)進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)極限能在15 μ L腦脊液中檢測(cè)到50個(gè)ADDL分子ftoeva等人利用BCA技術(shù)對(duì)血清中的三種腫瘤標(biāo)志物PSA、人體絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)禾口 α 月臺(tái)JL球蛋白(α -fetoprotein, AFP)進(jìn)行了聯(lián)合檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示檢測(cè)限度可達(dá)170f mol/L。綜上所述，BCA技術(shù)與現(xiàn)代標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)——ELISA技術(shù)相比，具有非常顯著的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1)BCA技術(shù)顯示了比常規(guī)的ELISA方法高出六個(gè)數(shù)量級(jí)(100萬倍)的敏感性；2)針對(duì)不同的被檢物設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度和序列的條形碼DNA， 可分析復(fù)雜樣本中的多種物質(zhì)；幻具有較高的特異性，其特異性決定于檢測(cè)系統(tǒng)使用的單克隆抗體的特異性，只要使用高特異的抗目標(biāo)檢物的單克隆抗體就能保證檢測(cè)系統(tǒng)的高特異性；4)檢測(cè)范圍廣，只要被檢物具有單抗和多抗，就可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，這使得它在檢測(cè)一些不適宜用PCR技術(shù)檢測(cè)的微量物質(zhì)方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。但是，從BCA技術(shù)檢測(cè)的過程和顯示體系可以看出，這種技術(shù)存在著明顯的缺陷， 主要體現(xiàn)在對(duì)條形碼DNA的檢測(cè)上，具體有1)傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)是應(yīng)用終點(diǎn)PCR來定量樣品中模板的量，通常用凝膠電泳分離，并用熒光染色來檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物。但在PCR反應(yīng)中，由于模板、試劑、焦磷酸鹽分子的聚集等因素影響聚合酶反應(yīng)，最終導(dǎo)致PCR 反應(yīng)不再以指數(shù)形式進(jìn)行而進(jìn)入“平臺(tái)期”，一些反應(yīng)的終產(chǎn)物比另一些要多，因此終點(diǎn)PCR 反應(yīng)方法定量不準(zhǔn)確；其次終點(diǎn)PCR容易交叉污染，產(chǎn)生假陽性；幻條形碼DNA的芯片檢測(cè)由于銀染試劑自身的缺點(diǎn)而易產(chǎn)生假陽性，陰陽性不易界定，染色結(jié)果因時(shí)間、環(huán)境因素變化很大；3) PCR檢測(cè)體系和芯片檢測(cè)體系都不能對(duì)被檢物進(jìn)行有效定量，這與現(xiàn)今免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展要求及發(fā)展方向——不但能定性，而且能定量相比是落伍的，因此對(duì)常規(guī)BCA 技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)使之能克服上述缺點(diǎn)并能對(duì)被檢物確切定量就顯得很重要。
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我們?cè)O(shè)想，將BCA技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Iteal-timefIuorescentquantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)結(jié)合，在分析優(yōu)化關(guān)鍵數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，建立熒光定量型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)即可克服上述缺陷和不足。FQ-PCR技術(shù)創(chuàng)立于1996年，由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，是一種在PCR 定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。FQ-PCR技術(shù)是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過 Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。FQ-PCR技術(shù)融合PCR技術(shù)和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化使PCR的擴(kuò)增及其分析過程均在同一封閉系統(tǒng)下完成，并在電腦分析軟件支持下實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和自動(dòng)定量， 其特點(diǎn)主要有以下幾個(gè)方面1)定量原理獨(dú)特，用產(chǎn)生熒光信號(hào)的多少來顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)連續(xù)熒光監(jiān)測(cè)，具有很好的可視性；幻熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA， 或雙重標(biāo)記的序列特異性熒光探針或能量信號(hào)轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，大大地提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性；幻只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，免除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程，高效、快速；4)結(jié)果重現(xiàn)性好，定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)五個(gè)數(shù)量級(jí)。FQ-PCR作為PCR技術(shù)的發(fā)展，自1996年已來，在科研及臨床診斷的許多領(lǐng)域顯現(xiàn)出它的優(yōu)越性，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、疾病診斷、食品、 水質(zhì)環(huán)保、藥物開發(fā)等領(lǐng)域，被認(rèn)為是核酸定量的金標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種核苷酸檢測(cè)序列及其檢測(cè)方法。本發(fā)明成功地將熒光定量PCR技術(shù)和普通生物條形碼檢測(cè)方法有機(jī)結(jié)合起來用于HCV的檢測(cè)， 為HCV的診斷提供可靠保障，提供了一種靈敏度較高的丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼，所述生物條形碼為DNA寡聚核苷酸鏈，其序列為5 ‘ -CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTC GTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3‘。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)試劑盒，包括包被有HCVcAg單抗的MMP探針，以及包被有HCVcAg多抗的NP探針。所述與NP探針聯(lián)結(jié)的條形碼DNA寡聚核苷酸鏈優(yōu)選為具有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列；互補(bǔ)探針NP鏈優(yōu)選為具有如下的核苷酸序列5' -GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A10-(CH2)6-SH-3‘。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)的引物1和引物2，其序列分別為引物1 5' -CGCATTCAGGATTGCATGAC-3‘；引物2:5' -CAAGACGAGTGCAATCATGC-3‘。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法，是以丙肝病毒核心抗原作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法。所述檢測(cè)方法中使用的MMP探針可以包被有HCVcAg單抗，NP探針可以包被有 HCVcAg 多抗。所述對(duì)丙肝病毒進(jìn)行熒光定量型生物條形碼檢測(cè)的條形碼DNA鏈可以具有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈可以具有如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。所述丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法可以包括以下步驟1)NP探針的制備用金納米顆粒、HCVcAg多抗、所述互補(bǔ)探針NP鏈和所述條形碼 DNA鏈制備NP探針；2) MMP探針的制備用磁性微球和HCVcAg單抗制備MMP探針；3)丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)利用NP探針、MMP探針和丙肝病毒通過抗原、抗體作用制備NP-HCVcAg-MMP三明治復(fù)合物，然后在高溫低鹽條件下，釋放條形碼 DNA鏈，最后對(duì)獲得的條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。所述步驟1)中可以用檸檬酸三鈉還原法制備金納米顆粒，金納米顆粒的直徑為 30nm ；所述步驟2)中磁性微球的直徑可以為Ium ； 所述步驟1)和步驟2~)中還可以包括對(duì)NP探針和MMP探針進(jìn)行純化的步驟。所述方法也可以包括以下步驟a.寡核苷酸鏈的合成合成所述丙肝病毒熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法中所用的寡核苷酸鏈，序列如下條形碼DNA鏈長(zhǎng)度為IOObp ；5 ‘ -CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTC GTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3‘；互補(bǔ) probe NP 鏈5' -GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG Altl-(CH2)6-SH-3‘，長(zhǎng)度為 30bp;引物1 5 ‘ -CGCATTCAGGATTGCATGAC-3‘；引物2:5 ‘ -CAAGACGAGTGCAATCATGC-3‘；b.金納米顆粒的制備選擇使用直徑30nm的金納米顆粒，利用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒取 500mL 0.01% HAuCl4溶液在攪動(dòng)的情況下加熱至沸騰后迅速準(zhǔn)確加入7. 5mL的1 %檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸15min，整個(gè)過程始終用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌；當(dāng)溶液的顏色漸漸加深，最后為深紫紅色，停止加熱；將制備好的納米金用0. 45 μ m的尼龍膜過濾，冷卻至室溫，放置于4°C避光保存；c.抗HCVcAg蛋白的多克隆抗體的制備；d.金納米顆粒-HCVcAg多抗復(fù)合物的制備分別取ImL的金納米顆粒和HCVcAg多抗，用0. lmol/L K2CO3調(diào)節(jié)至pH9. 0 ；在攪拌下將金納米顆粒和抗體混合，IOmin后加入5% BSA，使其最終濃度為；或加入聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至標(biāo)記物總量的1/10，以防止抗體蛋白和金納米顆粒的聚合和發(fā)生沉淀；e. NP探針的制備、純化將終濃度為2 μ mol/L的互補(bǔ)探針NP鏈加入被HCVcAg多抗修飾的金納米顆粒(濃度為4. 5hmol/L)中，室溫放置16小時(shí)；再以磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH至7. 0，增強(qiáng)離子濃度至 0. lmol/L NaCl，室溫放置40小時(shí)，IOOOOg離心30min得到含互補(bǔ)探針NP鏈修飾的金納米顆粒；得到的深紅色沉淀用0. IM NaCiaOmM PBS (pH7. 0)溶液洗滌3次，去除未標(biāo)記的金納米顆粒；將條形碼DNA鏈(終濃度為2 μ mol/L)加入上述標(biāo)記有互補(bǔ)探針NP鏈修飾的金納米顆粒中，室溫雜交4小時(shí)，14，OOOg離心30分鐘，得到NP探針；f. HCVcAg單抗的制備；g. MMP探針的制備、純化將100 μ gHCVcAg單抗溶于20mL PBS中，將其加入到激活的磁珠中，劇烈振蕩，然后將燒瓶置于混合器上反應(yīng)16 M小時(shí)；磁性分離，棄去上清；在40mL PBS中重懸磁珠； 加入20mL甘氨酸，劇烈振蕩，將其放在混合器上反應(yīng)30min ；磁性分離，棄去上清；用PBS洗 3次，磁性分離；用50mL洗液重懸磁珠，4°C保存；h.丙肝病毒熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法的建立將50 μ L抗HCVcAg蛋白的單抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10 μ L已知濃度的HCVcAg蛋白或丙肝陽性病毒中，37°C下劇烈震蕩1小時(shí)；加上磁場(chǎng)固定MMP探針，用 PBS溶液反復(fù)沖洗；加入被雙鏈DNA和抗HCVcAg蛋白的多抗修飾的0. lnmol/L金納米顆粒探針50yL，劇烈震蕩30分鐘，形成三明治結(jié)構(gòu)；加上磁場(chǎng)，在用磁鐵固定MMPs的同時(shí)，用 500 μ L的PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，除去未連接的NP探針；加入50 μ L超純水到三明治結(jié)構(gòu)中，60°C劇烈震蕩30分鐘，使條形碼DNA鏈去雜交；三明治復(fù)合物被磁性分離，收集上清液，內(nèi)含條形碼DNA鏈，用于定性定量檢測(cè)；i.條形碼DNA鏈的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)獲得的條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件如下引物1 5' -CGCATTCAGGATTGCATGAC-3‘；引物2:5' -CAAGACGAGTGCAATCATGC-3‘。本發(fā)明丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法，是以丙肝病毒核心抗原 (HCVcAg)為檢測(cè)對(duì)象的靈敏度較高(可達(dá)100fg/mL)的檢測(cè)方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益的技術(shù)效果
1、首次建立了丙肝病毒的熒光定量生物條形碼檢測(cè)方法，利用此檢測(cè)方法可以對(duì)肝臟、血液、細(xì)胞培養(yǎng)物等中的丙肝病毒進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。2、本檢測(cè)方法與丙肝病毒的其它常規(guī)檢測(cè)方法如檢測(cè)抗-HCV或檢測(cè)HCV RNA相比，具有相當(dāng)高的靈敏度，檢測(cè)靈敏度是常規(guī)ELISA方法的104倍。3、本檢測(cè)方法與丙肝病毒的其它常規(guī)檢測(cè)方法如檢測(cè)抗-HCV或檢測(cè)HCVRNA相比，具有相當(dāng)高的特異性，只要使用高特異的抗丙肝病毒核心抗原的單克隆抗體就能保證檢測(cè)方法的高特異性。4、本檢測(cè)方法為研制丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。5、本檢測(cè)方法為其它類似的被檢物，尤其是那些不適于建立核酸檢測(cè)方法的微量物質(zhì)如毒素、生物戰(zhàn)劑、脂類、維生素、腫瘤特異性標(biāo)志物等的檢測(cè)提供了新方法，對(duì)被檢物建立類似檢測(cè)體系起到了良好的借鑒作用。綜上所述，本發(fā)明在丙肝病毒的檢測(cè)及原料血漿的檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為現(xiàn)有技術(shù)中HCV基因結(jié)構(gòu)圖；圖2為現(xiàn)有技術(shù)中普通生物條形碼檢測(cè)示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述HCVcAg的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述HCVcAg的特異性檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明丙肝病毒的熒光定量型生物條形檢測(cè)方法，是以丙肝病毒核心抗原 (HCVcAg)蛋白作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法。所述MMP探針包被有 HCVdg單抗，NP探針包被有HCVdg多抗。所述對(duì)丙肝病毒進(jìn)行熒光定量型生物條形碼檢測(cè)的條形碼DNA鏈具有序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈具有序列表中 SEQ ID No :2的核苷酸序列。本發(fā)明在丙型肝炎的診斷及原料血漿的篩查領(lǐng)域中具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明所提供的丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法，是以丙肝病毒的核心抗原(HCVcAg)作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法。所述HCVcAg單抗和HCVcAg多抗均可采用生物技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制備。優(yōu)選的對(duì)HCVcAg進(jìn)行熒光定量型生物條形碼檢測(cè)的條形碼DNA鏈具有序列表中 SEQ ID No 1的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈具有序列表中SEQID No 2的核苷酸序列。具體來講，所述丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法可包括以下步驟1)NP探針的制備用常規(guī)方法及金納米顆粒、HCVcAg多抗、互補(bǔ)探針NP鏈和條形碼DNA鏈制備NP探針；2) MMP探針的制備用磁性微球和HCVcAg單抗制備MMP探針；3)丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)利用NP探針、MMP探針和丙肝病毒通過抗原、抗體作用制備NP-HCVcAg-MMP三明治復(fù)合物，然后在高溫低鹽條件下，釋放條形碼DNA鏈，最后對(duì)獲得的條形碼DNA鏈進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，從而對(duì)丙肝病毒進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。在述丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法中，步驟1)中可利用檸檬酸三鈉還源法制備金納米顆粒，金納米顆粒的直徑可為20-40nm，優(yōu)選30nm，可利用HCVdg蛋白免疫新西蘭大白兔制備HCVcAg多抗。步驟幻中磁性微球的直徑為0. 5-1. 5um,優(yōu)選為lum，可通過將HCVcAg雜交瘤細(xì)胞株免疫BALB/c小鼠的方法制備HCVcAg單抗。為獲得更好的檢測(cè)效果，所述步驟1)和步驟2、中還包括對(duì)NP探針和MMP探針進(jìn)行純化的步驟。本發(fā)明的還提供一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒，可包括包被有HCVcAg單抗的MMP探針，以及包被有 HCVcAg多抗的NP探針。上述優(yōu)選的與NP探針聯(lián)結(jié)的條形碼DNA鏈具有序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈具有序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物及核苷酸序列均由大連TAKARA公司合成。實(shí)施例1 丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)用本發(fā)明的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法對(duì)丙肝病毒進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，具體方法包括以下步驟1、寡核苷酸鏈的合成設(shè)計(jì)并合成本發(fā)明丙肝病毒熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法中所用的寡核苷酸鏈，序列如下條形碼DNA鏈長(zhǎng)度為IOObp。5 ‘ -CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTC GTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3'。(序列表中 SEQ ID No 1)互補(bǔ) probe NP 鏈5 ‘ -GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A10- (CH2) 6-SH_3 ‘，長(zhǎng)度為 30bp。(序列表中 SEQ ID No 2)引物1:5' -CGCATTCAGGATTGCATGAC-3‘。(序列表中 SEQ ID No :3)引物2:5' -CAAGACGAGTGCAATCATGC-3‘(序列表中 SEQ ID No :4)2、金納米顆粒的制備本發(fā)明選擇使用直徑30nm的金納米顆粒。利用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒。取500mL 0. 01% HAuCl4溶液在攪動(dòng)的情況下加熱至沸騰后迅速準(zhǔn)確加入7. 5mL 的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸15min，整個(gè)過程始終用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌；當(dāng)溶液的顏色漸漸加深，最后為深紫紅色，停止加熱；將制備好的納米金用0. 45 μ m的尼龍膜過濾，冷卻至室溫，放置于4°C避光保存。3、抗HCVcAg蛋白的多克隆抗體的制備
利用HCVcAg蛋白免疫新西蘭大白兔制備HCVcAg蛋白多克隆抗體。每只雄性新西蘭大白兔免疫前，都由耳緣靜脈取血2mL，靜置分離血清，-20°C保存，以待作為陰性對(duì)照用。 首次免疫，每只家兔注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部?jī)蓚?cè)、領(lǐng)下、耳后等處皮下多點(diǎn)注射，對(duì)照兔子注射等量生理鹽水。2周后以同樣的劑量(含等體積弗氏不完全佐劑)加強(qiáng)免疫，背部多點(diǎn)注射，2周后再次加強(qiáng)免疫。10天后進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫， 約10天以后進(jìn)行末次免疫，直接用2mL乳化抗原靜脈注射。每次加強(qiáng)免疫后7 10天從兔耳緣靜脈采血2 3mL，用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，末次免疫后7天即用頸動(dòng)脈放血法采血，4°C靜置過夜，次日4000rpm離心lOmin，收集上清，分裝后_20°C保存。4、金納米顆粒-HCVcAg多抗復(fù)合物的制備分別取ImL的金納米顆粒和最適量的HCVcAg多抗，用O.lmol/L K2CO3調(diào)節(jié)至 PH9. 0。在攪拌下將金納米顆粒和抗體混合，IOmin后再加入一定量的穩(wěn)定劑，常用者為5% BSA，使其最終濃度為；或加入聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至標(biāo)記物總量的1/10， 以防止抗體蛋白和金納米顆粒的聚合和發(fā)生沉淀。5、NP探針的制備、純化將互補(bǔ)探針NP鏈(終濃度為2 μ mol/L)加入被HCVcAg多抗修飾的金納米顆粒 (濃度為4.5nmol/L)中，室溫放置16小時(shí)；再以磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH至7. 0，增強(qiáng)離子濃度至0. lmol/L NaCl，室溫放置40小時(shí)，10，OOOg離心30min得到含互補(bǔ)探針NP鏈修飾的金納米顆粒；得到的深紅色沉淀用0. IM NaCiaOmM PBS (pH7. 0)溶液洗滌3次，去除未標(biāo)記的金納米顆粒；將條形碼DNA鏈(終濃度為2 μ mol/L)加入上述標(biāo)記有互補(bǔ)探針NP鏈修飾的金納米顆粒中，室溫雜交4小時(shí)，14，OOOg離心30分鐘，得到NP探針。6、HCVcAg單抗的制備利用本室制備的HCVcAg雜交瘤細(xì)胞免疫BALB/c小鼠制備HCVcAg單克隆抗體。采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射雜交瘤細(xì)胞前7天，預(yù)先腹腔注射0. 5mL滅菌液體石蠟； 每只鼠腹腔注射含1 5X106雜交瘤細(xì)胞的0. 5mL的培養(yǎng)液；當(dāng)小鼠產(chǎn)生腹水時(shí)(1 3 周)，腹部穿刺放出腹水(1 5mL)，隔天穿刺直至小鼠死亡；3000rpm離心15min，除去腹水中的細(xì)胞；上清無菌儲(chǔ)存或加0. 01%疊氮鈉置于_70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、MMP探針的制備、純化將100 μ gHCVcAg單抗溶于20mL PBS中，將其加入到激活的磁珠中，劇烈振蕩，然后將燒瓶置于混合器上反應(yīng)16 M小時(shí)；磁性分離，棄去上清；在40mL PBS中重懸磁珠； 加入20mL淬滅劑(甘氨酸)，劇烈振蕩，將其放在混合器上反應(yīng)30min ；磁性分離，棄去上清；用PBS洗3次，磁性分離；用50mL洗液重懸磁珠，4°C保存。8、丙肝病毒熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法的建立將50 μ L抗HCVcAg蛋白的單抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入IOyL已知濃度的HCVcAg蛋白或丙肝陽性病毒中，37°C下劇烈震蕩1小時(shí)；加上磁場(chǎng)固定MMP探針，用PBS 溶液反復(fù)沖洗，除去未連結(jié)的HCVcAg蛋白和不相關(guān)的蛋白；加入被雙鏈DNA和抗HCVcAg蛋白的多抗修飾的0. lnmol/L金納米顆粒探針50 μ L，劇烈震蕩30分鐘，形成三明治結(jié)構(gòu)；加上磁場(chǎng)，在用磁鐵固定MMPs的同時(shí)，用500 μ L的PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，除去未連接的 NP探針。形成三明治結(jié)構(gòu)后，接著加上磁場(chǎng)，在用磁鐵固定MMPs的同時(shí)，用500yL的PBS 緩沖液反復(fù)沖洗4次，除去未連接的NP探針；加入50 μ L超純水到三明治結(jié)構(gòu)中，60°C劇烈震蕩30分鐘，使條形碼DNA鏈去雜交。 DNA鏈，用于定性定量檢測(cè)。明治復(fù)合物被磁性分離，收集上清液，內(nèi)含條形碼
9、條形碼DNA鏈的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)獲得的條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件如下
94°C預(yù)變性5min
94 °C30sec
56V30sec40 個(gè)循環(huán)
72 °C30sec
72 °C5min引物1 序列表中SEQ ID No :3引物2 序列表中SEQ ID No 4條形碼DNA鏈的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中HCVcAg蛋白濃度分別為100pg/mL、 10pg/mL、lpg/mL、100fg/mL、10fg/mL、lfg/mL、0g/mL。分析結(jié)果時(shí)，基線和閾值可取儀器默認(rèn)值，一般情況下取前6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)為基線。此外，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，一般需要進(jìn)行托運(yùn)設(shè)置，把數(shù)據(jù)縱軸改為線性。檢測(cè)結(jié)果表明本檢測(cè)的HCVdg蛋白檢測(cè)靈敏度可達(dá) 100fg/mLo以下將結(jié)合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。如圖3所示，為本發(fā)明實(shí)施例所述熒光定量型生物條形碼技術(shù)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果 (HCVcAg蛋白)。圖中不同濃度的HCVcAg蛋白FQ-BCA檢測(cè)結(jié)果為從左至右VP7蛋白濃度依次為lpg/mL、100fg/mL、10fg/mL、lfg/mL、100ag/mL、10ag/mL、lag/mL。如圖4所示，為本發(fā)明實(shí)施例熒光定量型生物條形碼技術(shù)的特異性檢測(cè)結(jié)果圖。 圖中FQ-BCA檢測(cè)的特異性結(jié)果為用建立的FQ-BCA檢測(cè)體系對(duì)丙肝病毒陽性血清標(biāo)本，甲肝病毒陽性血清標(biāo)本、乙肝病毒陽性血清標(biāo)本進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，3次重復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼，其特征在于，所述生物條形碼為DNA寡聚核苷酸鏈，其序列為5' -CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCT TAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3‘。
2.一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括包被有 HCVcAg單抗的MMP探針，以及包被有HCVcAg多抗的NP探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述與NP探針聯(lián)結(jié)的條形碼DNA寡聚核苷酸鏈具有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈具有如下的核苷酸序列5' -GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A10-(CH2)6-SH-3‘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒進(jìn)一步包括進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)的引物1和引物2，其序列分別為引物1:5 ‘ -CGCATTCAGGATTGCATGAC-3‘；引物2 5 ‘ -CAAGACGAGTGCAATCATGC-3‘。
5.一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法，其特征在于，是以丙肝病毒核心抗原作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法中使用的MMP探針包被有HCVcAg單抗，NP探針包被有HCVcAg多抗。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述對(duì)丙肝病毒進(jìn)行熒光定量型生物條形碼檢測(cè)的條形碼DNA鏈具有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈具有如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法包括以下步驟1)NP探針的制備用金納米顆粒、HCVcAg多抗、所述互補(bǔ)探針NP鏈和所述條形碼DNA 鏈制備NP探針；2)MMP探針的制備用磁性微球和HCVcAg單抗制備MMP探針；3)丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)利用NP探針、MMP探針和丙肝病毒通過抗原、抗體作用制備NP-HCVcAg-MMP三明治復(fù)合物，然后在高溫低鹽條件下，釋放條形碼DNA 鏈，最后對(duì)獲得的條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5 8中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟1)中用檸檬酸三鈉還原法制備金納米顆粒，金納米顆粒的直徑為30nm ；所述步驟2)中磁性微球的直徑為Ium ；所述步驟1)和步驟2~)中還包括對(duì)NP探針和MMP探針進(jìn)行純化的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a.寡核苷酸鏈的合成合成所述丙肝病毒熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法中所用的寡核苷酸鏈，序列如下條形碼DNA鏈長(zhǎng)度為IOObp ；.5' -CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCT TAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3‘；互補(bǔ)probe NP鏈.5' -GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG Altl-(CH2)6-SH-3‘，長(zhǎng)度為 30bp;引物1:.5 ‘ -CGCATTCAGGATTGCATGAC-3‘；引物2 .5 ‘ -CAAGACGAGTGCAATCATGC-3‘；b.金納米顆粒的制備選擇使用直徑30nm的金納米顆粒，利用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒取500mL 0. 01% HAuCl4溶液在攪動(dòng)的情況下加熱至沸騰后迅速準(zhǔn)確加入7. 5mL的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸15min，整個(gè)過程始終用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌；當(dāng)溶液的顏色漸漸加深，最后為深紫紅色，停止加熱；將制備好的納米金用0. 45 μ m的尼龍膜過濾，冷卻至室溫， 放置于4°C避光保存；c.抗HCVcAg蛋白的多克隆抗體的制備；d.金納米顆粒-HCVcAg多抗復(fù)合物的制備分別取ImL的金納米顆粒和HCVcAg多抗，用0. lmol/L K2CO3調(diào)節(jié)至pH9. 0 ；在攪拌下將金納米顆粒和抗體混合，IOmin后加入5% BSA，使其最終濃度為；或加入1%聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至標(biāo)記物總量的1/10，以防止抗體蛋白和金納米顆粒的聚合和發(fā)生沉淀；e.NP探針的制備、純化將終濃度為2 μ mol/L的互補(bǔ)探針NP鏈加入被HCVcAg多抗修飾的金納米顆粒(濃度為4. 5nmol/L)中，室溫放置16小時(shí)；再以磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH至7. 0，增強(qiáng)離子濃度至 0. lmol/L NaCl，室溫放置40小時(shí)，IOOOOg離心30min得到含互補(bǔ)探針NP鏈修飾的金納米顆粒；得到的深紅色沉淀用0. IM NaCiaOmM PBS (pH7. 0)溶液洗滌3次，去除未標(biāo)記的金納米顆粒；將條形碼DNA鏈(終濃度為2 μ mol/L)加入上述標(biāo)記有互補(bǔ)探針NP鏈修飾的金納米顆粒中，室溫雜交4小時(shí)，14，OOOg離心30分鐘，得到NP探針；f.HCVcAg單抗的制備；g.MMP探針的制備、純化將100 μ gHCVcAg單抗溶于20mL PBS中，將其加入到激活的磁珠中，劇烈振蕩，然后將燒瓶置于混合器上反應(yīng)16 M小時(shí)；磁性分離，棄去上清；在40mL PBS中重懸磁珠；加入 20mL甘氨酸，劇烈振蕩，將其放在混合器上反應(yīng)30min ；磁性分離，棄去上清；用PBS洗3次， 磁性分離；用50mL洗液重懸磁珠，4°C保存；h.丙肝病毒熒光定量型生物條形碼檢測(cè)方法的建立將50 μ L抗HCVcAg蛋白的單抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10 μ L已知濃度的 HCVcAg蛋白或丙肝陽性病毒中，37°C下劇烈震蕩1小時(shí)；加上磁場(chǎng)固定MMP探針，用PBS 溶液反復(fù)沖洗；加入被雙鏈DNA和抗HCVcAg蛋白的多抗修飾的0. lnmol/L金納米顆粒探針50 μ L，劇烈震蕩30分鐘，形成三明治結(jié)構(gòu)；加上磁場(chǎng)，在用磁鐵固定MMPs的同時(shí)，用 500 μ L的PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，除去未連接的NP探針；加入50 μ L超純水到三明治結(jié)構(gòu)中，60°C劇烈震蕩30分鐘，使條形碼DNA鏈去雜交；三明治復(fù)合物被磁性分離，收集上清液，內(nèi)含條形碼DNA鏈，用于定性定量檢測(cè)； i.條形碼DNA鏈的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 對(duì)獲得的條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件如下
全文摘要
本發(fā)明公開了一種丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼，檢測(cè)試劑盒，及其檢測(cè)方法。所述生物條形碼為DNA寡聚核苷酸鏈，其序列為5′-CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3′。丙肝病毒的熒光定量型生物條形碼檢測(cè)試劑盒，包括包被有HCVcAg單抗的MMP探針，以及包被有HCVcAg多抗的NP探針。所述與NP探針聯(lián)結(jié)的條形碼DNA寡聚核苷酸鏈具有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，互補(bǔ)探針NP鏈具有如下的核苷酸序列5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A10-(CH2)6-SH-3′。本發(fā)明在丙肝病毒的檢測(cè)及原料血漿的檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102181438SQ20111005461
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者馮玉奎, 單守勤, 孫英姿, 張立營(yíng), 李克峰, 梁冰, 王軍 申請(qǐng)人:張立營(yíng)