專利名稱：：一種基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式的細(xì)胞活性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式的細(xì)胞活性檢測方法，屬于生物細(xì)胞活性檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：細(xì)胞活性和毒性檢測在細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)、藥物研發(fā)等領(lǐng)域應(yīng)用極其廣泛，是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)中重要的技術(shù)和手段。近年來，根據(jù)細(xì)胞死亡過程中的各個狀態(tài)的細(xì)胞特性變化，建立了多種細(xì)胞活性檢測方法。常規(guī)細(xì)胞活性檢測方法主要有細(xì)胞計數(shù)法、臺盼藍(lán)拒染法、中性紅染色法、四噻唑藍(lán)(MTT)比色法、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測等方法。在細(xì)胞活性檢測過程中，顯微鏡、酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀等儀器發(fā)揮著重要的作用。顯微鏡觀察是推動細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展的技術(shù)手段，也是細(xì)胞活性檢測的基本手段。而熒光顯微鏡的使用，使得這種技術(shù)手段在細(xì)胞活性檢測方面發(fā)揮了更大的作用。運用顯微鏡觀察來檢測細(xì)胞活性，通常是將細(xì)胞染色、制片后，顯微鏡直接觀察、拍照。該方法是通過肉眼觀察，從形態(tài)學(xué)或染色程度分辨活細(xì)胞或死細(xì)胞，人工判斷細(xì)胞的染色程度和數(shù)目，借此判斷細(xì)胞的活性。但是，這種方法主要依靠人眼的主觀判斷，易引起較大的人為誤差。酶標(biāo)儀檢測是根據(jù)細(xì)胞群體染色后的吸光值大小判斷細(xì)胞活性。其中的四噻唑藍(lán)(MTT)比色法是進(jìn)行細(xì)胞活性判斷的常用方法。MTT染料被活細(xì)胞攝取后，可被線粒體脫氫酶氧化生成紫色結(jié)晶，其生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。MTT法利用測量組的吸光度值與對照組相比得出的百分率作為所測細(xì)胞的存活率，表征細(xì)胞活性。此外，還有利用活細(xì)胞染料進(jìn)行染色的方法，細(xì)胞群體染色后的吸光值與活細(xì)胞數(shù)目成正比，根據(jù)吸光值的差異可判斷活細(xì)胞的數(shù)目，從而得出細(xì)胞群體的相對活性。該方法的不足是僅考慮了活細(xì)胞的數(shù)目，而不能結(jié)合更多因素測定細(xì)胞活性。流式細(xì)胞術(shù)是現(xiàn)代細(xì)胞分析檢測技術(shù)。可高速分析上萬個細(xì)胞，快速實現(xiàn)細(xì)胞活性檢測，并可同時從一個細(xì)胞中測得多個生物化學(xué)參數(shù)。但是流式細(xì)胞儀價格昂貴，實驗成本很高，非普通從事生物學(xué)研究的科研和醫(yī)療單位所能擁有。而且，由于流式細(xì)胞儀儀對人員操作的技術(shù)要求高，使其大規(guī)模的應(yīng)用難以實現(xiàn)?，F(xiàn)代微量分析技術(shù)毛細(xì)管電泳是通過樣品組分在ym級內(nèi)徑的毛細(xì)管通道內(nèi)進(jìn)行電泳，因組分具有的荷質(zhì)比差異實現(xiàn)彼此分離。毛細(xì)管電泳具有高效、快速、儀器成本和實驗費用低等明顯優(yōu)勢。在生物、醫(yī)藥和臨床等研究中，毛細(xì)管電泳已廣泛用于生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸等)，有機小分子和無機離子等的分析檢測，并可用于細(xì)胞內(nèi)的成分分析。毛細(xì)管電泳在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，是分析化學(xué)的前沿禾口熱點。目前，已有連續(xù)流毛細(xì)管電泳應(yīng)用于細(xì)胞活性檢測的方法報道。例如，文章"ContinuousintactcelldetectionandviabilitydeterminationbyCEwithdual-wavelengthdetection,Electrophoresis"(D0I10.1002/elps.200900417，2010,31:1-7)介紹的方法，該方法使單細(xì)胞連續(xù)地通過毛細(xì)管檢測窗口，使用紫外-可見雙波長檢測細(xì)胞，其對細(xì)胞活性的檢測與表征已經(jīng)過MTT和臺盼藍(lán)染色兩種常用方法的驗證，結(jié)果準(zhǔn)確。但是，該方法在實施時，由于單細(xì)胞連續(xù)電泳模式的實現(xiàn)依賴于細(xì)胞濃度，不易實現(xiàn)，導(dǎo)致對細(xì)胞活性的檢測較難實施。此外，數(shù)據(jù)處理過程復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析較為耗時。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種毛細(xì)管區(qū)帶電泳結(jié)合二極管陣列檢測器檢測細(xì)胞活性的方法，以克服現(xiàn)有方法存在的人為誤差，儀器設(shè)備昂貴、實驗成本高，不適合高通量分析等不足，實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡便、成本低且可定性定量檢測細(xì)胞活性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式的細(xì)胞活性檢測方法，包括以下步驟步驟一、為使毛細(xì)管區(qū)帶電泳能夠?qū)?xì)胞活性進(jìn)行檢測，先對待測細(xì)胞樣品進(jìn)行預(yù)處理。即，用細(xì)胞染料將待測細(xì)胞染色，離心后，棄去上清液，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，直至將殘留細(xì)胞染料洗凈為止。之后，向清洗后的細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞固定液，由此對細(xì)胞進(jìn)行固定化處理，固定化反應(yīng)溫度優(yōu)選為15-3(TC，細(xì)胞固定液和固定時間可根據(jù)染料特點和細(xì)胞性質(zhì)進(jìn)行選擇。最后，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，直至除去剩余的細(xì)胞固定液。其中，所述細(xì)胞染料為各種活細(xì)胞染料，細(xì)胞的染色程度可反映細(xì)胞的活性。所述細(xì)胞固定液為常用細(xì)胞固定液中的任意一種。例如，可采用4%中性甲醛溶液，固定化處理時反應(yīng)至少4h;80%_95%的乙醇固定液，固定化處理時反應(yīng)至少15min;4%多聚甲醛固定液，固定化處理時反應(yīng)至少10min;5%冰醋酸，固定化處理時反應(yīng)至少15min;乙醇-甲醛(乙醇-福爾馬林，AF)固定液，固定化處理時反應(yīng)至少10min;醋酸鈉_升汞_甲醛(B5)固定液，固定化處理時反應(yīng)至少10min;Bouin固定液，固定化處理時反應(yīng)至少30min;Carnoy固定液，固定化處理時反應(yīng)至少20min;Zenker固定液，固定化處理時反應(yīng)至少2h。步驟二、為控制樣品中的細(xì)胞濃度，進(jìn)行細(xì)胞懸浮液的配制。S卩，向步驟一得到的細(xì)胞沉淀中加入電泳緩沖液，混勻后得到細(xì)胞懸浮液。然后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)確定出細(xì)胞濃度，再用電泳緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至104-107個/!111范圍。由此可確保每個樣品分析時所用細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞濃度一致。其中，所述電泳緩沖液選用常用毛細(xì)管電泳緩沖液中的任意一種，例如硼酸-硼砂緩沖液、磷酸鹽緩沖液、醋酸銨緩沖液、羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液等。步驟三、采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測細(xì)胞。即，將步驟二中配制好的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣或電進(jìn)樣，使細(xì)胞溶液進(jìn)入毛細(xì)管一端。然后加電壓，使細(xì)胞溶液在毛細(xì)管內(nèi)移動并通過二極管陣列檢測器。此時，在選定的紫外波長和可見波長下同時檢測進(jìn)樣細(xì)胞。由于進(jìn)樣細(xì)胞聚集成一個或多個細(xì)胞團(tuán)，因此每種波長檢測時得到的電泳峰可能為一個或多個，因此，將所有電泳峰的峰面積相加，得到峰面積總和，由其表示細(xì)胞在相應(yīng)波長下的吸光值。用紫外和可見兩波長的吸光值的乘積即可表示細(xì)胞活性的量值。其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳所用毛細(xì)管的長度為30-60cm，內(nèi)徑為10-100ym。采用壓力進(jìn)樣時壓強為5-250mbar，進(jìn)樣時間為3-30s;采用電進(jìn)樣方式時的電壓為500V-30KV，進(jìn)樣時間為3-30s。電泳電壓為5-30KV。檢測時采用的紫外波長為180-300nm，可見波長直接采用染料的最大吸收波長。有益效果本發(fā)明方法，對比現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點1)本發(fā)明應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測，具有簡單、快速、實用、高效、安全和低成本等優(yōu)點，并且避免了人工觀察帶來的誤差。毛細(xì)管電泳是現(xiàn)代微量分析技術(shù)，其在儀器成本、實驗成本和操作技術(shù)等方面具有優(yōu)勢，利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行細(xì)胞活性檢測是一種簡單、實用和低成本的細(xì)胞分析新方法。使用毛細(xì)管電泳，結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞染色的方法，進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測，用儀器檢測的客觀量值代替以往人工觀察的主觀判斷，實現(xiàn)細(xì)胞活性的定量分析。2)由于本方法中的細(xì)胞樣品經(jīng)過固定化處理，因此能夠耐受電泳分析過程中電壓的不利影響。同時，方法具有樣品存放時間長的優(yōu)點。這是因為固定化后的細(xì)胞其原有狀態(tài)得以保持，且在分析過程中細(xì)胞的活性和狀態(tài)不再改變，所以樣品可長時間存放。3)本方法以紫外-可見雙波長吸光值的乘積表示細(xì)胞活性，綜合考慮多種因素，具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。采用紫外-可見雙波長檢測細(xì)胞，細(xì)胞在紫外波長下的吸收主要反映了細(xì)胞的大小和細(xì)胞的蛋白含量，由于細(xì)胞活性改變的凋亡過程伴隨著細(xì)胞的皺縮和細(xì)胞內(nèi)蛋白的流失，所以凋亡細(xì)胞在紫外波長下的吸光值較低，即細(xì)胞活性與紫外波長下的吸光值正相關(guān)；而細(xì)胞在可見波長下的吸收主要反映了細(xì)胞被染料染色的深淺程度，用活細(xì)胞染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，則細(xì)胞活性與可見波長下細(xì)胞的吸光值也呈正相關(guān)。以雙波長吸光值的乘積表示細(xì)胞活性，同時考慮了細(xì)胞大小、細(xì)胞蛋白含量以及活細(xì)胞染料染色程度三個因素對細(xì)胞活性的反映，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且，用雙波長吸光值的乘積表示細(xì)胞活性，對于數(shù)據(jù)的批間差異有放大的作用，因此提高了檢測方法的靈敏度。4)與連續(xù)流毛細(xì)管電泳進(jìn)行細(xì)胞活性檢測的方法相比，本方法使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測細(xì)胞活性，具有分析時間短，數(shù)據(jù)處理簡單，染料選擇范圍廣，對細(xì)胞的大小限制小等優(yōu)點。5)本發(fā)明建立的細(xì)胞活性檢測方法有望應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)、藥物分析、環(huán)境毒性物質(zhì)檢測、食品安全毒性分析、醫(yī)用材料的生物相容性評價等相關(guān)領(lǐng)域。圖1為毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)行細(xì)胞活性檢測的示意圖。其中，l-毛細(xì)管，2-二極管陣列檢測器，3_正負(fù)電極，4_電泳圖譜。圖2為實施例1的正常細(xì)胞毛細(xì)管區(qū)帶電泳214nm和健那綠染料最大吸收波長(596nm)雙波長檢測的結(jié)果。具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明方法做進(jìn)一步詳細(xì)說明。表1、2、3為細(xì)胞活性檢測的數(shù)據(jù)表。其中第一列為處理細(xì)胞所用藥物的濃度，對于甲基汞等毒性物質(zhì)，藥物濃度的增大將導(dǎo)致細(xì)胞活性的降低。表中第二列和第三列分別為紫外波長下和可見波長下細(xì)胞樣品的吸光值。表中第四列數(shù)據(jù)為上述兩個吸光值的乘積，以此表示細(xì)胞的活性，該乘積值越大，表明細(xì)胞活性越大。表中第五列為重復(fù)電泳三次所得數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值，RSD值越小，說明測定結(jié)果的精密度越高，數(shù)據(jù)越可靠。實施例1培養(yǎng)6組Hela細(xì)胞，可使用六孔板或者規(guī)格相同的培養(yǎng)瓶。其中一組作為對照組，不加誘導(dǎo)劑，其余5組分別加入濃度為2、4、6、8、10iig/ml的甲基汞。在37。C，5XC02條件下培養(yǎng)12h，得到正常細(xì)胞樣品和經(jīng)不同濃度甲基汞誘導(dǎo)的待測細(xì)胞樣品。步驟一、對正常細(xì)胞樣品和待測細(xì)胞樣品均進(jìn)行預(yù)處理。S卩，用0.2mg/mL的健那綠將正常細(xì)胞樣品和待測細(xì)胞樣品染色10min，離心后移去上清液，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，直至將殘留的健那綠染料洗凈。之后，向清洗后的細(xì)胞沉淀中加入200iiL濃度為4%的甲醛溶液，由此對細(xì)胞進(jìn)行固定化處理，固定化過程是在室溫下反應(yīng)4h。最后，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，直至除去剩余的細(xì)胞固定液。步驟二、為控制樣品中的細(xì)胞濃度，進(jìn)行細(xì)胞懸浮液的配制。即，向步驟一得到的6組細(xì)胞沉淀中分別加入50mM的硼酸-硼砂緩沖液，混勻后得到細(xì)胞懸浮液。然后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)確定出細(xì)胞濃度，再用50mM的硼酸-硼砂緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1.25X105個/ml范圍。由此可確保每個樣品分析時所用細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞濃度一致。步驟三、采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測細(xì)胞，如圖l所示。S卩，將步驟二中配制好的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣，使細(xì)胞溶液進(jìn)入毛細(xì)管一端。然后加電壓進(jìn)行電泳，使細(xì)胞溶液在毛細(xì)管內(nèi)移動并通過二極管陣列檢測器，此時，在紫外波長為214nm和可見波長為596nm下同時檢測進(jìn)樣細(xì)胞。由于進(jìn)樣細(xì)胞聚集成一個或多個細(xì)胞團(tuán)，因此每種波長檢測時得到的電泳峰可能為一個或多個，因此，將所有電泳峰的峰面積相加，得到峰面積總和，由其表示細(xì)胞在相應(yīng)波長下的吸光值。用紫外和可見兩波長的吸光值的乘積即可表示細(xì)胞活性。其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳所用毛細(xì)管的長度為30cm，內(nèi)徑為100ym。采用壓力進(jìn)樣時的條件為50mbar，進(jìn)樣6s;電泳電壓20KV。電泳圖譜如圖2所示，記錄了細(xì)胞在214nm和596nm波長下的吸光值。以214nm波長下的吸光值表征細(xì)胞皺縮情況和細(xì)胞蛋白丟失情況，以596nm波長下的吸光值表征細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目和線粒體膜電位的下降情況。兩個波長下的吸光值變化都在一定程度上反映了細(xì)胞樣品的活性，而二者的乘積可同時表征細(xì)胞樣品幾方面的變化。并且，選擇乘積作為表征參數(shù)，對于細(xì)胞樣品的變化具有放大的作用，可提高檢測靈敏度。因此選擇以214nm和596nm下的吸光值的乘積作為細(xì)胞樣品活性的表征。求出對照組正常細(xì)胞以及2、4、6、8、10iig/ml甲基汞處理的待測細(xì)胞樣品的雙波長吸光值乘積數(shù)值見表1。表1甲基汞處理的細(xì)胞樣品活性檢測結(jié)果(健那綠染色)甲基汞濃度tig/ml214nm峰面積596rnn峰面積雙波長吸光值乘積(X103)RSD(X103)046.6844.652.080.206<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2培養(yǎng)6組Hela細(xì)胞，可使用六孔板或者規(guī)格相同的培養(yǎng)瓶。其中一組作為對照組，不加誘導(dǎo)劑，其余5組分別加入濃度為2、4、6、8、10iig/ml的甲基汞。在37。C，5XC02條件下培養(yǎng)12h，得到正常細(xì)胞樣品和經(jīng)不同濃度甲基汞誘導(dǎo)的待測細(xì)胞樣品。步驟一、對正常細(xì)胞樣品和待測細(xì)胞樣品均進(jìn)行預(yù)處理。即，用10iig/mL的Rhodamine123將待測細(xì)胞樣品在37。C下染色10min，離心后移去上清液，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，直至將殘留的Rhodamine123洗凈。之后，向清洗后的細(xì)胞沉淀中加入200iiL濃度為4%的多聚甲醛，由此對細(xì)胞進(jìn)行固定化處理，固定化過程是在室溫下反應(yīng)30min。最后，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，直至除去剩余的細(xì)胞固定液。步驟二、為控制樣品中的細(xì)胞濃度，進(jìn)行細(xì)胞懸浮液的配制。S卩，向步驟一得到的6組細(xì)胞沉淀中分別加入50mM的硼酸-硼砂緩沖液，混勻后得到細(xì)胞懸浮液。然后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)確定出細(xì)胞濃度，再用50mM的硼酸-硼砂緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至6.25X104個/ml范圍。由此可確保每個樣品分析時所用細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞濃度一致。步驟三、采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測細(xì)胞。即，將步驟二中配制好的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣，使細(xì)胞溶液進(jìn)入毛細(xì)管一端。然后加電壓進(jìn)行電泳，細(xì)胞溶液在毛細(xì)管內(nèi)移動并通過二極管陣列檢測器，此時，在紫外波長為214nm和可見波長為500nm下同時檢測進(jìn)樣細(xì)胞。由于進(jìn)樣細(xì)胞聚集成一個或多個細(xì)胞團(tuán)，因此每種波長檢測時得到的電泳峰可能為一個或多個，因此，將所有電泳峰的峰面積相加，得到峰面積總和，由其表示細(xì)胞在相應(yīng)波長下的吸光值。用紫外和可見兩波長的吸光值的乘積即可表示細(xì)胞活性的量值。其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳所用毛細(xì)管的長度為30cm，內(nèi)徑為100iim。采用壓力進(jìn)樣時的條件為50mbar，進(jìn)樣12s;電泳電壓20KV。艮卩以214nm波長下的吸光值表征細(xì)胞皺縮情況和細(xì)胞蛋白丟失情況，以500nm波長下的吸光值表征細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目和線粒體膜電位的下降情況。兩個波長下的吸光值變化都在一定程度上反映了細(xì)胞樣品的活性，而二者的乘積可同時表征細(xì)胞樣品幾方面的變化。并且，選擇乘積作為表征參數(shù)，對于細(xì)胞樣品的變化具有放大的作用，可提高檢測靈敏度。因此選擇以214nm和500nm下的吸光值的乘積作為細(xì)胞樣品活性的表征。求出對照組正常細(xì)胞以及2、4、6、8、10yg/ml甲基汞處理的待測細(xì)胞樣品的雙波長吸光值乘積數(shù)值見表2。表2甲基滎處理的細(xì)胞樣品活性檢測結(jié)果(Rhodamine123染色)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3培養(yǎng)6組Hela細(xì)胞，可使用六孔板或者規(guī)格相同的培養(yǎng)瓶。其中一組作為對照組，不加誘導(dǎo)劑，其余5組分別加入濃度為2、4、6、8、10iig/ml的甲基汞。在37°〇，5%C02條件下培養(yǎng)16h，得到正常細(xì)胞樣品和經(jīng)不同濃度甲基汞誘導(dǎo)的待測細(xì)胞樣品。步驟一、對正常細(xì)胞樣品和待測細(xì)胞樣品均進(jìn)行預(yù)處理。S卩，用O.lmg/mL的中性紅染色將待測細(xì)胞樣品在37t:下染色10min，離心后移去上清液，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，直至將殘留的中性紅染料洗凈。之后，向清洗后的細(xì)胞沉淀中加入200iiL濃度為4%的甲醛溶液，由此對細(xì)胞進(jìn)行固定化處理，固定化過程是在室溫下反應(yīng)4h。最后，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，直至除去剩余的細(xì)胞固定液。步驟二、為控制樣品中的細(xì)胞濃度，進(jìn)行細(xì)胞懸浮液的配制。S卩，向步驟一得到的6組細(xì)胞沉淀中分別加入50mM的硼酸-硼砂緩沖液，混勻后得到細(xì)胞懸浮液。然后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)確定出細(xì)胞濃度，再用50mM的硼酸-硼砂緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至3.125X104個/ml范圍。由此可確保每個樣品分析時所用細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞濃度一致。步驟三、采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測細(xì)胞。即，將步驟二中配制好的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣，使細(xì)胞溶液進(jìn)入毛細(xì)管一端。然后加電壓進(jìn)行電泳，使細(xì)胞溶液在毛細(xì)管內(nèi)移動并通過二極管陣列檢測器，此時，在紫外波長為214nm和可見波長為525nm下同時檢測進(jìn)樣細(xì)胞。由于進(jìn)樣細(xì)胞聚集成一個或多個細(xì)胞團(tuán)，因此每種波長檢測時得到的電泳峰可能為一個或多個，因此，將所有電泳峰的峰面積相加，得到峰面積總和，由其表示細(xì)胞在相應(yīng)波長下的吸光值。用紫外和可見兩波長的吸光值的乘積即可表示細(xì)胞活性的量值。其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳所用毛細(xì)管的長度為30cm，內(nèi)徑為100iim。采用壓力進(jìn)樣時的條件為50mbar，進(jìn)樣24s;電泳電壓20KV。艮卩以214nm波長下的吸光值表征細(xì)胞皺縮情況和細(xì)胞蛋白丟失情況，以525nm波長下的吸光值表征細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)目和溶酶體活性的變化情況。兩個波長下的吸光值變化都在一定程度上反映了細(xì)胞樣品的活性，而二者的乘積可同時表征細(xì)胞樣品幾方面的變化。并且，選擇乘積作為表征參數(shù)，對于細(xì)胞樣品的變化具有放大的作用，可提高檢測靈敏度。因此選擇以214nm和525nm下的吸光值的乘積作為細(xì)胞樣品活性的表征。求出對照組正常細(xì)胞以及2、4、6、8、10iig/ml甲基汞處理的待測細(xì)胞樣品的雙波長吸光值乘積數(shù)值見表3。表3甲基汞處理的細(xì)胞樣品活性檢測結(jié)果(中性紅染色)甲基汞濃度tig/ml214rnn峰面積525nm峰面積雙波長吸光值乘積(X103)RSD(X103)090.843.23.920.13282.645.03.720.22455.236.62.020.05650.332.61.640.08848.729.81.450.101042.929.61.270.0權(quán)利要求一種基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式的細(xì)胞活性檢測方法，其特征在于包括以下步驟步驟一、對待測細(xì)胞樣品進(jìn)行預(yù)處理用細(xì)胞染料將待測細(xì)胞染色，離心后移去上清液，再加入磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，直至將殘留細(xì)胞染料洗凈為止；之后，向清洗后的細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞固定液，由此對細(xì)胞進(jìn)行固定化處理，細(xì)胞固定液和固定時間根據(jù)染料特點和細(xì)胞性質(zhì)進(jìn)行選擇；最后，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，直至除去剩余的細(xì)胞固定液；其中，所述細(xì)胞染料為各種活細(xì)胞染料；所述細(xì)胞固定液為常用細(xì)胞固定液中的任意一種；步驟二、進(jìn)行細(xì)胞懸浮液的配制向步驟一得到的細(xì)胞沉淀中加入電泳緩沖液，混勻后得到細(xì)胞懸浮液；然后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)確定出細(xì)胞濃度，再用電泳緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至104-107個/ml范圍；其中，所述電泳緩沖液選用常用毛細(xì)管電泳緩沖液中的任意一種；步驟三、采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測細(xì)胞將步驟二中配制好的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣或電進(jìn)樣，使細(xì)胞溶液進(jìn)入毛細(xì)管一端；然后加電壓，使細(xì)胞溶液在毛細(xì)管內(nèi)移動并通過二極管陣列檢測器；此時，在選定的紫外波長和可見波長下同時檢測進(jìn)樣細(xì)胞，將所有電泳峰的峰面積相加，得到峰面積總和，由其表示細(xì)胞在相應(yīng)波長下的吸光值，用紫外和可見兩波長的吸光值的乘積即可表示細(xì)胞活性的量值；其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳所用毛細(xì)管的長度為30-60cm，內(nèi)徑為10-100μm；采用壓力進(jìn)樣時的壓強為5-250mbar，進(jìn)樣時間為3-30s；采用電進(jìn)樣方式時，電壓為500V-30KV，進(jìn)樣時間為3-30s；加電壓時的電泳電壓為5-30KV；檢測時采用的紫外波長范圍為180-300nm，可見波長直接采用染料的最大吸收波長值。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式的細(xì)胞活性檢測方法，其特征在于所述步驟一中的固定化處理過程在15-3(TC溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式的細(xì)胞活性檢測方法，屬于生物細(xì)胞活性檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明首先將待測細(xì)胞染色并固定，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液，利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)對細(xì)胞進(jìn)行單波長、或多波長紫外可見吸收檢測，以檢測的峰面積總和表示細(xì)胞在檢測波長下的吸光值，以紫外和可見雙波長吸收值的乘積表征細(xì)胞活性。本發(fā)明所述方法準(zhǔn)確、快速、簡便、成本低且能定性定量地檢測細(xì)胞活性，可用于細(xì)胞活性檢測以及毒物的細(xì)胞毒性分析，在細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)及藥物研發(fā)，毒物的毒性評價等相關(guān)領(lǐng)域均可應(yīng)用。文檔編號G01N21/33GK101782509SQ20101010263公開日2010年7月21日申請日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者丁金美,屈鋒,張璐,江倫,胡美齡,郝帥申請人:北京理工大學(xué)