專利名稱：用于樣品瞬逝照明的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于樣品瞬逝照明的裝置和方法。
背景技術(shù)：
在樣品的瞬逝照明中，如此提供照明樣品的光線束以使得在樣品的邊界面發(fā)生 全反射。因此樣品中形成了持續(xù)存在的瞬逝波，其強(qiáng)度隨相對(duì)邊界面的距離按指數(shù)減 弱。強(qiáng)度下降到Ι/e的距離可以定義為描述瞬逝波穿透深度的距離。典型值位于100 至200nm的范圍內(nèi)。瞬逝輻射例如用于在樣品中激發(fā)熒光。然后能夠借助顯微鏡探測所激發(fā)的熒光 輻射。幾種具有不同波長的熒光越來越多地被激發(fā)。這在相同的條件下應(yīng)該明顯發(fā) 生至最可能的程度，以使得單個(gè)熒光圖像依然有意義并且能夠定量地相互結(jié)合或相互比 較。在穿透深度依賴于波長和入射角這方面存在難題。在相同入射角時(shí)，穿透深度對(duì)于 不同波長是大小不同的。

發(fā)明內(nèi)容
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的是提供一種用于樣品瞬逝照明的裝置，其中穿透深 度與波長相關(guān)的差異被減小。而且，將提供用于樣品瞬逝照明的特定方法。該目的通過一種用于樣品瞬逝照明的裝置而實(shí)現(xiàn)，所述裝置包括照明光學(xué)器 件，其設(shè)有校正光學(xué)器件和設(shè)置于所述校正光學(xué)器件下游的物鏡，并且用所提供的包含 至少兩種不同波長光輻射的光線束瞬逝照明樣品，校正光學(xué)器件具有橫向色差，其在照 明期間導(dǎo)致光輻射根據(jù)波長在不同高度穿過物鏡光瞳，并且對(duì)其以如此方式選擇，即減 小在瞬逝照明期間輻射進(jìn)入樣品的穿透深度與波長相關(guān)的差異。因此，根據(jù)本發(fā)明的裝置可用于同時(shí)以具有至少兩種不同波長的光輻射或以具 有兩種不同波長的光錐照明樣品，其在例如熒光檢驗(yàn)的情況下具有優(yōu)勢。穿透深度的差 異能夠顯著減小，由其例如可以評(píng)估來源于同時(shí)或順序完成的頻率激發(fā)的多光譜圖像。因而瞬逝照明中的光譜穿透深度與依據(jù)本發(fā)明的裝置相統(tǒng)一。所以具有不再需 要提供儀器中用于校準(zhǔn)光譜穿透深度的調(diào)整選項(xiàng)的優(yōu)勢。在依照本發(fā)明的裝置中有利地利用了物鏡光瞳的高度影響照明角度并因此影響 瞬逝照明中的穿透深度。依照本發(fā)明通過有意的校正光學(xué)器件的倍率色差對(duì)其如此進(jìn)行 利用，即物鏡光瞳中存在需要的依賴于波長的高度，從而在瞬逝照明期間獲得相同的穿 透深度。由于依照本發(fā)明的裝置，可以用高得多的頻率在例如其中不同熒光團(tuán)或染料以 不同波長被同時(shí)或順序激發(fā)的實(shí)驗(yàn)情況下進(jìn)行測量或檢驗(yàn)，因?yàn)樵僖膊恍枰褚郧八?需的那樣為了達(dá)到相同的穿透深度或相同的激發(fā)量而在兩個(gè)檢測(或瞬像(snapshot))之間移動(dòng)機(jī)械元件了。校正光學(xué)器件可包括衍射和/或折射元件。尤其，其可以是傾斜放置的平板、 楔形物、棱鏡、衍射元件和/或可以傾斜放置的透鏡，以及這些元件的任意組合。由校 正光學(xué)器件引起的橫向色差也可以通過考慮物鏡的放大倍率而特別地選擇。如果物鏡在 照明中具有色差，這可以在選擇校正光學(xué)器件的橫向色差或倍率色差時(shí)考慮。校正光學(xué)器件可以具有與物鏡光瞳共軛的平面，所提供的光線束穿過所述平面。尤其是，所提供的光線束平行于校正光學(xué)器件的光軸穿過共軛平面。在這種情況下 校正光學(xué)器件的設(shè)置容易實(shí)現(xiàn)。另外，光線束能夠以離軸方式與物鏡光瞳中的主光線所需傳播路徑相對(duì)應(yīng)地以 一定距離并在一定角度下穿過該平面。例如在光纖內(nèi)不同波長的光可以提供在該平面 中，依照本發(fā)明其光線以限定的橫向色差在物鏡光瞳中成像，由此能夠以有目的的方式 減小穿透深度的光譜差。尤其，根據(jù)本發(fā)明的用于樣品瞬逝照明的裝置可包括饋送單元，其以離軸方式 和/或采用光線束不平行于校正光學(xué)器件的光軸延伸的方式來饋送校正光學(xué)器件的光線 束。饋送單元可包括光纖，設(shè)置其光纖端面以實(shí)現(xiàn)所期望的光線束饋送?？梢岳斫怵佀?單元也能夠包括其它光學(xué)元件，諸如分束器、透鏡、光柵等。在所提供的光線束中，包括具有不同波長尤其是彼此同軸的光錐(ray pencil)。 這簡化了校正光學(xué)器件的配置。根據(jù)本發(fā)明的用于樣品瞬逝照明的裝置還可以包括驅(qū)動(dòng)元件，其例如可以作為 饋送單元的一部分，并且用它可以設(shè)定光線束的位置和/或角度，光線束在該位置中或 該角度下穿過共軛平面。尤其，光線束到校正光學(xué)器件光軸的距離可以改變。因此有可 能同時(shí)改變對(duì)于所有波長的穿透深度。也可以這樣設(shè)置驅(qū)動(dòng)元件，以使得在物鏡光瞳中所有依賴于波長的高度可因此 同時(shí)改變。優(yōu)選地，以這樣的方式實(shí)行改變，即穿透深度以不依賴于波長的方式變化。 在借助驅(qū)動(dòng)元件改變穿透深度的情況下，光譜穿透深度可發(fā)生微小的依賴于波長的變 化。與非校正情形相比，仍存在的差異降低了至少一個(gè)量級(jí)。當(dāng)所提供的光線束包括兩個(gè)或更多個(gè)具有不同波長的光錐時(shí)，穿透深度與波長 相關(guān)的差異能夠最小化。特別是有可能對(duì)于兩種、三種或更多波長的穿透深度是相同 的。與穿透深度沒有進(jìn)行任何校正的情形相比，顯著的減小在波長介于中間的情形下是 可能的。與非校正的情形相比，仍存在的差異能夠降低一個(gè)或幾個(gè)量級(jí)。在多于兩種或三種不同波長的情況下，校正光學(xué)器件可以設(shè)置成例如這樣的方 式以使得對(duì)于所有的波長光譜差異被最小化。例如對(duì)于任何波長來講可以要求光譜差異 不超過預(yù)定的限值。任何其它類型的最小化也是可能的。光輻射或光學(xué)光錐在這里將特別理解為根據(jù)光學(xué)定律而表現(xiàn)的電磁輻射。尤其 是，其涉及來自可見波長范圍的輻射。來自紅外范圍或紫外范圍的輻射也是可能的。根據(jù)本發(fā)明的用于樣品瞬逝照明的裝置可以是顯微鏡組件。在這種情形下，可 以用這樣的方式設(shè)置能夠瞬逝照明樣品的顯微鏡，即使得輻射在樣品中的穿透深度與波 長相關(guān)的差異減小。在這種情形下，校正光學(xué)器件可以利用顯微鏡照明光學(xué)器件的一部分。校正光學(xué)器件可以包括設(shè)置于物鏡下游的入射垂直照明的一部分。在這種情形下，校正光學(xué)器 件包括例如校正組件，其可被加到顯微鏡上并與照明光學(xué)器件的該部分一起實(shí)現(xiàn)依照本 發(fā)明的校正光學(xué)器件。在這種情形下，校正光學(xué)器件優(yōu)選地以這樣的方式設(shè)置，即與所 使用的照明光學(xué)器件的該部分一起實(shí)現(xiàn)所期望的校正光學(xué)器件的橫向色差。當(dāng)使用這種顯 微鏡探測熒光輻射時(shí)，它也經(jīng)常稱作TIRF(=全內(nèi)反射熒光)顯微 鏡。在TIRF顯微鏡中，大幅地減小從落射熒光(epi-fluorescence)獲知的背景熒光并且 成像對(duì)比度大幅地提高。結(jié)果是很高的ζ軸向分辨率(z-resolution)。瞬逝場的典型厚度 為 100 至 200nm。依據(jù)本發(fā)明的裝置容許在TIRF顯微鏡和用幾種不同波長的處理中優(yōu)化激發(fā)光譜 量，以通過利用這幾種波長而獲得更明亮和更好的TIRF彩色圖像。由于成像原理，根據(jù)本發(fā)明的裝置的這種照明方法尤其適合于檢測在細(xì)胞膜環(huán) 境下的動(dòng)態(tài)過程以及檢測無細(xì)胞的系統(tǒng)中分子與分子的相互作用。另外，電生理學(xué)和藥 理學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)合(樣品操作)也將起到主要作用，因?yàn)門IRF顯微鏡能夠在先前只有間接 測量可行的地方提供圖像。根據(jù)本發(fā)明的用于樣品瞬逝照明的裝置還可以包括產(chǎn)生光線束的源。輻射特別 可涉及激光輻射。根據(jù)本發(fā)明的用于樣品瞬逝照明的裝置和具有這種裝置的顯微鏡可包括本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知的控制裝置。尤其顯微鏡可采取慣用方式設(shè)置。由用于樣品瞬逝照明的方法進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，其包括光線束，所述光線 束包含具有至少兩種不同波長的光輻射，經(jīng)校正光學(xué)器件和設(shè)置于校正光學(xué)器件下游的 物鏡將光線束引導(dǎo)至樣品，使得樣品被瞬逝照明，所述校正光學(xué)器件具有橫向色差，其 在照明期間導(dǎo)致光輻射依照波長在不同高度穿過物鏡光瞳，并且以如此方式對(duì)其選擇， 即減小在瞬逝照明期間輻射在樣品中的穿透深度與波長相關(guān)的差異。依據(jù)本發(fā)明的方法容許同時(shí)以不同波長瞬逝照明樣品并確保穿透深度只稍有差 異。特別是，穿透深度可以相同。以這一方法可在突出方式中實(shí)現(xiàn)具有不同波長的相同照明條件。校正光學(xué)器件可設(shè)有至少一個(gè)折射和/或至少一個(gè)衍射元件。尤其，校正光學(xué)器件可包括與物鏡光瞳共軛的平面，所提供的光線束穿過所述 平面。優(yōu)選地，對(duì)于不同波長光線束作為同軸線束穿過共軛平面。在該方法中，優(yōu)選以具有不同波長的光輻射同時(shí)照明樣品。該方法可用于以離軸方式和/或不平行于校正光學(xué)器件的光軸延伸的方式對(duì)校 正光學(xué)器件提供光線束。因而能夠以有目的的方式利用校正光學(xué)器件的橫向色差，使得 不同波長在所期望的不同高度穿過物鏡光瞳。依照本發(fā)明的照明方法可用于顯微鏡檢測中。因此提供了特定的顯微鏡使用方 法，例如TIRF顯微鏡使用方法。顯微鏡使用方法可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進(jìn)一 步開發(fā)。要理解以上所提到和下面仍要解釋的特征不僅能用于所闡明的組合中，而且也 用于不脫離本發(fā)明范圍的其它組合或單獨(dú)地使用。


參照所附的同樣公開了有關(guān)本發(fā)明的特征的附圖，本發(fā)明將在下文得到更為詳細(xì)的解釋，其中圖1示出了依照本發(fā)明用于樣品瞬逝照明的裝置的一個(gè)實(shí)施例的示意圖；圖2示出了圖1的帶有樣品11的物鏡4的放大圖；圖3示出了依照本發(fā)明用于樣品瞬逝照明的裝置的另一個(gè)實(shí)施例；圖4示出了圖1-3的實(shí)施例中現(xiàn)有穿透深度的解釋的示意圖；圖5示出了依照本發(fā)明使用衍射光學(xué)器件的樣品瞬逝照明裝置的另一個(gè)實(shí)施 例；以及圖6示出了依照本發(fā)明使用以衍射方式作用的光柵的樣品瞬逝照明裝置的另一 個(gè)實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式在圖1和2所示的實(shí)施例中，依照本發(fā)明的樣品瞬逝照明裝置集成于顯微鏡2 中，并且包括校正光學(xué)器件3和置于校正光學(xué)器件3下游的物鏡4。校正光學(xué)器件3包括帶有三個(gè)透鏡Li、L2和L3的校正單元5，下游的偏轉(zhuǎn)棱鏡 6，帶有兩個(gè)透鏡L4和L5的入射光光學(xué)器件7和反射鏡8。入射光光學(xué)器件7可以是顯微鏡2的常規(guī)入射垂直照明部件。出于簡化圖解的 原因，這里未表示入射垂直照明的更多元件。如果移除棱鏡6，用于入射垂直照明的光將 從箭頭Pl所示的方向遇到入射光光學(xué)器件7，然后經(jīng)反射鏡8被饋送到顯微鏡光束路徑 中。反射鏡8可設(shè)置為部分透明的反射鏡和/或二向色反射鏡(取決于應(yīng)用)。顯微鏡2還可以包括管狀光學(xué)器件9和圖像傳感器10。在依照?qǐng)D1和2的實(shí)施例中，以波長450nm和575nm的輻射15進(jìn)行的樣品11 的瞬逝照明采取這樣的方式，即穿透深度與兩波長無關(guān)，在每一情形下均為93nm。所提 供的光線束15在圖1中由箭頭表示。箭頭的尖端位于平面16上并可以是例如輻射15出 射的光纖端面。在這種情形下，采用平面16是物鏡4的出射光瞳14的共軛平面的方式設(shè)置校正 光學(xué)器件3，出射光瞳14的位置如圖1中箭頭14所表示。另外，校正光學(xué)器件3包括橫 向色差，配置橫向色差，使得以該方式補(bǔ)償了兩種波長450nm和575nm在待檢測樣品11 的瞬逝照明中穿透深度d(圖2)依賴于波長的差。對(duì)于兩種波長450nm和575nm，為了獲得相同的93nm的預(yù)定穿透深度d，設(shè)置 校正光學(xué)器件3的校正單元5，使其具有強(qiáng)的橫向色差。采用這樣的方式選擇橫向色差， 即具有波長450nm的光輻射或者光學(xué)光錐Sl在探測側(cè)比具有波長575nm的光輻射S2以 更低的高度hi (距光軸OA的距離)穿過物鏡4的光瞳14，如圖2中示意性地表示。通 過校正單元5預(yù)設(shè)不同的高度hi、h2(距光軸OA的距離)，使得作為因而輻射Si、S2 在樣品11上產(chǎn)生不同入射角的結(jié)果，對(duì)于兩種波長每個(gè)穿透深度d都是93nm。校正單元5的設(shè)置取決于高度h，其可以基于所期望的穿透深度d進(jìn)行如下計(jì) 算穿透深度d可以根據(jù)下面的公式1表示
權(quán)利要求
1.一種用于樣品瞬逝照明的裝置，包括照明光學(xué)器件，其設(shè)有校正光學(xué)器件(3)和位 于所述校正光學(xué)器件(3)下游的物鏡(4)，以用所提供的包含具有至少兩種不同波長的光 輻射(Si、S2)的光線束(15)瞬逝照明所述樣品，所述校正光學(xué)器件(3)具有橫向色差， 其在照明期間導(dǎo)致所述光輻射(Si、S2)根據(jù)所述波長在不同高度穿過所述物鏡(4)的光 瞳(14)，并且以如此方式對(duì)其選擇，即減小在瞬逝照明期間輻射進(jìn)入所述樣品(11)的穿 透深度與波長相關(guān)的差異。
2.按照權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述校正光學(xué)器件(3)包含至少一個(gè)折射元件 (Li、L2、L3)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的裝置，其中，所述校正光學(xué)器件(3)包含至少一個(gè)傾斜 放置的平板(17)和/或傾斜放置的透鏡。
4.按照上述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述校正光學(xué)器件(3)包括與所述 物鏡光瞳(14)共軛的平面(16)，所提供的光線束(15)穿過所述平面。
5.按照上述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的裝置，包括饋送單元，其將所述光線束(15)以 離軸方式饋送至所述校正光學(xué)器件(3)。
6.按照權(quán)利要求5所述的裝置，其中，所述饋送單元以如此方式饋送所述校正光學(xué)器 件(3)的光線束(15)，以使其不平行于所述校正光學(xué)器件(3)的光軸而延伸。
7.一種用于樣品瞬逝照明的方法，包括含有至少兩種不同波長的光輻射的光線束， 所述光線束經(jīng)校正光學(xué)器件和設(shè)置于所述校正光學(xué)器件下游的物鏡引導(dǎo)至樣品，以使得 樣品被瞬逝照明，所述校正光學(xué)器件具有橫向色差，其在照明期間導(dǎo)致光輻射根據(jù)所述波長在不同高 度穿過所述物鏡的光瞳，并且以如此方式對(duì)其選擇，即減小在瞬逝照明期間輻射進(jìn)入所 述樣品的穿透深度與波長相關(guān)的差異。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述校正光學(xué)器件設(shè)有至少一個(gè)折射元件。
9.按照權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述校正光學(xué)器件設(shè)有至少一個(gè)傾斜放置 的平板和/或傾斜放置的透鏡。
10.按照權(quán)利要求7-9中的一項(xiàng)所述的方法，其中，所述校正光學(xué)器件具有與物鏡光 瞳共軛的平面，所提供的光線束穿過所述平面。
11.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述光線束包括光輻射，以使其作為同軸光 線束穿過共軛平面。
12.按照權(quán)利要求7-11中的一項(xiàng)所述的方法，其中，用具有所述至少兩種波長的光輻 射同時(shí)照明所述樣品。
13.按照權(quán)利要求7-12中的一項(xiàng)所述的方法，其中，所述光線束以離軸方式饋送至所 述校正光學(xué)器件。
14.按照權(quán)利要求7-13中的一項(xiàng)所述的方法，其中，所述光線束以如此方式饋送至所 述校正光學(xué)器件，以使其不平行于所述校正光學(xué)器件的光軸而延伸。
15.按照權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述校正光學(xué)器件(3)包括至少一個(gè)衍射元 件(20、 25)。
16.按照權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述校正光學(xué)器件設(shè)有至少一個(gè)衍射元件 (20、25)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樣品瞬逝照明的裝置，所述裝置包括設(shè)有光學(xué)校正元件(3)和位于所述光學(xué)校正元件下游的物鏡(4)的光學(xué)照明元件，從而用所提供的包含具有至少兩種不同波長的光輻射的光束瞬逝地照明樣品。校正光學(xué)元件(3)具有橫向色差，其在照明期間導(dǎo)致光輻射根據(jù)波長在不同高度穿透物鏡(4)的光瞳(14)，并且對(duì)其選擇，使得在瞬逝照明期間輻射進(jìn)入樣品的穿透深度的波長相關(guān)差減小。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102016551SQ200980115071
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者布魯尼·維納斯, 曼弗雷德·馬薩 申請(qǐng)人:卡爾·蔡司顯微成像有限公司