專利名稱：用于逐一細(xì)胞分析的參考對(duì)照的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有由被滲透的血細(xì)胞制成的細(xì)胞類似物的參考對(duì)照，所述被滲透的血細(xì)胞含有聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和被保留的抗原位點(diǎn)，還涉及制備所述參考對(duì)照的方法、以及通過在流式細(xì)胞分析儀上在細(xì)胞成分的逐一細(xì)胞測定中使用該參考對(duì)照的方法。
背景技術(shù)：
在逐一細(xì)胞試驗(yàn)中，細(xì)胞成分的定量測定通常是在細(xì)胞計(jì)數(shù)器上或者血液學(xué)分析儀上進(jìn)行的。通過使用特定的試劑和程序來制備血樣，并且通過利用在這些分析儀上測量的光散射和熒光信號(hào)來確定細(xì)胞成分的存在。許多物理或化學(xué)的因素會(huì)影響細(xì)胞中存在的靶細(xì)胞成分的比例和測定分析儀上的信號(hào)輸出。沒有合適的對(duì)照或參照，很難獲得精確的細(xì)胞成分定量測定。參考對(duì)照可以作為外部對(duì)照被包括在一系列樣品的測定中，或者參考對(duì)照可以作為內(nèi)部對(duì)照被添加進(jìn)每一個(gè)要測定的樣品中。在后一情況中，分析儀必須能區(qū)分參考對(duì)照的細(xì)胞成分和所測定的樣品中的血細(xì)胞的細(xì)胞成分。參考對(duì)照可以包含一種合成的顆粒，比如一種覆蓋著已知含量靶細(xì)胞成分的乳膠珠子。其它參考對(duì)照可包含被穩(wěn)定化的血細(xì)胞，所述血細(xì)胞具有已知量的靶細(xì)胞成分并且在較低的非冷凍溫度下在給定的一段時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的。只要信號(hào)的變化不僅是由于測定儀器固有的誤差造成的，而且是由于用于測定的樣品制品的不同造成的，則優(yōu)選參考對(duì)照的顆粒的表現(xiàn)類似于在樣品制備條件下的樣品中的血細(xì)胞。在這一方面，穩(wěn)定化的血細(xì)胞優(yōu)于合成的粒子。然而，在制備對(duì)照細(xì)胞的過程中或者在非冷凍溫度下的保藏期間，細(xì)胞成分或者細(xì)胞成分的抗原特性常常會(huì)惡化。冷凍細(xì)胞和在超低溫下保藏將克服對(duì)照細(xì)胞隨著時(shí)間的過去而降解的問題。然而，細(xì)胞內(nèi)冰晶會(huì)損害細(xì)胞膜，并且要采取特別預(yù)防措施，比如在凍融循環(huán)中采取添加保護(hù)性試劑例如甘油或者二甲亞砜的方法來保護(hù)細(xì)胞。即使細(xì)胞未損壞，然而被處理的細(xì)胞在凍融循環(huán)后常常呈現(xiàn)大量的變化，這將影響隨后的測定。此外，保護(hù)性試劑也會(huì)干擾將要進(jìn)行的試驗(yàn)。因此，理想的是被用于參考對(duì)照的細(xì)胞具有與被測定的血細(xì)胞相當(dāng)?shù)募?xì)胞形態(tài)， 并且具有被保留的細(xì)胞成分和被保留的待測定的細(xì)胞成分的抗原，并且參考對(duì)照的細(xì)胞可以經(jīng)受凍融循環(huán)且細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞成分抗原沒有惡化。此外，雖然所關(guān)注的具有已知參數(shù)值的參考對(duì)照可用于校正組間分析誤差(inter assay variability)，但是理想的是用含有呈標(biāo)記形式的內(nèi)部對(duì)照來校正組內(nèi)分析誤差 (intra assay variability)以及組間分析誤差。參考對(duì)照中的細(xì)胞標(biāo)記使得測定儀器可以區(qū)分待測定的樣品中的細(xì)胞和被添加至樣品中的對(duì)照細(xì)胞，并且使用這些被標(biāo)記的細(xì)胞作為測定過程的內(nèi)部對(duì)照。此外，在使用抗體或者其它分子探針測定細(xì)胞內(nèi)成分的逐一細(xì)胞試驗(yàn)中，必需滲透細(xì)胞膜，以便抗體或者其它分子探針可以穿透細(xì)胞膜。對(duì)于這樣的試驗(yàn)，理想的是使用的參考對(duì)照含有細(xì)胞膜已經(jīng)被滲透的細(xì)胞，該細(xì)胞膜允許大的探針例如抗體穿透。美國專利號(hào)4，777，139 (Wong等人)教導(dǎo)一種具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的紅細(xì)胞成分的血液學(xué)對(duì)照。Wong等人教導(dǎo)，在足以增加細(xì)胞穩(wěn)定性且不損害溶解試劑溶解細(xì)胞能力的條件下，將洗滌后的紅細(xì)胞暴露于不飽和的醛例如丙烯醛(丙烯醛)。在處理后，洗滌被處理的細(xì)胞，并且細(xì)胞被懸浮在一種穩(wěn)定化懸浮液介質(zhì)中。參考對(duì)照在低的非冷凍溫度下保藏。這些被穩(wěn)定化的細(xì)胞的膜沒有被滲透。紅細(xì)胞中的細(xì)胞血紅蛋白是一種用于臨床診斷的重要參數(shù)。在大多數(shù)血液學(xué)分析儀上，通過溶解試劑溶解血樣的紅細(xì)胞，并且通過使用分光光度法來測定被釋放的血紅蛋白分子形成的色原，獲得血樣的總血紅蛋白濃度。血樣的紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)來源于紅細(xì)胞(RBC)數(shù)目和血樣的總血紅蛋白濃度。平均紅細(xì)胞血紅蛋白量是所有紅細(xì)胞的平均測定值，它不表示單個(gè)紅細(xì)胞的血紅蛋白含量。相反，在流式細(xì)胞儀上細(xì)胞血紅蛋白的測定是逐一細(xì)胞的測定，提供的診斷信息是通過平均紅細(xì)胞血紅蛋白量得不到的。Campbell等人(Cytometry 35，pp 242-248(1999))使用熒光抗血紅蛋白A的抗體進(jìn)行單個(gè)紅細(xì)胞中的血紅蛋白的流式細(xì)胞分析。Burshteyn等人(美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2004/021424 使用抗pan血紅蛋白抗體進(jìn)行流式細(xì)胞分析。因?yàn)榧t細(xì)胞具有高濃度血紅蛋白，為了使用抗體測定總細(xì)胞血紅蛋白，需要大量熒光標(biāo)記的抗體。此外，由于抗體結(jié)合位阻，存在可能的假象；或者由于細(xì)胞中的高密度血紅蛋白，存在可能的熒光消失的情況。因此，理想的是具有一種能夠測定總的細(xì)胞血紅蛋白且不依賴于使用抗體的方法。識(shí)別和/或定量血紅蛋白的變體和異常形式對(duì)于不同的疾病比如鐮刀形紅細(xì)胞貧血病、地中海貧血和糖尿病的臨床診斷是重要的。血紅蛋白Aic的測定已經(jīng)是最頻繁使用的血紅蛋白變體測定法中的一種，并且是用于糖尿病病人的一項(xiàng)重要的臨床測定。已知大約90%的總的血紅蛋白是非糖基化的。非糖基化血紅蛋白的主要部分是非糖基化HbA，稱為HbAO。糖化血紅蛋白指的是通過添加不同的糖類至血紅蛋白分子而形成的一系列較少的血紅蛋白成分。對(duì)于葡萄糖而言，人紅血球是可以自由滲透的。每個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)，糖化血紅蛋白以與周圍葡萄糖濃度成正比例的速度形成。葡萄糖和血紅蛋白的反應(yīng)是無酶催化的、不可逆轉(zhuǎn)的和緩慢的，以致于在紅細(xì)胞生存期間(120天)僅有總血紅蛋白的一小部分被糖化。因此，被糖化的血紅蛋白的測定可提供一種加權(quán)的“移動(dòng)性的”血糖平均水平，可用于長期監(jiān)控血糖水平，提供了在頭2至3個(gè)月內(nèi)的血糖濃度平均值指數(shù)。這個(gè)最重要的臨床應(yīng)用是用于糖尿病病人中糖血控制的評(píng)定。血紅蛋白Alc(HbAlc)是糖化血紅蛋白的一種具體類型，并且是與糖尿病相關(guān)的最重要的血紅蛋白類型。HbAlc占非糖尿病血紅蛋白總量的約3至6%，占糖尿病血紅蛋白總量的 20%或者更高，即控制不佳(Goldstein 等人，CHn. Chem. 32 :B64_B70，1986)。HbAlc 濃度的測定在診斷和監(jiān)控糖尿病中是很有用的。在最近幾十年，已經(jīng)開發(fā)了一些標(biāo)準(zhǔn)HbAlc測定法。一種測定HbAlc的標(biāo)準(zhǔn)方法使用離子交換高壓液相色譜(HPLC)，基于電荷密度差異，分離并分析血紅蛋白HbAO和HbAlc 及其他較少的血紅蛋白成分。另一種色譜分離法是硼酸鹽親合層析，使用一種含固定化的硼酸的凝膠基質(zhì)來捕獲糖化血紅蛋白的順式二醇基。在這些方法中，血樣首先利用溶解試劑溶解，然后形成的溶血液(hemolysate)被用于色譜分離分析。進(jìn)一步的HbAlc測定法是基于免疫比濁法。在此方法中，血樣首先利用溶解試劑溶解，然后形成的溶血液被用于兩個(gè)分開的測定。通過一種比色法測定總血紅蛋白濃度。使用濁度免疫抑制法測定HbAlc濃度，其中試劑中的HbAlc抗體結(jié)合樣品的HbAlc從而形成可溶的抗原-抗體復(fù)合物。然后來自試劑的多半抗原結(jié)合多余抗體，并且生成的凝集的復(fù)合物通過濁度法測定。樣品混合物的混濁度與樣品中的HbAlc濃度成反比。使用血紅蛋白總量和HbAlc濃度計(jì)算樣品HbAlc的百分比。這些標(biāo)準(zhǔn)的HbAlc測定法是總血紅蛋白平均濃度和由樣品中所有溶解紅細(xì)胞獲得的溶血液的HbAlc百分比的整體分析，所述樣品包含成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞。這個(gè)結(jié)果只能被用作在頭2至3個(gè)月內(nèi)的血糖濃度平均值指數(shù)，它并不代表單個(gè)紅細(xì)胞的細(xì)胞 HbAlc百分比，并且沒有提供成熟紅細(xì)胞和未成熟的紅細(xì)胞之間的HbAlc百分比的信息。因此，這些標(biāo)準(zhǔn)方法沒有提供病人對(duì)醫(yī)學(xué)治療的反應(yīng)的及時(shí)信息。許多HbAlc對(duì)照是可商業(yè)性購買的。大多數(shù)這些對(duì)照呈凍干蛋白質(zhì)粉末或者溶血后的液體溶液的形式，被用于上述方法中。最近，美國專利號(hào)7，361，563 (Ryan等人)教導(dǎo)了用于糖化血紅蛋白HbAlc測定的細(xì)胞對(duì)照，其適用于離子交換或者親和層析和如上所述的免疫學(xué)檢測。Ryan等人教導(dǎo)了一種制備參考對(duì)照的方法，包括洗滌血樣；從紅細(xì)胞中除去白細(xì)胞和血小板；利用戊二醛固定紅細(xì)胞；利用一種含葡萄糖、氟化鈉和大豆胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定化稀釋劑洗滌并懸浮被固定的紅細(xì)胞。Ryan等人教導(dǎo)這個(gè)參考對(duì)照在300天6°C下是穩(wěn)定的，并顯示出其在一些利用離子交換HPLC、硼酸鹽親合層析或者免疫比濁法的臨床化學(xué)分析儀上的實(shí)用性。如上所述，使用這些方法，Ryan等人的被穩(wěn)定化的紅細(xì)胞首先被溶解，然后測定來自對(duì)照的所有紅細(xì)胞的總血紅蛋白和總HbAlc濃度。Ryan等人沒有教導(dǎo)滲透被固定的紅細(xì)胞的細(xì)胞膜使得它們可滲透抗體，用于在流式細(xì)胞儀上逐一細(xì)胞的免疫測定?；谝陨纤觯虼死硐氲氖翘峁┮环N包含細(xì)胞類似物的參考對(duì)照用于在流式細(xì)胞儀上逐一分析HbAlc、其它血紅蛋白變體或者其它細(xì)胞成分，該細(xì)胞類似物具有被滲透的細(xì)胞膜。還期望的是具有一種參考對(duì)照，其中細(xì)胞類似物中的總細(xì)胞血紅蛋白可以在一步中與血紅蛋白變體一起被測定。進(jìn)一步地理想的是具有一種含被標(biāo)記的細(xì)胞類似物的參考對(duì)照，以便可以通過使用常用的檢測裝置來容易地識(shí)別并區(qū)分類似物和待測定的血細(xì)胞。 并且，理想的是具有一種可以被冷凍和解凍的用于長期保藏的參考對(duì)照，同時(shí)保持待測定的細(xì)胞類似物的細(xì)胞成分，比如保持蛋白質(zhì)抗原的位點(diǎn)。此外，還期望一種具有抗凍融處理且不使用可能干擾要進(jìn)行的試驗(yàn)的保護(hù)性試劑的參考對(duì)照。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明的目的是提供一種用于在流式細(xì)胞分析儀上逐一細(xì)胞分析的參考對(duì)照。該參照對(duì)照包含由被滲透的血細(xì)液胞制成的細(xì)胞類似物和懸浮介質(zhì)，所述血細(xì)胞中含有被聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和一個(gè)以上被保留的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)，具有可滲透抗體的細(xì)胞膜。該參照對(duì)照在制備后可被冷凍，并在使用前被解凍。所述細(xì)胞類似物在解凍后保持被保留的抗原位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該參考對(duì)照包含被標(biāo)記的細(xì)胞類似物，所述細(xì)胞類似物含有與被處理的血細(xì)胞的細(xì)胞成分相結(jié)合的細(xì)胞標(biāo)記物。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞類似物是由含有被保留的一種以上血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)的紅細(xì)胞所制成的紅細(xì)胞類似物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的目的是提供一種制備本發(fā)明的參考對(duì)照的方法。該方法包括將滲透試劑和血細(xì)胞混合，并且溫育所形成的滲透混合物足夠長的一段時(shí)間，以便引起所述血細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集并同時(shí)保留它的抗原位點(diǎn)，并使所述細(xì)胞膜可滲透抗體；向所述滲透混合物中添加中和試劑來抑制滲透劑的進(jìn)一步反應(yīng)；用洗滌液洗滌被滲透的血細(xì)胞，以便除去滲透劑和中和試劑；以及在保藏溶液中懸浮被滲透的血細(xì)胞，以便形成參考對(duì)照。優(yōu)選地，參照對(duì)照可被冷凍用于保藏，并且在使用前被解凍。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的目的是提供一種通過使用本發(fā)明的參考對(duì)照在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行細(xì)胞成分的逐一細(xì)胞測定的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法的目的是使用參考對(duì)照用于在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行血樣的細(xì)胞血紅蛋白測定。該方法包括提供一種含有紅細(xì)胞類似物的參考對(duì)照，所述紅細(xì)胞類似物由被處理的其內(nèi)含有被聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的紅細(xì)胞制成，所述參考對(duì)照具有平均細(xì)胞血紅蛋白參考值；在流式細(xì)胞分析儀上逐一細(xì)胞地測定所述參考對(duì)照中紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)；以及使用測得的側(cè)向角散射信號(hào)和所述參考對(duì)照的參考值來確定待測定樣品中單個(gè)紅細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白。該方法可以進(jìn)一步包括將所述參考對(duì)照與滲透試劑混合；隨后添加含有對(duì)所述血紅蛋白變體具有特異性的熒光標(biāo)記抗體的中和試劑，并使所述抗體與所述紅細(xì)胞類似物內(nèi)的所述血紅蛋白變體結(jié)合；逐一細(xì)胞地測定所述參考對(duì)照中所述紅細(xì)胞類似物的熒光信號(hào)，一并測定側(cè)向角散射信號(hào)；以及使用測得的熒光信號(hào)和測得的側(cè)向角散射信號(hào)、以及所述參考對(duì)照中血紅蛋白變體的參考百分比值來確定待測定樣品中單個(gè)紅細(xì)胞的所述血紅蛋白變體。所述血紅蛋白變體包含糖化血紅蛋白、胎兒血紅蛋白或者異常形式的血紅蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該方法的目的在于使用一種被標(biāo)記的參考對(duì)照用于在流式細(xì)胞分析儀上測定血樣中的細(xì)胞血紅蛋白。該方法包括將一定量的血液與滲透試劑混合以便形成第一樣品混合物；添加含有紅細(xì)胞類似物并具有細(xì)胞血紅蛋白參考值的參考對(duì)照至所述第一樣品混合物中，所述紅細(xì)胞類似物由被處理的其中含聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和被保留的血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)的紅細(xì)胞制成，并且所述被處理的紅細(xì)胞具有可滲透抗體的細(xì)胞膜，所述紅細(xì)胞類似物包含與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光染料；隨后添加中和試劑以便形成第二樣品混合物；在所述流式細(xì)胞分析儀上逐一細(xì)胞地測定所述血液中的所述紅細(xì)胞和所述參考對(duì)照中的所述紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)和第一波長處的熒光信號(hào)；使用在所述第一波長處測得的熒光信號(hào)，將所述血液中的所述紅細(xì)胞和所述參考對(duì)照中的所述紅細(xì)胞類似物區(qū)分開來；以及使用測得的所述紅細(xì)胞和所述紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)、以及所述參考對(duì)照的所述細(xì)胞血紅蛋白參考值，來確定所述紅細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白。該方法進(jìn)一步包括在所述血液與所述滲透試劑混合之前，將所述血液與核酸染料混合以便染色RNA;通過使用在所述第一波長處的所述熒光信號(hào)，將網(wǎng)織紅細(xì)胞與所述血液中的成熟紅細(xì)胞以及與所述紅細(xì)胞類似物區(qū)分開來；以及使用所述側(cè)向角散射信號(hào)和所述參考對(duì)照的所述細(xì)胞血紅蛋白參考值，來確定所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞中的細(xì)胞血紅蛋白。此外，中和試劑可以進(jìn)一步包含一種對(duì)所述血紅蛋白變體特異的熒光標(biāo)記抗體。 該方法進(jìn)一步包括溫育所述第二樣品混合物，使得所述被標(biāo)記的抗體與所述血液的所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞中的、以及所述參考對(duì)照的所述紅細(xì)胞類似物中的所述血紅蛋白變體相結(jié)合；逐一細(xì)胞地測定所述血液中的所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞以及所述參考對(duì)照中的所述紅細(xì)胞類似物在第二波長處的熒光信號(hào)，一并測定所述側(cè)向角散射信號(hào)和在第一波長處的所述熒光信號(hào)；以及使用在所述第二波長處的熒光信號(hào)和所述側(cè)向角
8散射信號(hào)、以及所述參考對(duì)照的所述血紅蛋白變體百分比的參考值，分別確定所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞中的所述血紅蛋白變體的細(xì)胞百分比。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以從下面顯示本發(fā)明典型實(shí)施方式的說明書、連同附圖中體現(xiàn)出來。


圖1A、1B和IC顯示了含被標(biāo)記的參考對(duì)照的正常血樣的前向角散射對(duì)側(cè)向角散射、前向角散射對(duì)FL1、和FLl對(duì)FL4的散點(diǎn)圖，該參考對(duì)照包含如實(shí)施例3描述的由糖尿病病人的血樣制成的紅細(xì)胞類似物。在這三個(gè)散點(diǎn)圖中，所有的軸都是對(duì)數(shù)刻度。圖2A和圖2B分別顯示了正常人血樣㈧和內(nèi)部對(duì)照⑶中紅細(xì)胞的側(cè)向角散射平均值和FL4平均值，在參考對(duì)照解凍后的不同時(shí)期獲得，如實(shí)施例4所描述。圖3顯示了隨著用于測定FL4信號(hào)的PMT的電壓變化的HbAlc百分比變化，和通過使用本發(fā)明的參考對(duì)照所達(dá)到的校正效果。圖4顯示了隨著重新配制的血樣中紅細(xì)胞濃度的變化的HbAlc百分比變化，和通過使用本發(fā)明的參考對(duì)照所達(dá)到的校正效果。圖5A和5B顯示了分別在數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換前后通過本方法獲得的HbAlc百分比與通過來自于參考實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果之間的相關(guān)性，如同實(shí)施例7所述。圖6A至6F分別顯示了在沒有和有使用內(nèi)部對(duì)照的情況下，通過使用本方法獲得的HbAlc百分比與通過來自于參考實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果之間的相關(guān)性，如同實(shí)施例8所述。
具體實(shí)施例方式一方面，本發(fā)明提供了一種包含細(xì)胞類似物的參考對(duì)照及其制備方法，該參考對(duì)照用于在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行逐一細(xì)胞分析。在一個(gè)實(shí)施方式中，該參考對(duì)照包含由被滲透的血細(xì)胞制成的細(xì)胞類似物和懸浮介質(zhì)，所述血細(xì)胞中含有被聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和一個(gè)以上被保留的該胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)，并具有可滲透一種以上抗體的細(xì)胞膜。該參考對(duì)照在制備后可被冷凍，并在使用前被解凍。在一個(gè)特殊的實(shí)施方式中，該參考對(duì)照包含由被滲透的紅細(xì)胞制成的紅細(xì)胞類似物，所述紅細(xì)胞中含有被聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和一個(gè)以上被保留的血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)，并具有可滲透對(duì)血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)特異的一種以上抗體的細(xì)胞膜。現(xiàn)在具體描述本發(fā)明制備參考對(duì)照的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本方法包含以下處理步驟(a)將滲透試劑和血細(xì)胞混合，并且溫育所形成的滲透混合物足夠長的一段時(shí)間，以便引起所述血細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集，同時(shí)保留它的抗原位點(diǎn)，并使所述細(xì)胞膜可滲透抗體；(b)向所述滲透混合物中添加中和試劑來抑制滲透劑的進(jìn)一步反應(yīng)；(c)用洗滌液洗滌被滲透的血細(xì)胞，以便除去滲透劑和中和試劑；以及(d)在保藏溶液中懸浮被滲透的血細(xì)胞，從而形成呈類似物懸浮液形式的參考對(duì)照。為長時(shí)間保藏，參考對(duì)照在制備后可被冷凍，在運(yùn)送過程中仍保持冷凍，正如下文所進(jìn)一步描述的那樣。參考對(duì)照在使用前能被使用者在室溫下自然地解凍。參考對(duì)照可以被用作在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行逐一細(xì)胞分析的內(nèi)部或外部對(duì)照，正如下文所描述的那樣。血液細(xì)胞有代表性地由合適個(gè)體的外周血液中(也稱為全血)收集，所述個(gè)體包括，但不限于，哺乳動(dòng)物、鳥類或爬行動(dòng)物。為測定特殊的臨床病情的目的，血液優(yōu)選從人類收集，包括正常的個(gè)體和已經(jīng)被診斷為所關(guān)注的特殊臨床病情的病人，因此，所關(guān)注的細(xì)胞成分如抗原是存在的或增加的。例如，為制備用于測定HbAlc的參考對(duì)照，血液能夠從被診斷為糖尿病的病人處收集。對(duì)于用于測定鐮狀細(xì)胞性貧血或地中海貧血的參考對(duì)照，血液能夠從患有各自疾病的病人處收集。在其他情況下，血液能夠從具有異常低含量的所關(guān)注細(xì)胞成分的個(gè)體處收集。血液被收集至包含抗凝血?jiǎng)┑娜萜髦?。乙二胺四乙?EDTA)或其他通常使用的抗凝血?jiǎng)绺嗡睾蜋幟仕徕c能被使用。血液在被處理前能在4°C溫度下保藏，優(yōu)選保藏不超過3天。在與滲透試劑混合前，所關(guān)注的血細(xì)胞能夠通過使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如離心、透析或其他合適的方法進(jìn)行分離。例如，當(dāng)制備白細(xì)胞類似物時(shí)，白細(xì)胞能夠在全血離心后通過分離血沉棕黃層(buffy coat)而與紅細(xì)胞分離。然而，當(dāng)通過使用上述方法制備紅細(xì)胞類似物用于細(xì)胞血紅蛋白測定時(shí)，發(fā)現(xiàn)白血細(xì)胞和血小板不需要被從紅血細(xì)胞中去除，因?yàn)樵谥鹨患?xì)胞分析中，通過使用光散射和/或熒光測定，血小板和白血細(xì)胞能夠與紅細(xì)胞類似物區(qū)分開來。實(shí)施例2描述了通過上文所描述的本發(fā)明方法，使用全血制備被標(biāo)記的紅細(xì)胞類似物的示例性方法。應(yīng)當(dāng)注意，參考對(duì)照的制備特別被描述在制備被標(biāo)記的紅細(xì)胞類似物的方法中，該方法將在后面更詳細(xì)地被描述，然而，除了與標(biāo)記相關(guān)的步驟外，該方法能被用于制備不做標(biāo)記的細(xì)胞類似物。還應(yīng)當(dāng)注意的是，當(dāng)制備無熒光標(biāo)記的細(xì)胞類似物時(shí)，血細(xì)胞不需要被洗滌，并且全血能夠直接用于制備參考對(duì)照。此外，該方法也能用于制備其他細(xì)胞類似物，如白血細(xì)胞，或特殊的白血細(xì)胞亞群。為測定細(xì)胞血紅蛋白的目的，優(yōu)選被標(biāo)記的紅血細(xì)胞在用滲透試劑處理之前也可被暴露于球形化劑，以便球形化紅細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)注意，球形化步驟是可選的。而且，當(dāng)制備白血類似物時(shí)，不需要該步驟。此處使用的滲透試劑也被稱為細(xì)胞透化和穩(wěn)定化試劑，U. S. 20060178294 Al中描述了它在滲透細(xì)胞膜和保留細(xì)胞成分中的功能，用于流式細(xì)胞儀測定，其全部內(nèi)容并入此文以供參考。在一個(gè)實(shí)施方式中，滲透試劑是包含下述分子結(jié)構(gòu)式表示的N-?；“彼峄蚱潲}的水溶液=R1-CO-N(CH3)CH2COOxi其中R1是具有8-18個(gè)碳原子的烷基或亞烷基，X1是H、 Na+或K+，和一種以上用以調(diào)節(jié)試劑pH值至少于7的pH調(diào)節(jié)劑。滲透試劑優(yōu)選pH范圍是大約4到6的微酸性試劑。更優(yōu)選試劑的pH值是大約4. 6至5. 6。pH調(diào)節(jié)劑優(yōu)選強(qiáng)堿性或強(qiáng)酸性，因此，小劑量的化合物可以用于調(diào)節(jié)PH在所需要的范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用N-酰基肌氨酸游離酸，并且使用吡咯烷(強(qiáng)有機(jī)堿)或者氫氧化鈉(強(qiáng)無機(jī)堿)來調(diào)節(jié)PH值在4到6之間。若使用N-?；“彼猁}， 則可以使用強(qiáng)酸如HCl來調(diào)節(jié)pH值。另外，可以使用有機(jī)緩沖液來維持pH。在一個(gè)典型的實(shí)施方式中，使用PKal是4. 19并且pKa2是5. 57的琥珀酸。滲透試劑具有電導(dǎo)率限定為小于9. OmS/cm的低離子強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞暴露于滲透試劑時(shí)，胞內(nèi)蛋白的聚集在低離子強(qiáng)度下更加有效。為本發(fā)明的目的，通過試劑電導(dǎo)率來定量含水試劑組合物所需要的離子強(qiáng)度。人們認(rèn)為胞內(nèi)蛋白聚集對(duì)于滲透后維持細(xì)胞完整性是必須的。當(dāng)滲透試劑的離子強(qiáng)度太高時(shí)，例如當(dāng)試劑電導(dǎo)率是9mS/cm以上時(shí)，試劑不再能夠聚集胞內(nèi)蛋白，細(xì)胞會(huì)失去它們的完整性。優(yōu)選滲透試劑的電導(dǎo)率小于3. OmS/ cm，最好小于1. 2mS/cm0因?yàn)殡x子化合物，例如鹽，是水溶液離子強(qiáng)度的主要貢獻(xiàn)者，因此滲透試劑優(yōu)選低鹽濃度。游離酸形式的N-?；“彼峒捌潲}是市場上可買到的。優(yōu)選使用不會(huì)將金屬離子帶入滲透試劑中的游離酸形式。游離酸形式的N-?；“彼岵皇撬苄缘?，它能夠預(yù)先溶解在酒精溶液中，然后被加入到水溶液中。當(dāng)滲透試劑的PH值用堿調(diào)節(jié)到4到6之間時(shí)， 作為PH調(diào)節(jié)劑，N-?；“彼嵊坞x酸可以被溶解且以溶液中陰離子的形式存在。N-?；“彼岷线m的例子包括N-油酰肌氨酸，N-硬脂酰肌氨酸，N-月桂酰肌氨酸，N-肉豆蔻酰肌氨酸，N-椰油酰肌氨酸和它們的鹽。R1烷基或亞烷基優(yōu)選具有12個(gè)碳原子。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用N-月桂酰肌氨酸。滲透試劑N-?；“彼峒捌潲}的用量足以滲透細(xì)胞膜，足以允許胞內(nèi)標(biāo)記物穿透被滲透的膜，同時(shí)基本上保留細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分，用于與其細(xì)胞標(biāo)記物特異性地結(jié)合，用于通過流式細(xì)胞術(shù)的逐一細(xì)胞分析。研究發(fā)現(xiàn)，N-?；“彼岬臐舛瓤梢栽诖蠹s 0. OlmM至大約IOOmM的范圍，優(yōu)選大約0. ImM至大約IOmM的范圍，更優(yōu)選大約ImM至大約 5mM的范圍。可以選擇的，滲透試劑進(jìn)一步包含下述分子結(jié)構(gòu)式表示的陰離子表面活性劑R2-0-S03)(2其中&是具有8到18個(gè)碳原子的烷基或亞烷基；X2是Na+、K+、NH4+或者 NH2C(CH2OH)3(即，三羥甲基氨基甲烷)。優(yōu)選陰離子表面活性劑中的民烷基或亞烷基具有 12個(gè)碳原子。合適的例子包括鈉、鉀、銨和三羥甲基氨基甲烷十二烷基硫酸鹽。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用三羥甲基氨基甲烷十二烷基硫酸鹽，即下文所稱的Tris十二烷基硫酸鹽。烷基或亞烷基硫酸鹽可以在大約0. OlmM至大約5mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選大約0. 05mM至大約2mM的范圍內(nèi)。此外，滲透試劑優(yōu)選還包含一種以上有機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)劑。滲透壓調(diào)節(jié)劑的合適的例子包括，但不限于，糖、乙二醇、二甲亞砜或甘油。優(yōu)選使用糖或甘油。糖可以是多糖如雙糖、或單糖。在如實(shí)施例1所示的典型的實(shí)施方式中，使用了蔗糖。在存在有機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)劑的情況下，雖然滲透試劑具有非常低的離子強(qiáng)度，但它僅僅是低滲的，并具有大約240至大約^0m0sm/kg水的滲透壓濃度?？蛇x擇地，滲透試劑進(jìn)一步包括血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)。血清白蛋白增強(qiáng)了水溶液中表面活性劑的溶解度，且有利于滲透試劑的長期使用和保藏。此外，滲透試劑可進(jìn)一步包含一種以上防腐劑。合適的例子包括抗菌劑和抗氧化劑，用以延長滲透試劑保質(zhì)期。防腐劑以一定數(shù)量存在不會(huì)影響滲透試劑的功能。在一個(gè)實(shí)施方式中，5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮被作為抗菌劑使用。由羅門哈斯公司(費(fèi)城，賓夕法尼亞州)制備的商品名為ftx)Clin 150和ftOclin 300的5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉_3_酮的組合物是可以買到的。實(shí)施例1顯示了本發(fā)明的滲透試劑的示例性組合物。優(yōu)選以試劑對(duì)血液為大約100 1或以上的比例混合血液和滲透試劑。形成的滲透混合物被溫育足以允許滲透試劑與細(xì)胞反應(yīng)的一段時(shí)期。溫育時(shí)間優(yōu)選大約1分鐘至10 分鐘，更優(yōu)選大約2分鐘至大約5分鐘。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)混合了血細(xì)胞時(shí)，滲透試劑能有效地滲透細(xì)胞膜至一定程度，以允許大分子胞內(nèi)標(biāo)記物比如抗體滲透入細(xì)胞以便與胞內(nèi)成分相結(jié)合用于進(jìn)行隨后的測定。滲透試劑導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集，同時(shí)保留了細(xì)胞成分，如胞內(nèi)和細(xì)胞表面的抗原位點(diǎn)、 DNA和RNA分子以及細(xì)胞骨架成分，用于隨后的逐一細(xì)胞分析。此外，在滲透處理期間，紅細(xì)胞也可被滲透試劑球形化，使得可以通過光散射測定法來測定紅細(xì)胞，而不會(huì)有因不同的細(xì)胞形狀和朝向造成的不良影響。為本發(fā)明的目的，術(shù)語“細(xì)胞成分”或“細(xì)胞組成”包括細(xì)胞內(nèi)的、細(xì)胞膜表面上的細(xì)胞成分，例如細(xì)胞表面抗原位點(diǎn)。而術(shù)語“胞內(nèi)成分”或“胞內(nèi)組成”指的是細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞成分，包括，但不限于胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白和血紅蛋白變體、細(xì)胞骨架成分、 DNA和RNA。細(xì)胞骨架成分包括但不限于微管蛋白和血影蛋白。此處使用的術(shù)語“細(xì)胞標(biāo)記物”包括，但不限于對(duì)于胞內(nèi)蛋白質(zhì)抗原位點(diǎn)、細(xì)胞表面抗原位點(diǎn)或細(xì)胞骨架成分有特異性的抗體；染料如核酸染料或?qū)?xì)胞蛋白質(zhì)有特異性的染料；和對(duì)DNA或RNA分子有特異性的核酸探針，如寡聚核苷酸探測劑。細(xì)胞標(biāo)記物優(yōu)選是熒光性的或是用熒光染料標(biāo)記的。 此外，對(duì)胞內(nèi)成分特異的細(xì)胞標(biāo)記物指的是胞內(nèi)標(biāo)記物。如U. S. 2006/0178294 Al中所描述的，滲透試劑引起由全血制備的血清部分、可溶性細(xì)胞部分(胞液)和膜部分的沉淀。尤其是在可溶性細(xì)胞部分中，通過樣品混合物光密度的大量增長證明，因?yàn)檠t蛋白的存在，在與滲透試劑反應(yīng)后發(fā)生了強(qiáng)力聚集和沉淀。如U. S. 2007/0020612 Al中所進(jìn)一步描述的，在被暴露于滲透試劑的全血樣品中，紅細(xì)胞側(cè)向角散散信號(hào)的大量增長反映了血細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集。然而，另一方面，正如 U. S. 2006/0178294 Al所進(jìn)一步顯示的，被滲透的血細(xì)胞維持了它們的抗原位點(diǎn)和抗體結(jié)合特異性，例如，紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的微管蛋白與抗微管蛋白-FITC抗體的結(jié)合、胎兒血紅蛋白和抗HbF-FITC的結(jié)合、胎兒紅細(xì)胞和胞外標(biāo)記抗i-藻紅蛋白(PE)的結(jié)合。正如上述描述的，在暴露于滲透試劑后，中和試劑被加入滲透混合物中以抑制滲透試劑的進(jìn)一步反應(yīng)。中和試劑是高滲性的，并具有7或稍微高一些的pH值。當(dāng)與滲透混合物混合后，中和試劑將混合物的PH值調(diào)至中性并增加了混合物的離子強(qiáng)度。同樣地，它有效地抑制了滲透試劑的進(jìn)一步反應(yīng)。人們認(rèn)為與滲透試劑的過度反應(yīng)能導(dǎo)致過度緊密的胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集，這導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)的掩蔽并影響它們與胞內(nèi)標(biāo)記物的結(jié)合。通過滲透試劑處理血細(xì)胞的程度可以被上述的溫育時(shí)間和中和試劑的有效抑制所控制。中和試劑包含滲透壓調(diào)節(jié)劑和緩沖液。滲透壓調(diào)節(jié)劑優(yōu)選一種以上的堿金屬鹽， 優(yōu)選堿金屬鹵化物，如鈉或氯化鉀。中性試劑的滲透壓度優(yōu)選大約800至大約1200m0sm/kg 水。緩沖液可以是提供中性PH值的有機(jī)緩沖液或無機(jī)緩沖液。中性試劑的pH值優(yōu)選大約 7. 0至7. 5，更優(yōu)選大約7. 1至大約7. 4。此外，中和試劑可進(jìn)一步包含血清白蛋白，如牛血清白蛋白。血清白蛋白，尤其是高濃度的血清白蛋白，能提供表面活性劑的競爭性結(jié)合并抑制表面活性劑在細(xì)胞上的作用。因此，血清白蛋白有助于保持細(xì)胞成分的完整，所述細(xì)胞成分尤其是胞內(nèi)抗原位點(diǎn)，如與各自抗體結(jié)合的糖化血紅蛋白(HbAlc)的或者胎兒血紅蛋白(HbF)的抗原位點(diǎn)。血清白蛋白濃度優(yōu)選大約0.4至大約1.2mM。并且，中和試劑可進(jìn)一步包含抗菌劑。在一個(gè)典型的實(shí)施方式中，使用疊氮化鈉。疊氮化鈉是強(qiáng)抗菌劑，該強(qiáng)抗菌劑尤其適合中和試劑，因?yàn)樗兄行訮H值并具有高濃度的牛血清白蛋白。實(shí)施例1描述了中和試劑的典型組合物。優(yōu)選實(shí)施例1所示的中和試劑與滲透試劑的使用比例為大約0. 3至0. 8。在添加中性試劑后，形成的中和混合物進(jìn)一步被溫育一段時(shí)間，以便有效地抑制滲透試劑的反應(yīng)。 該溫育時(shí)間優(yōu)選大約5分鐘至大約30分鐘，更優(yōu)選大約8分鐘至大約12分鐘。中和后，被處理的血細(xì)胞(也稱為被滲透的血細(xì)胞)，或形成的細(xì)胞類似物是穩(wěn)定的，且細(xì)胞混合物可以被冷凍儲(chǔ)存。然而，中性混合物包含鹽、緩沖液和牛血清白蛋白，可以干擾隨后將要進(jìn)行的試驗(yàn)。因此，從細(xì)胞類似物中除去中和混合物的介質(zhì)，并且用洗滌溶液洗滌細(xì)胞類似物。優(yōu)選使用溫和的離心來改變介質(zhì)。正如實(shí)施例2中所顯示的，包含滲透試劑和中和試劑的中和混合物被分層加在在離心管中的洗滌液體積上。在離心后，上清液被除去。然后，保藏溶液(也稱為懸浮介質(zhì))被加入到堆積的細(xì)胞中，以便懸浮細(xì)胞類似物，形成參考對(duì)照。也可使用其他改變介質(zhì)的合適方法，如過濾或透析。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高速離心對(duì)類似物具有破壞效果。如果使用太高速的離心力，會(huì)導(dǎo)致類似物粘在一起。并且，高速離心可能導(dǎo)致細(xì)胞喪失其部分細(xì)胞成分。為防止離心的有害效果，對(duì)洗滌液層上的中和混合物，使用低速離心。洗滌液包含一種以上的鹽，且具有中性PH 值，包含高濃度的蔗糖。鹽濃度優(yōu)選略微高于生理鹽濃度，以便抑制細(xì)胞類似物的聚集。應(yīng)當(dāng)理解，保藏溶液的組合物，即參考對(duì)照類似物的懸浮介質(zhì)，能夠基于隨后即將進(jìn)行的試驗(yàn)而被確定。換句話說，懸浮介質(zhì)的組合物應(yīng)與即將進(jìn)行的試驗(yàn)相適配。實(shí)施例 1描述了適合此處所述的細(xì)胞血紅蛋白和血紅蛋白變體測定的示例性保藏溶液組合物。在本實(shí)施例中，保藏溶液是包含鹽分和高濃度蔗糖并具有中性PH值的水溶液。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞類似物的細(xì)胞血紅蛋白能夠通過在流式細(xì)胞分析儀上測定的類似物的測向角散射信號(hào)而被確定，正如實(shí)施例中所進(jìn)一步描述的那樣。本發(fā)明的紅細(xì)胞類似物的性質(zhì)與全血中未處理的紅細(xì)胞、被球形化的紅細(xì)胞或穩(wěn)定的紅細(xì)胞的性質(zhì)完全不同，因?yàn)檫@些細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白不能根據(jù)測向角散射信號(hào)測定來確定。雖然確切的原理尚沒有完全被理解，但人們確信紅細(xì)胞類似物中細(xì)胞血紅蛋白和它們的測向角散射信號(hào)的直接相關(guān)性可歸因于滲透試劑處理后滲透細(xì)胞內(nèi)的聚集血紅蛋白的特性。該差異能夠進(jìn)一步被該事實(shí)證實(shí)使用本發(fā)明方法獲取的紅細(xì)胞類似物不能被溶解試劑所溶解從而釋放血紅蛋白；而穩(wěn)定的紅細(xì)胞，即使在某一固定條件下被處理，也能被溶解試劑所溶解從而釋放血紅蛋白，用于在標(biāo)準(zhǔn)的臨床化學(xué)分析儀器上通過色譜分析法或免疫比濁測定法進(jìn)行測定。此外，本發(fā)明的紅細(xì)胞類似物的細(xì)胞膜具有高滲透性，允許大分子探針例如抗體進(jìn)入并與胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明的紅細(xì)胞類似物通過阻抗量測進(jìn)行測定時(shí)， 例如通過血液分析儀上的直流電(DC)阻抗量測時(shí)，來自這些類似物的阻抗信號(hào)實(shí)質(zhì)上要比那些未經(jīng)處理的紅細(xì)胞或固定的紅細(xì)胞所產(chǎn)生的阻抗信號(hào)小。DC阻抗測量已被通用于在血液分析儀上測定血細(xì)胞大小。該測定方法是基于由血細(xì)胞引起的電阻增加，電阻增加能抵制一定量的被測定的電導(dǎo)溶劑。正如可被證實(shí)的那樣，由于本發(fā)明的紅細(xì)胞類似物胞膜被高度滲透，所以當(dāng)類似物懸浮于導(dǎo)電溶劑時(shí)，導(dǎo)電溶劑能夠自由地出入該類似物，因此， 由這些類似物所產(chǎn)生的阻抗信號(hào)減少。然而，當(dāng)通過前向角散射測定時(shí)，該方法在測定細(xì)胞尺寸時(shí)也是通用方法，這些被滲透的紅細(xì)胞基本上顯示出與球形化的紅細(xì)胞相同的尺寸。 由于這個(gè)原因，紅細(xì)胞類似物與固定紅細(xì)胞完全不同。后者對(duì)抗體不具有滲透性，且具有與未被處理的紅細(xì)胞基本相同的阻抗信號(hào)。
如后文所描述的，制備用于本發(fā)明參考對(duì)照的細(xì)胞類似物所使用的滲透試劑和中和試劑與用于通過在流式細(xì)胞儀上處理血樣而使用的試劑相同。形成的細(xì)胞類似物被洗滌并再次在保藏溶劑中懸浮，無需通過用細(xì)胞類似物制備中通用的固定劑固定。然而，正如隨后通過實(shí)施例所描述的，在缺少固定劑處理時(shí)，這些細(xì)胞類似物在暴露于冷凍和融化的環(huán)境下是穩(wěn)定的，且維持了用于免疫測定的抗原位點(diǎn)的特異性。為了長時(shí)間的穩(wěn)定性，參考對(duì)照優(yōu)選在制備后保持冷凍。典型地，在制備后，參考對(duì)照被分配至對(duì)照小瓶中。對(duì)照小瓶隨后被冷凍并保持在不高于-io°c的溫度，優(yōu)選-io°c 到-80°C。參考對(duì)照在制備后優(yōu)選在少于M小時(shí)內(nèi)、更優(yōu)選在少于2小時(shí)內(nèi)、最優(yōu)選在1小時(shí)內(nèi)冷凍。在發(fā)貨到顧客期間，參考對(duì)照被保持在干冰中或其他合適的材料中冷凍。在使用前，小瓶中的參考對(duì)照在室溫下解凍。在解凍后，參考對(duì)照在使用前輕柔地混合以便形成均勻的類似物懸浮物。正如可被證實(shí)的那樣，為本發(fā)明的目的，保藏溶液或懸浮介質(zhì)適合于在冷凍和解凍的條件下保藏。在一個(gè)實(shí)施方式中，保藏溶液是包含鹽和糖的水溶液。鹽濃度為大約
0.05M到大約2M，優(yōu)選大約0. IM到大約0. 5M。糖是多糖比如二糖，或單糖。實(shí)施例1所示的示例性的實(shí)施方式中，蔗糖被使用。糖濃度從大約0. IM到大約2M，優(yōu)選大約0. 5M到大約
1.5M。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，糖比如蔗糖的相對(duì)高濃度阻止了細(xì)胞類似物在冷凍類似物懸浮解凍后、和在試驗(yàn)使用過程中在對(duì)照小瓶中的下降。此外，正如上文所描述的，懸浮介質(zhì)也應(yīng)當(dāng)與將要進(jìn)行的試驗(yàn)相適配。例如，由于磷酸鹽傾向干擾流式細(xì)胞儀上進(jìn)行的試驗(yàn)，應(yīng)考慮在參考對(duì)照將被使用的試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定是否在保藏溶液中使用磷酸鹽。已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的參考對(duì)照中的細(xì)胞類似物在沒有使用保護(hù)劑的情況下對(duì)冷凍和解凍處理也是有耐受性的，并且在類似物懸浮物冷凍和解凍后，保留了細(xì)胞抗原位點(diǎn)和細(xì)胞類似物對(duì)于大分子探針的滲透性。在不結(jié)合任何理論的情況下，相信該獨(dú)一無二的特性可能可歸因于被聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)上抗原位點(diǎn)的保留。正如下文所描述的，在使用參考對(duì)照的方法中，本發(fā)明參考對(duì)照中的細(xì)胞類似物維持了它們對(duì)抗體的特異性。當(dāng)被加入血樣中時(shí)，本發(fā)明參考對(duì)照的細(xì)胞類似物經(jīng)歷著與血樣在試驗(yàn)中經(jīng)歷的相同的抗體抗原反應(yīng)，且基本上模擬了儀器中樣品的血細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含被熒光標(biāo)記的細(xì)胞類似物的參考對(duì)照。用如此標(biāo)記產(chǎn)生的細(xì)胞類似物在此被稱為被標(biāo)記類似物，包含被標(biāo)記類似物的參考對(duì)照被稱為(被)標(biāo)記的參考對(duì)照。當(dāng)參考對(duì)照被加入血樣中作為試驗(yàn)的內(nèi)部對(duì)照時(shí)，參考對(duì)照中被標(biāo)記的類似物能被識(shí)別，且能容易地通過熒光測定與樣品的血細(xì)胞區(qū)別開來。為了制備被標(biāo)記的參考對(duì)照，上述的本發(fā)明方法進(jìn)一步包括標(biāo)記用于制備細(xì)胞類似物的血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，熒光染料、羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯被用于標(biāo)記血細(xì)胞中的細(xì)胞蛋白質(zhì)。其他各種熒光標(biāo)記也用于標(biāo)記細(xì)胞。眾所周知，羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)是親脂性分子和可被動(dòng)地?cái)U(kuò)散入細(xì)胞的非熒光性化合物。在細(xì)胞內(nèi)，酯酶去除了乙?；?，剩余的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)明顯具有熒光。CFSE與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，且能很好地保留在細(xì)胞內(nèi)。CFSE具有488nm的激發(fā)波長和510-550nm的發(fā)射波長，適合在具有488nm的激發(fā)波長和525nm檢測器的流式細(xì)胞儀上使用。實(shí)施例2描述了用上文描述的本發(fā)明方法使用全血來制備標(biāo)記紅細(xì)胞類似物的實(shí)施例。如其所示，在制備被標(biāo)記的細(xì)胞類似物時(shí)，血細(xì)胞首先與血漿分離，在將血細(xì)胞暴露于熒光染料前，用等滲稀釋液例如磷酸鹽緩沖鹽水或其他合適的稀釋劑進(jìn)行洗滌。為了使用CFDA-SE標(biāo)記血細(xì)胞，被洗滌的血細(xì)胞在包含CFDA-SE的等滲溶液中被溫育一段充分的時(shí)間，以便使染料穿透細(xì)胞膜并且允許CFSE標(biāo)記胞內(nèi)蛋白質(zhì)。溫育時(shí)間可以是大約1小時(shí)到大約5小時(shí)左右，優(yōu)選大約2小時(shí)到大約4小時(shí)。溫育后，被標(biāo)記的血細(xì)胞在暴露于滲透試劑前用等滲稀釋液洗滌，以便去除介質(zhì)中多余的染料。隨后的制備步驟，即，與滲透試劑反應(yīng)、用中和試劑抑制、洗滌、冷凍及解凍，與在上文所描述的制備無標(biāo)記的參考對(duì)照過程中的步驟相同。在暴露于滲透試劑前，被標(biāo)記的血細(xì)胞優(yōu)選在實(shí)施例2中所描述的自體血清或其他血清中再次懸浮以形成重新配制的血液。血清的存在防止在隨后的制備步驟中血細(xì)胞丟失血紅蛋白。優(yōu)選重新配制的血液與滲透試劑混合，試劑與血液的比例大約為100 1以上。任選地，為測定細(xì)胞血紅蛋白，被標(biāo)記的紅細(xì)胞在用滲透試劑處理前可以暴露于球形化試劑，以便使得被標(biāo)記的紅細(xì)胞球形化。在下文描述的測定成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞中的細(xì)胞血紅蛋白和血紅蛋白變體的方法中，通過使用核酸染料的熒光測定使得網(wǎng)狀細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞區(qū)分開來。用熒光標(biāo)記的細(xì)胞類似物需要與用核酸染料染色的網(wǎng)狀細(xì)胞區(qū)分開來。正如實(shí)施例3中所描述的，被 CFSE標(biāo)記的細(xì)胞類似物和血液樣本中經(jīng)核酸染料染色的網(wǎng)狀細(xì)胞都可在525nm(FLl)處被檢測到，但是，CFSE的FLl信號(hào)比用于染色網(wǎng)狀細(xì)胞中RNA的吖啶橙的FLl信號(hào)要強(qiáng)的多。 當(dāng)參考對(duì)照被用于作為試驗(yàn)內(nèi)部對(duì)照時(shí)，該強(qiáng)度的不同使得參考對(duì)照中被標(biāo)記的類似物與血樣中成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞區(qū)分開來。已知熒光標(biāo)記與蛋白質(zhì)的結(jié)合可能影響蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)或干擾抗體結(jié)合。因此，重要的是參考對(duì)照中被標(biāo)記的類似物基本保留它們的結(jié)合特異性和對(duì)用于試驗(yàn)的抗體的親和力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在熒光標(biāo)記后，上文描述的細(xì)胞類似物的特性得以保留。更具體地說， 被標(biāo)記的細(xì)胞類似物的細(xì)胞血紅蛋白能夠使用上文描述的和下述實(shí)施例中所進(jìn)一步描述的側(cè)向角散射信號(hào)進(jìn)行測定。蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)特異性和膜的滲透性得以保留。此外，被標(biāo)記的類似物對(duì)冷凍與解凍處理的耐受性也得以保留。本發(fā)明的參考對(duì)照包含被標(biāo)記的類似物或未被標(biāo)記的類似物，可以在上文描述的冷凍環(huán)境下保藏至少一年，同時(shí)保留細(xì)胞類似物的細(xì)胞成分的特性。實(shí)施例2描述了由正常的人類全血制備被標(biāo)記的參考對(duì)照。實(shí)施例4進(jìn)一步描述了由糖尿病患者的全血制備被標(biāo)記的參考對(duì)照，以及解凍后在使用側(cè)向角散射信號(hào)測定細(xì)胞血紅蛋白和使用熒光測定HbAlc中被標(biāo)記的參考對(duì)照的穩(wěn)定性，這些在下文中有進(jìn)一步的描述。細(xì)胞血紅蛋白，具體的血紅蛋白變體含量如HbAlc以及參考對(duì)照中特定的血紅蛋白變體百分比可以通過在流式細(xì)胞分析儀上使用側(cè)向角散射和熒光測定來確定，這些方法在下文會(huì)進(jìn)一步描述。術(shù)語“流式細(xì)胞分析儀”指本領(lǐng)域已知的流式細(xì)胞儀和裝有光散射和/或熒光檢測裝置的血液分析儀。參考對(duì)照的這些參數(shù)的參考值可通過在相同的流式細(xì)胞分析儀上和在相同的操作條件下測定血樣和參考對(duì)照進(jìn)行賦值，這些血樣具有根據(jù)現(xiàn)有參考方法而獲得的已知的這些參數(shù)值。多種參考方法在本領(lǐng)域是已知的，例如，血樣的平均細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)能夠從血液分析儀中獲得，HbAcl百分比能夠通過使用親和色譜法、免疫比濁法或者離子交換色譜法獲得。實(shí)施例7描述了用于本發(fā)明參考對(duì)照的賦值參考值的具體方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在流式細(xì)胞分析儀上將上文描述的參考對(duì)照用于細(xì)胞中細(xì)胞成分的逐一細(xì)胞分析的方法。參考對(duì)照能或者被用作獨(dú)立對(duì)照、或者用作內(nèi)部對(duì)照。術(shù)語“獨(dú)立對(duì)照”指不與樣品混合，單獨(dú)通過流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析的參考對(duì)照。獨(dú)立對(duì)照一般與一批樣品一起分析，作為用于組內(nèi)分析或組間分析目的的參考物。術(shù)語“內(nèi)部對(duì)照”指被加入樣品中與樣品一起在流式細(xì)胞分析儀上分析的參考對(duì)照。本發(fā)明參考對(duì)照用于逐一細(xì)胞分析的方法通過下文中測定細(xì)胞血紅蛋白和血紅蛋白變體的細(xì)胞百分比的實(shí)施例進(jìn)行描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，使用本發(fā)明方法制備的參考對(duì)照也可被用于測定其他細(xì)胞成分。本文中，術(shù)語“細(xì)胞血紅蛋白”指單個(gè)紅細(xì)胞中血紅蛋白總量，該血紅蛋白包含了細(xì)胞中存在的所有血紅蛋白變體。術(shù)語“網(wǎng)狀細(xì)胞的血紅蛋白”指單個(gè)網(wǎng)狀細(xì)胞中的血紅蛋白總量，該血紅蛋白包含了網(wǎng)狀細(xì)胞中存在的所有血紅蛋白變體。細(xì)胞血紅蛋白通常也被稱為逐一細(xì)胞(cell-by-cell)的血紅蛋白。術(shù)語“血紅蛋白變體”指所有的血紅蛋白變體，例如，胎血紅蛋白、糖化血紅蛋白如HbAlc、以及血紅蛋白的異常形式如那些在鐮狀細(xì)胞疾病和地中海貧血中發(fā)現(xiàn)的異常形式。術(shù)語“細(xì)胞血紅蛋白變體”指在單個(gè)紅細(xì)胞中血紅蛋白變體含量。術(shù)語“血紅蛋白變體的細(xì)胞百分比”指單個(gè)紅細(xì)胞中血紅蛋白變體比上血紅蛋白總量的百分比。例如，在本文描述的HbAlc的測定中，用HbAlc的細(xì)胞百分比或細(xì)胞的HbAlc百分比表示。因此，使用本發(fā)明方法獲得的樣品中血紅蛋白變體百分比是血樣中所有被測定的紅細(xì)胞中該血紅蛋白變體的細(xì)胞百分比的平均值。為了在流式細(xì)胞分析儀上將本發(fā)明參考對(duì)照用于血樣的細(xì)胞血紅蛋白和細(xì)胞血紅蛋白變體的測定，提供了包含由被滲透的紅細(xì)胞制備的紅細(xì)胞類似物的參考對(duì)照。紅細(xì)胞類似物包含其內(nèi)被聚集的胞內(nèi)蛋白和被保留的所關(guān)注的血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)，且具有可滲透抗體的細(xì)胞膜。當(dāng)該參考對(duì)照被用于內(nèi)部對(duì)照或獨(dú)立對(duì)照時(shí)，將參考對(duì)照和血樣暴露于相同的試劑和相同的試驗(yàn)步驟(見實(shí)施例幻，然后在流式細(xì)胞分析儀上通過側(cè)向角散射和熒光測定方法進(jìn)行分析。血樣中紅細(xì)胞和參考對(duì)照中紅細(xì)胞類似物的血紅蛋白通過使用側(cè)向角散射信號(hào)確定。血樣中紅細(xì)胞和參考對(duì)照中紅細(xì)胞類似物的血紅蛋白變體通過使用熒光信號(hào)確定。通過使用側(cè)向角散射和熒光測定來測定血樣的細(xì)胞血紅蛋白和細(xì)胞血紅蛋白變體的方法已在U. S. 2007/0020612 Al中有詳細(xì)描述，在此將其全部內(nèi)容并入此文以供參考。更具體地說，通過使用該方法，將血樣與滲透試劑混合形成第一樣品混合物。第一樣品混合物被溫育了一段充分的時(shí)間，以使胞內(nèi)蛋白聚集，且使得抗體可滲透入細(xì)胞膜。隨后，中和試劑被加入第一樣品混合物中，以抑制滲透試劑進(jìn)一步與紅細(xì)胞反應(yīng)，從而形成了第二樣品混合物。接著，在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行第二樣品混合物的側(cè)向角散射測定。血樣的細(xì)胞血紅蛋白通過使用獲得的側(cè)向角散射信號(hào)被確定。當(dāng)測定血紅蛋白變體時(shí)，中和試劑可進(jìn)一步包含對(duì)所關(guān)注血紅蛋白變體具有特異性的熒光標(biāo)記的抗體，如抗HbAlc或抗Hbf抗體。由于細(xì)胞膜能被滲透試劑滲透，大的抗體分子能穿過細(xì)胞膜與紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)結(jié)合。第二樣品混合物被溫育一段
16時(shí)間，以允許抗體結(jié)合。接著，第二樣品混合物的熒光測定與側(cè)向角散射測定同時(shí)進(jìn)行，血紅蛋白變體的細(xì)胞百分比可以通過使用熒光信號(hào)和側(cè)向角散射信號(hào)來確定。此外，當(dāng)血樣網(wǎng)狀細(xì)胞中的細(xì)胞血紅蛋白和血紅蛋白變體將被測定時(shí)，如上文所描述，該方法可進(jìn)一步包括在將血樣暴露于滲透試劑前，用核酸染料染色血樣?？梢赃x擇的是，核酸染料可以被包含在球形化試劑中，這能增強(qiáng)核酸染料穿透進(jìn)入細(xì)胞膜的速度。在半自動(dòng)測定方法中，上文描述的第二樣品混合物在流式細(xì)胞分析儀上以一個(gè)批次接一個(gè)批次的方式被測定。被制備的樣品混合物在測定前可能等候很長時(shí)間，如幾小時(shí)。 因此，在本發(fā)明的方法中，固定試劑可以選擇性地被加入第二樣品混合物中以固定細(xì)胞。固定試劑包含固定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和緩沖液。固定劑優(yōu)選醛類，包括但不限于甲醛、多聚甲醛或戊二醛。滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是一種以上堿金屬鹽，優(yōu)選堿金屬鹵化物，如氯化鈉或氯化鉀。固定劑優(yōu)選滲透壓為大約1100到大約1400m0sm/kg水的高滲透性試劑。 緩沖液可以是能提供中性PH值的有機(jī)或無機(jī)緩沖液。固定試劑的PH值優(yōu)選大約6. 9到大約7. 3，能夠維持中和試劑所獲得的中性pH值。此外，固定試劑優(yōu)選包含螯合劑如硫酸葡聚糖、EGTA和硼酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與一般使用包含甲醛和磷酸鹽緩沖劑的固定試劑相比，固定試劑中的硫酸葡聚糖、EGTA和硼酸的組合能有效地抑制在最終樣品混合物中的細(xì)胞聚集。實(shí)施例1顯示了固定試劑的示例性組合物。實(shí)施例3描述了使用被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照來測定血樣的細(xì)胞血紅蛋白和血紅蛋白變體的方法，被標(biāo)記的參考對(duì)照通過使用實(shí)施例2的方法由正常的全血制備。如實(shí)施例3中所描述，一定體積的全血樣品首先與包含吖啶橙的球形化試劑混合，以便染色網(wǎng)狀細(xì)胞RNA。然后，一定體積的被染色的樣品混合物與實(shí)施例1中的滲透試劑混合， 形成第一樣品混合物。溫育后，被標(biāo)記的參考對(duì)照被加入第一樣品混合物中。隨后，加入實(shí)施例1中的包含熒光抗HbAlc抗體的中和試劑，形成第二樣品混合物。第二樣品混合物被溫育，以允許抗體穿透被滲透的細(xì)胞膜且與HbAlc抗原結(jié)合。其后，加入實(shí)施例1中的固定試劑，形成最終樣品混合物。在Beckman Coulter _ FC500MCL血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上，通過前向角散射和側(cè)向角散射測定、以及在525nm(FLl)與675nm(FL4)處的熒光測定，分析最終樣品混合物。圖IA到IC 分別顯示了得到的前向角散射(FS)對(duì)側(cè)向角散射(SS)、FS對(duì)FL1、和FLl對(duì)FL4的散點(diǎn)圖。本文中，術(shù)語“側(cè)向角散射信號(hào)”，在流式細(xì)胞術(shù)中已知是指來自入射光90°左右或直角的光散射信號(hào)，該光散射信號(hào)由穿過流動(dòng)細(xì)胞孔徑的粒子或血細(xì)胞產(chǎn)生。前向角散射信號(hào)是指量出的來自入射光小于10°的光散射信號(hào)。術(shù)語“側(cè)向角散射信號(hào)測定”是指光檢測器的側(cè)向角散射信號(hào)測定。大部分市場上可買到的流式細(xì)胞分析儀都裝備有能夠測定前向角散射信號(hào)和側(cè)向角散射信號(hào)的檢測系統(tǒng)。圖IA中，區(qū)域A包含血樣中的紅細(xì)胞和參考對(duì)照中的被標(biāo)記的類似物，如圖IB和 IC所顯示，在該散點(diǎn)圖上選出的(gated)紅細(xì)胞和類似物通過使用熒光被用于進(jìn)一步的差異分析。區(qū)域A外的種群是白血球和血小板。圖IB中，區(qū)域B包含血樣中的成熟紅細(xì)胞；區(qū)域C包含血樣中用吖啶橙染色的網(wǎng)狀細(xì)胞；區(qū)域D包含參考對(duì)照中用CFSE標(biāo)記的類似物。如圖所示，血樣中的成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞及參考對(duì)照中被標(biāo)記的類似物在FLl軸上被區(qū)分開來。圖IC中，區(qū)域F包含血樣中的成熟紅細(xì)胞；區(qū)域G包含血樣中的網(wǎng)狀細(xì)胞；區(qū)域E包含被標(biāo)記的參考對(duì)照中的類似物。可以證實(shí)的是，525nm(FLl)處的熒光測定法可測定產(chǎn)生于吖啶橙染色的RNA和用 CFSE標(biāo)記的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的熒光信號(hào)。如上文所描述的，吖啶橙被用于區(qū)分網(wǎng)狀細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞，CFSE用于標(biāo)記參考對(duì)照中的細(xì)胞類似物。雖然兩種信號(hào)在相同的波長處都能被檢測到，但用CFSE標(biāo)記的細(xì)胞類似物具有比網(wǎng)狀細(xì)胞強(qiáng)得多的信號(hào)。因此，參考對(duì)照中的類似物在散點(diǎn)圖的FLl軸上不會(huì)與網(wǎng)狀細(xì)胞重疊，且能夠與網(wǎng)狀細(xì)胞區(qū)分。血樣的平均細(xì)胞血紅蛋白由血樣中單個(gè)紅細(xì)胞的側(cè)向角散射值的平均值獲得。血樣的HbAlc含量由675nm(FL4)處的熒光信號(hào)在減去熒光背景值后的平均值獲得。血樣的 HbAlc百分比由血樣的HbAlc含量除以血樣的平均細(xì)胞血紅蛋白而計(jì)算。由于成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞相互區(qū)分開來，可以獲得血樣中這兩種紅細(xì)胞亞種群的平均細(xì)胞血紅蛋白和 HbAlc百分比。類似地，由于被標(biāo)記的參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物被與血樣中的成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞區(qū)別開來，通過使用上文描述的相同計(jì)算方法，使用紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)和熒光信號(hào)，可以獲得參考對(duì)照的平均細(xì)胞血紅蛋白和HbAlc百分比?？梢宰C實(shí)的是，當(dāng)具有紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH，血紅蛋白總量)和HbAlc 百分比已知值(根據(jù)現(xiàn)有參考方法測定)的血樣和參考對(duì)照采用本發(fā)明的方法被一起測定時(shí)，這些已知值和血樣的側(cè)向角散射信號(hào)平均值及熒光信號(hào)平均值能被用于將這些參數(shù)的參考值賦值給本發(fā)明的參考對(duì)照，正如實(shí)施例7中所描述的那樣。當(dāng)具有賦值參考值的參考對(duì)照被用作待檢測血樣中的內(nèi)部對(duì)照時(shí)，血樣的細(xì)胞平均血紅蛋白含量和HbAlc百分比可通過使用參考對(duì)照而獲得。實(shí)施例7與實(shí)施例8描述了示例性的方法。應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)參考對(duì)照被用于作為獨(dú)立對(duì)照時(shí)，相同的機(jī)制也適用。此外，在實(shí)施例7和實(shí)施例8中，通過使用本發(fā)明參考對(duì)照獲得的血樣的細(xì)胞平均血紅蛋白含量和HbAlc百分比的方法已被詳細(xì)描述，以便與參考實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法所產(chǎn)生的結(jié)果相比較，每一個(gè)參數(shù)是一個(gè)值，也就是說，由每一個(gè)測試樣品的溶血產(chǎn)物所獲得的血紅蛋白總量和HbAlc百分比。然而，除了細(xì)胞平均血紅蛋白含量和HbAlc百分比外，更重要的是，本發(fā)明的方法提供了單個(gè)紅細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白和細(xì)胞HbAlc比率。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就胞內(nèi)蛋白含量和胞內(nèi)抗體而言，解凍后的本發(fā)明參考對(duì)照的穩(wěn)定性與新鮮血液的穩(wěn)定性相同。實(shí)施例4描述了這樣的實(shí)施例。如其顯示，被標(biāo)記的參考對(duì)照通過使用來自糖尿病患者的全血采用上文所述的制備方法來制備。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，被標(biāo)記的參考對(duì)照被加入正常血樣中作為內(nèi)部對(duì)照，接著血樣通過采用實(shí)施例3中描述的試驗(yàn)步驟進(jìn)行測定。在一小瓶冷凍類似物懸浮物解凍后，試驗(yàn)分別在解凍后立刻、1. 5小時(shí)、2. 5小時(shí)和20小時(shí)進(jìn)行。在試驗(yàn)期間，在將被標(biāo)記的參考對(duì)照加入血樣前，血樣樣品和被標(biāo)記的參考對(duì)照都被室溫保存。血樣中紅細(xì)胞與被標(biāo)記的參考對(duì)照中紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)和FL4信號(hào)的分析分別進(jìn)行。更具體地說，血樣中的成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞與參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物首先如圖IB中描述的那樣通過FS對(duì)FLl的散點(diǎn)圖進(jìn)行區(qū)分。區(qū)分后， 獲得每一種群的側(cè)向角散射信號(hào)。成熟紅細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞和紅細(xì)胞類似物的FL4信號(hào)由圖 IC中描述的FLl對(duì)FL4的散點(diǎn)圖獲得。圖2A和2B分別顯示了被標(biāo)記的參考對(duì)照解凍后平均側(cè)向角散射信號(hào)和平均FL4信號(hào)對(duì)時(shí)間的圖。如圖所示，血樣中的紅細(xì)胞和被標(biāo)記的參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物的平均側(cè)向角散射信號(hào)在20小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，表明了解凍后紅細(xì)胞類似物的穩(wěn)定的血紅蛋白含量。由于血紅蛋白構(gòu)成了 99%的紅細(xì)胞干重，該結(jié)果表明在被標(biāo)記的細(xì)胞類似物解凍后沒有發(fā)生細(xì)胞成分的損失。另一方面，在解凍后第一個(gè)2小時(shí)內(nèi)觀察到FL4信號(hào)的少量減少，這表明了血樣的紅細(xì)胞和參考對(duì)照的紅細(xì)胞類似物中HbAlc抗原數(shù)量的少量減少。然而，在最初減少后，紅細(xì)胞類似物的FL4信號(hào)在20小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。如圖所示，紅細(xì)胞類似物的FL4信號(hào)比血樣中的紅細(xì)胞稍微穩(wěn)定一些。雖然實(shí)施例4顯示了在測定細(xì)胞血紅蛋白和血紅蛋白變體中本發(fā)明參考對(duì)照的穩(wěn)定性，但是包含冷凍和解凍細(xì)胞類似物的本發(fā)明參考對(duì)照可以被用于其它細(xì)胞成分的流式細(xì)胞分析。參考對(duì)照能被用于勻一化在試驗(yàn)中(組內(nèi)分析)來自不同樣品的數(shù)據(jù)以及在空間或時(shí)間分別進(jìn)行的試驗(yàn)中(組間分析)的數(shù)據(jù)。實(shí)施例5中描述了在模擬情況下使用本發(fā)明參考對(duì)照來校正組間分析誤差的有效性。由糖尿病患者進(jìn)行制備的被標(biāo)記的參考對(duì)照被用作內(nèi)部對(duì)照。血樣通過使用實(shí)施例 3中描述的試驗(yàn)步驟進(jìn)行制備，通過FC500 MCL血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在FL4檢測器的光電倍增管 (PMT)的不同電壓下進(jìn)行分析。在每一 PMT設(shè)定下獲得成熟紅細(xì)胞和紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)和FL4信號(hào)。在每一 PMT設(shè)定下，血樣中紅細(xì)胞的HbAlc百分比通過FL4平均值除以紅細(xì)胞的側(cè)向角散射平均值而獲得。類似地，被標(biāo)記的參考對(duì)照中紅細(xì)胞類似物的 HbAlc百分比通過每一 PMT設(shè)定下的FL4平均值除以類似物的側(cè)向角散射平均值而獲得。圖3顯示了在不同PMT設(shè)定下血樣的成熟紅細(xì)胞和參考對(duì)照的紅細(xì)胞類似物的 HbAlc百分比。如圖所示，PMT電壓的增加提高了血樣(曲線A)和對(duì)照(曲線B)的HbAlc 百分比。然而，在每一 PMT設(shè)定下，在血樣的HbAlc百分比除以參考對(duì)照的HbAlc百分比并且歸一化后，在不同PMT設(shè)定下獲得的被校正的血樣的HbAlc百分比(曲線C)是恒定的和可再現(xiàn)的。實(shí)施例中使用的PMT電壓變化模擬了由儀器引起的熒光信號(hào)變化。由于參考對(duì)照經(jīng)歷了與血樣所經(jīng)歷的相同的變化，該變化對(duì)測定的表觀值的影響可通過使用參考對(duì)照而被消除。該實(shí)施例證明，本發(fā)明的參考對(duì)照能被用于勻一化數(shù)據(jù)并校正由外在因素比如儀器、溫度或試驗(yàn)試劑所引起的組間分析誤差。實(shí)施例6描述了使用本發(fā)明參考對(duì)照在模擬情況下校正組間分析差異的有效性。 一系列測試樣品由全血樣品制備，每一測試樣品具有不同的紅細(xì)胞濃度。根據(jù)實(shí)施例3描述的試驗(yàn)步驟，使用由糖尿病患者進(jìn)行制備的被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照，處理并分析該測試樣品。圖4顯示了測試樣品的紅細(xì)胞和參考對(duì)照的紅細(xì)胞類似物的HbAlc百分比對(duì)于測試樣品的紅細(xì)胞濃度的關(guān)系。如圖所示，測試樣品(曲線A)和參考對(duì)照(曲線B)的HbAlc 百分比隨著測試樣品的紅細(xì)胞濃度的增加而減少。然而，在將測試樣品的HbAlc百分比除以參考對(duì)照的HbAlc百分比并歸一化后，獲取的被校正的不同紅細(xì)胞濃度的測試樣品的 HbAlc百分比(曲線C)基本上是相同的，該百分比是獨(dú)立于血細(xì)胞濃度變化的。可以理解的是，當(dāng)參考對(duì)照的細(xì)胞類似物被用作內(nèi)部對(duì)照時(shí)，該細(xì)胞類似物暴露于與血樣所經(jīng)歷的相同的環(huán)境。因此，該變化對(duì)測定的表觀值的影響可通過使用參考對(duì)照被消除。該實(shí)施例進(jìn)一步證明本發(fā)明的參考對(duì)照可以用于校正由血樣的內(nèi)在因素引起的組內(nèi)分析誤差。實(shí)施例7和實(shí)施例8進(jìn)一步描述了本發(fā)明參考對(duì)照對(duì)組內(nèi)分析和組間分析差異的校正作用。在實(shí)施例7中，提供了一種詳細(xì)的方法，通過使用具有已知HbAlc百分比(根據(jù)參考實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的三種現(xiàn)有的參考方法測定)的第一系列的20個(gè)血樣，將HbAlc百分比的參考值賦值給被標(biāo)記的參考對(duì)照。在將參考值賦值給參考對(duì)照后，另兩個(gè)系列的血樣的 HbAlc百分比通過使用被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照予以確定。為比較目的，另兩個(gè)系列的血樣的HbAlc百分比也通過使用第一個(gè)系列的血樣作為參考進(jìn)行計(jì)算，而沒有使用來自本發(fā)明參考對(duì)照的信息。如表3和表4所示，通過使用本發(fā)明參考對(duì)照獲得的三個(gè)系列血樣的HbAlc平均百分比相比那些沒有通過使用參考對(duì)照獲得的百分比的相關(guān)性要好得多。此外，有內(nèi)部對(duì)照的三個(gè)系列的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0. 015，該標(biāo)準(zhǔn)偏差與沒有內(nèi)部對(duì)照的0. 079的標(biāo)準(zhǔn)偏差有了實(shí)質(zhì)性的提高。在實(shí)施例8的組內(nèi)分析誤差校正效果的評(píng)估中，結(jié)果顯示，通過使用本發(fā)明方法、 用被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照所獲得的血樣的HbAlc百分比與由現(xiàn)有參考方法獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性要比那些不使用內(nèi)部對(duì)照而獲得的HbAlc百分比的相關(guān)性要明顯好得多。因此，使用本發(fā)明參考對(duì)照提高了組內(nèi)分析一致性。本發(fā)明的參考對(duì)照有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，參考對(duì)照的細(xì)胞類似物具有能滲透大分子探針例如通常用于免疫分析的熒光標(biāo)記抗體的滲透性細(xì)胞膜，并且能被用于逐一細(xì)胞分析，所述分析通過使用胞內(nèi)標(biāo)記物標(biāo)記胞內(nèi)成分以便模擬被測試的樣品中胞內(nèi)標(biāo)記物的結(jié)合過程。第二，參考對(duì)照中細(xì)胞類似物的細(xì)胞血紅蛋白能通過使用簡單的側(cè)向角散射測定進(jìn)行測定。這提供了如下一個(gè)較強(qiáng)優(yōu)勢可在側(cè)向角散射信號(hào)和熒光信號(hào)的一個(gè)單一步驟測定中，測定每個(gè)細(xì)胞的血紅蛋白總量和細(xì)胞的血紅蛋白變體。兩種測定方法都可以在通過市場買到的大部分流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行。第三，參考對(duì)照的細(xì)胞類似物被標(biāo)有熒光標(biāo)記。因此，參考對(duì)照能被用作內(nèi)部對(duì)照。細(xì)胞類似物能很容易地識(shí)別并且與被測定的樣品中血細(xì)胞相區(qū)分。第四，參考對(duì)照對(duì)凍融處理有耐受性，不會(huì)導(dǎo)致被測定的細(xì)胞類似物的細(xì)胞成分的降解，且在冷凍并解凍后維持了細(xì)胞膜的可滲透性。同樣地，本發(fā)明的參考對(duì)照與已知現(xiàn)有技術(shù)的穩(wěn)定化細(xì)胞相比能被儲(chǔ)存的時(shí)間要長得多，這意味著產(chǎn)品穩(wěn)定性要長得多。正如上文描述的，本發(fā)明的參考對(duì)照能在上述冷凍的情況下儲(chǔ)存至少一年，同時(shí)能保留細(xì)胞類似物中細(xì)胞成分的特性。第五，正如上文進(jìn)一步描述的，在制備參考對(duì)照的過程中， 未使用傳統(tǒng)的保護(hù)劑如甘油或二甲亞砜。因此，這避免了這些化學(xué)品對(duì)將要進(jìn)行的試驗(yàn)的干擾，尤其是當(dāng)參考對(duì)照被加入樣品用作內(nèi)部對(duì)照時(shí)。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的參考對(duì)照對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)中參考對(duì)照的實(shí)用性和穩(wěn)定性方面提供了重大的改善。下述實(shí)施例用于說明本發(fā)明，并沒有限制權(quán)利要求中所限定的本發(fā)明的范圍。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)進(jìn)行的公開可以使用不同的其他成分和比例。實(shí)施例1制備用于在流式細(xì)胞分析儀上講行細(xì)胞血紅蛋白測定的細(xì)胞類似物所使用的試劑球形化試劑成分根據(jù)下述組合物制備含水的球形化試劑
20成分濃度
氯化鈉137 mM
HEPES5 mM
DC+0海藻糖0.5 mM
甲醛83 mM
η-十二烷基-p-D·麥芽糖苷40 mM
Proclin -3000.5 ml/I
氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH在7.5的量
去離子水適量至1升應(yīng)當(dāng)注意，除非另有說明，本文描述的所有試劑皆通過0. 22 μ m孔徑的無菌的尼
龍過濾器過濾。滲誘試劑組合物根據(jù)下述成分制備下述滲透試劑
成分濃度N-十二烷基肌氨酸2.03 mM丁二酸10 mM庶糖0.22 M牛血清白蛋白0.015 mMProclin 3000.5 ml/l吡咯烷調(diào)節(jié)pH值在5.4的量去離子水適量至1升
試劑具有 0. 99mS/'cm的電導(dǎo)率和洸8m0sm/Kg水的滲透壓度。Proclin 300 JiJ福利亞南舊金山Zymed實(shí)S金室中獲得。中和試劑組合物
根據(jù)下述組合物制備含水中和試劑成分濃度HEPES40 mM氯化鈉0.5 M牛血清白蛋白0.91 mM疊氮化鈉0.03 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值在7.25的量去離子水造量至i升 ^洗滌溶液組合物
根據(jù)下述組合物制備洗滌溶液
21成分
氯化鈉
鹿糖· 去離子水 pH值在5到8之間
保藏溶液組合物
根據(jù)下述組合物制備保藏溶液
成分濃度
氯化鈉0.3 M
蔗糖0.87M
去離子水 .適量至1升 pH值在5到8之間
固定試劑成分根據(jù)下述組合物制備含水的固定試劑
成分濃度
氯化鈉155 mM
二水合磷酸氫二鈉40 mM
甲醛0.62 M
硼酸180 mM
EGTAIOmM
硫酸葡聚 ! (MW 500.000)0.016 μΜ
氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值在7.1的量
去離子水適量至1并
熒光性抗HbAlc抗體根據(jù)廠商說明書，通過熒光染料分子Alexa Fluor 647與單克隆抗HbAlc抗體以每一抗體分子5個(gè)染料分子的分子比率共價(jià)結(jié)合，制備熒光性的抗HbAlc抗體。Alexa Fluor 647由加利福利亞卡爾斯巴德的hvitrogen公司制備。染料在647nm處有最大吸收。實(shí)施例2制備被標(biāo)記的參考對(duì)照全血從捐贈(zèng)者處收集，用0. 7mM乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑。全血在4°C溫度下儲(chǔ)存不超過3天。自體血清從部分全血中制備。全血在300g下離心5分鐘，上清液通過在13000g 下第二次離心5分鐘除去粒子。0. Iml的全血通過在300g下離心，用Iml的磷酸鹽緩沖劑鹽水(PBQ洗滌3次。 在洗滌后，混合了 0.01ml羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)的Iml PBS被加入到團(tuán)粒中，不定期地混合的細(xì)胞懸浮物在室溫下溫育3個(gè)小時(shí)，以便允許羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記細(xì)胞蛋白質(zhì)。溫育后，細(xì)胞懸浮物在300g下離心，并用Iml的PBS再洗
濃庋
0.3 M 0.58 M
適量至1升滌一次。團(tuán)粒加至0.05ml的自體血清中，形成重新配制的被標(biāo)記的血液。使用的PBSWpH 值為7. 4，含有150mM氯化鈉和IOmM的磷酸鈉。羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯具有IOmg/ ml濃度的二甲亞砜，在使用前_20°C儲(chǔ)存。重新配制的被標(biāo)記的血液與0. 4ml實(shí)施例1中的球形化試劑混合，并在室溫下溫育2分鐘。溫育后，加入16ml實(shí)施例1中的滲透試劑、混合并在室溫下溫育另外的3分鐘， 以便滲透細(xì)胞膜并引起胞內(nèi)蛋白聚集。接著，加入8ml實(shí)施例1中的中和試劑，以防止?jié)B透試劑的進(jìn)一步反應(yīng)。形成的具有24. 45ml總體積的中和混合物在離心管內(nèi)在20ml的實(shí)施例1中的洗滌溶液上分層，并在300g下離心10分鐘。除去上清液后，團(tuán)粒被置于5ml實(shí)施例1的保藏溶液中，以形成類似懸浮物，也就是被標(biāo)記的參考對(duì)照。類似懸浮物以0. 5ml的體積分配至Iml小瓶中、封閉、在_50°C的溫度下冷凍不到1小時(shí)。使用前，冷凍參考對(duì)照小瓶在室溫下解凍，在被加入待檢測的血樣或作為單獨(dú)對(duì)照使用前，輕輕地混合，以形成均勻的類似懸浮物。實(shí)施例3被標(biāo)記的參考對(duì)照用作內(nèi)部對(duì)照來測定血樣中細(xì)胞血紅蛋白和糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的測試使用收集在含有0. 7mM EDTA作為抗凝劑的試管中的全血樣品。全血樣品在4°C溫度下保藏不超過3天。使用來自糖尿病患者的全血制備的被標(biāo)記的參考對(duì)照和實(shí)施例2的制備方法被用于該測試。一等分4 μ 1的全血樣品與200 μ 1實(shí)施例1中的球形化試劑相混合，其進(jìn)一步包含8. 3 μ M的吖啶橙并形成染色樣品混合物。溫育1分鐘后，將3 μ 1的染色樣品混合物與 60 μ 1實(shí)施例1中的滲透試劑相混合，形成了第一樣品混合物。溫育1. 5分鐘后，5 μ 1的被標(biāo)記的參考對(duì)照被加入第一樣品混合物中并進(jìn)行混合。溫育1分鐘后，加入100 μ 1的實(shí)施例1中的中和試劑并混合，形成了第二樣品混合物。中和試劑含有5mg/l的實(shí)施例1中的熒光抗HbAlc抗體。在溫育另外10分鐘后，加入80 μ 1實(shí)施例1中的固定試劑，形成了最終的樣品混合物。通過前向角散射和側(cè)向角散射測定、以及在525nm(FLl)和在675nm(FL4)處的熒光測定，在FC500MCL細(xì)胞計(jì)數(shù)器上分析最終的樣品混合物。圖IA至IC分別顯示得到的前向角散射(FS)對(duì)側(cè)向角散射(SS)、FS對(duì)FL1、和FLl對(duì)FL4的散點(diǎn)圖。在圖IA中，區(qū)域A包含血樣中的紅細(xì)胞和被標(biāo)記的參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物， 它們?cè)谶@個(gè)散點(diǎn)圖上被選出，通過使用熒光做進(jìn)一步的差異分析，如圖IB和圖IC所示。區(qū)域A外的群體是白細(xì)胞和血小板。在圖IB中，區(qū)域B包含血樣中的成熟紅細(xì)胞；區(qū)域C包含被吖啶橙染色的血樣中的網(wǎng)織紅細(xì)胞；并且區(qū)域D包含被CFSE標(biāo)記的參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物。在圖IC中，區(qū)域F包含血樣中的成熟紅細(xì)胞；區(qū)域G包含血樣中的網(wǎng)織紅細(xì)胞； 并且區(qū)域E包含被標(biāo)記的參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物。通過FC500MCL細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定的單個(gè)紅細(xì)胞的側(cè)向角散射數(shù)值(SS)的平均值可以得到樣品的平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(與MCH相關(guān))。通過在675nm(FL4)處的單個(gè)紅細(xì)胞熒光信號(hào)的平均值，在減去熒光背景值后，可以獲得血樣的HbAlc含量。在不含HbAlc 抗體并存在非特異性等型對(duì)照單克隆抗體(IgGl)(該抗體被偶聯(lián)至Alexa Fluor647)的情況下，通過使用如上所述的試驗(yàn)步驟分析血樣而獲得所述熒光背景值。由血樣中所有被測定的紅細(xì)胞的FL4/SS的平均值可以獲得血樣的HbAlc百分比，該平均值是紅細(xì)胞的細(xì)胞 HbAlc百分比的平均值。實(shí)施例4參考對(duì)照在解凍之后的穩(wěn)定性
通過使用來自于糖尿病病人的全血和實(shí)施例2中描述的制備方法，制備被標(biāo)記的參考對(duì)照。被標(biāo)記的參考對(duì)照被加入正常全血樣品中，作為內(nèi)部對(duì)照，并且使用實(shí)施例3中描述的測試工藝來分析血樣。在一小瓶冷凍的類似物懸浮液解凍后立即、在解凍后1. 5小時(shí)、2. 5小時(shí)和20小時(shí)分別進(jìn)行測試。在這些試驗(yàn)之間的時(shí)間間隔中、在被標(biāo)記的參考對(duì)照添加于血樣之前，血樣和被標(biāo)記的參考對(duì)照兩者均被放置于室溫下。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，細(xì)胞計(jì)數(shù)器的設(shè)置未改變。血樣中的紅細(xì)胞和參考對(duì)照中的類似物的側(cè)向角散射和FL4信號(hào)的分析是分開進(jìn)行的。更具體地說，血樣中的成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞以及參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物首先是如圖IB所示在FS對(duì)FLl散點(diǎn)圖上被區(qū)分。在區(qū)分后，獲得每一個(gè)群體的側(cè)向角散射信號(hào)。通過如圖IC所示的FLl對(duì)FL4散點(diǎn)圖，得到成熟紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞以及類似物的FL4信號(hào)。圖2A和2B分別顯示了在被標(biāo)記的參考對(duì)照解凍后，平均側(cè)向角散射信號(hào)和平均 FL4信號(hào)相對(duì)于時(shí)間的圖。用A標(biāo)明的曲線是從血樣紅細(xì)胞中獲得，用B標(biāo)明的曲線是從被標(biāo)記的參考對(duì)照的紅細(xì)胞類似物中獲得。在圖2A和2B中，計(jì)時(shí)起點(diǎn)是解凍完成時(shí)候的時(shí)間。如圖所示，樣品中的紅細(xì)胞和被標(biāo)記的參考對(duì)照中的紅細(xì)胞類似物的平均側(cè)向角散射信號(hào)在20小時(shí)內(nèi)都是穩(wěn)定的，表明在解凍之后的穩(wěn)定的血紅蛋白含量。另一方面，觀察到在解凍之后的第一個(gè)兩小時(shí)內(nèi)FL 4信號(hào)的稍微的降低，表明血樣中的紅細(xì)胞和參考對(duì)照中的類似物兩者中的HbAlc抗原含量稍微降低。然而，在最初的減少之后，紅細(xì)胞類似物的FL 4信號(hào)在20小時(shí)內(nèi)都是穩(wěn)定的。如圖所示，類似物的FL 4信號(hào)比血樣的紅細(xì)胞的 FL 4信號(hào)稍微更加穩(wěn)定。實(shí)施例5參考對(duì)照在通過FL4檢測器電壓的變化模擬組間分析誤差中的應(yīng)用正常全血樣品被用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，從糖尿病病人樣本制成的被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照。根據(jù)使用實(shí)施例3中描述的試驗(yàn)步驟制備血樣，并且在FC500MCL細(xì)胞計(jì)數(shù)器上在 FL4檢測器的光電倍增管(PMT)的不同電壓下分析血樣。在每一次PMT設(shè)定處，使用先前描述的方法，獲得成熟紅細(xì)胞和紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射和FL4信號(hào)。在每個(gè)PMT設(shè)定處， 通過FL4平均值除以紅細(xì)胞側(cè)向角散射平均值，可以得到血樣中紅細(xì)胞的HbAlc百分比。類似地，在每個(gè)PMT設(shè)定處，通過FL4平均值除以類似物側(cè)向角散射平均值，可以得到被標(biāo)記的參考對(duì)照的類似物的HbAlc百分比。圖3顯示了在不同PMT設(shè)定下血樣的成熟紅細(xì)胞和對(duì)照的紅細(xì)胞類似物的HbAlc 百分比。如圖所示，PMT電壓的增加提高了血樣(曲線A)和對(duì)照(曲線B)的HbAlc百分比。然而，在每個(gè)PMT設(shè)定下，血樣的HbAlc百分比除以參考對(duì)照的HbAlc百分比后，乘以因子6以便歸一化數(shù)據(jù)，在不同的PMT設(shè)定下獲得的被校正的血樣(曲線C)的HbAlc百分比是恒定的和可再現(xiàn)的。實(shí)施例6參考對(duì)照在通過改變樣品中紅細(xì)胞濃度來模擬組內(nèi)分析誤差中的應(yīng)用按如下所述方法制備具有不同紅細(xì)胞濃度的測試樣品。將用EDTA作為抗凝血?jiǎng)┑娜獦悠?參見實(shí)施例幻在30(^下離心。除去血清，然后將堆積的細(xì)胞再懸浮在體積大約是被堆積細(xì)胞體積三分之一的血清中。100 μ 1再懸浮的細(xì)胞被分配至九個(gè)試管中，向每個(gè)試管中添加不同量的血清，從0至160 μ 1。通過計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的細(xì)胞，確定這些測試樣品的實(shí)際紅細(xì)胞濃度。根據(jù)實(shí)施例3中描述的試驗(yàn)步驟，使用由糖尿病病人的全血制備的被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照，來處理和分析測試樣品。圖4顯示了測試樣品中紅細(xì)胞和參考對(duì)照中紅細(xì)胞類似物的HbAlc百分比相對(duì)于測試樣品中紅細(xì)胞濃度的圖。如圖所示，測試樣品(曲線Α)和參考對(duì)照(曲線B)的HbAlc 百分比隨著測試樣品中紅細(xì)胞濃度的增加而降低。然而，在測試樣品的HbAlc百分比除以參考對(duì)照的HbAlc百分比后，乘以因子6以便歸一化數(shù)據(jù)，在不同的紅細(xì)胞濃度下獲得的被校正的測試樣品的HbAlc百分比(曲線C)是基本上相等的。實(shí)施例7使用參考對(duì)照，在 HbAlc百分比的測定中校正組間分析誤差在使用被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照的HbAlc百分比測定中，三個(gè)系列的20個(gè)血樣被用于評(píng)估組間分析誤差。通過參考實(shí)驗(yàn)室，使用三種不同的HbAlc測定標(biāo)準(zhǔn)方法，更具體地說使用Primus Ultra 2 (Primus Diagnostics，密蘇里州)的親和層析法、Roche Unimate (羅氏診斷公司，印地安那州)的免疫比濁法和Tosoh 心7變型(日本東曹達(dá)公司， 加利福尼亞)的離子交換色譜法，來測定每個(gè)血樣的HbAlc百分比。參考實(shí)驗(yàn)室的HbAlc 百分比是根據(jù)NGSP標(biāo)準(zhǔn)化(David Sachs用于HbAlc分析的ADA/EASD/IDF工作組；臨床化學(xué)2005 ；51 :681-683).在第一個(gè)系列和第二個(gè)系列之間是4星期的時(shí)間間隔，在第二個(gè)系列和第三個(gè)系列之間是2星期的時(shí)間間隔。與參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的HbAlc測定相平行地，根據(jù)實(shí)施例3中描述的測試工藝，使用本發(fā)明的方法，且使用由糖尿病病人的全血制備的被標(biāo)記的參考對(duì)照作為內(nèi)部對(duì)照，來分析每個(gè)系列的20個(gè)血樣。在所有三個(gè)系列的血樣中，實(shí)驗(yàn)條件和細(xì)胞計(jì)數(shù)器設(shè)置保持相同。由在FC500MCL細(xì)胞計(jì)數(shù)器上收集的原始數(shù)據(jù)，計(jì)算出使用本發(fā)明方法得到的 HbAlc百分比，如下所述1.從抗HbA1。-AleXa Fluor 647抗體的FL4信號(hào)中減去吖啶橙和/ 或CFSE產(chǎn)生的FLl信號(hào)的13. 3%部分，以便補(bǔ)償FLl溢出至FL4的信號(hào)。這是FL1-FL4補(bǔ)償，普遍用于流式細(xì)胞儀上的多色熒光測定中。2.從得到的FL4數(shù)值中減去如實(shí)施例3中所描述的獲得的熒光背景值。3.在步驟1和步驟2后獲得的被校正的紅細(xì)胞的FL4值(代表紅細(xì)胞的細(xì)胞HbAlc含量)，除以側(cè)向角散射(SS)數(shù)值(反映紅細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白)， 以便獲得每個(gè)紅細(xì)胞的FL4/SS。來自血樣中所有被測定的紅細(xì)胞的FL4/SS平均值是樣品的細(xì)胞HbAlc百分比平均值，與由參考實(shí)驗(yàn)室得到的相同血樣的HbAlc百分比相關(guān)。4.為了歸一化FL4/SS數(shù)值，并使它們處在HbAlc百分比的范圍內(nèi)，可以使用來自于這三個(gè)參考方法的HbAlc百分比數(shù)值的平均值(參見表1A)。當(dāng)被標(biāo)記的參考對(duì)照的參考值被賦值時(shí)， 該工作就算完成了。對(duì)于待分析的血樣，能夠使用被標(biāo)記的參考對(duì)照的參考值來使得FL4/ SS數(shù)值歸一化(參見表1B)。圖5A顯示了被歸一化的FL4/SS數(shù)值與從參考實(shí)驗(yàn)室獲得的相同血樣的HbAlc百分比數(shù)值之間的相關(guān)性。需注意的是，在表IA和IB中，血樣或者參考對(duì)照的FL4/SS值是所有被測定的細(xì)胞或者紅細(xì)胞類似物的FL4/SS數(shù)值的平均值。5.如圖 5A所示，在高端處FL4/SS數(shù)值和參考實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果是稍微非線性相關(guān)，這被認(rèn)為是由于細(xì)胞內(nèi)被偶聯(lián)的抗體分子間的位阻造成的，并且取決于細(xì)胞中的抗原密度。為了校正高端處的這個(gè)稍微的非線性相關(guān)，被歸一化的FL4/SS數(shù)值經(jīng)受下列轉(zhuǎn)換被轉(zhuǎn)換的FL4/SS數(shù)值=e0.157Xttfi-ftMFL4/SSM+l這個(gè)公式在FL4/SS數(shù)值范圍為大約3至I5時(shí)是有效的。對(duì)于反向轉(zhuǎn)換，使用下列公式被歸一化的FL4/SS數(shù)值=(LN(被轉(zhuǎn)化的FL4/SS數(shù)值)-1)/0. 157應(yīng)理解，上述的公式是適合NGSP標(biāo)準(zhǔn)化的HbAlc百分比數(shù)據(jù)。上述轉(zhuǎn)換是憑經(jīng)驗(yàn)開發(fā)的，為來自于參考實(shí)驗(yàn)室的HbAlc數(shù)值提供了更好的線性相關(guān)(參見圖5A和5B)。需注意的是，流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)的一些數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換可為參考實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)提供線性相關(guān)性。優(yōu)選地，可使用上面顯示的簡單的指數(shù)公式，因?yàn)槠湟子谵D(zhuǎn)換或者反向轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)，如此處所述。用于上述計(jì)算的符號(hào)被總結(jié)在表IA和表IB中。表1A.使用具有已知HbAlc百分比數(shù)值的血樣，HbAlc百分比參考值被賦值給被標(biāo)記的參考對(duì)照
權(quán)利要求
1.一種用于在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行逐一細(xì)胞分析的參考對(duì)照，其包含由被滲透的血細(xì)胞制成的細(xì)胞類似物和懸浮介質(zhì)，所述血細(xì)胞內(nèi)含有聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和一個(gè)以上被保留的該胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)，具有可滲透抗體的細(xì)胞膜，所述參考對(duì)照被冷凍。
2.如權(quán)利要求1所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞類似物在解凍后仍保持所述一個(gè)以上被保留的所述蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞類似物由具有正?；蛘弋惓Ｋ降乃P(guān)注抗原的個(gè)體的血細(xì)胞制成。
4.如權(quán)利要求3所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物、鳥或者爬行動(dòng)物個(gè)體。
5.如權(quán)利要求1所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞類似物是由被滲透的紅細(xì)胞制成的紅細(xì)胞類似物，所述被滲透的紅細(xì)胞含有一個(gè)以上血紅蛋白變體的被保留抗原位點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求1所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞類似物進(jìn)一步包含與所述被滲透的血細(xì)胞中一種以上細(xì)胞成分相結(jié)合的細(xì)胞標(biāo)記物。
7.如權(quán)利要求6所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞標(biāo)記物是熒光染料。
8.如權(quán)利要求7所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述熒光染料是羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)。
9.如權(quán)利要求8所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞類似物是由被滲透的紅細(xì)胞制成的紅細(xì)胞類似物，所述被滲透的紅細(xì)胞含有一個(gè)以上血紅蛋白變體的被保留抗原位點(diǎn)。
10.如權(quán)利要求9所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述細(xì)胞類似物和所述懸浮介質(zhì)被冷凍，在解凍后，所述細(xì)胞類似物仍保持所述一個(gè)以上血紅蛋白變體的被保留抗原位點(diǎn)。
11.一種制備參考對(duì)照的方法，其包括(a)將滲透試劑與血細(xì)胞相混合，溫育所形成的滲透混合物足夠長的一段時(shí)間，足以使胞內(nèi)蛋白質(zhì)在保持其抗原位點(diǎn)的同時(shí)在所述血細(xì)胞內(nèi)發(fā)生聚集，并足以滲透細(xì)胞膜，并使所述細(xì)胞膜可滲透抗體；(c)向所述滲透混合物中添加中和試劑來抑制所述滲透劑的進(jìn)一步反應(yīng)；(d)用洗滌液洗滌被滲透的血細(xì)胞，以便除去所述滲透試劑和中和試劑；以及(e)在保藏溶液中懸浮所述被滲透的血細(xì)胞，以便形成類似物懸浮液。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括冷凍所述類似物懸浮液。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述血細(xì)胞是紅細(xì)胞，所述方法進(jìn)一步包括在將所述滲透試劑與所述紅細(xì)胞混合前，將球形化試劑與所述紅細(xì)胞相混合，以使所述紅細(xì)胞呈球形。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述血細(xì)胞是白細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述血細(xì)胞收集自具有異常水平的所關(guān)注抗原的個(gè)體的血液。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括在將所述滲透試劑與所述血細(xì)胞混合前，將所述血細(xì)胞與膜可滲透熒光染料一起溫育足以使所述熒光染料結(jié)合至一種以上細(xì)胞成分的時(shí)間。
17.如權(quán)利要求16所述的參考對(duì)照，其特征在于，所述熒光染料是羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，所述一種以上細(xì)胞成分是細(xì)胞蛋白質(zhì)。
18.一種使用參考對(duì)照用于在流式細(xì)胞分析儀上測定血樣中細(xì)胞血紅蛋白的方法，其包括(a)提供含有紅細(xì)胞類似物的參考對(duì)照，所述紅細(xì)胞類似物由內(nèi)含有聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的經(jīng)處理紅細(xì)胞制成，所述參考對(duì)照具有細(xì)胞血紅蛋白參考值；(b)在所述流式細(xì)胞分析儀上逐一細(xì)胞地測定所述參考對(duì)照中的所述紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)；以及(c)使用測得的側(cè)向角散射信號(hào)和所述參考對(duì)照的所述參考值來確定待測定樣品中單個(gè)紅細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括將所述參考對(duì)照與滲透試劑混合；隨后添加含有對(duì)血紅蛋白變體特異的經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體的中和試劑，并允許所述抗體結(jié)合至所述紅細(xì)胞類似物內(nèi)的所述血紅蛋白變體；逐一細(xì)胞地測定所述參考對(duì)照中的所述紅細(xì)胞類似物的熒光信號(hào)，連同測定所述側(cè)向角散射信號(hào)；以及使用測得的熒光信號(hào)和測得的側(cè)向角散射信號(hào)、以及所述參考對(duì)照中的所述血紅蛋白變體的參考百分比值，來確定待測定樣品中單個(gè)紅細(xì)胞的所述血紅蛋白變體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述血紅蛋白變體包括糖化血紅蛋白、胎兒血紅蛋白或者異常形式的血紅蛋白。
21.一種使用參考對(duì)照用于在流式細(xì)胞分析儀上測定血樣中細(xì)胞血紅蛋白的方法，其包括(a)將一定體積的血液與滲透試劑相混合，以便形成第一樣品混合物；(b)將含紅細(xì)胞類似物并具有細(xì)胞血紅蛋白參考值的參考對(duì)照添加至所述第一樣品混合物中，所述紅細(xì)胞類似物由經(jīng)處理的紅細(xì)胞制成，所述經(jīng)處理的紅細(xì)胞內(nèi)含有聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和被保留的血紅蛋白變體的抗原位點(diǎn)、并且具有可滲透抗體的細(xì)胞膜，所述紅細(xì)胞類似物包含與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光染料；(c)隨后添加中和試劑，以便形成第二樣品混合物；(d)在所述流式細(xì)胞分析儀上，逐一細(xì)胞地測定所述血液中所述紅細(xì)胞和所述參考對(duì)照中所述紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)和第一波長處的熒光信號(hào)；(e)使用在所述第一波長處測得的熒光信號(hào)，將所述血液中的所述紅細(xì)胞從所述參考對(duì)照中的所述紅細(xì)胞類似物中區(qū)分開來；以及(f)使用測得的所述紅細(xì)胞和所述紅細(xì)胞類似物的側(cè)向角散射信號(hào)、以及所述參考對(duì)照的所述細(xì)胞血紅蛋白參考值，來確定所述紅細(xì)胞的細(xì)胞血紅蛋白。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括在步驟(a)中所述血液與所述滲透試劑混合之前，將所述血液與核酸染料相混合，以便染色RNA ；在步驟(e)中，使用在所述第一波長處的所述熒光信號(hào)，將網(wǎng)織紅細(xì)胞從所述血液中的成熟紅細(xì)胞中以及從所述紅細(xì)胞類似物中區(qū)分開來；以及在步驟(f)中，使用所述側(cè)向角散射信號(hào)和所述參考對(duì)照的所述細(xì)胞血紅蛋白參考值，確定所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞中的細(xì)胞血紅蛋白。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述中和試劑進(jìn)一步包含對(duì)所述血紅蛋白變體特異的經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體，所述方法進(jìn)一步包括在步驟(c)中，溫育所述第二樣品混合物，以允許所述被標(biāo)記的抗體結(jié)合至所述血液的所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞中的所述血紅蛋白變體、以及所述參考對(duì)照的所述紅細(xì)胞類似物中的所述血紅蛋白變體；在步驟(d)中，逐一細(xì)胞地測定所述血液的所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞在第二波長處的的熒光信號(hào)、以及所述參考對(duì)照的所述紅細(xì)胞類似物在第二波長處的熒光信號(hào)， 連同測定所述側(cè)向角散射信號(hào)和在第一波長處的所述熒光信號(hào)；以及在步驟(f)中，使用在所述第二波長處的熒光信號(hào)和所述側(cè)向角散射信號(hào)、以及所述參考對(duì)照的所述血紅蛋白變體百分比的參考值，分別確定所述網(wǎng)織紅細(xì)胞和所述成熟紅細(xì)胞中的所述血紅蛋白變體的細(xì)胞百分比。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述血紅蛋白變體包括糖化血紅蛋白、胎兒血紅蛋白或者異常形式的血紅蛋白。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述熒光染料是羧基熒光素琥珀酰亞胺
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸染料是吖啶橙。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記抗體是單克隆抗-HbA1。-Alexa Fluor 647 抗體。
全文摘要
一種用于在流式細(xì)胞分析儀上逐一細(xì)胞分析的參考對(duì)照，其包含由被滲透的血細(xì)胞制成的細(xì)胞類似物和懸浮介質(zhì)，所述血細(xì)胞內(nèi)含有被聚集的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和被保留的該胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)，具有可滲透抗體的細(xì)胞膜。參考對(duì)照在被制備后可被冷凍并在使用前解凍。細(xì)胞類似物在其內(nèi)進(jìn)一步包含熒光標(biāo)記物。還公開了一種制備參考對(duì)照的方法和一種使用參考對(duì)照的方法，其作為內(nèi)部對(duì)照或者獨(dú)立對(duì)照用于測定血樣中的細(xì)胞血紅蛋白和細(xì)胞血紅蛋白變體。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102177437SQ200980140599
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2009年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日
發(fā)明者安德烈亞斯·范阿格托萬, 法布里斯·馬萊格 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特公司