專利名稱：一種奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學檢驗技術，具體說就是一種奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診斷試劑品.O背景技術：
自1896年G. Widal和A. Sicad應用凝集反應診斷傷寒起，免疫學就與醫(yī)學檢驗結(jié) 下不解之緣，至今已經(jīng)歷了一個世紀。隨著免疫學技術的發(fā)展，免疫學檢驗已成為獸醫(yī)臨床 檢驗中的一個重要部分。免疫學檢驗的檢測對象是具有免疫活性的物質(zhì)，內(nèi)容包括檢測方法和臨床意義。 免疫學檢驗可分為細胞免疫檢驗和體液免疫檢驗兩大類，免疫活性細胞及其功能的檢測屬 于前者，抗原、抗體、補體等的檢測屬于后者。近年來免疫學檢驗飛躍發(fā)展，在各種疾病的診斷和防治中起著日益重要的作用。 免疫學檢驗在傳染病的診斷中應用廣泛，大部分傳染病病原體及其抗體的檢測已在實驗室 中作為常規(guī)檢驗。由于新技術的發(fā)展，許多與免疫無關的物質(zhì)亦可作為免疫原而制備其相 應抗體并用于這些物質(zhì)的測定。利用抗原體反應來測定標本中微量物質(zhì)的方法稱為免疫測 定(immunoassay)。免疫測定具有高度的特異性和敏感性，在臨床檢驗中已用于測定各種蛋 白質(zhì)、酶、激素、藥物等?？乖c抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩中分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性，這兩種特 性是由抗原與抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的?？乖贵w反應可分為兩個階段。第一為抗原 與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應。第 二為可見反應階段，抗原抗體復合物在環(huán)境因素(如電解質(zhì)、pH、溫度、補體)的影響下，進 一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補體結(jié)合介導的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應。此 階段反應慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時。實際上這兩個階段以嚴格區(qū)分，而且兩階段的反應 所需時間亦受多種因素和反應條件的影響，若反應開始時抗原抗體濃度較大且兩者比較適 合，則很快能形成可見反應。隱性子宮內(nèi)膜炎由于臨床診斷困難，而且潛在的危害性嚴重，所以近年來，國內(nèi)外 不少學者都在探索對該病的快速、早期、簡易診斷方法，同時也獲得了很大進展，如沖洗液 沉淀法，是將子宮內(nèi)沖洗回流液靜置后發(fā)現(xiàn)有沉淀物，或見到蛋白樣或絮狀物浮游時，可作 出初步診斷，但本方法的主觀性較強一些，因為對于沉淀物性狀的判斷因檢驗者的視覺不 同而不一樣。隱性子宮內(nèi)膜炎是子宮內(nèi)膜慢性的不明顯的炎癥過程，而且子宮內(nèi)膜上有大量的 嗜中性粒細胞浸潤，這個炎癥過程抑制了奶牛的繁殖力。認為嗜中性粒細胞的比例“相對 較高”的判定標準，取決于采樣的技術及分娩的時間。國外學者通過對分娩后臨床表現(xiàn)正 常的、泌乳20-30天奶牛的研究，證實子宮內(nèi)膜的細胞學與超聲波檢查可作為隱性子宮內(nèi) 膜炎的診斷工具。包括直腸觸診、子宮內(nèi)膜細胞學檢查和超聲波檢查在內(nèi)的檢查要在第一 次檢查后的兩周重新作一次，例如在泌乳的34-47d。用于子宮內(nèi)膜細胞學分析樣本的采集是通過改良的應用于細胞刷技術獲得，在顯微鏡的載玻片上轉(zhuǎn)動、固定、用經(jīng)過改良的瑞 士-姬姆薩染色液染色。與相對較低的妊娠率有關的因素已經(jīng)被確定并可以作為診斷隱性 子宮內(nèi)膜炎的標準(1)泌乳20-33天確定子宮內(nèi)膜PMN(中性粒細胞)的數(shù)量> 18%; (2) 泌乳34-47天確定子宮內(nèi)膜PMN的數(shù)量> 10% ； (3)子宮內(nèi)液體可做任何檢查。Gilbert 等000 應用另一種技術，從泌乳40-60天的奶牛子宮沖洗液中獲取子宮內(nèi)膜細胞樣本。 由于樣本是2-5ml的液體，所以在染色前必須重新懸浮樣本并通過細胞涂片離心機轉(zhuǎn)移到 顯微鏡的載玻片上。采用瑞士-姬姆薩染色，PMN的下限是5%，作為診斷隱性子宮內(nèi)膜炎 的標準。Foldi等認為子宮的直腸檢查對隱性子宮內(nèi)膜炎沒有診斷價值。IIIh π η Ji0 B 等報道，可用精液作生物學診斷，在加溫(38°C)的載玻片上分開滴2滴精液，將子宮分泌 的粘液加入其中的一滴精液中，用干凈蓋玻片蓋住兩個液滴，置顯微鏡下觀察，如果精子在 粘液中逐漸不運動或被凝集，說明發(fā)生了隱性子宮內(nèi)膜炎。金子一幸等報道，可通過檢查 發(fā)情期子宮頸口粘液中的白細胞診斷隱性子宮內(nèi)膜炎，即取發(fā)情期宮頸外口粘液，涂片，晾 干，姬姆薩染色后鏡檢，全視野無白細胞為(_)，散在點狀存在為(+)，全視野中有白細胞密 集者為(+++)，介于⑴和(+++)為(++)。ra B ρ HIU報道，用牛尿液與硝酸銀作用可診 斷隱性子宮內(nèi)膜炎，方法是取被檢牛尿液2ml放入清潔的試管里，加入5%硝酸銀溶液lml， 加熱煮沸anin，試管底部有黑色沉淀物的為陽性反應，褐色或色澤較淡的為陰性反應。對于以上所述對隱性子宮內(nèi)膜炎的檢測方法，直腸觸診、超聲波檢查都需要檢測 者具有一定的臨床經(jīng)驗和具備一定的技術操作知識，同時直腸檢查還容易導致奶牛受到驚 嚇，產(chǎn)生應激，從而影響檢測結(jié)果。而對子宮分泌物所作的細胞學檢查，同樣也會對奶牛造 成應激反應，同時如果操作不當還可能破壞陰道組織，或?qū)⑼庠葱灾虏【鷰胱訉m體內(nèi)。對 于進行細胞學檢查的操作人員要求能夠識別中性粒細胞及其染色技術。IUH Π H JT0 B等 提出用精液所作的生物學診斷，操作雖然簡便，但對精液的溫度控制不容易掌握。而對于 Fa B ρ Hm等所采用的尿液與硝酸銀反應的方法，其缺點在于樣品不易采集，奶牛的排 尿隨意性很大，所以不容易操作。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準確、簡潔、方便的奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診 斷試劑盒。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的它是利用SAA、IL-6和IL_8的標準抗體包被酶標板， 用新型單克隆抗體作競爭抗體，用辣根過氧化物酶標記二抗，配制血清稀釋液、洗滌液、底 物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成；1. SAA、IL-6 和 IL-8 抗體的制備(1)抗原的獲得與動物接種將E. coli進行原核培養(yǎng)，通過M柱分離純化，然后用弗氏完全佐劑乳化的抗原在 家兔的背部進行多點皮內(nèi)注射，每點需要注射0. Iml左右，共注射0. 5ml，2周后加強免疫；(2)抗血清的采集和保存耳緣靜脈或耳動脈采血，以常規(guī)方法分離血清，將血 清用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，為了防止血清發(fā)生腐敗，需在無菌條件下加入硫柳 汞和慶大霉素使其終濃度均為0. 02%，然后無菌條件下定量分裝、凍干，貼上標簽，存放 于-80°C冰箱內(nèi)備用；
2.辣根過氧化物酶標記二抗制備(1)羊抗兔IgG獲得無菌采健康兔心臟血，辛酸-硫酸銨法提取血清IgG， SephadexG25柱層析，SDS-PAGE電泳檢測IgG純度，透析袋濃縮，與福氏完全佐劑和不完全 佐劑乳化后，免疫健康奶牛，10天后靜脈采血，用同樣方法純化奶牛IgG ；(2)酶標記使酶與戊二醛反應，除去未反應的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與 抗體分子的氨基結(jié)合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基；(3)酶標抗體結(jié)合物的純化50 %飽和硫酸銨沉淀法；Sephadex凝膠過濾法；3.其他ELISA試劑的配制(1)稀釋液的制備用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液，為避免結(jié)合物在反應中直接吸附在固相 載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白，通過競爭以抑制 結(jié)合物的吸附，一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐 溫20，0. 05%的濃度較為適宜；A 液(NaH2PO4 ·2Η20)2· ;34g/100ml，B 液(NaHPO4 · 12H20) 5. 37g/100ml ；取 A 液 2ml、 B 液 8ml、NaC13. 18g、TritonX 1000. 75m，加雙蒸水至 150ml ；(2)洗滌液的配制NaCO3O. 3g, NaHCO3O. 58g,加水至 200ml，即可配成 0. 05mol/LpH9. 6 的磷酸鹽緩沖 液 200ml ；NCl 8. 0g, KH2PO4 0. 2g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, Tween-200. 5ml, BAS Ig 加雙蒸水至1000ml，即可配成0. Olmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液1000ml ；(3)顯色液的配制A液19. 2g檸檬酸鈉加蒸餾水至1000ml，配成0. lmol/L檸檬酸鈉溶液；B 液=Na2HPO4 · 12H20 71. 7g 加蒸餾水至 IOOOml ；臨用前取A液24. 3ml與B液25. 7ml混合，加入聯(lián)苯二胺20mg，待充分溶解后，加 入30%的H2A 250 μ L，即可配成顯色液；(4)封閉液的配制小牛血清5ml,0. 01mol/L ρΗ7· 4PBS 95ml ；(5)終止液的制備雙蒸水200ml，濃硫酸3細1，緩慢滴加并不斷攪拌，加至300ml蒸餾水即配成終止 液；4.酶標板制作的工藝流程(1)包被過程無菌條件下，將所制備的SAA、IL-6和IL_8抗體用包被稀釋液 (0. 05M pH9. 6)的碳酸緩沖液稀釋到適當濃度，每孔抗原加入100μ 1，密封，4°C過夜；(2)洗滌棄去孔中液體，以0. 01mol/L, pH值為7. 4的PBST作洗滌液，加入足量 室溫作用3分鐘后甩去，如上重復3次，或用洗板機重復洗3次，拍干至無水印為止；(3)封閉酶標反應孔5%小牛血清置37°C封閉40min，封閉時將封閉液加滿各反 應孔，并去除各孔中的氣泡，封閉結(jié)束后，甩去封閉液，加入足量洗滌液，室溫作用3min，甩 去，重復3遍，每次要吸干孔內(nèi)的反應液，傾去液體后在吸水紙上拍干，重復3次；(4)包裝將封閉好的酶標板放于鋁箔袋中，加入Ig包裝的干燥劑，用真空包裝機將酶標板包裝好，貼上標簽。本發(fā)明一種奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診斷試劑盒，主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗的 方法(ELISA)。ELISA方法應用范圍廣泛，因為各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可 用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體。利用此抗體作為試劑可檢測標本中相應的抗原， 所以不需要除去未結(jié)合試劑，操作速度快，兩分鐘便得到結(jié)果，可以消除一些疫苗反應。它 既可以用于實驗室檢測，也可以運用于牧場和野外操作，適合于臨床及養(yǎng)殖戶現(xiàn)場的檢測。 ELISA方法的敏感性高，在測定血清中SAA、IL-6、IL-8的含量時，化學比色法的敏感度為 mg/ml水平，而酶反應測定法的敏感度約為5-10 μ g/ml，是優(yōu)秀的篩選試驗。價格相對低 廉，準確度與其它的初級結(jié)合試驗一樣。這種類型的測定，也適合自動化。它的原理是測量 分子反應率變化，這種改變是由于在試驗樣品中抗體與可溶性抗原反應引起。如果抗體結(jié) 合抗原，抗原的旋轉(zhuǎn)率將下降，則可測量這種反應。ELISA的基本原理是抗原或抗體的固相 化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標 記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表 面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其 他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上 的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有 色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量 分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感 度。本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法中的競爭法測抗原的原理。小分子抗原(SAA、 IL-6、IL-8)或半抗原因缺乏夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法測定，所 以本試劑盒采用此種模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié) 合。標本中抗原量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色愈淺。反之亦然。此檢 測法以高敏感度的單克隆抗體為基礎，是很好的最后隱性子宮內(nèi)膜炎病的確診試驗，也是 用于區(qū)分顯性和隱性子宮內(nèi)膜炎的最有效的方法。具體實施例方式下面對本發(fā)明作進一步說明。實施例1 本發(fā)明一種奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診斷試劑盒，它是利用SAA、IL-6 和IL-8的標準抗體包被酶標板，用新型單克隆抗體作競爭抗體，用辣根過氧化物酶標記二 抗，配制血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成；1. SAA、IL-6 和 IL-8 抗體的制備(1)抗原的獲得與動物接種將E. coli進行原核培養(yǎng)，通過M柱分離純化，然后用弗氏完全佐劑乳化的抗原在 家兔的背部進行多點皮內(nèi)注射，每點需要注射0. Iml左右，共注射0. 5ml，2周后加強免疫；(2)抗血清的采集和保存耳緣靜脈或耳動脈采血，以常規(guī)方法分離血清，將血 清用0. 450. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，為了防止血清發(fā)生腐敗，需在無菌條件下加入硫 柳汞和慶大霉素使其終濃度均為0. 02 %，然后無菌條件下定量分裝、凍干，貼上標簽，存放 于-80°C冰箱內(nèi)備用；
2.辣根過氧化物酶標記二抗制備(1)羊抗兔IgG獲得無菌采健康兔心臟血，辛酸-硫酸銨法提取血清IgG， SephadexG25柱層析，SDS-PAGE電泳檢測IgG純度，透析袋濃縮，與福氏完全佐劑和不完全 佐劑乳化后，免疫健康奶牛，10天后靜脈采血，用同樣方法純化奶牛IgG ；(2)酶標記使酶與戊二醛反應，除去未反應的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與 抗體分子的氨基結(jié)合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基；(3)酶標抗體結(jié)合物的純化50 %飽和硫酸銨沉淀法；Sephadex凝膠過濾法；3.其他ELISA試劑的配制(1)稀釋液的制備用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液，為避免結(jié)合物在反應中直接吸附在固相 載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白，通過競爭以抑制 結(jié)合物的吸附，一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐 溫20，0. 05%的濃度較為適宜；A 液(NaH2PO4 ·2Η20)2· ;34g/100ml，B 液(NaHPO4 · 12H20) 5. 37g/100ml ；取 A 液 2ml、 B 液 8ml、NaC13. 18g、TritonX 1000. 75m，加雙蒸水至 150ml ；(2)洗滌液的配制NaCO3 0. 3g, NaHCO3 0. 58g，加水至 200ml，即可配成 0. 05mol/LpH9. 6 的磷酸鹽緩 沖液200ml ；NCl 8. 0g, KH2PO4 0. 2g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, Tween-200. 5ml, BAS Ig 加雙蒸水至1000ml，即可配成0. Olmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液1000ml ；(3)顯色液的配制A液19. 2g檸檬酸鈉加蒸餾水至1000ml，配成0. lmol/L檸檬酸鈉溶液；B 液=Na2HPO4 · 12H20 71. 7g 加蒸餾水至 IOOOml ；臨用前取A液24. 3ml與B液25. 7ml混合，加入聯(lián)苯二胺20mg，待充分溶解后，加 入30%的H2A 250 μ L，即可配成顯色液；(4)封閉液的配制小牛血清5ml,0. 01mol/L ρΗ7· 4PBS 95ml ；(5)終止液的制備雙蒸水200ml，濃硫酸3細1，緩慢滴加并不斷攪拌，加至300ml蒸餾水即配成終止 液；4.酶標板制作的工藝流程(1)包被過程無菌條件下，將所制備的SAA、IL-6和IL_8抗體用包被稀釋液 (0. 05M pH9. 6)的碳酸緩沖液稀釋到適當濃度，每孔抗原加入100μ 1，密封，4°C過夜；(2)洗滌棄去孔中液體，以0. 01mol/L, pH值為7. 4的PBST作洗滌液，加入足量 室溫作用3分鐘后甩去，如上重復3次，或用洗板機重復洗3次，拍干至無水印為止；(3)封閉酶標反應孔5%小牛血清置37°C封閉40min，封閉時將封閉液加滿各反 應孔，并去除各孔中的氣泡，封閉結(jié)束后，甩去封閉液，加入足量洗滌液，室溫作用3min，甩 去，重復3遍，每次要吸干孔內(nèi)的反應液，傾去液體后在吸水紙上拍干，重復3次；(4)包裝將封閉好的酶標板放于鋁箔袋中，加入Ig包裝的干燥劑，用真空包裝機將酶標板包裝好，貼上標簽。實施例2 就隱性子宮內(nèi)膜炎競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒的有關問題作如 下說明1關于標本的采取和保存大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其 他成份均同等于血清。除特殊情況外，在醫(yī)學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中 血清和血漿可同等應用。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋 放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特 異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生 假陽性反應。一般來說，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4°C，超過一周測定的需低溫凍 存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)濃縮，分布不均，應充分混勻，但動作宜輕緩，避免氣泡，可上下 顛倒混合，不要在混勻器上強烈震蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再 檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分 裝凍存。2關于試劑的準備ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配 的緩沖液應用PH計測量校正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試 劑盒中本次實驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。3關于加樣的要求在操作過程中有3次加樣步驟，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應將所加 物加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。4關于保溫在反應過程中有兩次抗原抗體反應，S卩加標本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應的 完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育或孵育。保溫的方式一般采用水浴， 可將ELISA板至于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上 應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫 箱，ELISA板應放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳導性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最 后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較 低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都 能迅速平衡。室溫溫育時，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指 20- °C。5關于洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是 靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與 固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾 物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重 視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下5. 1浸泡式a.吸干或甩干孔內(nèi)反應液；b.用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板 孔后，即甩去)；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨 意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔 毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次(或按說明規(guī)定)。在間接法中如 本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多 為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型 洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而 削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到 水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在 0. 05% -0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的 靈敏度。5. 2 流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至 可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分 鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋 浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴 定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。6關于顯色和比色6. 1 顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。 反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨 時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后 的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴 格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時 判斷。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結(jié)果。但為保證實驗 結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰， 隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基 硫酸鈉(SDQ等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-M 小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此 時可用特定的波長G50nm)測讀吸光值。6. 2 比色比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀 的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。最 好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空 白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔)，以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可 用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。比色 結(jié)果的表達以往通用光密度(oplical density，0D)，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence，A)， 兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為〃 A492nm〃 或〃 0D492nm〃。7關于結(jié)果的判定ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之 間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條 件下制作標準曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線最 高點的吸光度可接近2. 0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱 坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直 線的部分是最理想的檢測區(qū)域。測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受 檢物質(zhì)的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。
權利要求
1. 一種奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診斷試劑盒，其特征在于它是利用SAA、IL-6和IL-8 的標準抗體包被酶標板，用單克隆抗體作競爭抗體，用辣根過氧化物酶標記二抗，配制血清 稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成；(一 )SAA、IL-6和IL-8抗體的制備(1)抗原的獲得與動物接種將E. coli進行原核培養(yǎng)，通過M柱分離純化，然后用弗氏完全佐劑乳化的抗原在家兔 的背部進行多點皮內(nèi)注射，每點需要注射0. Iml左右，共注射0. 5ml，2周后加強免疫；(2)抗血清的采集和保存耳緣靜脈或耳動脈采血，以常規(guī)方法分離血清，將血清用 0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，為了防止血清發(fā)生腐敗，需在無菌條件下加入硫柳汞和慶大 霉素使其終濃度均為0. 02%，然后無菌條件下定量分裝、凍干，貼上標簽，存放于-80°C冰 箱內(nèi)備用；(二)辣根過氧化物酶標記二抗制備(1)羊抗兔IgG獲得無菌采健康兔心臟血，辛酸-硫酸銨法提取血清IgG， SephadexG25柱層析，SDS-PAGE電泳檢測IgG純度，透析袋濃縮，與福氏完全佐劑和不完全 佐劑乳化后，免疫健康奶牛，10天后靜脈采血，用同樣方法純化奶牛IgG ；(2)酶標記使酶與戊二醛反應，除去未反應的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體 分子的氨基結(jié)合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基；(3)酶標抗體結(jié)合物的純化50%飽和硫酸銨沉淀法；kphadex凝膠過濾法；(三)其他ELISA試劑的配制(1)稀釋液的制備用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液，為避免結(jié)合物在反應中直接吸附在固相載體 上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白，通過競爭以抑制結(jié)合 物的吸附，一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20， 0. 05%的濃度較為適宜；A 液(NaH2PO4 · 2H20) 2. 34g/100ml，B 液(NaHPO4 · 12H20) 5. 37g/100ml ；取 A 液 2ml、B 液 8ml、NaC13. 18g、TritonX 1000. 75m，加雙蒸水至 150ml ；(2)洗滌液的配制NaCO3 0. 3g，NaHCO3 0. 58g，加水至200ml,即可配成0. 05mol/LpH9. 6的磷酸鹽緩沖液 200ml ；NCl 8. 0g, KH2PO4 0. 2g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, Tween-200. 5ml, BAS Ig 加雙 蒸水至1000ml,即可配成0. Olmol/L ρΗ7· 4的磷酸鹽緩沖液IOOOml ；(3)顯色液的配制A液19. 2g檸檬酸鈉加蒸餾水至1000ml，配成0. lmol/L檸檬酸鈉溶液；B 液=Na2HPO4 · 12H20 71. 7g 加蒸餾水至 IOOOml ；臨用前取A液24. 3ml與B液25. 7ml混合，加入聯(lián)苯二胺20mg，待充分溶解后，加入 30%的H2O2 250 μ L，即可配成顯色液;(4)封閉液的配制小牛血清 5ml，0. 01mol/L pH7. 4PBS 95ml ；(5)終止液的制備雙蒸水200ml，濃硫酸3細1，緩慢滴加并不斷攪拌，加至300ml蒸餾水即配成終止液； (四)酶標板制作的工藝流程(1)包被過程無菌條件下，將所制備的SAA、IL-6和IL-8抗體用包被稀釋液(0.05M PH9. 6)的碳酸緩沖液稀釋到適當濃度，每孔抗原加入100μ 1，密封，4°C過夜；(2)洗滌棄去孔中液體，以0.01mol/L, pH值為7. 4的PBST作洗滌液，加入足量室溫 作用3分鐘后甩去，如上重復3次，或用洗板機重復洗3次，拍干至無水印為止；(3)封閉酶標反應孔5%小牛血清置37°C封閉40min，封閉時將封閉液加滿各反應孔， 并去除各孔中的氣泡，封閉結(jié)束后，甩去封閉液，加入足量洗滌液，室溫作用3min，甩去，重 復3遍，每次要吸干孔內(nèi)的反應液，傾去液體后在吸水紙上拍干，重復3次；(4)包裝將封閉好的酶標板放于鋁箔袋中，加入Ig包裝的干燥劑，用真空包裝機將酶 標板包裝好，貼上標簽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速準確的奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎早期診斷試劑盒。它是利用SAA、IL-6和IL-8的標準抗體包被酶標板，用新型單克隆抗體作競爭抗體，用辣根過氧化物酶標記二抗，配制血清稀釋液等組裝組成。包括SAA、IL-6和IL-8抗體制備，辣根過氧化物酶標記二抗制備，ELISA試劑的配制，酶標板制作。本發(fā)明主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法。ELISA方法應用范圍廣泛，操作速度快，兩分鐘便得到結(jié)果，可以消除一些疫苗反應。它既可以用于實驗室檢測，也可以運用于牧場和野外操作，適合于臨床及養(yǎng)殖戶現(xiàn)場的檢測。
文檔編號G01N33/577GK102043054SQ201010518500
公開日2011年5月4日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權日2010年10月26日
發(fā)明者劉運楓, 李德軍, 王海彬 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學