專利名稱：細(xì)胞早期凋亡的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞凋亡的檢測方法，尤其是能區(qū)分早期凋 亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的檢測方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡(apoptosis)或稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是指 細(xì)胞本身在一定的生理或病理條件下，按照自身程序主動性、生理性的死亡過程，它是一個 多步驟，由基因調(diào)控的發(fā)生過程，涉及到一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控作用。細(xì)胞凋亡 對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時 引起的細(xì)胞損傷老化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。進(jìn)入20世 紀(jì)90年代，細(xì)胞凋亡的研究一下子被推到了生命科學(xué)的前沿，形成了一個幾乎涉及生物醫(yī) 學(xué)各個領(lǐng)域的研究高潮。由于細(xì)胞凋亡的早期和執(zhí)行過程中有許多重要事件，因此加強(qiáng)細(xì) 胞凋亡檢測方法的研究，尤其是細(xì)胞早期凋亡檢測方法的研究，對于廣泛深入地研究嚴(yán)重 威脅人類健康疾病的發(fā)生、早期診斷和治療等重大醫(yī)學(xué)問題具有重要意義。目前，細(xì)胞凋亡的檢測方法可分為兩類形態(tài)學(xué)特征的檢測和生物化學(xué)特征的檢 測。形態(tài)學(xué)特征的檢測包括光學(xué)顯微鏡檢測、電子顯微鏡檢測、熒光顯微鏡檢測和共聚焦激 光掃描顯微鏡檢測等。但是此類方法大多只能定性，不能定量，且只有在發(fā)現(xiàn)了凋亡晚期 具有的凋亡小體時才能確定為陽性，因而不易檢出早期凋亡細(xì)胞。生物化學(xué)特征的檢測包 括DNA凝膠電泳法、TUNEL法、AnnexinV-FITC/PI法和線粒體膜電位變化的檢測等。但是 DNA凝膠電泳法敏感性差，且不適用于細(xì)胞早期凋亡的檢測，而TUNEL法的實驗方法復(fù)雜， 費時，每次只能處理少量樣本。這類方法中較為常用的是Armexin V-FITC/PI法檢測，該法 不需要固定細(xì)胞，避免了 TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失，是目前較為理想的凋亡定量 檢測方法。但是，該方法中的Armexin V價格昂貴，且標(biāo)記的熒光染料FITC的熒光強(qiáng)度弱， 長時間容易淬滅，同時PI染料的發(fā)射波譜較寬，對FITC的發(fā)射波譜有一定的干擾。因此探 求新的、成本低廉且特異性高的細(xì)胞早期凋亡檢測方法成了眾多學(xué)者研究的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞早期凋亡的檢測方法。該方法不僅能夠定量檢測早 期凋亡細(xì)胞，而且能夠區(qū)分正?；罴?xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞以及機(jī)械損傷細(xì)胞。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的一種細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，將標(biāo)記 有熒光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰絲氨酸抗體與核酸熒光染料7-AAD搭配，共同對細(xì) 胞進(jìn)行檢測。磷脂酰絲氨酸抗體是一種針對磷脂酰絲氨酸的單克隆抗體，能與細(xì)胞凋亡 時外翻的磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結(jié)合，所以將磷脂酰絲氨酸抗體進(jìn)行Alexa Fluor 488標(biāo)記后，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，在合適波長激發(fā)光的激發(fā)下就可以發(fā)出明亮的綠色熒光。 7-AAD是一種核酸熒光染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，所以早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完好 對7-AAD有拒染性，而對晚期凋亡細(xì)胞，7-AAD能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染色發(fā)出紅色熒光。因此，將磷脂酰絲氨酸抗體-Alexa Fluor 488和7-AAD搭配共同對細(xì)胞進(jìn)行檢測，磷 脂酰絲氨酸抗體-Alexa Fluor 488可以區(qū)分正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，而7-AAD可以區(qū)分凋亡 細(xì)胞中的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，從而達(dá)到檢測細(xì)胞早期凋亡的目的。這種細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，細(xì)胞經(jīng)兩種熒光染料Alexa Fluor 488和 7-AAD染色后，在流式細(xì)胞儀激光束的激發(fā)下產(chǎn)生不同的熒光，熒光可被光學(xué)系統(tǒng)檢測并 輸送到計算機(jī)進(jìn)行分析。分析后，細(xì)胞分為4個亞群，分別為正?；罴?xì)胞Alexa Fluor 48877-AAD\ 早期凋亡細(xì)胞 Alexa Fluor 488+/7-AAD\ 晚期凋亡細(xì)胞 Alexa Fluor 488+/7-AAD+和機(jī)械性損傷細(xì)胞 Alexa Fluor 48877-AAD+。細(xì)胞早期凋亡的檢測方法的具體步驟為(1)將0. 2 μ g標(biāo)記有熒光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰絲氨酸抗體與細(xì)胞懸液 在4°C避光孵育20 30分鐘，此時Alexa Fluor 488可以對凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；(2)用1 μ g的核酸熒光染料7-AAD與細(xì)胞懸液在4°C避光孵育5分鐘，此時7-AAD 只標(biāo)記凋亡細(xì)胞中的晚期凋亡細(xì)胞；(3)通過流式細(xì)胞儀的檢測分析，標(biāo)記上Alexa Fluor 488的凋亡細(xì)胞發(fā)出綠色 熒光，而標(biāo)記上7-AAD的晚期凋亡細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，因此Alexa Fluor488+/7-AAD_即為早 期凋亡細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述方法可以定量檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生比例，檢測成本低廉，操作簡 單，且熒光染料Alexa Fluor 488的熒光強(qiáng)度強(qiáng)，長時間不易淬滅，同時7-AAD的發(fā)射波譜 窄，對其他檢測通道的干擾更小，與Alexa Fluor 488聯(lián)合使用具有較好的效果。


圖1至圖6為采用本發(fā)明所述細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，通過流式細(xì)胞儀檢測0， 20，50，80，100，120mg/L六個不同濃度EGCG誘導(dǎo)人白血病T淋巴細(xì)胞系(Jurkat細(xì)胞)早 期凋亡的變化圖譜，圖中右下象限為早期凋亡細(xì)胞。圖7至圖12為采用本發(fā)明所述細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，通過流式細(xì)胞儀檢測0， 50，100，125，150，175mg/L六個不同濃度EGCG誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞早期凋亡的變化 圖譜，圖中右下象限為早期凋亡細(xì)胞。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些實例僅用于說明本發(fā)明的具體 方案，而不是于限制本發(fā)明范圍。實施例1本實施例為采用本發(fā)明對人白血病T淋巴細(xì)胞系(Jurkat細(xì)胞)早期凋亡的檢測 的一個實例。人白血病T淋巴細(xì)胞系(Jurkat懸浮細(xì)胞)，生長在含10%胎牛血清，100U/ml青 霉素_鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長 期的Jurkat懸浮細(xì)胞懸液的密度調(diào)整到2. 5X IO5個/ml，然后用吸管吸取3ml細(xì)胞懸液加 入到60mm的無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入凋亡誘導(dǎo)藥物EGCG，使其終濃度分別為20，50，80，100和120mg/L，同時設(shè)置未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為空白對照，然后放在37°C培養(yǎng)箱 靜置培養(yǎng)24小時。將EGCG作用24小時后的Jurkat細(xì)胞收集到離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，除 去上清，用4°C預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，IOOOrpm離心10分鐘，再重復(fù)一次，最后除去上清。在 冰浴上，加入500μ 1的含胎牛血清的PBS上樣緩沖液到離心管中，用吸管吹打使細(xì)胞重 懸，加入標(biāo)記有Alexa Fluor 488熒光染料的磷脂酰絲氨酸抗體0.2 μ g，振蕩均勻后4°C避 光孵育20 30分鐘。然后加入7-AAD 1 μ g，振蕩均勻后4°C避光孵育5分鐘，孵育后即可 上流式細(xì)胞儀檢測分析。流式細(xì)胞儀分析的原始數(shù)據(jù)用FCS Express V3軟件處理，選擇Create FreeForm Gate工具設(shè)置門，選擇Show Quadrants工具確定十字中心位置。在數(shù)據(jù)處理中，所有樣本 的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)都采用同一個門來圈選細(xì)胞，并且將十字中心點置于同一位置，以保證 所有樣本的數(shù)據(jù)處理都采用同一標(biāo)準(zhǔn)。Jurkat細(xì)胞早期凋亡的檢測結(jié)果如下Jurkat細(xì)胞分為4個亞群=Alexa Fluor 488_/7_AAD_亞群為正?；罴?xì)胞，流式圖中左下象限；Alexa Fluor 488+/7_AAD_亞群為早期 凋亡細(xì)胞，流式圖中右下象限；Alexa Fluor 488+/7-AAD+亞群為晚期凋亡細(xì)胞，流式圖中右 上象限；Alexa Fluor 488_/7-AAD+亞群為機(jī)械損傷細(xì)胞，流式圖中左上象限。隨著EGCG濃 度的增加，Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率先升后降，正?；罴?xì)胞的比例不斷下降，晚期凋亡細(xì)胞 的百分比明顯升高，如圖1至圖6所示。實施例2本實施例為采用本發(fā)明對人肝癌SMMC-7721早期凋亡的檢測的一個實例。人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長在含10 %胎牛血清，100U/ml青霉素-鏈霉素的 RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的SMMC-7721 細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，密度調(diào)整到2. 5X IO5個/ml，然后用吸管吸取3ml細(xì)胞懸液加入到 60mm的無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，每個培養(yǎng)皿中加入凋亡誘導(dǎo)藥物EGCGdi 其終濃度分別為50，100，125，150和175mg/L，同時設(shè)置未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為空白對 照，然后放在37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時。將EGCG作用24小時后的SMMC-7721細(xì)胞收集到離心管中，IOOOrpm離心10分鐘， 除去上清，用4°C預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，IOOOrpm離心10分鐘，再重復(fù)一次，最后除去上清。 在冰浴上，加入500 μ 1的含1 %胎牛血清的PBS上樣緩沖液到離心管中，用吸管吹打使細(xì)胞 重懸，加入標(biāo)記有Alexa Fluor488熒光染料的磷脂酰絲氨酸抗體0. 2 μ g，振蕩均勻后4°C 避光孵育20 30分鐘。然后加入7-AAD 1 μ g，振蕩均勻后4°C避光孵育5分鐘，孵育后即 可上流式細(xì)胞儀檢測分析。流式細(xì)胞儀分析的原始數(shù)據(jù)用FCS Express V3軟件處理，選擇CreateFreeForm Gate工具設(shè)置門，選擇Show Quadrants工具確定十字中心位置。在數(shù)據(jù)處理中，所有樣本 的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)都采用同一個門來圈選細(xì)胞，并且將十字中心點置于同一位置，以保證 所有樣本的數(shù)據(jù)處理都采用同一標(biāo)準(zhǔn)。SMMC-7721細(xì)胞早期凋亡的檢測結(jié)果如下SMMC_7721細(xì)胞分為4個亞群=Alexa Fluor 48877-AAD—亞群為正?；罴?xì)胞，流式圖中左下象限；Alexa Fluor48877-AAD_亞群 為早期凋亡細(xì)胞，流式圖中右下象限；Alexa Fluor 488+/7-MD+亞群為晚期凋亡細(xì)胞，流式圖中右上象限；Alexa Fluor 48877-AAD+亞群為機(jī)械損傷細(xì)胞，流式圖中左上象限。隨著 EGCG濃度的增加，SMMC-7721細(xì)胞的早期凋亡率先升后降，正?；罴?xì)胞的比例不斷下降，晚 期凋亡細(xì)胞的百分比明顯升高，如圖7至圖12所示。
權(quán)利要求
一種細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，其特征在于，該檢測方法是將標(biāo)記有熒光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰絲氨酸抗體與核酸熒光染料7 AAD搭配，共同對細(xì)胞進(jìn)行檢測，前者用于區(qū)分正?；罴?xì)胞和凋亡細(xì)胞，后者用于區(qū)分凋亡細(xì)胞中的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，其特征在于，所述方法的具體步 驟為(1)將0.2yg標(biāo)記有熒光染料AlexaFluor 488的磷脂酰絲氨酸抗體與細(xì)胞懸液在 4°C避光孵育20 30分鐘，此時Alexa Fluor 488對凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；(2)用1μ g的核酸熒光染料7-AAD與細(xì)胞懸液在4°C避光孵育5分鐘，此時7-AAD只 標(biāo)記凋亡細(xì)胞中的晚期凋亡細(xì)胞；(3)通過流式細(xì)胞儀的檢測分析，標(biāo)記上AlexaFluor 488的凋亡細(xì)胞發(fā)出綠色熒光， 而標(biāo)記上7-AAD的晚期凋亡細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，因此Alexa Fluor488+/7-AAD"即為早期凋 亡細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，其特征在于，所述AlexaFluor 488和7-AAD兩種不同發(fā)射波長的熒光染料同時對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì) 胞早期凋亡的發(fā)生。
全文摘要
一種細(xì)胞早期凋亡的檢測方法，將標(biāo)記有熒光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰絲氨酸抗體與核酸熒光染料7-AAD搭配，共同對細(xì)胞進(jìn)行檢測，前者用于區(qū)分正?；罴?xì)胞和凋亡細(xì)胞，后者用于區(qū)分凋亡細(xì)胞中的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀對不同發(fā)射波長的兩種熒光染料Alexa Fluor 488和7-AAD進(jìn)行檢測分析后，細(xì)胞分為4個亞群，其中Alexa Fluor 488+/7-AAD-亞群即為早期凋亡細(xì)胞。
文檔編號G01N21/64GK101893572SQ201010205808
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者何敏, 李剛, 蕭浩, 鐘艷平 申請人:廣西醫(yī)科大學(xué)