專(zhuān)利名稱(chēng)：用于同時(shí)自動(dòng)破碎多個(gè)生物樣品的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于破碎植物或動(dòng)物樣品進(jìn)行處理的方法和裝置，例如從樣品分離核酸或蛋白質(zhì)。這些制備和測(cè)試在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)化的處理指令進(jìn)行。所謂規(guī)程是這種處理指令的一部分。這種用于從大腸桿菌(E.coli)分離質(zhì)粒的規(guī)程的一個(gè)例子可以從文獻(xiàn)DE 101 53 957A1 了解。
背景技術(shù)：
為了按所需方式處理樣品，S卩，分離核酸或蛋白質(zhì)，例如根據(jù)樣品和所需結(jié)果， 可以從市場(chǎng)購(gòu)得所謂“試劑盒”，例如恰根公司Oiiagen)的“超凈組織DNA分離試劑盒 (UltraClean Tissue DNA Isolation Kit) ”(www. Qiagen. com)。在使用這種試劑念桉照預(yù)先確定的規(guī)程處理樣品之前，必須以合適的方式對(duì)樣品進(jìn)行制備。以下描述這些現(xiàn)有技術(shù)已知的典型制備方法。例如，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠取出器官。動(dòng)物器官的選擇取決于目的。在洗滌緩沖溶液如PBS (磷酸鹽緩沖鹽水，具有以下組成=Na2HPO4 (干燥的)、NaH2PO4 (干燥的)、NaCl和蒸餾水)中對(duì)取出的動(dòng)物器官或組織進(jìn)行洗滌。由于洗滌過(guò)程，取出的組織部分以無(wú)血狀態(tài)提供，而且沒(méi)有不利的組分。然后，將取出的組織在液氮中冷卻，以停止細(xì)胞活動(dòng)等。否則，將不能在處理之后以所需質(zhì)量獲得所需的信息。在該過(guò)程中，通常將具有體溫例如37°C的組織浸沒(méi)在液氮中。 將產(chǎn)生氣泡。直到氣泡停止形成才將組織從液氮中取出。然后使用例如干冰將組織儲(chǔ)存在-80"C。如果要避免在液氮中的冷卻步驟，則作為替代，在洗滌過(guò)程之后，使用穩(wěn)定化試劑如RNAlater‘ 對(duì)取出的組織進(jìn)行化學(xué)保存。RNAlater 是一種粘性液體，由Ambion公司開(kāi)發(fā)(www, ambion. com)用于保存新鮮組織。該保存效果主要基于通過(guò)除水使組織中所有的酶失活，以及基于停止細(xì)胞活動(dòng)。該粘性液體必須迅速擴(kuò)散到組織的所有細(xì)胞中。因此，組織片的尺寸必須限于邊長(zhǎng)最多為0. 5厘米?；瘜W(xué)處理之后，經(jīng)過(guò)如此處理的組織也在_80°C 冷卻，以在處理之前對(duì)其進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于處理而言，通常需要10-100毫克組織以進(jìn)行所需測(cè)試、分離等。在處理之前， 使用例如解剖刀切下所需量的動(dòng)物組織。上述樣品制備步驟可以單獨(dú)或組合地作為下述本發(fā)明的特征。對(duì)切割的樣品即切割的組織進(jìn)行破碎，意味著必須打開(kāi)細(xì)胞壁。這種操作可以通過(guò)機(jī)器、化學(xué)或酶方式進(jìn)行。機(jī)器破碎可以例如使用恰根公司的“TissueRuptor”進(jìn)行(參見(jiàn) TissueRuptor 手冊(cè)，2006 年 7 月，恰根公司(Qiagen)，德國(guó)希爾敦(Hiden Germany) 了解)。在這種情況中，旋轉(zhuǎn)刀片以35000轉(zhuǎn)/分鐘的速度使組織的細(xì)胞壁分解。機(jī)械破碎通常在緩沖劑中進(jìn)行，以避免破壞成分如核酸。在緩沖劑(即一種化學(xué)物質(zhì))存在下在容器中進(jìn)行的機(jī)械破碎在文獻(xiàn)EP 1577011A2 中描述。
在低溫研磨機(jī)中制備樣品也是已知的(參見(jiàn)例如http://www. Iaborpraxis. de/ fachartikel/lp_fachartikel_nh_2384859.html，2007 年 3 月 12 日)。在這種主動(dòng)冷卻的研磨機(jī)中，在液氮溫度下對(duì)樣品進(jìn)行研磨。樣品在整個(gè)研磨過(guò)程中保持深度冷凍，而不與氮接觸。這種技術(shù)上相當(dāng)復(fù)雜的方法可以在上述方法失敗的那些樣品情況中進(jìn)行，例如在材料非常硬的情況中，例如骨頭，或者在材料含膠原的情況中，例如皮膚。如果要制備骨頭樣品，則將其放置在充滿(mǎn)液氮的容器中，使用金屬釘將其壓碎。然后提供粉末形式的骨頭。如果要用顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)測(cè)試，則首先用石蠟浸漬樣品，使其變硬，然后使用顯微鏡切片機(jī)切割成組織薄層。如果要處理植物樣品，則只有在軟材料(如葉、軟豆等)的情況中才能用解剖刀將它們切割成一定尺寸。在干燥的或冷凍的植物樣品的情況中，它們被冷凍在液氮中，在用液氮主動(dòng)冷卻的研缽中使用研杵進(jìn)行研磨。德國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)738 286說(shuō)明了將細(xì)胞與分散液體一起進(jìn)行冷凍和研磨，從而分解細(xì)胞。從文獻(xiàn)DE 602005001256T2和WO 2004/0^837Α1 了解了用于食品如香料的壓碎 /混合裝置。該裝置包括中空體，該中空體中放置一個(gè)球，使用該球壓碎食品。文獻(xiàn)US 2004/0144874A1、JP 2006051505A、JP 2002-066 366A 和 JP 03-186 360A揭示了用于球磨機(jī)和同類(lèi)可比裝置的其他例子。從這些文獻(xiàn)不能了解破碎生物樣品的方法。發(fā)明概述以上述方式制備樣品的目的是在處理之后獲得盡可能好的所探尋的結(jié)果。因此， 本發(fā)明的目的是適當(dāng)且簡(jiǎn)單地破碎生物樣品。一種達(dá)到該目的的解決方案包括權(quán)利要求1的特征。一種用于進(jìn)行該方法的裝置包括獨(dú)立權(quán)利要求的特征。通過(guò)從屬權(quán)利要求了解有利的實(shí)施方式。將適當(dāng)制備的樣品插入塑料構(gòu)成的容器中。將該塑料容器插入適配器中。然后密封該塑料容器?？梢杂眠m配器的蓋子進(jìn)行密封。但是優(yōu)選塑料容器具有其自身的蓋子，因此即使在破碎過(guò)程之后從適配器中取出塑料容器時(shí)，該塑料容器仍然是密封的。而且，如果塑料容器不再使用而是最后丟棄，則使清潔努力最小化。隨后將適配器與使其自動(dòng)往復(fù)(尤其是上下往復(fù))的設(shè)備相連，從而破碎樣品。具體來(lái)說(shuō)，以一定方式對(duì)適配器進(jìn)行設(shè)置，使其能夠容納大量塑料容器，從而能同時(shí)破碎大量生物樣品。在插入塑料容器之前，樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)制備，具體是首先洗滌樣品，然后使用液氮進(jìn)行保存或進(jìn)行化學(xué)保存，即，例如使用美國(guó)公司Ambion，弗斯特城 (Foster City)的 RNAlater $ # 卞艮 ig 網(wǎng)]^ http://wwwl. qiagen. com/products/ RnaStabilizationPurification/AlIprotectTissueReagent. aspx iJ M f合 tfl & 司 (Qiagen)的AllProtect進(jìn)行。主要根據(jù)塑料容器的尺寸，將適當(dāng)制備的樣品全部或部分地裝入塑料容器中。如果只裝入一部分樣品，則使用例如解剖刀將該部分切除。因?yàn)樵诨瘜W(xué)保存的情況中，待保存樣品必須比較小，優(yōu)選對(duì)塑料容器的尺寸進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其只能容納小樣品。因此，如果出于這個(gè)原因總是只能制備優(yōu)選不超過(guò)50毫克、更優(yōu)選不超過(guò)30毫克的少量樣品，則可以以改進(jìn)的方式避免操作誤差。該方法能自動(dòng)破碎樣品，即以不同方式自動(dòng)破碎樣品。通過(guò)首先將經(jīng)過(guò)冷凍或化學(xué)保存的樣品放置在密封的處于插入狀態(tài)的塑料容器中，由此避免整體裝置的其他成分污染。該塑料容器是一種便宜的可丟棄的制品，在樣品破碎之后，不一定需要因?yàn)榻?jīng)濟(jì)原因而再使用。因此，可以省去對(duì)用過(guò)的塑料容器的清潔。由于適配器能容納大量其中放置了樣品的塑料容器，所以可以同時(shí)破碎大量樣品。從根本上說(shuō)，另一方面，適配器是能從設(shè)備分離的部件，從而能夠適當(dāng)且簡(jiǎn)單地制備適配器。具體來(lái)說(shuō)，在該情況中，在將樣品插入塑料容器中之前，可以簡(jiǎn)單地將適配器冷卻到一定的溫度范圍，具體是_20°C到-80°C，例如在冷凍箱中進(jìn)行冷卻，或者使用干冰進(jìn)行冷卻，從而能破碎冷凍的樣品，而無(wú)須擔(dān)心樣品解凍，即使在缺少主動(dòng)冷卻的條件下也無(wú)須擔(dān)心。根據(jù)權(quán)利要求的內(nèi)容可以用于植物也可以用于動(dòng)物或人的組織，用于植物或組織的穩(wěn)定化的以及新鮮的樣品。此外，可以在室溫下以非常簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行破碎，對(duì)于化學(xué)保存的樣品，以及對(duì)于在低溫冷凍的樣品，都是如此。為了能可靠地在破碎過(guò)程中保持冷凍的樣品處于適當(dāng)冷卻條件下，在一種實(shí)施方式中，適配器包括一個(gè)、優(yōu)選若干個(gè)金屬套，該金屬套插入塑料容器中。除此以外，適配器全部或至少主要由塑料構(gòu)成。金屬套具有在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持塑料容器冷卻所需的熱容。 此外，適配器全部或至少主要由塑料構(gòu)成，因此，適配器不會(huì)太重，否則會(huì)使其操作變得困難得多。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將深度冷凍的樣品放置在冷卻的塑料容器中，該容器中另外包含至少一個(gè)可移動(dòng)的硬體。然后將冷卻的塑料容器插入冷卻的適配器中，或者插入冷卻的適配器的金屬套中。在一種實(shí)施方式中，適配器冷卻的溫度應(yīng)當(dāng)?shù)陀?50°C，從而可靠地防止冷凍的樣品在破碎過(guò)程中解凍。優(yōu)選溫度約為-80°C，例如應(yīng)當(dāng)選擇為-70°C 到-90°C?？梢允褂酶杀蛘咴诶鋬鱿渲幸猿杀居行У姆绞教峁?80°C或者-70°C到-90°C 的溫度。發(fā)現(xiàn)通過(guò)冷卻到約_80°C能獲得特別優(yōu)良的結(jié)果。在某種程度上，低于_80°C的溫度也是可能的。但是，應(yīng)當(dāng)注意適配器不能過(guò)度冷卻，否則將無(wú)法進(jìn)行破碎。例如，已經(jīng)證明液氮溫度(即-196°C )太低，不能獲得優(yōu)良的結(jié)果。然后，插入設(shè)備中之后，使適配器非常迅速地往復(fù)運(yùn)動(dòng)，從而使可移動(dòng)體相對(duì)于塑料容器以一定方式振搖，可移動(dòng)體將深度冷凍的樣品壓碎并破碎。已經(jīng)證明，例如通過(guò)氮對(duì)適配器進(jìn)行額外的主動(dòng)冷卻是不必要的，因此優(yōu)選不提供。這使得與破碎過(guò)程中需要主動(dòng)冷卻的現(xiàn)有技術(shù)相比，操作變得簡(jiǎn)單得多。特別合適的情況是，塑料容器的圓筒形內(nèi)部具有至少一個(gè)中空球形狀的端部。在這種情況下，可移動(dòng)體優(yōu)選是球或具有球形端部的銷(xiāo)。球或銷(xiāo)的直徑略小于塑料容器內(nèi)部的直徑，從而確保移動(dòng)性?？梢苿?dòng)體由硬質(zhì)材料、優(yōu)選是重質(zhì)材料構(gòu)成，例如金屬，從而能壓碎樣品。優(yōu)選以一定方式將樣品引入塑料容器中，將其放置在塑料容器的中空球形端部和球或銷(xiāo)之間。球或銷(xiāo)的直徑優(yōu)選至少為5毫米，更優(yōu)選至少為8毫米。塑料容器的直徑優(yōu)選不超過(guò)15毫米，優(yōu)選最大為10毫米。優(yōu)選塑料容器在破碎過(guò)程中垂直設(shè)置，中空球形端部位于底部。由于重力的原因，樣品材料主要保持在較低的區(qū)域中，因此，只要一個(gè)(較低的)中空球形端部就足以使用球可靠地進(jìn)行壓碎。具體來(lái)說(shuō)，將冷卻到至少-50°C的樣品放置在塑料容器中。然后振搖該容器，具體來(lái)說(shuō)，使用設(shè)備以一定方式振搖10-200秒，使可移動(dòng)體來(lái)回運(yùn)動(dòng)，優(yōu)選上下運(yùn)動(dòng)，優(yōu)選運(yùn)動(dòng)頻率為10-100赫茲，具體來(lái)說(shuō)，頻率至少為30赫茲。如果振搖或往復(fù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間太長(zhǎng)，則樣品有解凍的風(fēng)險(xiǎn)。為了能可靠地在可用時(shí)間內(nèi)破碎樣品，往復(fù)過(guò)程應(yīng)足夠長(zhǎng)且頻率足夠高。 由此，將樣品壓碎，從塑料容器中取出，按照規(guī)程使用試劑盒對(duì)所需量的樣品進(jìn)行處理。除了冷凍的樣品和一個(gè)或多個(gè)可移動(dòng)的硬體以外，容器中基本上沒(méi)有其他物質(zhì)，尤其是沒(méi)有冷卻劑(如液氮)或例如緩沖溶液。這些其他物質(zhì)至少在通常情況下只會(huì)對(duì)所需結(jié)果造成摻假。令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)與本領(lǐng)域已知的樣品制備法相比，這種形式的對(duì)冷凍試樣的破碎能獲得非常優(yōu)良的結(jié)果，而且不需要進(jìn)行大的技術(shù)改進(jìn)，操作也很簡(jiǎn)單?？梢允∪ピ诶鏣issueRupter中的破碎，因?yàn)檫@種額外的破碎基本上是不需要的。由此制備的樣品可以立刻進(jìn)行處理，給出特別優(yōu)良的結(jié)果。技術(shù)改進(jìn)要求不高，因?yàn)橹挥邪梢苿?dòng)體的容器和其中放置的適配器需要冷卻，例如在冷凍箱中冷卻到例如-50°C到-80°C的溫度。將樣品壓碎之后，可以將其取出，例如儲(chǔ)存在另一個(gè)容器中并進(jìn)行冷卻，供以后使用?；蛘?，不需要取出樣品并儲(chǔ)存在另一個(gè)容器中，而是仍然在包括可移動(dòng)體的塑料容器中進(jìn)行。在該情況中， 該容器同時(shí)用作破碎容器和儲(chǔ)存容器?？梢跃_且簡(jiǎn)單地決定處理所需的樣品量。另外， 在該過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)同種組織分配。甚至可以制備穩(wěn)定化的組織、植物的葉和種子，以這種方式進(jìn)行進(jìn)一步處理。但是，這種方法并不適合皮膚和骨頭以及比較硬或粘的樣品。由于在冷卻的密封適配器中進(jìn)行處理不需要很長(zhǎng)時(shí)間，所以不需要中斷振搖過(guò)程和在間歇時(shí)間內(nèi)將適配器冷卻到適當(dāng)?shù)牡蜏?。如果適配器具有壁足夠厚的金屬套，這樣做是特別有利的。一般來(lái)說(shuō)，壁厚幾毫米就足夠了。在一種實(shí)施方式中，壁的厚度至少為0.5 毫米，從而提供足夠的熱容，優(yōu)選至少為1毫米。為了不至于變得太重，在一種實(shí)施方式中， 壁厚不超過(guò)4毫米。由于壓碎之后，樣品以粉末形式提供，所以使樣品具有特定的大表面積是有利的， 隨后可以在該大表面積上與使用的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生作用?？梢砸蕴貏e簡(jiǎn)單的方式為隨后的步驟提供所需量的粉末，例如通過(guò)稱(chēng)量提供，或者甚至通過(guò)相應(yīng)尺寸的測(cè)量容器(例如量匙) 提供。適配器本身適合于以非冷卻的狀態(tài)破碎未冷卻的樣品。但是，在這種情況中，樣品通過(guò)分解緩沖劑的方式進(jìn)行破碎，在破碎過(guò)程中，該分解緩沖劑與樣品一起位于塑料容器中。當(dāng)適配器以非冷卻狀態(tài)使用時(shí)，也對(duì)樣品進(jìn)行壓碎。在這種情況中，產(chǎn)生緩沖劑和組織的溶液。合適的分解緩沖劑包括含有用于破碎DNA的絡(luò)合劑和表面活性劑的緩沖劑，例如，從德國(guó)希爾敦的(Hilden，Germany)恰根公司^jiagen GmbH)購(gòu)得的分解緩沖劑ATL， 或者緩沖劑包含用于破碎RNA的離液劑，例如從恰根公司Oliagen GmbH)購(gòu)得的分解緩沖劑 RLT。將之前稱(chēng)量的組織片在冷卻狀態(tài)中處理成粉末之后，在一種實(shí)施方式中加入緩沖劑，即將粉末轉(zhuǎn)移到溶液中。由此避免困難的操作，從而再次取出非常少量的樣品，例如10 毫克組織粉末。如果對(duì)組織進(jìn)行破碎，則優(yōu)選對(duì)破碎使用位于塑料容器中的較大的金屬可移動(dòng)體。如果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行破碎，則較小的可移動(dòng)體主要由玻璃構(gòu)成(所謂玻璃珠)。玻璃珠具有較小的直徑，類(lèi)似砂。由此，摩擦變得強(qiáng)得多。這些性質(zhì)是需要的，以便對(duì)細(xì)菌進(jìn)行破碎。 一般來(lái)說(shuō)，金屬珠太大，因此單個(gè)球之間的距離產(chǎn)生的間隙太大，從而無(wú)法破碎細(xì)菌。作為上述實(shí)踐的代替方式，還可在原則上選擇不同的非金屬材料，尤其是能與塑料相近的材料。但是，塑料是特別優(yōu)選的。通過(guò)以下對(duì)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)明，其他優(yōu)點(diǎn)和實(shí)施方式將是顯而易見(jiàn)的。

圖1顯示通過(guò)適配器1的橫截面。適配器1包括容器形狀的基體2，該基體被蓋子 3密封。在該基體中，設(shè)置了總共12個(gè)套4 (在俯視圖中看)，這些套由鋁構(gòu)成，在適配器中軸周?chē)詧A形方式設(shè)置。套4的壁厚度為1毫米。套4的上部區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)縫5。 有縫的上部區(qū)域通過(guò)夾具固定在插入件加中，插入件位于基體2中。因此，可以為了清潔的目的從基體2取下套4，尤其是與插入件加一起簡(jiǎn)單地取下。圖1顯示有蓋的塑料容器6，其插入金屬套4中。塑料容器6被夾在兩個(gè)發(fā)泡硅酮的彈性環(huán)狀盤(pán)7之間，該盤(pán)7設(shè)置在塑料容器6的下方和上方。上部環(huán)狀盤(pán)通過(guò)蓋子3 以設(shè)置在蓋子3下側(cè)的橫向溝槽的方式固定。下部環(huán)狀盤(pán)7通過(guò)橫向溝槽固定在基體2的底部上。彈性盤(pán)7在破碎過(guò)程中使容器穩(wěn)定化，因此不會(huì)破損。此外，彈性盤(pán)7具有降噪效
果 ο由塑料構(gòu)成的容器6的底部是中空球形的。在容器6中存在鋼構(gòu)成的球8。將生物樣品9放置在鋼球8和塑料容器6的中空球形底部之間。只需要塑料容器6的底部是中空球形的就足夠的，而對(duì)其蓋子區(qū)域沒(méi)有這種要求，由于重力的原因，樣品將至少主要保持在較低的部分中，因此樣品在底部區(qū)域中被壓碎。在其上半部，基體2具有鋼質(zhì)螺線插入件10，該插入件中螺旋連接有蓋子3的緊固螺絲11，從而用蓋子密封基體。轉(zhuǎn)四分之一圈就足以緊固蓋子。在下半部中有另一個(gè)鋼質(zhì)螺線軸襯12，該軸襯中螺旋連接有螺絲13，從而使螺絲13的螺線在容器2的底部區(qū)域上突出。而且，螺絲13用膠粘劑緊固，反面連接了螺母14，這種連接非?？煽?，不會(huì)使這種緊固狀態(tài)松脫。螺絲13向下突出的那部分螺線用于將適配器1以可松脫的方式緊固于設(shè)備，從而使適配器能以振動(dòng)方式上下移動(dòng)，用球8將樣品9壓碎并使其破碎。而且，基體2由塑料(即聚甲醛)構(gòu)成。這種塑料能承受約-80°C的低溫，以及普通的清潔溶液。由聚甲醛構(gòu)成的環(huán)狀插入件加在基體2的上部區(qū)域中受到硅酮0形環(huán)15 的支承，該0形環(huán)的肖氏硬度為50，并通過(guò)蓋子3通過(guò)夾具固定。將金屬套的上部區(qū)域夾在插入件加中。因此，由硅酮構(gòu)成的環(huán)能降噪。但是，還可選擇其他符合上述要求的塑料。蓋子3和插入件加通過(guò)彈性中間層互相分開(kāi)，從而進(jìn)一步降低破碎過(guò)程中的噪聲。中間層還可以是硅酮環(huán)。插入件加包括向上的突起，居中設(shè)置的夾鉗16，從而能使插入件14與套和其中懸掛的塑料容器一起移動(dòng)。為了能適當(dāng)?shù)貞覓焖芰先萜?，其上部部分中具有較寬的輪緣，其寬度大于套4的內(nèi)部直徑。在所示的示例性實(shí)施方式中，套的上部部分具有加寬的內(nèi)部直徑， 從而能容納塑料容器的加寬的輪緣。如果插入件加與塑料容器6 —起取出，則塑料容器的加寬的上部輪緣能進(jìn)入內(nèi)部直徑放大的套的相應(yīng)上部凹陷中，然后在運(yùn)輸過(guò)程中特別牢固地固定。圖1中所示基體的直徑約為80毫米?；w高度約為50毫米。金屬套4的內(nèi)部直徑為11毫米。這種套4的高度為35毫米。相應(yīng)尺寸的塑料容器6方便地裝有約25毫克樣品材料作為標(biāo)準(zhǔn)。上述尺寸和適配器材料僅僅是優(yōu)選情況，無(wú)須強(qiáng)制選擇。同樣適用于所示適配器的設(shè)計(jì)。圖2顯示一個(gè)臺(tái)架，其上可以放置插入件加以及懸掛的塑料容器6和套。臺(tái)架的圓筒形凹陷18用于容納套4和塑料容器6。鉆錐19用于將塑料容器從套中推出，從而能簡(jiǎn)單地取出塑料容器。臺(tái)架17的向上突起夾鉗20推過(guò)插入件加的中央開(kāi)口，從而將插入件加放置在臺(tái)架17上。
實(shí)施例以下實(shí)驗(yàn)使用圖1中所示的適配器進(jìn)行。1.從新鮮大鼠肝臟和新鮮大鼠心臟分離DNA分別將12個(gè)新鮮大鼠肝臟和心臟的樣品(25毫克)加入180微升ATL (即包含絡(luò)合劑和表面活性劑的緩沖劑，從恰根公司toiagen GmbH)，德國(guó)希爾敦(Hilden，Germany) 購(gòu)得(參見(jiàn)網(wǎng)頁(yè) http://wwwl. qiagen. com/Products/Accessories/Buffers/BufferATL. aspx))禾口 10 微升 DX (參見(jiàn)網(wǎng)頁(yè) http://wwwL qiagen. com/Products/ReagentDX. aspx)中， 使用兩個(gè)金屬不銹鋼球(也稱(chēng)為“珠”)，其直徑為5毫米，以50赫茲的頻率破碎1. 5分鐘。 測(cè)試顯示，在兩個(gè)珠的情況中，紊流較大，導(dǎo)致組織研磨程度較高。因此，通過(guò)設(shè)備以50赫茲的頻率上下移動(dòng)適配器。然后取出樣品，用小的臺(tái)式離心機(jī)離心。破碎過(guò)程之后，將適配器夾在這種臺(tái)式離心機(jī)中。然后打開(kāi)離心機(jī)短時(shí)間周期，再次使所有成分來(lái)到適配器的底部。然后加入20微升蛋白酶K，進(jìn)行旋流，將溶液在56°C培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)之后，向樣品中加入4微升RNAse A(100毫克/毫升)，培養(yǎng)5分鐘。其他步驟按照DNeasy規(guī)程進(jìn) ^f (參見(jiàn)網(wǎng)頁(yè) http://wwwl. qiagen. com/Products/GenomicDnaStabilizationPurificati on/DNeasyTissueSystem/DNeasyBloodTissueKit. aspx)。結(jié)果心臟心臟組織給出平均5. 83微克DNA和1. 07的標(biāo)準(zhǔn)偏差。分離的DNA質(zhì)量可以略高， 但是對(duì)于該結(jié)果沒(méi)有抱怨。肝臟肝臟組織給出平均34. 08微克DNA和10. 97的標(biāo)準(zhǔn)偏差。肝臟組織的破碎顯示， 破碎工作非常優(yōu)良。2.從新鮮的牛肝臟分離DNA分別將12個(gè)樣品(25毫克)的新鮮牛肝臟加入180微升ATL和6微升DX中，使用兩個(gè)珠，以50赫茲的頻率破碎2分鐘。然后取出樣品，并離心。然后加入20微升蛋白酶 K，進(jìn)行旋流，將溶液在56°C培養(yǎng)1.5小時(shí)。培養(yǎng)之后，向樣品中加入4微升RNAse A(100毫克/毫升)，以室溫培養(yǎng)5分鐘。其他步驟按照德國(guó)希爾敦得恰根公司(Quiagen，Hilden, Germany)的QIAcube組織和嚙齒動(dòng)物尾巴規(guī)程進(jìn)行。組織和嚙齒動(dòng)物尾巴規(guī)程與QIA cube 一起裝運(yùn)。結(jié)果肝臟肝臟組織給出平均44. 38微克DNA和12. 84的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)肝臟組織的破碎再次顯示，破碎工作非常優(yōu)良。DNA同樣可以作為白色卷狀物看到，使用移液管將其轉(zhuǎn)移到新的 MRV中比較困難(MRV =微反應(yīng)容器，或簡(jiǎn)稱(chēng)為“印pi ” )。 一般來(lái)說(shuō)，預(yù)計(jì)有20微克DNA。較高的44. 38微克的DNA平均值表明，DNA進(jìn)行了進(jìn)一步的分解。小的碎片導(dǎo)致測(cè)量中產(chǎn)生較高的信號(hào)，會(huì)造成濃度較高的錯(cuò)誤指示。
權(quán)利要求
1.破碎生物樣品(9)的方法，其包括以下步驟將樣品(9)裝入非金屬容器(6)中，將所述容器(6)插入適配器0，2a)中，將其中設(shè)置有密封的容器(6)的適配器與能使該適配器往復(fù)移動(dòng)、尤其是上下往復(fù)移動(dòng)的設(shè)備相連。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，有多個(gè)容器(6)中裝有生物樣品(9)，這些樣品通過(guò)自動(dòng)往復(fù)方式通過(guò)適配器進(jìn)行同時(shí)破碎，這些容器插入適配器中。
3.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，首先洗滌樣品(9)，然后在液氮中冷凍或進(jìn)行化學(xué)保存，將由此制備的樣品裝入容器(6)中。
4.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述適配器包括金屬套，套中插有容器(6)，所述容器中裝有生物樣品。
5.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，首先將所述容器(6)、樣品(9) 和適配器0，2a)冷卻到低于-20°C，優(yōu)選冷卻到低于-50°C，隨后通過(guò)使適配器往復(fù)移動(dòng)而破碎樣品。
6.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將所述適配器0，2a)冷卻到不低于-80°C。
7.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，容器中裝入至少一個(gè)可移動(dòng)硬體(8)，優(yōu)選是兩個(gè)可移動(dòng)硬體，該硬體具體由金屬或玻璃構(gòu)成。
8.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在破碎之前將分解緩沖劑裝入容器(6)中，具體是包含用于破碎DNA的絡(luò)合劑和表面活性劑的緩沖劑，優(yōu)選是ATL，或包含用于破碎RNA的離液劑的緩沖劑，具體是RLT。
9.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述適配器0，2a)以至少10赫茲、優(yōu)選至少30赫茲的頻率往復(fù)移動(dòng)。
10.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，裝入容器(6)中的樣品重量不超過(guò)50毫克，優(yōu)選不超過(guò)30毫克。
11.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述容器(6)由塑料構(gòu)成。
12.用于進(jìn)行如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法的裝置，其包括適配器(2, )，該適配器具體主要由塑料構(gòu)成，還包括套G)，套由金屬構(gòu)成，套用于容納非金屬容器(6)，該容器優(yōu)選由塑料構(gòu)成。
13.如以上裝置權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，適配器0，2a)以可松脫的方式與能使適配器平行于所述套自動(dòng)往復(fù)移動(dòng)的設(shè)備連接，具體是以可旋松螺絲的方式連接。
14.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述設(shè)備經(jīng)過(guò)設(shè)置，使適配器能以至少10赫茲、優(yōu)選至少30赫茲的頻率往復(fù)移動(dòng)。
15.如以上裝置權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，容器(6)插入套中，所述容器中還有生物樣品(9)以及另外的可移動(dòng)硬體(8)，所述容器主要由金屬或玻璃構(gòu)成。
16.如以上裝置權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，金屬套的內(nèi)部直徑不超過(guò)16毫米，優(yōu)選不超過(guò)12毫米。
17.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，有至少6個(gè)金屬套0)，優(yōu)選有至少12個(gè)金屬套，所述金屬套用于容納容器(6)。
18.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，套(4)通過(guò)插入件Oa)固定， 該插入件能從適配器取下。
19.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，在俯視圖中，套(4)設(shè)置成環(huán)的形狀。
20.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，具有蓋子(3)，所述蓋子能與適配器0，2a)牢固連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用來(lái)破碎生物樣品(9)的方法，所述方法包括以下步驟將所述樣品(9)放入由塑料組成的容器(6)中，具體來(lái)說(shuō)，將所述容器(6)插入適配器(2，2a)中，將所述其中裝有封閉容器的適配器與能夠使得該適配器自動(dòng)往復(fù)移動(dòng)、具體來(lái)說(shuō)是上下移動(dòng)的設(shè)備相連。通過(guò)該方法可以使得生物樣品以自動(dòng)的方式破碎，能夠?qū)κ覝貥悠泛屠鋬鰳悠愤M(jìn)行精確處理。本發(fā)明還涉及用來(lái)實(shí)施該方法的設(shè)備，所述設(shè)備包括適配器(2，2a)，該適配器主要由塑料組成，包括由金屬制成的套(4)，所述套(4)用來(lái)容納容器(6)，所述容器(6)具體來(lái)說(shuō)由塑料組成。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102159931SQ200980136984
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者A·謝弗, D·梅爾騰斯, F·威莫爾, G·巴爾 申請(qǐng)人:恰根有限公司