專利名稱：信號放大微球、其在一步和多步分析放大方法中的用途和用于其生產(chǎn)的方法
信號放大微球、其在一步和多步分析放大方法中的用途和用于其生產(chǎn)的方法本發(fā)明涉及包含蛋白質(zhì)載體分子和信號前體分子的蛋白質(zhì)微球及其生產(chǎn)方法，且還涉及這樣的蛋白質(zhì)微球在用于檢測樣品中靶物類的體外生物測定中的用途。本發(fā)明也涉及使用包括但不限于光學(xué)、磁學(xué)、電化學(xué)或化學(xué)方法的檢測技術(shù)提高體外生物測定靈敏度水平的方法。還提供檢測方法(直接方法和有效的序貫信號放大方法)和各種測試試劑盒。在將本發(fā)明的蛋白質(zhì)微球應(yīng)用于生物測定領(lǐng)域時，蛋白質(zhì)微球在表面攜帶用于特異性識別和結(jié)合樣品中的靶分子的親和分子。生物測定例如酶聯(lián)免疫測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、熒光免疫測定(F IA)、免疫凝集測定或者DNA、RNA或基因組測定是熟知的，并在檢測研究中的分析物、人和獸醫(yī)診斷領(lǐng)域、法醫(yī)診斷、環(huán)境分析、食品分析和生物防御篩選空氣或水中的危險物質(zhì)方面起重要作用。生物測定基于至少一種標記生物分子與待檢測分析物(靶標)的相互作用。標記為用于將相互作用“可視化”的工具。已知不同種類的標記，并且對上文所提及各種技術(shù)給出其名稱=ELISA中的酶、RIA中的放射性同位素、FIA中的熒光團或用于蛋白質(zhì)印跡、DNA印跡或RNA印跡的特異性標記。其它標記類型包括脂質(zhì)體、免疫凝集測定中的膠乳顆粒以及染料、介體、金顆粒。生物測定的最重要要求是分析特異性和分析靈敏度。例如在將抗體的結(jié)合位點與其抗原(分析物)匹配或者使兩條互補核酸鏈雜交的情況中，分析靈敏度由親和分子或生物識別分子確定。生物測定的分析靈敏度也受到生物識別分子的影響，這是由于其與靶物類生物相互作用的親和常數(shù)。標記作為表明反應(yīng)已經(jīng)在靶標與親和分子之間發(fā)生的標記物起作用，并可用以下不同技術(shù)測量(i)光學(xué)測量染料的吸收或者熒光團發(fā)出的熒光或發(fā)光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)出的光，或者測量由凝集膠乳顆粒的光散射引起的濁度；( )放射性測量放射性同位素；(iii)電化學(xué)測量介體或電活性物質(zhì)；或者(iv)磁學(xué)測量磁力。(V)壓電測量質(zhì)量變化。使用放射性同位素作為標記的放射免疫測定仍然被許多人認為是最靈敏的方法。該項非常有效的技術(shù)于1959年由Yalow和Berson提出，并代表分析化學(xué)、診斷學(xué)和醫(yī)學(xué)的新時代。然而，該項技術(shù)具有的缺點是，有害污染人類和環(huán)境的風(fēng)險由于所使用的放射性同位素而不能完全排除。與此同時，已開發(fā)和改進非放射性方法，以便達到類似的分析靈敏度?；跓晒?、發(fā)光和吸收波譜的光學(xué)方法的重要性隨著時間推移而增強并仍在增加。ELISA技術(shù)使用酶作為標記物以放大信號。在進行生物測定后，通過一種酶標記分子產(chǎn)生大量染料分子來放大分析物與探針之間的生物相互作用?？墒褂妹咐缙咸烟茄趸?GOD, EC I. I. 3. 4.)、堿性磷酸酶(AP，EC 3. I. 3. I)或過氧化物酶(POD, EC I. 11. I. 7)，其中轉(zhuǎn)換數(shù)分別為2000底物分子每秒(s’jOOOs—1和lOOOOs' ELISA技術(shù)的缺點是在方法中包括大量步驟和底物溫育所需要的時間長度。熒光方法也已用于生物測定許多年并且持續(xù)高度令人關(guān)注。所有基于熒光的技術(shù)確保良好的靈敏度和10_8-10_18m的低檢測限。特殊技術(shù)例如“時間分辨熒光”、化學(xué)和生物發(fā)光或基于供體與受體分子之間能量轉(zhuǎn)移的技術(shù)可達到檢測限為10-15-10_18M。現(xiàn)有技術(shù)已知的熒光免疫測定使用具有反應(yīng)性功能連接基團的低分子量熒光標記(S0UTHWICK, P. L.等，Cytometry, 11,第 418-430 頁，1990，MUJUMDAR, R. B.等，Bioconjugate Chemistry,4,第 105-111 頁，1993, MUJUMDAR, R. B.等，Cytometry,10,第11-19頁，1989)、熒光和染料著色顆粒(美 國專利號US 4837168和US 6013531及國際專利申請?zhí)朩O 95/08772)或熒光團刺狀(spiked)樹枝狀大分子(DE 197 03 718)。也已知采用負載有標記物的脂質(zhì)體用于免疫測定中的信號放大(美國專利號US5756362、US 4874710和US 4703017)。實際上，這些方法的靈敏度受到可以溶解形式摻入到脂質(zhì)體中的標記物質(zhì)的量的限制。使用標記脂質(zhì)體的另一個缺點是有限的脂質(zhì)體穩(wěn)定性。如以上所提及的那樣，在生物測定開發(fā)中重要的是達到很高的分析靈敏度，其定義為對分析物濃度某些變化的信號響應(yīng)程度(校準曲線的斜率)。在免疫化學(xué)測定中，無論是夾心測定還是競爭測定類型，分析靈敏度取決于濃度范圍。影響分析靈敏度的另外兩個因素為測定所必需的樣品量和結(jié)果的總體反應(yīng)時間。樣品體積越高，并且所應(yīng)用的總體反應(yīng)時間越長，可檢測和測量的分析物濃度越低。然而，在許多實際情況中，沒有足夠體積的樣品可用(例如在藥學(xué)研究中)或者組分分布在很大體積的樣品中(例如牛奶中的抗生素殘余物或空氣中的生化防御性物質(zhì))。因此，關(guān)鍵性挑戰(zhàn)是檢測和/或測定在可得到的小樣品體積中的很小量物質(zhì)，或者檢測和/或測定在大樣品體積中以很低濃度分布的物質(zhì)。因此，所應(yīng)用的技術(shù)必須具有高的分析靈敏度，尤其是在很低的濃度范圍內(nèi)。為了可客觀地在很低的濃度范圍內(nèi)比較各種已知技術(shù)的分析靈敏度，CLSI (美國的臨床實驗室標準研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)和/或NCCLS)已經(jīng)使用3個術(shù)語定義分析靈敏度空白限(Limit of Blank，LoB)、檢測限(Limitof Detection, LoD)和定量限(Limit of Quantitation, LoQ)。對這些參數(shù)的數(shù)據(jù)進行評價并用于各項技術(shù)之間的比較。為了達到高的分析靈敏度，已經(jīng)開發(fā)不同的生物標記系統(tǒng)以影響信號放大，例如酶生物標記、有機微晶生物標記和膠體金標記等。在酶生物標記系統(tǒng)中，酶分子將底物轉(zhuǎn)化為具有光學(xué)或電化學(xué)性質(zhì)的產(chǎn)物。由于高的轉(zhuǎn)換率(例如使用辣根過氧化物酶)，或者由于很大的線性酶促反應(yīng)(例如使用堿性磷酸酶)，可產(chǎn)生大量的產(chǎn)物(信號)以實現(xiàn)放大。另一種方法是放大檢測信號的所謂“酶循環(huán)”技術(shù)，其提高檢測靈敏度。一種使用信號產(chǎn)生物質(zhì)的固體顆粒的新標記類別已經(jīng)揭示于歐洲公開的專利申請?zhí)朎P 1309867中。在曝露于釋放劑時，存在于各固體顆粒中的數(shù)十億信號產(chǎn)生分子可被立即釋放以產(chǎn)生“超新星效果”。酶系統(tǒng)的信號放大原理基于轉(zhuǎn)化酶底物以產(chǎn)生被釋放到體相中的信號。固體顆粒系統(tǒng)的信號放大原理基于產(chǎn)生并釋放大量的信號分子到反應(yīng)室的體相中。然而，釋放信號分子到體相中導(dǎo)致信號分子濃度的部分稀釋并影響分析靈敏度。也已知使用膠體金標記的信號放大生物測定。Taton等(T. Andrew Taton, ChadA. Mirkin, Robert L. LetsingerZiScanometric DNA Array Detection with NanoparticleProbes”，Science, 289 (8) 1757-1760，2000)報道基于膠體金然后銀增強的信號放大方法，其中膠體金促進銀(I)還原到金顆粒表面上，導(dǎo)致大量銀金屬在膠體金標記上積累。銀增強方法可檢測低至5納摩爾/升的寡核苷酸濃度。使用膠體金標記用于放大生物測定的另 一種方法基于生物親和力誘導(dǎo)的膠體金聚集，其導(dǎo)致可用肉眼觀察到的顏色從紅色變?yōu)樗{色。生物親和力誘導(dǎo)的聚集方法可檢測10飛摩爾/升濃度水平的寡核苷酸。膠體金標記的信號放大原理基于信號分子積累或聚集到濃縮的小體積中。通過比較以上所提及標記系統(tǒng)的信號放大能力，具有信號分子積累(通過另一種親和分子固定)在固體載體(例如在側(cè)流裝置中)上的集中區(qū)域的膠體金放大系統(tǒng)可達到高分析靈敏度。本發(fā)明的一個實施方案提供一種用于檢測樣品中靶分子的方法，所述方法確保優(yōu)良的分析靈敏度、低檢測限和任選通過序貫應(yīng)用步驟的重復(fù)循環(huán)放大進一步增強檢測信號。該方法完全不同于已知方法。本發(fā)明的另一個實施方案提供用于在研究和診斷領(lǐng)域中光學(xué)、電化學(xué)或化學(xué)檢測靶分子的各種測試試劑盒。本發(fā)明的又一個實施方案提供標記的生物分子，其可被可靠地制備并可廣泛用于生物測定，優(yōu)選用于人和獸醫(yī)診斷領(lǐng)域、法醫(yī)診斷、環(huán)境分析、食品分析、生物防御篩選、DNA、RNA或基因組研究和診斷。定義親和分子/生物識別分子親和分子為通過其結(jié)構(gòu)或通過其孔徑或通過其電荷以一定親和力(親和力(affinity/avidity)常數(shù))特異性地識別并與另一種物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。存在許多不同的親和分子，其通?？膳c某類物質(zhì)一起使用(例如用于IgG-抗體的蛋白質(zhì)A/G)或者可僅對一種物質(zhì)非常特異(例如用于抗原的抗體、用于另一種序列的DNA序列或用于生物素的抗生物素蛋白、用于其底物的某些酶)。載體蛋白載體蛋白主要通過打開胞內(nèi)S-S鍵并然后使其自組裝形成分子間和分子內(nèi)S-S鍵兩者來參與形成海綿狀微膠囊；分子間S-S鍵負責(zé)蛋白質(zhì)微球的結(jié)構(gòu)完整性?？墒褂玫妮d體蛋白的實例包括-纖維狀蛋白(例如細胞骨架蛋白、胞外基質(zhì)蛋白等)-球狀蛋白-可自血清和血漿分離的血蛋白(例如血紅素蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、DNA結(jié)合蛋白等)-脂蛋白-糖蛋白-免疫系統(tǒng)蛋白(例如單克隆抗體和多克隆抗體、抗原等)-重組蛋白-遺傳修飾蛋白
-化學(xué)修飾蛋白-合成蛋白-各種蛋白的混合物-營養(yǎng)蛋白(例如貯藏蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等)-酶-核酶通常，可使用人、動物和植物來源的任何含硫蛋白質(zhì)或含硫肽(包括合成肽)。信號放大導(dǎo)致物理化學(xué)可測量信號的在兩種以上的物質(zhì)/反應(yīng)伙伴之間的任何反應(yīng)。在大多數(shù)情況中，免疫化學(xué)和雜交反應(yīng)中的信號如此弱，以致于在得到可解釋的結(jié)果的測量之前必須進行該信號的放大。放大可通過各種方法和技術(shù)進行。本發(fā)明提供使用信號放大微球的一步和多步放大方法兩者。在多步放大方法的變體中，至少一個放大循環(huán)可使用EP 1309867(其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)所公開類型的膠囊，該膠囊包封信號產(chǎn)生有機物質(zhì)的固體顆粒并在其表面攜帶用于特異性識別和結(jié)合靶分子的親和分子。微球本發(fā)明的微球不具有固體邊界并可比作具有延伸到其內(nèi)部中的孔隙的海綿球。它們?yōu)楣矁r連接在一起的蛋白質(zhì)分子網(wǎng)絡(luò)。它們通過在新沉淀的模板(template)處吸附結(jié)合或共沉淀并通過打開分子內(nèi)
S-S鍵形成。然后使所得的游離巰基能夠形成新的分子間和分子內(nèi)S-S鍵，分子間S-S鍵有助于微球形成。微球具有均勻結(jié)構(gòu)并且不是通過逐層技術(shù)(例如在EP 1309867中公開的那些)形成的分層狀膠囊。微球的直徑為IOnm-Imm,優(yōu)選地為400nm_10 μ m。盡管這些界限至少部分地落在微米范圍之外，但是本文為方便起見使用術(shù)語“微球”，指由本發(fā)明的由蛋白分子網(wǎng)絡(luò)形成的離散顆粒。信號放大微球信號放大微球為由載體蛋白+信號前體分子+親和分子組成的微球。它們在其表面上具有對于待測定物質(zhì)(靶標或分析物)的特異性結(jié)合特性?；|(zhì)形成劑基質(zhì)形成劑為與載體蛋白和/或信號前體分子混合以通過共沉淀形成微球模板的材料，例如碳酸鈣、藻酸鈣、多孔二氧化硅、寡糖或多糖(例如葡聚糖)。還原劑還原劑為引起微球模板中蛋白分子內(nèi)的分子內(nèi)二硫鍵打開的材料。還原劑的實例為二硫蘇糖醇(DTT)?；|(zhì)除去劑基質(zhì)除去劑為用于從微球模板除去基質(zhì)形成劑留下蛋白微球的材料，例如螯合劑(EDTA)、酸或堿。信號前體分子
信號前體分子為當(dāng)與一種或多種其它試劑反應(yīng)時得到可測量信號的分子。信號前體分子可為直接或間接類型。在直接信號前體的情況中，信號前體分子本身在活化時變化以產(chǎn)生待檢測的信號。在間接信號前體的情況中，信號前體分子在活化時與另一物類反應(yīng)并且該其它物類可負責(zé)產(chǎn)生待檢測信號。信號前體分子可為低分子量信號前體分子或高分子量信號前體分子。低分子量信號前體分子信號前體分子可為低分子量物質(zhì)，選自熒光團及其衍生物、發(fā)光團及其衍生物、發(fā)色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質(zhì)的氧化還原活性物質(zhì)。高分子量信號前體分子高分子量蛋白信號前體分子包括但不限于選自酶及其前體、生物發(fā)光蛋白和熒光蛋白及核酶的高分子量物質(zhì)；選自抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、重組蛋
白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和適配體。存在許多來自不同化學(xué)類別的不同物質(zhì)，其借助開始的反應(yīng)得到可測量的信號?？蓽y量的信號可基于-熒光測定法-發(fā)光測定法-在紫外、可見和近紅外范圍內(nèi)的顏色變化-氧化還原電勢的變化-在復(fù)合物形成或沉淀期間的質(zhì)量變化靶分子該術(shù)語與“分析物”同義，其意指在分析方法(例如免疫測定)中測定的物質(zhì)或化
學(xué)組分。發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提供包含與信號前體分子結(jié)合的載體蛋白的微球，其中信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號同時保持與載體蛋白結(jié)合。在一個實施方案中，微球為雜合顆?；虍愋皖w粒，其意指載體蛋白與信號前體分子不同。在一個備選實施方案中，微球為同型顆粒，其意指載體蛋白與信號前體相同。如上所示，信號前體分子可為直接或間接類型。在直接信號前體的情況中，信號前體分子本身在活化時變化以產(chǎn)生待檢測信號。在間接信號前體的情況中，信號前體分子在活化時與另一物類反應(yīng)并且該其它物類可產(chǎn)生待檢測信號。優(yōu)選地，載體蛋白選自纖維狀蛋白，包括但不限于細胞骨架蛋白或胞外基質(zhì)蛋白；或球狀蛋白，包括但不限于血蛋白、血紅素蛋白、細胞粘附蛋白；或轉(zhuǎn)運蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA結(jié)合蛋白、免疫系統(tǒng)蛋白(包括但不限于單克隆抗體或多克隆抗體)、營養(yǎng)貯藏/轉(zhuǎn)運蛋白、伴侶蛋白或酶；或者遺傳修飾蛋白；或者重組蛋白或化學(xué)修飾蛋白和合成蛋白。更優(yōu)選地，載體蛋白為在血液中循環(huán)的蛋白，例如牛血清白蛋白。該蛋白廣泛用于生化應(yīng)用，包括ELISA和免疫印跡。其具有良好穩(wěn)定性并且可以低成本得到，因為大量的該蛋白可易于自牛血純化,牛血為養(yǎng)牛業(yè)的副產(chǎn)物。信號前體分子可為低分子量物質(zhì)，選自熒光團及其衍生物、發(fā)光團及其衍生物、發(fā)色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質(zhì)的氧化還原活性物質(zhì)。
優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光團，例如熒光素、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質(zhì)以及小的熒光芳香和雜芳香分子。備選地，低分子量信號前體分子可為發(fā)色團，例如吡唑啉酮、蒽醌、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質(zhì)。最優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光素衍生物，例如熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。
高分子量蛋白信號前體分子包括但不限于選自酶及其前體、生物發(fā)光蛋白和熒光蛋白及核酶的高分子量物質(zhì)；選自抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、重組蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和適配體。優(yōu)選地，高分子量信號前體分子為親和分子，例如肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。備選地，高分子量信號前體分子可為酶，例如過氧化物酶、氧化還原酶、連接酶、聚合酶和轉(zhuǎn)移酶。最優(yōu)選地,高分子量信號前體分子為抗生物素蛋白和NeutrAvidin (商標)。以上所描述的微球具有在lOnm-lmm，優(yōu)選地在400nm-10iim范圍內(nèi)的尺寸。微球的結(jié)構(gòu)優(yōu)選地基本均勻；也就是說，形成微球的材料基本均一地分散并且它們遍及顆粒主體具有基本均一的密度和孔隙率。微球類似微型海綿或棉花球，并且盡管它們具有可識別的邊界，但是它們不是具有限定邊界的固體外殼的膠囊。當(dāng)將微球與用于結(jié)合溶液中的靶標的親和分子混合時，那些親和分子將變?yōu)楦街谖⑶?。微球包含親和分子，或者親和分子可與微球表面綴合或者直接或通過連接分子與微球表面結(jié)合，或者通過吸附結(jié)合/附著。連接分子包括但不限于生物分子例如抗生物素蛋白、鏈霉親和素、NeutrAvidin (商標)、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交聯(lián)劑。然而在特殊情況中，一些親和分子將擴散進入微球內(nèi)部并也將附著于那里。當(dāng)然，這種擴散的程度將取決于親和分子的相對尺寸和微球的孔徑。附著于微球的親和分子可為生物識別分子，例如特異性肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可為抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應(yīng)原或其部分。核酸可為DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、適配體及其部分。碳水化合物的實例包括單糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或激素、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、酶的假底物或輔基、藥物、變應(yīng)原或半抗原。在第二方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生本文定義的微球的方法，微球包含與信號前體分子結(jié)合的載體蛋白，其中信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號同時保持與載體蛋白結(jié)合。該方法包括通過攪拌在溶液中(優(yōu)選在水溶液中)將載體蛋白和信號前體分子與基質(zhì)形成劑混合；伴隨攪拌加入小分子還原劑；洗滌除去小分子還原劑；伴隨攪拌加入基質(zhì)除去劑；和洗滌除去基質(zhì)形成劑并留下與信號前體分子結(jié)合的載體蛋白微球。優(yōu)選地，該方法在含有含水試劑的水溶液中，優(yōu)選在室溫下進行。優(yōu)選的混合方法為用磁力攪拌器攪拌。
基質(zhì)形成劑的作用是在微球模板中捕獲蛋白分子?；|(zhì)形成劑可為碳酸鈣、藻酸鈣、多孔二氧化硅或者寡糖或多糖(例如葡聚糖)。優(yōu)選地通過將碳酸鈉溶液加入載體蛋白、信號前體分子和氯化鈣在溶液中的混合物中形成碳酸鈣。微球的尺寸可通過控制攪拌速度來控制。微球的密度可通過調(diào)節(jié)載體蛋白、信號前體分子、基質(zhì)形成劑和還原劑的相對比例來控制。如前所述，微球可為雜合顆粒，其中載體蛋白與信號前體分子不同。備選地，載體蛋白與信號前體分子可相同。而且，信號前體可如以上所解釋的那樣為直接或間接的。優(yōu)選地，載體蛋白選自纖維狀蛋白，包括但不限于細胞骨架蛋白或胞外基質(zhì)蛋白；或球狀蛋白，包括但不限于血蛋白、血紅素蛋白、細胞粘附蛋白；或轉(zhuǎn)運蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA結(jié)合蛋白、免疫系統(tǒng)蛋白(包括但不限于單克隆抗體或多克隆抗體、營養(yǎng)貯藏/轉(zhuǎn)運蛋白、伴侶蛋白或酶；或者遺傳修飾蛋白；或者重組蛋白或化學(xué)修飾蛋白和合成
蛋白。更優(yōu)選地，載體蛋白為在血液中循環(huán)的蛋白，例如牛血清白蛋白。信號前體分子可為低分子量物質(zhì)，選自熒光團及其衍生物、發(fā)光團及其衍生物、發(fā)色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質(zhì)的氧化還原活性物質(zhì)。優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光團，例如熒光素、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質(zhì)以及小的熒光芳香和雜芳香分子。備選地，低分子量信號前體分子可為發(fā)色團，例如吡唑啉酮、蒽醌、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質(zhì)。最優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光素衍生物，例如熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。高分子量蛋白信號前體分子包括但不限于選自酶及其前體、生物發(fā)光蛋白和熒光蛋白及核酶的高分子量物質(zhì)；選自抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、重組蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和適配體。優(yōu)選地，高分子量信號前體分子為親和分子，例如肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。備選地，高分子量信號前體分子可為酶，例如過氧化物酶、氧化還原酶、連接酶、聚合酶和轉(zhuǎn)移酶。最優(yōu)選地,高分子量信號前體分子為抗生物素蛋白和NeutrAvidin (商標)。產(chǎn)生微球的方法可進一步包括將親和分子附著于微球的表面。親和分子可例如通過范德華力、氫鍵或靜電相互作用與微球的外表面綴合，或者它們可直接或經(jīng)連接分子與微球的外表面共價結(jié)合。如果間接結(jié)合，連接分子包括但不限于生物分子例如抗生物素蛋白、鏈霉親和素、NeutrAvidin (商標)、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交聯(lián)劑?？稍诩尤牖|(zhì)除去劑步驟之前將親和分子加入反應(yīng)混合物中。典型的親和分子可為生物識別分子，例如特異性肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體、受體分子和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可為抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應(yīng)原或其部分。核酸可為DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、適配體及其部分。碳水化合物的實例包括單糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或激素、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、酶的假底物或輔基、藥物、變應(yīng)原或半抗原。在第三方面，本發(fā)明提供一種用于使用微球檢測樣品中的一種或多種靶分子的信號放大方法，微球包含與信號前體分子鍵合的載體蛋白，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號同時保持與載體蛋白結(jié)合，并且所述微球在其表面上具有用于特異性識別和結(jié)合所述靶分子的親和分子，所述方法包括(a)溫育靶分子與所述微球；(b)分離在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球與沒有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球；
(C)用顯示劑處理所分離的在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球以活化信號前體分子產(chǎn)生信號，和(d)檢測或定量信號。因此產(chǎn)生的信號與樣品中靶分子的量直接或間接相關(guān)。另外，信號為局部的，因為信號前體分子保持在微球內(nèi)結(jié)合并且未被釋放到溶液中。因此，不存在信號稀釋。恰恰相反，信號放大，因為對于在溫育步驟期間形成的每個親和分子-靶分子復(fù)合物，存在許多在活化步驟期間活化的信號前體分子。優(yōu)選地，載體蛋白選自纖維狀蛋白，包括但不限于細胞骨架蛋白或胞外基質(zhì)蛋白；或球狀蛋白，包括但不限于血蛋白、血紅素蛋白、細胞粘附蛋白；或轉(zhuǎn)運蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA結(jié)合蛋白、免疫系統(tǒng)蛋白(包括但不限于單克隆抗體或多克隆抗體)、營養(yǎng)貯藏/轉(zhuǎn)運蛋白、伴侶蛋白或酶；或者遺傳修飾蛋白；或者重組蛋白或化學(xué)修飾蛋白和合成蛋白。更優(yōu)選地，載體蛋白為在血液中循環(huán)的蛋白，例如牛血清白蛋白。信號前體分子可為低分子量物質(zhì)，選自熒光團及其衍生物、發(fā)光團及其衍生物、發(fā)色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質(zhì)的氧化還原活性物質(zhì)。優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光團，例如熒光素、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質(zhì)以及小的熒光芳香和雜芳香分子。備選地，低分子量信號前體分子可為發(fā)色團，例如吡唑啉酮、蒽醌、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質(zhì)。最優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光素衍生物，例如熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。高分子量蛋白信號前體分子包括但不限于選自酶及其前體、生物發(fā)光蛋白和熒光蛋白及核酶的高分子量物質(zhì)；選自抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、重組蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和適配體。優(yōu)選地，高分子量信號前體分子為親和分子，例如肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。備選地，高分子量信號前體分子可為酶，例如過氧化物酶、氧化還原酶、連接酶、聚合酶和轉(zhuǎn)移酶。最優(yōu)選地，高分子量信號前體分子為抗生物素蛋白和NeutrAvidin (商標)。親和分子可為生物識別分子，例如肽、蛋白、核酸、碳水化合物、具有低分子量的配體、受體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可為抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應(yīng)原或其部分。單鏈核酸可為DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、適配體及其部分。碳水化合物的實例包括單糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或激素、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、酶的假底物或輔基、藥物、變應(yīng)原或半抗原。特別優(yōu)選的微球形式為這樣的微球形式其中載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)且信號前體分子選自熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。顯示劑適合在活化步驟中“活化”這些熒光素衍生物，例如通過化學(xué)反應(yīng)(例如堿性試劑)或生化反應(yīng)(例如酯酶)將其轉(zhuǎn)化為熒光素，藉此產(chǎn)生可檢測信號。備選地，活化步驟可通過物理方法(例如微波加熱)進行。在第四方面，本發(fā)明提供另一種使用微球檢測樣品中的一種或多種靶分子的信號放大方法，微球包含與第一種信號前體分子結(jié)合的載體蛋白，其中所述第一種信號前體分
子可活化以產(chǎn)生可檢測信號同時保持與載體蛋白結(jié)合，并且所述微球在其表面上具有用于特異性識別和結(jié)合所述靶分子的親和分子，所述方法包括(a)溫育靶分子與所述微球；(b)分離在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球與沒有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球；(C)用釋放劑處理所分離的在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球以分解微球并釋放第一種信號前體分子；(d)用另一批微球處理所釋放的第一種信號前體分子，另一批微球用對所釋放的第一種信號前體分子具有親和力的第二種親和分子功能化，所述微球包含與第二種信號前體分子結(jié)合的載體蛋白，其中所述第二種信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號同時保持與載體蛋白結(jié)合；(e)分離在其表面具有第二種親和分子-第一種信號前體分子復(fù)合物的微球與沒有第二種親和分子-第一種信號前體分子復(fù)合物的微球；(f)用顯示劑處理所分離的在其表面具有第二種親和分子-第一種信號前體分子復(fù)合物的微球以活化第二種信號前體分子產(chǎn)生信號，和(g)檢測或定量信號。因此產(chǎn)生的信號與樣品中靶分子的量有關(guān)。信號在兩個不同階段被放大許多倍，因為對于在溫育步驟(a)期間形成的每個親和分子-靶分子復(fù)合物，存在許多在步驟(C)中被釋放的第一種信號前體分子，然后將第一種信號前體分子與一批被功能化以對第一種信號前體分子具有親和力的不同微球一起溫育。加入從與不同微球一起的復(fù)合物釋放的許多第一種信號前體分子，并在除去沒有與所釋放的第一種信號前體分子形成復(fù)合物的那些微球之后，加入活化劑以活化在每個復(fù)合微球中的許多第二種信號前體分子以產(chǎn)生信號。應(yīng)當(dāng)理解，信號前體分子的這種釋放和再復(fù)合的循環(huán)可重復(fù)許多次以達到非常顯著的放大倍數(shù)。也就是說，在進行步驟(f)和(g)之前，步驟(c)-(e)可重復(fù)l_n次，其中n為正整數(shù)，其中至少在最后重復(fù)循環(huán)中的信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號。靶分子代表第一級分析物；第一種信號前體分子代表第二級分析物，并且第二種信號前體分子代表第三級分析物等。在一個變體中，僅在最后重復(fù)循環(huán)中的信號前體分子需要是可活化的以產(chǎn)生可檢測信號。在早期循環(huán)中釋放的信號前體分子不需要為可活化的以產(chǎn)生可檢測信號，它們可為結(jié)合分子例如抗生物素蛋白，但是被看作是信號前體分子，因為它們是最終導(dǎo)致信號的級聯(lián)反應(yīng)的重要部分?？稍谠摲糯蠓椒ㄖ袚饺敫咧眯哦群涂煽啃?，即通過使用充分理解和廣泛使用的對(例如抗生物素蛋白和生物素)作為前體分子-親和分子對，特別是在所述方法的后期，即在已經(jīng)選擇第一種靶分子-親和分子對適合于待檢測或測定的具體靶標之后。注意，如果最終信號前體分子保持在最終微球內(nèi)結(jié)合并且不被釋放到溶液中，那么在最后放大步驟中信號可為局部的。這使信號的稀釋最小。另一方面，以其未釋放狀態(tài)檢測最終信號前體 分子是不必要的；如果釋放，那么它們也可在溶液中被測定或者也可激發(fā)另一個放大步驟。例如，如果具有高轉(zhuǎn)換率的酶為最終信號前體分子，那么可使得酶能夠?qū)晒饣虬l(fā)光的底物起作用。另一個實例可使用包封FDA作為最終信號前體分子。在加入顯示劑例如氫氧化鈉水溶液時，F(xiàn)DA溶解、水解和釋放大量熒光素分子，并因此提供放大的熒光信號。優(yōu)選地，至少對于在溫育步驟(a)中使用的微球，載體蛋白選自纖維狀蛋白，包括但不限于細胞骨架蛋白或胞外基質(zhì)蛋白；或球狀蛋白或血蛋白，包括但不限于血紅素蛋白、細胞粘附蛋白；或轉(zhuǎn)運蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA結(jié)合蛋白、免疫系統(tǒng)蛋白(包括但不限于單克隆抗體或多克隆抗體)、營養(yǎng)貯藏/轉(zhuǎn)運蛋白、伴侶蛋白或酶；或者遺傳修飾蛋白；或者重組蛋白和合成蛋白。更優(yōu)選地，載體蛋白為在血液中循環(huán)的蛋白，例如牛血清白蛋白。同樣地，至少對于在溫育步驟(a)中使用的微球，信號前體分子可為低分子量物質(zhì)，選自熒光團及其衍生物、發(fā)光團及其衍生物、發(fā)色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質(zhì)的氧化還原活性物質(zhì)。優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光團，例如熒光素、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質(zhì)以及小的熒光芳香和雜芳香分子。備選地，低分子量信號前體分子可為發(fā)色團，例如吡唑啉酮、蒽醌、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質(zhì)。最優(yōu)選地，低分子量信號前體分子為熒光素衍生物，例如熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。高分子量蛋白信號前體分子包括但不限于選自酶及其前體、生物發(fā)光蛋白和熒光蛋白及核酶的高分子量物質(zhì)；選自抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、重組蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和適配體。優(yōu)選地，高分子量信號前體分子為親和分子，例如肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。備選地，高分子量信號前體分子可為酶，例如過氧化物酶、氧化還原酶、連接酶、聚合酶和轉(zhuǎn)移酶。最優(yōu)選地，高分子量信號前體分子為抗生物素蛋白和NeutrAvidin(商標)。至少對于在溫育步驟(a)中使用的微球，親和分子可為生物識別分子，例如特異性肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可為抗體(包括單克隆和多克隆抗體)、受體、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應(yīng)原或其部分。核酸可為DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、適配體及其部分。碳水化合物的實例包括單糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或激素、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、酶的假底物或輔基、藥物、變應(yīng)原或半抗原。特別優(yōu)選的最終微球形式為這樣的微球形式其中載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)且信號前體分子選自熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素異硫氰酸酯(FITC)和熒光素馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。顯示劑適合在活化步驟中“活化”這些熒光素衍生物，通過化學(xué)反應(yīng)(例如使用堿性試劑)，或通過生化反應(yīng)(例如酯酶)將其轉(zhuǎn)化為熒光素，使得產(chǎn)生可檢測信號。用于分解微球并釋放信號前體分子的化學(xué)釋放劑可為小分子還原劑，其有效斷裂微球中的硫-硫鍵(分子間和分子內(nèi))。二硫蘇糖醇(DTT)為特別優(yōu)選的釋放劑。微球的分解也可通過聲處理、高溫、光輻射或PH變化實現(xiàn)。下面參照附圖僅通過實施例描述本發(fā)明，其中圖I為圖解說明用于制造本發(fā)明微球的技術(shù)的示意圖；圖2為本發(fā)明第一方面的蛋白微球的相差顯微圖；圖3顯示具有不同孔隙率的蛋白微球掃描電子顯微鏡圖像；上面一行圖像顯示22000放大率和下面一行圖像顯示150000放大率；圖4為顯示夾心生物測定中信號積累和定位工作原理的示意圖；圖5為用山羊抗小鼠IgG (Gt-a -MIgG)功能化的BSA-FDA微球的固相夾心熒光免疫測定的示意圖；圖6為圖解說明放大循環(huán)原理的示意圖。首先參照

圖1，視圖(a)顯示含有氯化鈣(CaCl2)、載體蛋白和信號前體分子的混合溶液的第一個容器100，和含有碳酸鈉(Na2CO3)溶液的第二個容器200。將兩個容器的內(nèi)容物迅速混合，使得蛋白和信號前體分子Uf^BBSA-FDA)通過共沉淀而被捕獲在支持碳酸鈣(CaCO3)微球模板300中。視圖(b)圖解說明在下一步中所發(fā)生的。將具有所捕獲的蛋白和信號前體分子的CaCO3微球模板300用還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理，其引起蛋白分子中的分子內(nèi)二硫鍵打開。然后，在多個重復(fù)洗滌步驟中除去DTT。在蛋白分子之間形成新的分子間和分子內(nèi)二硫鍵。新形成的分子間二硫鍵有助于蛋白分子裝配成為也含有信號前體分子的微球20。除去CaCO3模板材料，剩下蛋白/信號前體分子微球20而不需要使用化學(xué)交聯(lián)劑?，F(xiàn)轉(zhuǎn)到圖2，這是根據(jù)以上方法生產(chǎn)的蛋白微球的相差顯微圖。它們顯示良好的尺寸均一性，具有與平均值的少許偏差。也重要的是微球帶有相同的表面電荷，使得它們不粘附在一起。在圖中清楚顯示不存在粘附在一起。而且，窄的尺寸分布對于定量分析是重要的。圖3顯示使用在0. Ol-ImM范圍DTT濃度于15-60分鐘時間內(nèi)制備的BSA微球的SEM顯微圖。所得微球直徑相似，微球的表面粗糙度和孔徑隨著DTT濃度降低而增加。較高的DTT濃度導(dǎo)致BSA分子內(nèi)較高程度的分子內(nèi)二硫鍵斷裂，即蛋白分子內(nèi)的游離巰基數(shù)目增加。在通過洗滌除去DTT之后(使用重復(fù)洗滌步驟)，BSA分子內(nèi)的游離巰基自組裝形成新的分子間和分子內(nèi)二硫鍵，分子間二硫鍵有助于形成其在除去碳酸鈣模板后仍然存在的蛋白微球。使用低DTT濃度制造的微球含有較少的分子間二硫鍵并因此為更加多孔的。
現(xiàn)轉(zhuǎn)到圖4，這是顯示在使用本發(fā)明微球的夾心生物測定中信號積累和定位工作原理的示意圖。在視圖(a)中，顯示在其表面具有親和分子50的固相支持體10。微球20在這里表示為含有與信號前體分子40結(jié)合的載體蛋白30的稍扁平的圓。注意這是示意圖并且已經(jīng)給予微球僅用于圖解說明目的的實線邊界。而且，為清楚起見已經(jīng)省略在載體蛋白分子之間的S-S結(jié)合線(以及在載體蛋白分子與信號前體分子之間的鍵)。實際上，微球不是具有實線邊界的膠囊；恰恰相反，其象具有延伸到其內(nèi)部中的孔并由均一分布的相互結(jié)合的載體蛋白分子和信號前體分子形成的微型海綿球。微球20具有在其表面附著的親和分子50。在固相支持體10上的親和分子50之一與微球上的親和分子50之一之間的夾有
靶分子或分析物60。固相支持體可為膜、微量滴定板的孔、磁珠或者更通常為用于免疫或雜交分析的任何固相平臺。在視圖(b)中，顯示通過靶分子60在兩個親和分子50之間的“夾心”仍然附著于固相支持體10的相同微球20。然而，在該視圖中，顯示在用顯示劑處理之后的微球20，并且目前具有用微型太陽符號表示的信號分子40%其中先前其具有用菱形表示的信號前體分子40。簡而言之，圖4(a)顯示關(guān)閉的微球，而圖4(b)顯示點亮的微球。僅為圖解說明的目的，圖4顯示固相支持體10上和微球20表面上的相同類型的親和分子50。然而，在大多數(shù)實際情況中，兩種親和分子不同，除了當(dāng)使用單克隆抗體時或者如果靶分析物具有重復(fù)的表位之外。實際上，許多微球生物標記將在生物測定中特異性結(jié)合各自的靶分析物，這取決于分析物(靶標)分子尺寸和微球尺寸。在免疫學(xué)測定中，微球生物標記將特異性結(jié)合抗原靶分子的表位；在雜交測定中，微球生物標記將結(jié)合特異性DNA序列靶分析物。在加入顯示劑時，在生物標記中的數(shù)百萬信號產(chǎn)生前體分子將轉(zhuǎn)化為高度熒光分子，并且生物標記將點亮并產(chǎn)生局部信號。圖5圖解顯示用山羊抗小鼠IgG (Gt-a -MIgG)功能化的BSA-FDA微球的固相夾心熒光免疫測定。在視圖(a)中，顯示溫育步驟，其中Gt-a-MIgG附著于固相支持體。在步驟(b)中，結(jié)合在固相支持體上的Gt- a -MIgG暴露于含有靶物類或分析物MIgG的溶液。靶物類被所結(jié)合的Gt-a-MIgG捕獲。洗滌步驟(未顯示)除去未被捕獲的靶物類。在步驟(C)中，通過使用由用作為其表面上的親和分子的Gt- a -MIgG功能化BSA-FDA形成的微球處理捕獲的靶物類進行夾心測定。在另一個洗滌步驟(未顯示)中，洗去未與捕獲的靶物類結(jié)合的微球。在步驟(d)中，加入顯示劑并且將FDA水解為熒光素產(chǎn)生可見的局部信號。圖6圖解說明放大循環(huán)原理。在視圖(a)中，顯示通過靶互補核酸30和與微球20’綴合的親和分子50’之間的夾心雜交，單個捕獲分子60在其一端附著于固相支持體10’，而在其另一端附著于微球20’。如圖示地，顯示捕獲分子60作為與靶互補核酸30和與微球20’綴合的親和分子50’雜交的靶核酸。視圖(b)顯示在用引起微球分解的釋放劑處理之后的微球。在該視圖中，微球剛剛開始破裂并釋放多個(X)第二級分析物40’進入溶液中。第二級分析物可為例如抗生物
素蛋白。在視圖(c)中，顯示第二級分析物40’被親和分子50”捕獲在不同的固相支持體10”上。在其中第二級分析物40’為抗生物素蛋白的實例中，親和分子50”可為與白蛋白12”結(jié)合的生物素。在該形式中，其將附著于固相支持體10”。捕獲的第二級分析物40’被夾在與固相支持體10”間接結(jié)合的親和分子50”和與不同微球20”結(jié)合的另一個親和分子50”之間。視圖(d)顯示在用引起微球分解的釋放劑處 理之后的微球20”。在該視圖中，微球剛剛開始破裂并釋放多個第二級分析物40”。因此，單個靶分子60可在放大兩個循環(huán)之后產(chǎn)生千百萬個第二級分析物。視需要，可進行進一步的放大循環(huán)。下面參照各實施例具體描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解這些實施例是非限定性的。實施例I BSA-FDA微球的制各步驟I :BSA框架的形成將BSA(10mg/mL)在氯化鈣(0. 5mol/L)中的溶液與碳酸鈉溶液(0. 5mol/L)迅速混合。碳酸鈣形成并且僅微溶，在碳酸鈣基質(zhì)的核心/內(nèi)部捕獲BSA。碳酸鈣起捕獲BSA的模板的作用。下一步驟是打開BSA分子內(nèi)S-S鍵并形成新的BSA分子間S-S鍵。每一步驟包括若干洗滌和離心循環(huán)。將所得的負載有BSA的碳酸鈣微球與濃度在0. Ol-ImM范圍內(nèi)的二硫蘇糖醇(DTT)溶液(pH 7.5)在室溫下溫育15-60分鐘。隨后，通過離心(2000rpm，2分鐘)和再分散循環(huán)，用緩沖液(pH 7. 4)洗滌負載有BSA的碳酸鈣微球5次。加入DTT引起B(yǎng)SA中分子內(nèi)硫-硫鍵還原/斷裂，同時在這些洗滌步驟中除去DTT導(dǎo)致在BSA分子之間形成新的分子內(nèi)和分子間硫-硫鍵以將蛋白保持在一起并形成微球。步驟2 :信號分子與BSA框架-基質(zhì)的結(jié)合向重懸的含有碳酸鈣的微球中加入熒光素二乙酸-5-異硫氰酸酯(lmg/mL)，并于室溫下溫育反應(yīng)混合物I小時，以在BSA氨基和熒光素二乙酸酯的硫氰酸酯之間形成共價鍵。St印3 :BSA-FDA微球的功能化使用EDC/NHS化學(xué)進行山羊抗小鼠抗體與帶有信號分子的微球的結(jié)合。步驟3. I :親和分子的溶液制備將含有山羊抗小鼠IgG的溶液(0. 2mg/mL)加入到含1_乙基_3_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)分別為2mM和5mM的pH 7. 4的MES緩沖液中。在振蕩下使溶液于室溫反應(yīng)15分鐘。步驟3. 2 :帶有抗體的微球的功能化在溫育15分鐘后，將用于結(jié)合山羊抗小鼠IgG的活化親和分子的溶液加入到預(yù)洗滌的BSA-FDA微球的懸浮液中，并在振蕩下使混合物于室溫反應(yīng)2小時。將與BSA-FDA微球結(jié)合的親和分子的溶液于1800rpm下離心2分鐘。
除去上清液并用2mL的MES緩沖液(pH 7. 4)重懸沉淀。用MES緩沖液(pH 7. 4)將親和分子功能化的BSA-FD微球洗滌3次，并重懸于2mL的MES緩沖液(pH 7.4)中。步驟4 :碳酸鈣模板的除去然后將IOmL的0. 2M EDTA加入到BSA-FDA微球懸浮液中，并攪拌整個體系5分鐘。EDTA處理從微球除去碳酸鈣基質(zhì)。然后使反應(yīng)混合物于室溫下在3000rpm下經(jīng)歷離心2分鐘。除去上清液，并將抗體功能化的BSA-FDA-微球沉淀重懸于2mL的MES緩沖液(pH7. 4)中。實施例2 使用藻酸鈣基質(zhì)形成劑的BSA框架的形成將BSA(10mg/mL)在氯化I丐(0. 5mol/L)中的溶液與藻酸鈉(0. 5mol/L)溶液迅速混合。藻酸鈣形成并且僅微溶，在碳酸鈣基質(zhì)的核心/內(nèi)部捕獲BSA。藻酸鈣起捕獲BSA的模板的作用。下一步驟是打開BSA分子內(nèi)S-S鍵并形成新的BSA分子間S-S鍵。每一步驟包括若干洗滌和離心循環(huán)。將所得的負載有BSA的藻酸鈣微球與濃度在0. Ol-ImM范圍內(nèi)的二硫蘇糖醇(DTT)溶液(pH 7.5)在室溫下溫育15-60分鐘。隨后，通過離心(2000rpm，2分鐘)和再分散循環(huán)，用緩沖液(pH 7. 4)洗滌負載有BSA的藻酸鈣微球5次。加入DTT引起B(yǎng)SA中分子內(nèi)硫-硫鍵的還原/斷裂，同時在這些洗滌步驟中除去DTT導(dǎo)致在BSA分子之間形成新的分子內(nèi)和分子間硫-硫鍵以將蛋白保持在一起并形成微球。實施例3 測定小鼠-IgG的夾心型測定在夾心型測定中進行小鼠IgG的測定。在測定期間，小鼠IgG特異性結(jié)合在2種抗體之間。因為使用多克隆山羊抗體，所以抗體相同。用山羊抗小鼠IgG抗體吸附性包被固相(例如微量滴定板的孔)。第二種抗體為與BSA-FDA微球結(jié)合的山羊抗小鼠。該實施例概略性地示于圖5。將100 ii L的Gt- a -MIgG (2ng/ U L的包被緩沖液)轉(zhuǎn)移至微量滴定板并于4°C下溫育過夜。然后用洗滌緩沖液(IOmM PBS, 0. 1% (w/v)BSA,0. 5% (w/v) Tween-20 (Tween %商標))洗漆微量滴定板3次。然后用300 ii L的后包被溶液(post coating solution, PCS)于37°C下將孔封閉30分鐘。將不同濃度(1-100 u g/L)的100 y L的MIgG分別加至各孔中，并于37°C下溫育I小時。在洗去未結(jié)合的MIgG后，將Gt-a-MIgG-{BSA-FDA微球}的懸浮液分配到孔(100 y L/孔)中，并將微量滴定板于37°C下再次溫育I小時。在溫育后，用洗滌緩沖液洗去過量的Gt- a -MIgG- {BSA-FDA微球}。然后將100 u L釋放溶液的等分試樣加至每孔中，并測量各孔的熒光強度。實施例4 抗生物素蛋白微球的制備實施例4為其中載體蛋白和親和結(jié)合分子為一個和相同分子的實施例。步驟I :抗生物素蛋白框架的形成
將抗生物素蛋白(10mg/mL)在氯化鈣(0. 5mol/L)中的溶液與碳酸鈉溶液(0. 5mol/L)迅速混合。碳酸鈣形成并且僅微溶，沉淀并在其所形成的結(jié)晶表面上吸引/吸附抗生物素蛋白。碳酸鈣起用于沉淀抗生物素蛋白的模板的作用。下一步驟是通過打開其分子內(nèi)S-S鍵并形成抗生物素蛋白分子間S-S鍵來交聯(lián)抗生物素蛋白。每一步驟包括若干洗滌和離心循環(huán)。將所得的負載有抗生物素蛋白的碳酸鈣微球與濃度在0. Ol-ImM范圍內(nèi)的二硫蘇糖醇(DTT)溶液(pH 7. 5)在室溫下溫育15-60分鐘。隨后，通過離心(2000rpm，2分鐘)和再分散循環(huán)，用緩沖液(PH 7.4)洗滌負載有抗生物素蛋白的碳酸鈣微球5次。加入DTT引起抗生物素蛋白中分子內(nèi)硫-硫鍵還原/斷裂，同時在這些洗滌步驟中除去DTT導(dǎo)致在抗生物素蛋白分子之間形成分子內(nèi)和分子間硫-硫鍵以將蛋白保持在一起并形成微球。蛋白質(zhì)中被還原的SH鍵經(jīng)歷自組裝形成新的分子內(nèi)和分子間硫-硫鍵。步驟2:信號分子的功能化這通過仍不存在親和結(jié)合分子的條件下使特異性檢測分子(親和分子)與含有游離氨基、SH和羧基的抗生物素蛋白結(jié)合來實現(xiàn)，抗生物素蛋白用于使親和分子與微球共價
彡口口 對于含有抗生物素蛋白的微球的功能化步驟的詳情參見上文實施例2。對于鏈霉親和素或去糖基化抗生物素蛋白，例如NeutrAvidin (商標)，功能化步驟簡單得多，因為它們直接結(jié)合靶標(分析物)_識別分子，即結(jié)合親和分子。如果使用鏈霉親和素或NeutrAvidin (商標)，那么正常生物素化的親和分子(例如生物素化抗體)通過鏈霉親和素對生物素的強結(jié)合力(K約為IO16)與鏈霉親和素或NeutrAvidin (商標)直接結(jié)合。因此，使用例如EDC/NHS的化學(xué)綴合是不必要的。步驟3 :碳酸鈣溶出微球這通過將EDTA(0. 2mol/L)加入到抗生物素蛋白微球的懸浮液中來進行。在該步驟之后，已制備抗生物素蛋白信號前體微球。值得注意的是，如同在上文實施例I中，可在功能化步驟之前進行除去碳酸鈣模板的步驟。實施例5 固相直接測定(雙重放大系統(tǒng)，DNA測定模型隨后是生物素/抗生物素蛋白模型)這是一個其中載體蛋白和親和結(jié)合分子為一個和相同分子的實施例，并證實其在新的信號放大循環(huán)技術(shù)中的效用。該實施例概略性地示于圖6。在夾心型測定中進行人乳頭瘤病毒(HPV)DNA的測定。在測定HPV期間，DNA-鏈與其生物素化互補核酸特異性雜交。然后使該雜交產(chǎn)物與由NeutrAvidin (商標)制成的微球反應(yīng)。加入引起抗生物素蛋白微球分解的釋放劑，以使抗生物素蛋白釋放到溶液中。然后在隨后的固相直接測定中將釋放的抗生物素蛋白作為分析物處理。 步驟I :固相直接測定A (HPV DNA模型)將100 ii L的HPV探針(HPV 16)轉(zhuǎn)移至微量滴定板孔中，并于4°C下溫育過夜。然后用300 u L的洗滌緩沖液將微量滴定板洗滌5次。然后用300 u L的封閉溶液于37°C下將孔封閉30分鐘。然后用300 u L洗滌緩沖液將微量滴定板洗滌5次。將30 ii L的IM NaOH和不同稀釋度的50 ii L的PCR (生物素化HPV-病毒-DNA)產(chǎn)物分別加至各孔中，使其于室溫下靜置10分鐘。然后加入50 L的中和緩沖液，并在水槽(wet box)中于65°C下溫育30分鐘。然后用300 u L的洗滌緩沖液將微量滴定板洗滌5次。將100 u L的抗生物素蛋白微球分別加入到各孔中，并于37°C下溫育30分鐘。在溫育后取出板，并用DNA洗滌緩沖液洗滌5次。將120 u L的濃度在0. Ol-ImM范圍內(nèi)的二硫蘇糖醇(DTT)溶液(pH 7. 5)加至各孔中，并于室溫下靜置15-60分鐘。加入DTT引起抗生物素蛋白中分子間硫-硫鍵的還原/斷裂，使得微球能夠分解并將抗生物素蛋白釋放到溶液中。釋放的抗生物素蛋白分子變成分析物(“第二級分析物”)，用于隨后的固相測定(生物素/抗生物素蛋白模型)。
步驟2 :固相直接測定B(生物素/抗生物素蛋白模型)在4°C下將IOOii L的BSA-生物素(2ng/ii L的包被緩沖液)直接涂布到在0. lmol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)中的Nunc Maxisorp 96-孔微量滴定板(Nunc為NuncInternational, Rochester, NY 的商標)上過夜。在用洗漆緩沖液(IOmM PBS, 0. I % (w/v)BSA,0. 5% (w/v) Tween-20 (Tween 為商標))沖洗 3 次之后，用 300 u L 的 I. 0% BSA 溶液于37°C下將孔封閉半小時。然后將板洗滌4次，并將相應(yīng)的“第二級分析物”(抗生物素蛋白)的溶液分配到各孔(100 y L/孔)中。于37°C下再次溫育微量滴定板I小時。在洗去未結(jié)合的第二級分析物之后，將生物素-FDA微球懸浮液分配到各孔中(100 U L/孔)，并于37°C下將微量滴定板再次溫育I小時。在溫育之后，用洗滌緩沖液洗去過量的生物素-FDA微球。然后每孔加入100 UL顯示劑的等分試樣，用于熒光強度的測量。如根據(jù)上文顯而易見的，本發(fā)明為通用和有用的。系統(tǒng)始終使用簡單化學(xué)/生物化學(xué)和溫和條件。制備時間不長并且在放大方案中，可實現(xiàn)許多多重放大而無高技術(shù)要求(例如需要使用PCR)。微球技術(shù)可用于廣泛種類的檢測形式，包括但不限于流通裝置、微流裝置和側(cè)流裝置。其也可與珠(磁珠和非磁珠兩者)和微量滴定板孔一起使用。另一種應(yīng)用為在免疫化學(xué)、組織學(xué)領(lǐng)域中以及在用于檢測細胞結(jié)構(gòu)或者其另外條帶的蛋白質(zhì)印跡、DNA印跡和RNA印跡中使用這些信號分子，所述細胞結(jié)構(gòu)或者其另外條帶迄今無法檢測，因為例如FITC-標記的親和分子在其分析靈敏度限度內(nèi)起作用。本發(fā)明信號微球的使用在免疫化學(xué)、組織學(xué)及所有各種形式的檢測技術(shù)中開啟了新的可能性。經(jīng)典的檢測原理可非常容易地改進數(shù)個數(shù)量級。因此，本發(fā)明也可提供用于檢測和/或測定樣品中的靶分子的各種測試試劑盒，所述試劑盒包含含有與信號前體分子鍵合的載體蛋白的微球，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，同時保持與載體蛋白鍵合，所述微球適于在表面攜帶用于特異性識別和結(jié)合靶分子的親和分子。另一種試劑盒形式可進一步包含用于修飾親和分子以使其適于與微球表面結(jié)合的試劑和用于在微球與親和分子之間進行結(jié)合反應(yīng)的試劑。另一種測試試劑盒形式可包含這種類型的測試裝置，例如側(cè)流裝置、流通裝置或者測桿裝置其中將待分析的流體樣品加到測試裝置的吸附材料一端。流體通過毛細作用力遷移至另一端，毛細作用力任選通過位于所述另一端的吸墊增強。用微球(含有信號產(chǎn)生物質(zhì))標記的檢測抗體在測試裝置的起始點松散地過量結(jié)合。
信號產(chǎn)生物質(zhì)可為熒光染料、染色滲透液、生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、磁性物質(zhì)或酶。來自樣品的抗原與檢測抗體相互作用并攜帶微球遷移至裝置另一端。在吸墊附近的指示劑區(qū)域(點或帶)中用捕獲抗體形成夾心。在此，捕獲抗體更緊密地與吸附材料結(jié)合，因而不能遷移。分析物在樣品中存在越多，夾心結(jié)構(gòu)形成越多，并且在指示劑區(qū)域中結(jié)合微球越多。取決于信號前體分子的結(jié)構(gòu)，信號產(chǎn)生物質(zhì)可通過各種方法活化。例如，對于用作信號前體的FDA，應(yīng)可能將整個裝置浸入堿性活化溶液中或者將堿性活化劑滴加到指示劑區(qū)域上。一部分檢測抗體(用微球標記)不與指示劑區(qū)域結(jié)合，并進行遷移。置于指示劑區(qū)域后面的對照區(qū)域顯示固相反應(yīng)是否正常工作。使用競爭測定原理，可改變基于夾心樣固相/膜的技術(shù)用于低分子量物質(zhì)。可對本發(fā)明進行各種改進而不偏離隨后權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.微球，微球包含 (i)蛋白信號前體分子，或 (ii)與信號前體分子鍵合的載體蛋白， 其中所述微球在蛋白分子之間具有分子間鍵，所述微球通過包括以下步驟的方法形成 將蛋白分子與基質(zhì)形成劑在溶液中混合； 將還原劑加入混合物中； 除去所述還原劑； 加入基質(zhì)除去劑，和 除去基質(zhì)以留下蛋白分子的微球。
2.權(quán)利要求I的微球，其中所述蛋白信號前體分子為用于與靶標結(jié)合的親和分子。
3.權(quán)利要求I的微球，所述微球還在表面上包含用于與靶標結(jié)合的親和分子。
4.權(quán)利要求I的微球，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，同時保持結(jié)合在所述微球中。
5.權(quán)利要求I的微球，其中所述載體蛋白選自纖維狀蛋白，包括但不限于細胞骨架蛋白或胞外基質(zhì)蛋白；或球狀蛋白、血蛋白、血紅素蛋白、細胞粘附蛋白、或轉(zhuǎn)運蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA結(jié)合蛋白、免疫系統(tǒng)蛋白、單克隆抗體或多克隆抗體、營養(yǎng)貯藏/轉(zhuǎn)運蛋白、伴侶蛋白或酶；或者遺傳修飾蛋白；或者重組蛋白或化學(xué)修飾蛋白和合成蛋白。
6.權(quán)利要求5的微球，其中所述載體蛋白為血蛋白。
7.權(quán)利要求5或6的微球，其中所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
8.前述權(quán)利要求中任一項的微球，其中所述信號前體分子為低分子量物質(zhì)，選自突光團及其衍生物、發(fā)光團及其衍生物、發(fā)色團及其衍生物、酶底物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質(zhì)的氧化還原活性物質(zhì)；或者為高分子量物質(zhì)，選自酶及其前體、生物發(fā)光蛋白和熒光蛋白、核酸、核酶和適配體。
9.權(quán)利要求8的微球，其中所述信號前體分子為熒光團。
10.權(quán)利要求8的微球，其中所述熒光團選自熒光素、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的突光物質(zhì)以及小的突光芳香和雜芳香分子。
11.權(quán)利要求10的微球,其中所述突光團選自突光素二乙酸酯(FDA)、突光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。
12.權(quán)利要求8的微球，其中所述信號前體分子為發(fā)色團。
13.權(quán)利要求12的微球，其中所述發(fā)色團選自花青、吡唑啉酮、蒽醌、碳花青、若丹明、咕噸、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質(zhì)。
14.權(quán)利要求2或3或從屬于權(quán)利要求2或3的權(quán)利要求4-13中任一項的微球，其中所述親和分子為生物識別分子。
15.權(quán)利要求14的微球，其中所述親和分子選自肽和蛋白、核酸鏈、碳水化合物、具有低分子量的配體和分子印記聚合物(MIP)或其混合物。
16.權(quán)利要求15的微球，其中肽或蛋白選自包括單克隆和多克隆抗體在內(nèi)的抗體、受體、抗原、重組蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應(yīng)原或其部分。
17.權(quán)利要求15的微球，其中所述核酸選自DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、適配體及其部分。
18.權(quán)利要求15的微球，其中所述碳水化合物選自單糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。
19.權(quán)利要求15的微球，其中所述低分子量配體為生物素或生物素衍生物、類固醇或激素、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、酶的假底物或輔基、藥物、變應(yīng)原或半抗原。
20.權(quán)利要求15的微球，當(dāng)從屬于權(quán)利要求3時，其中所述親和分子與所述微球綴合或者直接或通過連接分子與所述微球結(jié)合。
21.權(quán)利要求15的微球，當(dāng)從屬于權(quán)利要求3時，其中所述親和分子通過物理吸附與所述微球綴合。
22.權(quán)利要求21的微球，其中所述連接體選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、去糖基化抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交聯(lián)劑。
23.前述權(quán)利要求中任一項的微球，所述微球具有在IOnm-Imm范圍內(nèi)的尺寸。
24.權(quán)利要求23的微球，所述微球具有在400nm-10y m范圍內(nèi)的尺寸。
25.權(quán)利要求I的微球，其中所述蛋白為載體蛋白，所述微球通過使信號前體分子與所述載體蛋白鍵合而形成。
26.權(quán)利要求25的微球，其中所述載體蛋白和所述信號前體分子通過共價綴合、物理吸附或經(jīng)連接分子結(jié)合。
27.權(quán)利要求25或26的微球，其中所述載體蛋白為權(quán)利要求5-7任一項中定義的載體蛋白。
28.權(quán)利要求25-27中任一項的微球,其中所述信號前體分子如權(quán)利要求8-13的任一項中所定義。
29.權(quán)利要求25-28中任一項的微球，所述微球通過使親和分子附著于所述微球表面的另外步驟產(chǎn)生。
30.權(quán)利要求29的微球，其中所述親和分子通過物理吸附或直接化學(xué)綴合與所述微球綴合或結(jié)合。
31.權(quán)利要求29的微球，其中所述親和分子與所述微球綴合或者通過連接分子與所述微球結(jié)合。
32.權(quán)利要求31的微球，其中所述連接分子選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、去糖基化抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交聯(lián)劑。
33.權(quán)利要求29-32中任一項的微球，其中所述親和分子如權(quán)利要求14-19的任一項中所定義。
34.權(quán)利要求1-33中任一項的微球，其中所述基質(zhì)形成劑選自碳酸鈣、藻酸鈣、多孔二氧化硅和寡糖或多糖。
35.權(quán)利要求34的微球，其中所述基質(zhì)形成劑為碳酸鈣。
36.權(quán)利要求35的微球，其中所述碳酸鈣通過將碳酸鈉溶液加入蛋白和氯化鈣在溶液中的混合物中形成。
37.權(quán)利要求1-36中任一項的微球，其中所述基質(zhì)除去劑選自螯合劑、EDTA、酸或堿。
38.權(quán)利要求1-36中任一項的微球，其中所述還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
39.一種產(chǎn)生蛋白微球的方法，所述方法包括 將蛋白分子與基質(zhì)形成劑在溶液中混合； 將還原劑加入混合物中； 除去所述還原劑；和 除去基質(zhì)以留下蛋白分子的微球。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)通過選自高溫處理或pH變化的物理方法除去。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述除去基質(zhì)的步驟包括加入基質(zhì)除去劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述基質(zhì)除去劑選自螯合劑、EDTA、酸或堿。
43.權(quán)利要求39-42中任一項的方法，其中所述還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
44.權(quán)利要求39-43中任一項的方法，其中所述基質(zhì)形成劑選自碳酸鈣、藻酸鈣、多孔二氧化硅和寡糖或多糖。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述基質(zhì)形成劑為碳酸鈣。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述碳酸鈣通過將碳酸鈉溶液加入蛋白和氯化鈣在溶液中的混合物中形成。
47.權(quán)利要求39-46中任一項的方法，其中所述蛋白分子為用于與溶液中的靶標結(jié)合的未和分子。
48.權(quán)利要求39-46中任一項的方法，其中所述蛋白為載體蛋白，且所述方法還包括使 信號前體分子與所述載體蛋白鍵合。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述載體蛋白和所述信號前體分子通過共價綴合、物理吸附或經(jīng)連接分子結(jié)合。
50.權(quán)利要求48或49的方法,其中所述載體蛋白為權(quán)利要求5-7的任一項中定義的載體蛋白。
51.權(quán)利要求48-50中任一項的方法,其中所述信號前體分子如權(quán)利要求8-13的任一項中所定義。
52.權(quán)利要求48-51中任一項的方法,所述方法還包括使親和分子附著于所述微球表面的步驟。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述親和分子通過物理吸附或直接化學(xué)綴合與所述微球綴合或結(jié)合。
54.權(quán)利要求52的方法，所述方法包括將所述親和分子與所述微球綴合或通過連接分子與所述微球結(jié)合。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述連接分子選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、去糖基化抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交聯(lián)劑。
56.權(quán)利要求47或52-55中任一項的方法，其中所述親和分子如權(quán)利要求14-19的任一項中所定義。
57.一種用于使用微球檢測樣品中的一種或多種靶分子的方法，所述微球包含與信號前體分子鍵合的載體蛋白，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，同時保持與所述載體蛋白鍵合，并且所述微球在其表面具有用于特異性識別和結(jié)合所述靶分子的親和分子，所述方法包括 (a)溫育所述靶分子與所述微球；(b)分離在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球與沒有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球； (c)用顯示劑處理所分離的在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球以活化信號前體分子產(chǎn)生信號，和 (d)檢測或定量信號。
58.權(quán)利要求57的方法，其中當(dāng)從屬于權(quán)利要求3時，所述微球如權(quán)利要求3或4-24的任一項中所定義。
59.權(quán)利要求57或58的方法，其中所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，且信號前體分子為熒光素二乙酸酯(FDA)。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述顯示劑為堿或酯酶。
61.一種使用第一種微球檢測樣品中的一種或多種靶分子的信號放大方法，所述第一種微球包含與信號前體分子結(jié)合的載體蛋白，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，同時保持與所述載體蛋白結(jié)合，并且所述微球在其表面具有用于特異性識別和結(jié)合所述靶分子的親和分子，所述方法包括 (a)溫育所述靶分子與所述微球； (b)分離在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球與沒有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球； (C)處理所分離的在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球以分解微球并釋放信號前體分子； (d)用第二種微球處理所釋放的信號前體分子，所述第二種微球用對所述釋放的信號前體分子具有親和力的另外的親和分子功能化，所述第二種微球包含與另外的信號前體分子結(jié)合的載體蛋白，其中所述另外的信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，同時保持與所述載體蛋白結(jié)合； (e)分離在其表面具有另外的親和分子-信號前體分子復(fù)合物的微球與沒有另外的親和分子-信號前體分子復(fù)合物的微球； (f)用顯示劑處理所分離的在其表面具有另外的親和分子-信號前體分子復(fù)合物的微球以活化另外的第二種信號前體分子產(chǎn)生信號，和 (g)檢測或定量信號。
62.權(quán)利要求61的方法，所述方法還包括在進行步驟⑴和(g)之前，重復(fù)步驟(c)-(e) 1-n次，其中n為正整數(shù)。
63.一種使用第一種微球檢測樣品中的一種或多種靶分子的信號放大方法，所述第一種微球包含與所述信號前體分子結(jié)合的載體蛋白，其中所述微球在其表面具有用于特異性識別和結(jié)合所述靶分子的親和分子，所述方法包括 (a)溫育所述靶分子與所述微球； (b)分離在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球與沒有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球； (C)處理所分離的在其表面具有親和分子-靶分子復(fù)合物的微球以分解所述微球并釋放所述信號前體分子； (d)用另外的微球處理所釋放的信號前體分子，所述另外的微球用對所述信號前體分子具有親和力的另外的親和分子功能化，所述微球包含與另外的信號前體分子結(jié)合的載體蛋白； (e)分離在其表面具有另外的親和分子-信號前體分子復(fù)合物的微球與沒有另外的親和分子-信號分子復(fù)合物的微球； (f)用顯示劑處理所釋放的在其表面具有另外的親和分子-信號前體分子復(fù)合物的微球以活化另外的信號前體分子產(chǎn)生信號，和 (g)檢測或定量信號。
64.權(quán)利要求63的方法，所述方法還包括在進行步驟⑴和(g)之前，重復(fù)步驟(c)-(e) 1-n次，其中n為正整數(shù)，其中至少最后重復(fù)循環(huán)中的所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號。
65.權(quán)利要求61-64中任一項的方法，其中所述微球的分解通過化學(xué)、物理或熱方法進行。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述微球的分解通過使用斷裂所述微球中分子間鍵的釋放劑的化學(xué)方法進行。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述釋放劑斷裂所述微球中蛋白分子之間的分子間硫-硫鍵。
68.權(quán)利要求66或67的方法，其中所述釋放劑為小分子還原劑。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述釋放劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
70.權(quán)利要求65的方法，其中所述微球的分解通過聲處理、加熱、光輻射或通過變化pH來進行。
71.權(quán)利要求61-70中任一項的方法,其中至少所述第一種微球如權(quán)利要求3或從屬于權(quán)利要求3的權(quán)利要求4-24的任一項中所定義。
72.權(quán)利要求61-70中任一項的方法,其中至少一個放大循環(huán)使用包封信號產(chǎn)生有機物質(zhì)的固體顆粒并在外表面攜帶用于特異性識別和結(jié)合靶分子的親和分子的膠囊。
73.權(quán)利要求62和64-71中任一項的方法，其中至少在最終微球中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，且所述信號前體分子為熒光素二乙酸酯(FDA)。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述顯示劑為堿或酯酶。
75.一種用于檢測樣品中靶分子的試劑盒，所述試劑盒包含在權(quán)利要求I或從屬于權(quán)利要求I的權(quán)利要求4-13中任一項的微球，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，所述微球適于在表面攜帶用于特異性識別和結(jié)合靶分子的親和分子。
76.權(quán)利要求75的試劑盒，所述試劑盒還包含用于修飾親和分子使其能夠與微球表面結(jié)合的試劑和用于在微球與親和分子之間進行結(jié)合反應(yīng)的試劑。
77.權(quán)利要求75或76的試劑盒，所述試劑盒包含選自膜、微量滴定板、珠、管和玻片的固體基底。
78.權(quán)利要求75-77中任一項的試劑盒，其中所述信號前體分子包括熒光染料、染色滲透液、生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、磁性物質(zhì)或酶。
79.權(quán)利要求1-24中任一項的微球在用于以下領(lǐng)域中檢測和/或測定樣品中的一種或多種靶分子的分析方法中的用途研究；人和獸醫(yī)診斷領(lǐng)域、法醫(yī)診斷；環(huán)境分析、食品分析；和生物防御篩選靶物質(zhì)。
80.權(quán)利要求1-24中任一項的微球在異相和固相膜測定中的用途。
81.權(quán)利要求1-24中任一項的微球在免疫組織化學(xué)中的用途。
82.權(quán)利要求1-24中任一項的微球在用于使特異性蛋白帶、DNA和RNA序列的存在可視化的蛋白質(zhì)印跡、RNA印跡和DNA印跡及斑點技術(shù)中的用途。
83.權(quán)利要求1-24中任一項的微球用于放大分析靈敏度的序貫用途。
84.權(quán)利要求I的微球，所述微球基本上如本文參照附3所述。
85.權(quán)利要求39的產(chǎn)生微球的方法，所述方法基本上如本文參照實施例I所述。
86.權(quán)利要求57的用于檢測樣品中一種或多種靶分子的方法，所述方法基本上如本文參照附4或圖5所述。
87.權(quán)利要求61或63的用于檢測樣品中一種或多種祀分子的信號放大方法,所述方法基本上如本文參照圖6所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含蛋白信號前體分子或與信號前體分子鍵合的載體蛋白的微球，其中所述信號前體分子可活化以產(chǎn)生可檢測信號，同時保持與載體蛋白結(jié)合。也公開了制造這樣微球的方法，所述方法包括以下步驟將蛋白分子與基質(zhì)形成劑在溶液中混合；將還原劑加入混合物中；除去還原劑；和除去基質(zhì)形成劑以留下蛋白分子微球。也公開了使用微球提供信號放大生物測定方法，所述方法包括放大循環(huán)步驟。
文檔編號G01N33/68GK102803962SQ201080026352
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者麥永昌, 王礽慧, P·Y·C·陳, R·任能博 申請人:超新星診斷公司