專利名稱：固體組織中分析物的光聲檢測(cè)和檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域?yàn)楣腆w組織中分析物的檢測(cè)和組織分析系統(tǒng)。本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用為在完整切除的前哨淋巴結(jié)中黑色素瘤微轉(zhuǎn)移的體外檢測(cè)，本發(fā)明的優(yōu)選系統(tǒng)為可以檢測(cè)提取的淋巴結(jié)中黑色素瘤微轉(zhuǎn)移的存在和位置的光聲系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
前哨淋巴結(jié)是從癌腫瘤經(jīng)淋巴系統(tǒng)傳輸?shù)霓D(zhuǎn)移性癌細(xì)胞到達(dá)的第一組淋巴結(jié)中的淋巴結(jié)。前哨淋巴結(jié)的示蹤涉及典型地通過(guò)染料注射來(lái)檢測(cè)前哨淋巴結(jié)，和取出用于活檢的前哨淋巴結(jié)以確定是否存在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞。淋巴示蹤的設(shè)想基于以下概念皮膚黑色素瘤和其它癌的位點(diǎn)具有特定的淋巴擴(kuò)散模式，以及在特定淋巴結(jié)流域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)首先被轉(zhuǎn)移性疾病波及。如果這些第一或前哨淋巴結(jié)未被波及，則整個(gè)淋巴結(jié)流域應(yīng)沒有腫瘤。目前采用這類方法診斷和治療惡性黑色素瘤和乳腺癌，這兩種癌可采用前哨淋巴結(jié)示蹤檢測(cè)。轉(zhuǎn)移性疾病的檢測(cè)和監(jiān)控在這些和其它形式癌的治療中對(duì)于積極臨床結(jié)果至關(guān)重要。對(duì)局部淋巴結(jié)狀態(tài)的了解不僅對(duì)于預(yù)后是重要的，而且對(duì)于確定療法也是重要的。黑色素瘤是皮膚癌致命性最強(qiáng)的形式，具有所有癌癥類型中最快的生長(zhǎng)速率。在美國(guó)，一生中染上黑色素瘤的風(fēng)險(xiǎn)為約1/55，而在世界其它地區(qū)甚至更高。黑色素瘤的早期手術(shù)切除是最佳治療途徑。然而，轉(zhuǎn)移性疾病的檢測(cè)和監(jiān)控是獲得積極臨床結(jié)果的關(guān)鍵。前哨淋巴結(jié)示蹤技術(shù)的弱項(xiàng)是用于確定提取的前哨淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞的活檢。這在前哨淋巴結(jié)可能僅有少量微轉(zhuǎn)移細(xì)胞的早期尤其如此。這類細(xì)胞僅占淋巴結(jié)極少的體積，并且難以在活檢中切片淋巴結(jié)時(shí)檢測(cè)。典型的活檢包括取8-10個(gè)切片， 這提供很小的機(jī)會(huì)檢測(cè)到這類微轉(zhuǎn)移細(xì)胞。由于僅檢查了部分淋巴結(jié)，可以預(yù)期較高的假陰性率。一旦取出淋巴結(jié)，典型地，取6-10個(gè)約6μπι厚的切片，并檢查轉(zhuǎn)移性。從而，在 Icm長(zhǎng)的典型淋巴結(jié)中，僅對(duì)非常小的比例(有時(shí)不足1%)的淋巴結(jié)進(jìn)行了檢測(cè)。即使大幅提高切片數(shù)量(實(shí)際上這是不現(xiàn)實(shí)的)，仍然會(huì)很大程度上依賴于檢測(cè)到微轉(zhuǎn)移細(xì)胞的幾率。用于黑色素瘤標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步增強(qiáng)了靈敏度，但即使采用最優(yōu)技術(shù)時(shí)，仍有相當(dāng)百分比的活檢顯示假陰性。研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)10%的前哨淋巴結(jié)活檢有假陰性° 參見 Jansen, L. , Nieweg, 0. , Peterse, J. , Hoefnagel, C. , Olmos, R. , and Kroon, B., “Reliability of Sentinel Lymph Node Biopsy for Staging Melanoma, J. Surg. ,87, pp. 484-489 (2000) ；Yu, L. ，F(xiàn)lotte, Τ. ，Tanabe, K. ，Gadd, Μ. ，Cosimi，Α· ，Sober, Α. ，Mihm, Μ. , Jr. , and Duncan,L. ,"Detection of Microscopic Melanoma Metastases in Sentinel Lymph Nodes,，，Cancer, 86，pp. 617-627 (1999)。已經(jīng)嘗試改進(jìn)前哨淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。例如，采用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)在
4前哨淋巴結(jié)活檢中檢測(cè)黑色素瘤前體，但RT-PCR在臨床檢測(cè)中的功用尚不清楚。參見 Hauschild, A. , and Christophers, Ε. ,"Sentinel Node Biopsy in Melanoma,，，Virchows Arch.，438，pp. 99-106(2001)。Wang等人提出了采用超聲調(diào)制光學(xué)斷層照相法檢測(cè)黑色素瘤和乳腺癌的前哨淋巴結(jié)，但該技術(shù)不檢測(cè)微轉(zhuǎn)移。Wang等人的“Sentinel Lymph Node Detection ex vivo Using Ultrasound-Modulated Optical Tomography,"J. Biomed. Opt.，13(2008)。相關(guān)的體內(nèi)技術(shù)定位了前哨淋巴結(jié)。Wang等人還提出了通過(guò)采用亞甲基藍(lán)注射的無(wú)創(chuàng)光聲識(shí)別系統(tǒng)在體內(nèi)定位前哨淋巴結(jié)的無(wú)創(chuàng)技術(shù)，但該技術(shù)通過(guò)檢測(cè)注射后在前哨淋巴結(jié)中聚集的亞甲基藍(lán)識(shí)別體內(nèi)前哨淋巴結(jié)的位置。參見Wang等人的 “Noninvasive Photoacoustic Identification of Sentinel Lymph Nodes Containing Methylene Blue in vivo in a Rat Model,，，Journal of Biomedical Optics 13(5), 0M033 (2008年9月/10月)。Wang等人通過(guò)將亞甲基藍(lán)染料注射至切除了初始腫瘤的組織中來(lái)識(shí)別前哨淋巴結(jié)。該染料被引流所述腫瘤并引導(dǎo)至前哨淋巴結(jié)(SLN)的淋巴管吸收。 使用該藍(lán)色染料作為光聲靶，染料檢測(cè)允許采用細(xì)針穿刺實(shí)施活檢而無(wú)需切入腋部。該技術(shù)可潛在地減少評(píng)估SLN的創(chuàng)傷性。進(jìn)行了離體檢驗(yàn)以測(cè)試染料檢測(cè)的靈敏度。該技術(shù)不適用于在提取出的淋巴結(jié)中進(jìn)行微轉(zhuǎn)移的定位，因?yàn)槠涫窃隗w內(nèi)找出SLN的外源性染料。 所述染料無(wú)選擇性地染色SLN。另一采用超聲檢測(cè)前哨淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移的嘗試表現(xiàn)出61%的 fi陽(yáng)性率。Rossi 等人的"The Role of Preoperative Ultrasound Scan in Detecting Lymph Node Metastasis Before Sentinel Node Biopsy in Melanoma Patients,"J. Surg. Oncol.，83，pp. 80—84。

發(fā)明內(nèi)容
用于體外檢測(cè)固體組織如完整淋巴結(jié)中分析物的優(yōu)選系統(tǒng)包括布置為產(chǎn)生進(jìn)入固體組織的脈沖激光束的激光器，所述固體組織可以是完整淋巴結(jié)。聲傳感器，優(yōu)選至少三個(gè)聲傳感器，布置在不同位置以跨越三維空間如在X、Y和Z坐標(biāo)系中以檢測(cè)該淋巴結(jié)內(nèi)產(chǎn)生的光聲信號(hào)。至少一個(gè)計(jì)算機(jī)接收來(lái)自該一個(gè)或多個(gè)聲傳感器的信號(hào)。計(jì)算機(jī)根據(jù)信號(hào)和信號(hào)的時(shí)間周期確定是否存在分析物，和優(yōu)選地確定分析物的位置。用于體外檢測(cè)淋巴結(jié)中分析物的優(yōu)選方法包括將提取的淋巴結(jié)暴露于脈沖激光束。感應(yīng)光聲信號(hào)。分析所述光聲信號(hào)以確認(rèn)在淋巴結(jié)中是否存在分析物。優(yōu)選地，感應(yīng)來(lái)自跨越三維空間的多個(gè)傳感器的多個(gè)光聲信號(hào)，并且還確定分析物的位置。


圖1是用于檢測(cè)固體組織中分析物的光聲檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案的示意圖；圖2A-2C是在按照?qǐng)D1的試驗(yàn)性三傳感器系統(tǒng)中取自健康的犬淋巴結(jié)的光聲響應(yīng)圖，圖2D-2F是顯示將黑色素細(xì)胞注入該淋巴結(jié)后的光聲響應(yīng)圖；以及圖3包括在按照?qǐng)D1的試驗(yàn)性三傳感器系統(tǒng)中豬淋巴結(jié)檢驗(yàn)的信號(hào)強(qiáng)度圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供用于在提取的固體組織如前哨淋巴結(jié)內(nèi)對(duì)分析物進(jìn)行光聲檢測(cè)的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的方法和系統(tǒng)能夠在淋巴結(jié)中檢測(cè)和精確定位微觀分析物?？稍诠腆w組織中檢測(cè)任何作為吸光體的分析物，但本發(fā)明的方法和系統(tǒng)尤其可用于檢測(cè)淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的存在和位置。本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可例如替代或輔助傳統(tǒng)前哨淋巴結(jié)活檢來(lái)檢測(cè)在提取的前哨淋巴結(jié)中是否存在微轉(zhuǎn)移并精確確定其在三維空間中的位置。用于體外檢測(cè)固體組織如完整淋巴結(jié)中分析物的優(yōu)選系統(tǒng)包括布置為產(chǎn)生進(jìn)入固體組織的脈沖激光束的激光器，所述固體組織可以是完整淋巴結(jié)。聲傳感器，優(yōu)選至少三個(gè)聲傳感器，布置在不同位置以跨越三維空間如X、Y和Z坐標(biāo)系以檢測(cè)淋巴結(jié)內(nèi)產(chǎn)生的光聲信號(hào)。至少一個(gè)計(jì)算機(jī)接收來(lái)自該一個(gè)或多個(gè)聲傳感器的信號(hào)。所述計(jì)算機(jī)根據(jù)該信號(hào)和該信號(hào)的時(shí)間周期確定是否存在分析物，并且優(yōu)選地確定分析物的位置。用于體外檢測(cè)淋巴結(jié)中分析物的方法包括將提取的淋巴結(jié)暴露于脈沖激光束。感應(yīng)光聲信號(hào)。分析所述光聲信號(hào)以確認(rèn)在淋巴結(jié)中是否存在分析物。優(yōu)選地，檢測(cè)來(lái)自跨越三維空間的多個(gè)傳感器的多個(gè)光聲信號(hào)，并且還確定分析物的位置。本發(fā)明優(yōu)選的方法和系統(tǒng)將提取的淋巴結(jié)放置在聲介質(zhì)中，然后感應(yīng)來(lái)自該聲介質(zhì)的光聲響應(yīng)。優(yōu)選的聲介質(zhì)是去離子水。也可使用凝膠和油如礦物油作為聲介質(zhì)。空氣也是聲介質(zhì)，但優(yōu)選液體、凝膠和油介質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，可將淋巴結(jié)懸在(釘在或以其它方式支撐在)空氣中，并使光聲換能器與淋巴結(jié)本身物理接觸，所述接觸優(yōu)選采用某種聲學(xué)匹配凝膠進(jìn)行。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的系統(tǒng)和方法在提取的淋巴結(jié)中檢測(cè)黑色素瘤的微轉(zhuǎn)移。在此情況下，分析物是微轉(zhuǎn)移本身。本發(fā)明的這些優(yōu)選方法和系統(tǒng)采用黑色素瘤固有的光學(xué)吸收以在切除SLN后找到轉(zhuǎn)移。利用黑色素瘤細(xì)胞的光學(xué)吸收以產(chǎn)生對(duì)檢測(cè)必要的光聲響應(yīng)。這提供了非常有力的用于黑色素瘤微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的技術(shù)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以檢測(cè)其它類型的癌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，可以檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞或其它類型的癌細(xì)胞。在此情況下，引入外源性吸收體。所述外源性吸收體是特定地吸引到所研究的癌細(xì)胞的物質(zhì)。示例性的外源性吸收體包括官能化癌細(xì)胞上已知抗原(例如對(duì)于一些乳腺癌為HER-2，或在雌激素陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中的雌激素受體)的納米粒子。這些納米粒子可以是金、銀或其它納米粒子。還可使用官能化的量子點(diǎn)或微球。 特定地染色目標(biāo)癌細(xì)胞的組織化學(xué)染料是可以特定地以癌細(xì)胞為目標(biāo)的另一種外源性受體并充當(dāng)吸收體?，F(xiàn)在基于附圖討論本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。所述附圖可包括示意性的表示，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本領(lǐng)域的一般知識(shí)和隨后的說(shuō)明能夠理解的?？赡転榱藦?qiáng)調(diào)而夸大圖中的某些特征，并且某些可能不按比例。將討論試驗(yàn)性的系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將基于所述試驗(yàn)性系統(tǒng)和測(cè)試結(jié)果認(rèn)識(shí)到本發(fā)明更寬泛的特征。圖1顯示了用于體外檢測(cè)固體組織中分析物的示例性系統(tǒng)10，所述固體組織例如為完整淋巴結(jié)。將完整淋巴結(jié)12或完整淋巴結(jié)的主要部分形式的固體組織定位在包含于樣品容器16中的聲介質(zhì)14中的預(yù)定樣品體積位置。樣品容器16懸在可以隔離外部機(jī)械振動(dòng)的架臺(tái)18上。通常，振動(dòng)不會(huì)影響測(cè)量，因?yàn)楦袘?yīng)到的信號(hào)在數(shù)十兆赫茲內(nèi)。聲傳感器20a、20b和20c布置在X、Y、Z坐標(biāo)體系中的三個(gè)不同位置，以感應(yīng)完整淋巴結(jié)12中產(chǎn)生的聲波信號(hào)。優(yōu)選的系統(tǒng)具有三個(gè)傳感器20a、20b、20c以產(chǎn)生能夠確定分析物是否存在以及其位置的獨(dú)立信號(hào)，然而，確定是否存在吸光分析物僅需要一個(gè)傳感器。 優(yōu)選的聲傳感器是壓電傳感器。也可使用除壓電傳感器以外的傳感器，其例子包括在圍繞淋巴結(jié)的載液或樣品中測(cè)量光學(xué)擾動(dòng)的檢測(cè)器。
所述光聲信號(hào)通過(guò)激光器22產(chǎn)生的脈沖激光束引發(fā)。激光束通過(guò)光纖23傳輸， 并可以用透鏡M校準(zhǔn)以指向淋巴結(jié)12。校準(zhǔn)是優(yōu)選但非必要的。校準(zhǔn)可有助于保持高的激光通量，這是期望的，但這不是關(guān)鍵的，因?yàn)橐呀?jīng)由光纖提供了充分聚焦的光束。在一種實(shí)施方案中，透鏡M產(chǎn)生覆蓋淋巴結(jié)12全部體積的光束。在其它實(shí)施方案中，透鏡M產(chǎn)生窄范圍聚焦的光束，然后該光束以使全部淋巴結(jié)12 “成像”的模式掃描。掃描窄范圍聚焦的光束將提供通過(guò)淋巴結(jié)12和任何存在于淋巴結(jié)12中的微轉(zhuǎn)移的光子傳播增加，但任何實(shí)施方案均可在三維例如在X、Y和Z空間中有效定位淋巴結(jié)12中的任何微轉(zhuǎn)移的位置。 掃描能夠使激光進(jìn)入更接近微轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)的混濁介質(zhì)中，提高光聲響應(yīng)。掃描微型電機(jī) 25可以通過(guò)移動(dòng)校準(zhǔn)透鏡M在樣品淋巴結(jié)12和激光束之間產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，其可通過(guò)計(jì)算機(jī)觀控制。纖維-透鏡以掃描模式掃描，以輻照整個(gè)淋巴結(jié)12，但掃描也可采用其它方法實(shí)施，例如通過(guò)調(diào)動(dòng)淋巴結(jié)或操縱激光束。與激光器22關(guān)聯(lián)的光傳感器也可以用于觸發(fā)計(jì)算機(jī)觀和波形傳感器26。任何微轉(zhuǎn)移均可通過(guò)由波形分析器沈感應(yīng)并由計(jì)算機(jī)觀分析的特征聲波揭示。借助于在跨越三維空間例如在Χ、Υ、Ζ坐標(biāo)系中的特定位置處的三個(gè)傳感器20a、20b和20c，計(jì)算機(jī)28可通過(guò)各傳感器20a、20b和20c接收到聲波的時(shí)間周期來(lái)確定淋巴結(jié)12內(nèi)任何微轉(zhuǎn)移的位置。所述三個(gè)傳感器20a、20b和20c應(yīng)該是正交的，但是只要它們不共線，可采用反投影確定分析物的位置。具體地，只要通過(guò)傳感器20a、20b、20c方向確定的三個(gè)向量跨越三維空間，就會(huì)有進(jìn)行反投影計(jì)算的足夠信息。在大多數(shù)情況下，傳感器與淋巴結(jié)的距離不是重要的，然而較大的距離需要較大的裝置，并且在耦合流體中還可能存在不期望的粘彈性衰減。通常，優(yōu)選傳感器20a、20b和20c與淋巴結(jié)12間的距離為約1厘米或更小。計(jì)算機(jī)28知道三個(gè)傳感器20a、20b和20c的位置以及信號(hào)在淋巴結(jié)內(nèi)和圍繞淋巴結(jié)的聲介質(zhì)14內(nèi)的傳播速率，這使得能夠作出對(duì)淋巴結(jié)內(nèi)黑色素瘤位置的確定。計(jì)算機(jī)觀可以進(jìn)行自動(dòng)掃描，并輸出或存儲(chǔ)關(guān)于分析物的位置信息。輸出或存儲(chǔ)的信息可采取圖的形式，該圖例如在三維空間中繪制出淋巴結(jié)并提供任何分析物的位置指示?？刹捎霉饴曅畔⒁蕴峁┓治鑫镂恢玫膱D，例如檢測(cè)到的黑色素瘤的圖?？蓪⒃撔畔⒏采w于例如通過(guò)照相機(jī)或其它光學(xué)傳感器四經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)成像得到的淋巴結(jié)圖像上，以顯示黑色素瘤在淋巴結(jié)中的位置?？刹捎贸^(guò)三個(gè)傳感器，其它例子包括5、7、10個(gè)或甚至數(shù)十個(gè)。知曉傳感器相對(duì)于淋巴結(jié)的位置和知曉各傳感器檢測(cè)到信號(hào)的相對(duì)時(shí)間是有用的?？梢詫⑺袀鞲衅鞫疾贾迷诔Ｒ?guī)時(shí)間標(biāo)度上，從而可以確定在第一和第二傳感器處接收信號(hào)之間的相對(duì)差異。通常，傳感器的數(shù)量越多，估計(jì)黑色素瘤位置的精度越高。然而，較多數(shù)量的傳感器也會(huì)導(dǎo)致較高的復(fù)雜度和成本。此外，在很多應(yīng)用中，估計(jì)黑色素瘤位置的精準(zhǔn)程度不會(huì)高到需要超過(guò)3、4、5、6或7個(gè)傳感器。樣品容器16可以是配置為包含液體聲介質(zhì)14并可以具有多種幾何形狀的試驗(yàn)柜。聲介質(zhì)14應(yīng)對(duì)所采用的激光波長(zhǎng)透明，從而該聲介質(zhì)不會(huì)起到吸收劑的作用。對(duì)于很多激光波長(zhǎng)，鹽水溶液是適宜介質(zhì)的例子。優(yōu)選地，聲介質(zhì)具有基本上與被檢查組織的聲阻相匹配的聲阻。樣品容器可以是透明的，或可具有用于接收激光束的透明部分。淋巴結(jié)應(yīng)定位在樣品容器內(nèi)的已知位置，從而可將傳感器檢測(cè)的結(jié)果與淋巴結(jié)中的位置相關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用對(duì)所使用的激光波長(zhǎng)透明的針32或其它元件刺穿或以其它方式保
7持住淋巴結(jié)。除在特定的預(yù)定位置保持淋巴結(jié)外，所述針還可提供三維空間位置參照。樣品容器16優(yōu)選包括其它地標(biāo)(landmark)以使得知曉淋巴結(jié)相對(duì)于試驗(yàn)柜的相對(duì)位置。樣品容器中的坐標(biāo)系標(biāo)記可用于在三維(如X、Y和Z軸)中建立已知的位置。這可用于將淋巴結(jié)中檢測(cè)的分析物的估計(jì)位置與已知位置關(guān)聯(lián)以進(jìn)行淋巴結(jié)的稍后細(xì)微切片。將傳感器 20a.20b.20c相對(duì)于樣品容器坐標(biāo)系的位置提供給計(jì)算機(jī)觀。所述系統(tǒng)優(yōu)選包括使淋巴結(jié) 12及地標(biāo)成像的照相機(jī)或其它形式的光學(xué)傳感器四。利用該圖像，計(jì)算機(jī)可產(chǎn)生能夠與由光聲信號(hào)產(chǎn)生的分析物位置圖相結(jié)合的淋巴結(jié)的三維圖。在其它實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可以采用來(lái)自激光22的不同波長(zhǎng)，以使淋巴結(jié)12以光聲方式成像。采用的波長(zhǎng)例如可靶向用于吸收的淋巴結(jié)中的水分。在此情況下，聲介質(zhì)不應(yīng)為水，可使用適宜的凝膠或油?？捎糜诔洚?dāng)?shù)貥?biāo)以輔助淋巴結(jié)定位的示例性標(biāo)記可包括網(wǎng)格或沿淋巴結(jié)可相對(duì)定位的并可用于建立X、Y和Z三維坐標(biāo)系和位置的第一和第二平面布置的其它參考標(biāo)記、 或標(biāo)記元件。其它示例性標(biāo)記元件包括針、標(biāo)桿或由樣品容器底部豎直上升的其它結(jié)構(gòu)元件、帶標(biāo)記的豎直壁或梁、由側(cè)壁水平擴(kuò)展至樣品容器內(nèi)的標(biāo)桿或針、或在樣品容器內(nèi)的三維空間中淋巴結(jié)可相對(duì)定位的其它物理標(biāo)記元件。由于不吸收激光，尼龍針是一個(gè)例子。也可使用由非吸光材料制成的其它保持元件，例如某些聚合物。每個(gè)針32可確定一個(gè)坐標(biāo)， 或者多個(gè)針32可以以使得傳感器20a、20b、20c形成X、Y和Z坐標(biāo)的方式使用。傳感器20a、20b、20c可沿樣品容器側(cè)壁、底部、頂壁布置，或可布置成與載液流體接觸以檢測(cè)流體的壓力波?；蛘?，可使用不需要流體接觸的通過(guò)光束偏轉(zhuǎn)檢測(cè)光聲事件的其它傳感器。這些可布置在試驗(yàn)樣品容器的外部?！┫到y(tǒng)可包括用于在黑色素瘤的估計(jì)位置對(duì)淋巴結(jié)精細(xì)切片的第二測(cè)點(diǎn) (second station)。這顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)之處在于，對(duì)淋巴結(jié)的高度精細(xì)切片可僅涉及淋巴結(jié)中黑色素瘤的特定位置。實(shí)現(xiàn)了顯著的勞動(dòng)力和成本節(jié)約。制作并測(cè)試根據(jù)圖1的試驗(yàn)系統(tǒng)。試驗(yàn)討論將揭示優(yōu)選系統(tǒng)和方法的其它特征， 而本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解根據(jù)本發(fā)明的商用系統(tǒng)可采用專門制作的組件制作，以實(shí)現(xiàn)性能、緊湊性和常規(guī)優(yōu)化的優(yōu)點(diǎn)。盡管所述試驗(yàn)和優(yōu)選實(shí)施方案涉及黑色素瘤的檢測(cè)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，作為光電能量吸收體的其它淋巴結(jié)和其它分析物也可采用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)分析。試驗(yàn)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)在所述試驗(yàn)中，清晰地檢測(cè)到具有低達(dá)500個(gè)黑色素瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)的光聲響應(yīng)，所述信息由多個(gè)傳感器得到，以使得能夠在淋巴結(jié)的三維空間中確定淋巴結(jié)中的細(xì)胞位置。正常淋巴結(jié)不表現(xiàn)出響應(yīng)。從而，本發(fā)明的檢測(cè)方法和系統(tǒng)可用于檢測(cè)完整淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的存在。其還可用于引導(dǎo)淋巴結(jié)的進(jìn)一步組織學(xué)研究，提高前哨淋巴結(jié)活檢的精度。該研究未表現(xiàn)出假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。大部分黑色素瘤是嚴(yán)重黑變病性質(zhì)的，估計(jì)無(wú)黑色素的黑色素瘤不足5%或?yàn)?1.8-8. 1%，但后一數(shù)字包括部分著色的黑色素瘤。從而，絕大部分黑色素瘤包含可采用光聲產(chǎn)生和檢測(cè)探尋的固有吸光體。當(dāng)光子的光能被轉(zhuǎn)換成機(jī)械擾動(dòng)，產(chǎn)生聲波時(shí)，產(chǎn)生光聲效應(yīng)。試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)使用三倍頻Q 開關(guān) Nd:YAG 激光器(Vibrant ；35511，Opotek，Carlsbad，CA)泵浦光參量振蕩器。該系統(tǒng)具有410-M00nm的波長(zhǎng)。對(duì)于這些試驗(yàn)，可將該系統(tǒng)設(shè)定在 532nm波長(zhǎng)，并通過(guò)600μπι直徑的纖維聚焦，以如圖1所示輻照淋巴結(jié)。激光器能量范圍在4-6mJ，激光脈沖時(shí)間為5ns。該激光系統(tǒng)具有IOHz的重復(fù)頻率。通過(guò)由聚偏二氟乙烯(PVDF)膜制成的三個(gè)壓電聲傳感器(Ktech Corp.，Albuquerque, NM)接收在淋巴結(jié)中產(chǎn)生的光聲信號(hào)。將該信號(hào)傳輸至通過(guò)監(jiān)控激光輸出的光電二極管(DET10A，Thorlabs, Newton, NJ)觸發(fā)的示波器(TDS 2024，Tektronix, ffilsonville, OR)。所述纖維位于淋巴結(jié)之上約Icm處。各聲傳感器正交地放置于淋巴結(jié)周圍，各傳感器距最接近的淋巴結(jié)表面 l-3mm。更加精確的位置可通過(guò)組織中的聲速和光聲波時(shí)間的乘積由各個(gè)波形推導(dǎo)得出， 其中所述聲速約為1. 5mm/μ S。換能器可采用約IOcm長(zhǎng)的半剛性同軸電纜(Micro-coax， Pottstown,PA)段制成。由PVDF和同軸電纜制作聲傳感器的工序更完整地描述于J. Viator ^AW "Clinical Testing of a Photoacoustic Probe for Port Wine Stain Depth Determination, "Lasers Surg. Med.，30，pp. 141—148 (2002)中。在該試驗(yàn)中，外導(dǎo)線直徑為3. 6mm,內(nèi)導(dǎo)線直徑為0. 9mm，兩個(gè)電纜通過(guò)電介質(zhì)分離。將25 μ m厚的PVDF膜附著于同軸電纜的暴露的拋光面上。淋巴結(jié)的準(zhǔn)備和測(cè)試從圍繞淋巴結(jié)的結(jié)締組織和其它組織中分離犬淋巴結(jié)，然后在去離子水中浸泡過(guò)夜，以除去淋巴結(jié)中或周圍的所有血。淋巴結(jié)為約Icm長(zhǎng)的利馬豆?fàn)睢⒄麄€(gè)淋巴結(jié)放置在去離子水浴形式的聲介質(zhì)中，以保證聲傳播至傳感器。通過(guò)600μπι直徑的纖維將532nm波長(zhǎng)引導(dǎo)到淋巴結(jié)上表面處。采用:350MHz儀器放大器(SR445, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA)將感應(yīng)到的信號(hào)放大五倍，然后求平均1 次。采用IOHz激光重復(fù)頻率， 具有1 個(gè)平均量的一次獲取花了 12. 8s。具有大黑色素瘤粒的犬淋巴結(jié)為測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)黑色素瘤的能力，將黑色素瘤細(xì)胞注入至淋巴結(jié)中。將惡性人體黑色素瘤細(xì)胞系HS936的培養(yǎng)物作為黑色素瘤細(xì)胞源。將高濃度黑色素瘤懸浮液通過(guò)離心旋轉(zhuǎn)沉降，直至黑色素瘤形成粒。除去過(guò)量溶液，并通過(guò)移液管抽出高濃度的黑色素瘤。黑色素瘤細(xì)胞總數(shù)為約IX 106。該細(xì)胞塊直徑約1mm。在淋巴結(jié)上的激光斑直徑為約1. 5mm。 掃描所述激光束以輻照整個(gè)淋巴結(jié)。該1.5mm光斑在淋巴結(jié)內(nèi)擴(kuò)散至較大面積，但仍然采用激光束掃描以輻照整個(gè)淋巴結(jié)。在淋巴結(jié)的側(cè)表面上制作小切口，將黑色素瘤通過(guò)移液管注入該切口內(nèi)，以模擬微轉(zhuǎn)移。在未植入黑色素瘤的對(duì)照淋巴結(jié)上重復(fù)包括制作切口的測(cè)試。具有小黑色素瘤粒的豬淋巴結(jié)還由更少數(shù)量的黑色素瘤細(xì)胞形成球。該工序與上述討論的離心不同。具體地說(shuō)， 將黑色素瘤細(xì)胞收集在丙烯酰胺溶液內(nèi)的懸浮體中。采用均由Sigma Aldrich,St. Louis, MO獲得的過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺(TEMED)將丙烯酰胺溶液固化成約Imm直徑的球。將具有懸浮細(xì)胞的未處理丙烯酰胺溶液滴加至礦物油中，由于過(guò)硫酸銨和TEMED而形成在Imin 內(nèi)凝固的球。采用該技術(shù)形成的各個(gè)球包含約500個(gè)黑色素瘤細(xì)胞，并將其植入健康的豬淋巴結(jié)中。來(lái)自健康豬的淋巴結(jié)具有與犬淋巴結(jié)相似的尺寸和形狀。將黑色素瘤細(xì)胞植入各“陽(yáng)性”淋巴結(jié)。使用更高度放大的傳感器信號(hào)進(jìn)行這些測(cè)量(X125)。光纖位于淋巴結(jié)之上約Imm處，形成約600 μ m直徑的光斑。從而，在豬淋巴結(jié)的淋巴結(jié)表面處的激光通量為犬淋巴結(jié)的約6倍。結(jié)果與討論圖2A-2C顯示了在輻照犬淋巴結(jié)后但在注入黑色素瘤細(xì)胞前分別由三個(gè)傳感器得到的光聲波形。圖2D-2F顯示了注入黑色素瘤細(xì)胞后由各傳感器得到的波形。在Iys 內(nèi)出現(xiàn)的初始波形是由激光器的電噪聲造成的。對(duì)于未加黑色素瘤的淋巴結(jié)，如圖2A-2C 所示，沒有光聲信號(hào)。信號(hào)僅顯示具有約100 μ V基線噪音水平的平線。如圖2D-2F所示， 對(duì)于存在黑色素瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)，有三個(gè)明顯的光聲信號(hào)。對(duì)于檢測(cè)器1，如圖2D所示，信號(hào)出現(xiàn)在約9μ s處，其具有約0. 5mV峰峰振幅。對(duì)于檢測(cè)器2，如圖2E所示，信號(hào)出現(xiàn)在約4. 5 μ s處，振幅約0. 4mV。對(duì)于檢測(cè)器3，如圖2F所示，信號(hào)出現(xiàn)在約4. 2 μ s處，振幅約 0.6mV。檢測(cè)器3的波形由于聲衍射而反轉(zhuǎn)。然而，對(duì)于檢測(cè)來(lái)說(shuō)，只有波的存在是需要的， 并且只有波的時(shí)間周期對(duì)于位置確定是需要的，從而波形是不相關(guān)的。由豬淋巴結(jié)得到的信號(hào)強(qiáng)度示于圖3。各淋巴結(jié)信號(hào)包含八次測(cè)量的平均。其中沒有植入黑色素瘤的對(duì)照淋巴結(jié)沒有顯示信號(hào)，與圖3所示的對(duì)照波形類似。由豬淋巴結(jié)的結(jié)果清楚地表明，當(dāng)采用納秒周期激光輻照時(shí)，少量黑色素瘤細(xì)胞就產(chǎn)生了光聲信號(hào)。在豬淋巴結(jié)中，存在約500個(gè)黑色素瘤細(xì)胞。由于平均直徑為約20 μ m，這類微轉(zhuǎn)移直徑約為 100-200 μ m。這些量的細(xì)胞構(gòu)成了通過(guò)染色切片的顯微檢查發(fā)現(xiàn)的小部分。這類微轉(zhuǎn)移可以容易地在Icm長(zhǎng)的淋巴結(jié)組織切片中錯(cuò)過(guò)。強(qiáng)烈且清晰的信號(hào)表明，即使更少量的細(xì)胞也應(yīng)是能檢測(cè)的。用干準(zhǔn)確定位的光聲反投影光聲反投影是一種用于確定淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移具體位置的技術(shù)，從而其可用于引導(dǎo)組織學(xué)檢查，并降低假陰性篩查。采用反投影再現(xiàn)，可定位轉(zhuǎn)移，并確定其在淋巴結(jié)內(nèi)的位置，從而可選擇組織切片以進(jìn)行最高概率檢測(cè)的組織學(xué)檢查。反投影是一種數(shù)學(xué)方法，其類似于采用不同位置對(duì)信號(hào)作三角測(cè)量。另外，可進(jìn)行濾波和降噪。適宜的反投影技術(shù)披露于"Iterative Reconstruction Algorithm for Optoacoustic Imaging, "J. Acoust. Soc. Am. Volume 112，Issue 4，pp.1536-1544(2002 年 10 月)。靈敏度優(yōu)化所述試驗(yàn)沒有顯示假陽(yáng)性率。然而，在實(shí)踐中，淋巴結(jié)的不完全沖洗可能導(dǎo)致淋巴結(jié)中存在殘余血。為避免血引起不期望的光聲響應(yīng)，可以將激光波長(zhǎng)改為紅色，例如630nm， 以將來(lái)自脫氧血紅蛋白的光聲響應(yīng)降低約八倍，和將氧化的響應(yīng)降低超過(guò)50倍。然而，黑色素響應(yīng)僅降低約兩倍。從而，在抑制噪聲的同時(shí)提高了靈敏度。另一種選擇是使用兩種波長(zhǎng)，并分析兩種波長(zhǎng)的相對(duì)響應(yīng)。例如，可取對(duì)532nm 和630nm波長(zhǎng)的響應(yīng)，以將由血紅蛋白或黑色素引起的光聲波分類。可采用統(tǒng)計(jì)分類法分辨熱凝固血和存活的血紅蛋白。參見Viator等人的“Photoacoustic Discrimination of Viable and Thermally Coagulated Blood Using a Two—Wavelength Method for Burn Injury Monitoring, "Phys. Med. Biol. ,52,pp. 1815-1829(2007) 采用兩種波長(zhǎng)可類似地用于區(qū)分血和黑色素。與黑色素的簡(jiǎn)單光譜相對(duì)比，血紅蛋白的獨(dú)特吸收光譜使得這種分類可行。上述試驗(yàn)表明，與犬淋巴結(jié)相比，用于豬淋巴結(jié)的設(shè)置增強(qiáng)了檢測(cè)。兩種設(shè)置的差異提高了放大率從5倍到125倍，并且通過(guò)使光纖更靠近組織表面放置來(lái)增強(qiáng)激光通量。此夕卜，用于豬淋巴結(jié)的傳感器對(duì)聲波的靈敏度高出數(shù)倍。豬傳感器具有與犬傳感器相同的基本結(jié)構(gòu)，但構(gòu)建得更加靈敏。這些改進(jìn)使我們將靈敏度提高約三個(gè)數(shù)量級(jí)?？刹捎眯〔ㄈピ胍蕴岣咝旁氡纫约霸跈z測(cè)期間進(jìn)行掃描。適宜的去噪和掃描披露于 Viator 等人的"Automated Wavelet Denoising of Photoacoustic Signals for Circulating Melanoma Cell Detection and Burn Image Reconstruction", Phys. Med. Biol.，pp. N227-N236 (2008 年 5 月 21 日)。盡管已經(jīng)呈現(xiàn)并描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但應(yīng)理解其它改進(jìn)、替換和變化方式對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是明顯的。可在不脫離由所附權(quán)利要求書確定的本發(fā)明范圍和主旨的情況下作出這種改進(jìn)、替換和變化方式。本發(fā)明的各種特征在所附的權(quán)利要求書中給出。
權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)固體組織中分析物的方法，包括 將固體組織(1 放置在預(yù)定位置處；用選擇為以不顯著的吸收穿過(guò)該固體組織并至少部分地被該分析物吸收的光的脈沖波長(zhǎng)輻照該固體組織；聲感應(yīng)由所述輻照步驟產(chǎn)生的光聲響應(yīng)一段時(shí)間以獲得光聲波形； 分析該光聲聲波波形并根據(jù)檢測(cè)到的響應(yīng)峰判斷分析物的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述放置步驟包括將該固體組織放置在聲介質(zhì)(14)中的預(yù)定位置處，和所述聲感應(yīng)步驟包括通過(guò)該聲介質(zhì)感應(yīng)光聲響應(yīng)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述聲介質(zhì)包括去離子水。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述聲介質(zhì)包括油或凝膠。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析步驟包括基于檢測(cè)到的響應(yīng)峰的時(shí)間周期確定任何檢測(cè)到的分析物的位置。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述聲感應(yīng)步驟包括獲得多個(gè)獨(dú)特的光聲響應(yīng)，和所述分析步驟除確定任何檢測(cè)到的分析物的位置外還確定分析物是否存在。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述輻照步驟包括對(duì)該固體組織掃描激光束。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述輻照步驟包括在該固體組織上聚焦激光束。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述激光束包括在紅色波長(zhǎng)區(qū)域發(fā)射的脈沖激光束。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述聚焦包括通過(guò)光纖在固體組織的一至數(shù)毫米內(nèi)發(fā)射激光束。
11.權(quán)利要求1的方法，其中該固體組織包括完整的淋巴結(jié)或完整淋巴結(jié)的主要部分。
12.權(quán)利要求8的方法，其中該分析物包括黑色素。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述輻照步驟包括用光的多個(gè)脈沖波長(zhǎng)輻照固體組織。
14.一種用于體外檢測(cè)固體組織中分析物的系統(tǒng)，包括樣品容器(16)，其配置為以預(yù)定體積將固體組織(1 保持在該樣品容器內(nèi)； 可以產(chǎn)生脈沖激光束的激光器02)； 用于將脈沖激光束導(dǎo)入該固體組織的光學(xué)聚焦器03，； 為檢測(cè)該固體組織中所含分析物的光聲響應(yīng)而定位的聲傳感器(20a)；和用于分析該光聲響應(yīng)并基于該光聲響應(yīng)確定固體組織中是否存在分析物的計(jì)算機(jī) (28)。
15.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述樣品容器(16)包含一個(gè)或多個(gè)用于以預(yù)定體積保持固體組織處的針(32)，和所述一個(gè)或多個(gè)針對(duì)于脈沖激光束基本上是透明的。
16.權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中所述樣品容器(16)配置為包含聲介質(zhì)(14)并將該固體組織以該預(yù)定體積保持在聲介質(zhì)中，和所述聲傳感器定位成與由樣品容器保持的聲介質(zhì)聲接觸。
17.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述聲傳感器包含至少三個(gè)不共線的傳感器Q0a、20b、 20c)，和所述計(jì)算機(jī)接收來(lái)自該至少三個(gè)聲傳感器的獨(dú)立信號(hào)并采用該獨(dú)立信號(hào)根據(jù)所述信號(hào)和信號(hào)的時(shí)間周期來(lái)確定分析物的存在與否和位置。
18.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述聲傳感器包含至少三個(gè)布置為跨越三維空間的聲傳感器O0a、20b、20c)，和所述計(jì)算機(jī)接收來(lái)自該至少三個(gè)聲傳感器的獨(dú)立信號(hào)并采用該獨(dú)立信號(hào)根據(jù)所述信號(hào)和信號(hào)的時(shí)間周期來(lái)確定分析物的存在與否和位置。
19.權(quán)利要求18的系統(tǒng)，其中所述至少三個(gè)聲傳感器布置在沿X、Y和Z坐標(biāo)系的不同位置。
20.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述樣品容器包括限定三維坐標(biāo)系的標(biāo)記物元件，所述固體組織定位在該三維坐標(biāo)系中的已知位置，所述至少三個(gè)傳感器布置在相對(duì)于限定的三維坐標(biāo)系的已知位置。
21.權(quán)利要求20的系統(tǒng)，進(jìn)一步包含用于使該固體組織成像的照相機(jī)或光傳感器 (四)，其中該計(jì)算機(jī)采用固體組織的成像和光聲響應(yīng)以產(chǎn)生該固體組織和該固體組織中分析物的位置的圖。
22.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述光學(xué)聚焦器包括在所述預(yù)定體積的一或數(shù)毫米內(nèi)發(fā)射脈沖激光束的光纖03)。
23.權(quán)利要求22的系統(tǒng)，進(jìn)一步包含相對(duì)于該預(yù)定體積掃描該脈沖激光束的掃描馬達(dá)。
24.權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中該聲傳感器包含由電介質(zhì)分離并以暴露的拋光面終止的同軸電纜，其中聲感應(yīng)薄膜覆蓋該拋光面。
25.權(quán)利要求對(duì)的系統(tǒng)，其中所述聲感應(yīng)膜包括聚偏二氟乙烯。
26.—種體外檢測(cè)固體組織中分析物的方法，包括 將提取的固體組織(1 曝露于脈沖激光束；檢測(cè)由所述曝露步驟產(chǎn)生的光聲信號(hào)；和分析該光聲信號(hào)以證實(shí)固體組織中是否存在分析物。
27.權(quán)利要求沈的方法，進(jìn)一步包含分析該光聲信號(hào)以估計(jì)分析物在固體組織中的位置。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中所述檢測(cè)包括采用多個(gè)在不共線位置放置的聲傳感器 (20a.20b.20c)進(jìn)行檢測(cè)，和采用來(lái)自各傳感器的檢測(cè)時(shí)間和各傳感器的相對(duì)位置估計(jì)分析物在固體組織中的位置。
29.權(quán)利要求沈的方法，其中聲傳感器的數(shù)量為至少3個(gè)，并且該至少三個(gè)聲傳感器位于該固體組織周圍不同的正交位置處。
30.權(quán)利要求沈的方法，其中該固體組織是完整的淋巴結(jié)。
31.權(quán)利要求30的方法，進(jìn)一步包括從患者提取淋巴結(jié)的預(yù)先步驟。
全文摘要
一種用于體外檢測(cè)固體組織(12)如完整的淋巴結(jié)中分析物的優(yōu)選系統(tǒng)，包括布置為產(chǎn)生進(jìn)入固體組織的脈沖激光束的激光器(22)，其中所述固體組織可以是完整淋巴結(jié)。聲波傳感器，優(yōu)選至少三個(gè)聲波傳感器(20a、20b、20c)布置在不同位置以跨越三維空間如在X、Y和Z坐標(biāo)系中以檢測(cè)該淋巴結(jié)內(nèi)產(chǎn)生的光聲信號(hào)。至少一個(gè)計(jì)算機(jī)(28)接收來(lái)自聲傳感器的信號(hào)。所述計(jì)算機(jī)從該信號(hào)和該信號(hào)的時(shí)間周期確定是否存在分析物，和優(yōu)選地確定分析物的位置。一種用于體外檢測(cè)淋巴結(jié)中分析物的優(yōu)選方法，包括將提取的淋巴結(jié)曝光于脈沖激光束。感應(yīng)光聲信號(hào)。分析所述光聲信號(hào)以證實(shí)淋巴結(jié)中是否存在分析物。優(yōu)選地，由跨越三維空間的多個(gè)傳感器檢測(cè)多個(gè)光聲信號(hào)，并且還確定分析物的位置。
文檔編號(hào)G01N29/04GK102460117SQ201080027138
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者D.麥克考馬克, J.A.維亞特, P.S.戴爾 申請(qǐng)人:密蘇里大學(xué)管理機(jī)構(gòu)