專利名稱：使用氣相和/或汽相分析用于分析檢測的生物學測定方法
使用氣相和/或汽相分析用于分析檢測的生物學測定方法背景本公開一般涉及用于通過氣相和汽相分析方法來完成生物學測定的改善的方法， 更具體地講，涉及在測定中使用載體顆粒作為支持物，以增強氣相和汽相分析。氣相和汽相分析方法例如離子淌度光譜法(ion mobility spectrometry, IMS) 可用于檢測和鑒定低濃度的爆發(fā)性、藥物、化學武器和其它目標化學品。這通過以下列文 獻為例的IMS操作來完成美國專利號3，699，333、美國專利號5，027，643、美國專利號 5，491，337 和美國專利號 6，690，005。在過去，已經(jīng)完成了費力的工作，以配置生化試驗或測定，使得氣相或汽相分析設(shè) 備能分析測定并能檢測指定靶標的存在和/或濃度。在通過標準競爭性或非競爭性測定方 法的這些生物學測定中，標記的靶標結(jié)合部分存在，其中或者標記本身可轉(zhuǎn)移至氣相或者 用于將另一分子轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，而產(chǎn)物可轉(zhuǎn)移至氣相，其中可以通過氣相分析設(shè)備對它們進 行分析，用于分析有關(guān)所測靶標的定量或定性信息。Regina等(W0 88/06732)已經(jīng)給出直 接分析已轉(zhuǎn)移至氣相的標記的前一種方法。使用將其他分子轉(zhuǎn)化為氣相類物質(zhì)的標記的后 一種方法在痕量生物學分析上具有優(yōu)勢，因為單一標記用于將多種分子轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，所述 產(chǎn)物容易轉(zhuǎn)移至氣相。這有效擴增了靶標的存在并有助于其檢測。這第二種方法也已經(jīng)在 一些不同實施方案中顯示，所有這些因所使用的測定方法而具有有限的檢測能力。這第二種方法的具體的實施方案是非競爭性酶聯(lián)免疫吸收測定(ELISA)，其中 靶標捕獲在固體支持物上并且用生物學識別配體(例如抗體)特異性標記，所述標記可 以用酶修飾。在充分洗滌后，將支持物暴露至含有多種前體分子的溶液，所述分子可以 被酶重復轉(zhuǎn)化為氣相分析設(shè)備可檢測的形式。在ELISA中，所產(chǎn)生的可檢測分子的數(shù)量 與所存在的靶標濃度直接相關(guān)。在相關(guān)ELISA技術(shù)中，競爭性形式酶標記被從支持物上 置換或者必須與靶標競爭性結(jié)合支持物，導致在這兩種情況下，隨著靶標濃度增加而產(chǎn) 生較少的可檢測分子。因此，氣相分析設(shè)備所提供的數(shù)值仍可用于與樣品中所存在的 靶標量相關(guān)。描述這些標準測定形式和術(shù)語的示例性參考文獻可參見E. P. Diamandis, & T.K.Christopoulos(Immunoassay ;Academic Press :1996) ；S.S.Deshpande(Enzyme Immunoassays :From Concept to Product Development ；Springer :1996)； 禾口 J. R. Crowther(The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology) ；Humana : 1996)。具體地講，Diamond等(美國專利 4，629, 689)、Snyder 等(Journal of Microbiological Methods. 27(1996)81-88 & U. S. Statutory Invention Registration H1563,7/2/1996)禾口 Eiceman (Field Analytical Chemistry and Technology. 1 (4) 213-226，1997)都顯示了用氣相分析設(shè)備分析的ELISA。然而，在這些示例性實例的每一個 中，進行ELISA的方法限制了總體生物學檢測方法的簡單性、效率和分析用途。Diamond等試圖通過在揮發(fā)后濃縮氣相類物質(zhì)，來改進該方法。Eiceman等試圖改 進，不通過分析頂部空間，而是通過采取大量支持物上的一部分未濃縮反應(yīng)體積并從濾紙 條上進行分析。Snyder等試圖通過粗糙和低效的方法例如“槳/組織”組合而減少酶促反 應(yīng)體積，來改進已知方法。
在所有情況下，在產(chǎn)生所檢測分子之前，使用濃縮轉(zhuǎn)化物(converter)(或酶)的 更全面的方法，特別有利。眾所周知的是，在酶促和其它催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，非常需要提高反 應(yīng)溶液中催化劑或酶的濃度。這不僅增加轉(zhuǎn)化過程的反應(yīng)速率，因而允許在設(shè)定時間內(nèi)可 檢測分子的數(shù)量的更大變化，而且還在更小液體體積中完成該反應(yīng)。因為允許引入氣相分 析設(shè)備的液體量是有限的，通過在減少的液體體積中完成轉(zhuǎn)化，就可以對更大部分的反應(yīng) 溶液進行采樣，因此可將更大部分的可檢測的分子遞送給分析設(shè)備，同時還減少了通常會 干擾或降低小分子揮發(fā)和/或分析效率的液體基質(zhì)的數(shù)量。在獨立的科學團體中可以找到在產(chǎn)生氣相分子之前達到該轉(zhuǎn)化物濃度的方法，其 中許多靶標測定研究使用了具有微米或納米尺寸和特異性識別能力(例如用抗體標記來 修飾)的分散的結(jié)合顆粒。已經(jīng)知道這些分散的結(jié)合顆粒通過增加測定表面積以及允許增 加靶標對固體底物或非分散的支持珠的識別動力學，而改進了生物學測定的效率和性能。 此外，將特定理化性能(即靜電、密度、磁性、折射率、光學)添加到微米或納米尺寸的分散 的結(jié)合顆粒上，允許有效分離，并且對于該申請更重要的是，靶標類物質(zhì)的濃度。用于測定 的分散的結(jié)合顆粒的示例性實例可參見美國專利4，628，037。然而，增加結(jié)合動力學、分離便利性和標記濃度的這兩種工作實體的組合(即對 生物識別方案的氣相分析和使用微米或納米尺寸的分散的結(jié)合顆粒)，至今并未具體地顯 示、描述或涉及。因此，需要有這樣的改進方法如何進行通過氣相或汽相分析設(shè)備來分析的測定， 以提高結(jié)合識別效率，提高測定標記轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效率，提高遞送給分析設(shè)備的測定成分的 部分，并減少遞送給分析設(shè)備的測定樣品體積。簡述本文所公開的是用于生物學測定的氣相和/或汽相分析的方法。在一個實施方案 中，為測定樣品中的靶標的方法，所述方法包括進行測定，其中所述測定在第一含水液體中 包括與具有已知靶標選擇性的第一靶標結(jié)合劑結(jié)合的分散的載體顆粒，與轉(zhuǎn)化物部分結(jié)合 的第二靶標結(jié)合劑，和可含有靶標的試驗樣品；其中所述轉(zhuǎn)化物部分與所述靶標選擇性結(jié) 合，所述靶標與所述載體顆粒選擇性結(jié)合，其量取決于所述試驗樣品中所述靶標的濃度；從 所述第一含水液體中濃縮和分離所述載體顆粒；用體積為所述第一含水液體體積的一部分 的第二含水液體替代所述第一含水液體，并將所述載體顆粒分散在其中；將底物施用到所 述第二含水液體中的所述分散的載體顆粒上，并使帶有所述轉(zhuǎn)化物部分的所述底物轉(zhuǎn)化形 成產(chǎn)物；用汽相和/或氣相分析技術(shù)檢測所述底物和/或產(chǎn)物中的變化。在另一個實施方案中，為用汽相和/或氣相分析來分析在液相生物學測定中產(chǎn)生 的可檢測產(chǎn)物的方法，該方法包括將用第一選擇性靶標結(jié)合劑修飾的磁性載體顆粒和用 第二選擇性靶標結(jié)合劑修飾的轉(zhuǎn)化物部分分散到測定溶液中，其中所述磁性載體顆粒的平 均粒度為5納米至100微米，其中所述轉(zhuǎn)化物部分是酶，并且其中所述測定溶液包含有待檢 測靶標的樣品；產(chǎn)生由至少一種磁性顆粒、至少一種靶標和通過所述第二選擇性靶標結(jié)合 劑連接的至少一種酶組成的復合物，如果所述靶標存在；施加磁場并從未復合的酶和測定 溶液中濃縮復合的和未復合的磁性載體顆粒；將所述濃縮的磁性載體顆粒再次分散在第二 溶液中，所述第二溶液的體積是所述第一含水液體體積的一部分，其中所述第二溶液含有 用于與復合的酶反應(yīng)產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的底物；通過將所述反應(yīng)溶液的等分試樣插入到氣相和/或汽相分析儀中來檢測所述可檢測的產(chǎn)物，其中所述反應(yīng)溶液含有可檢測的產(chǎn)物、未 反應(yīng)底物、復合的磁性載體顆粒和未復合的磁性載體顆粒，并且其中所述底物本身通過氣 相和/或汽相分析儀 是不可檢測的。在再一個實施方案中，為用汽相和/或氣相分析來分析在液相生物學測定中產(chǎn)生 的可檢測產(chǎn)物的方法，該方法包括將用第一選擇性靶標結(jié)合劑修飾的磁性載體顆粒和用 第二選擇性靶標結(jié)合劑修飾的轉(zhuǎn)化物部分分散到測定溶液中，其中所述磁性載體顆粒的平 均粒度為5納米至100微米，所述轉(zhuǎn)化物部分是酶，其中所述測定溶液包含有待檢測所述靶 標的樣品；產(chǎn)生由至少一種磁性顆粒、至少一種靶標和通過所述相應(yīng)的靶標結(jié)合劑連接的 至少一種酶組成的復合物，如果所述靶標存在；施加磁場并從未復合的酶和測定溶液中濃 縮復合的和未復合的磁性載體顆粒；將所述濃縮的磁性載體顆粒再次分散在反應(yīng)溶液中， 其中所述溶液含有用于與所述復合的酶反應(yīng)產(chǎn)生不可檢測產(chǎn)物的可檢測底物；和通過將所 述反應(yīng)溶液的等分試樣插入到氣相和/或汽相分析儀中來檢測所述可檢測的底物，其中所 述反應(yīng)溶液含有產(chǎn)物、未反應(yīng)底物、復合的磁性載體顆粒和未復合的磁性載體顆粒，其中所 述產(chǎn)物本身通過氣相和/或汽相分析儀是不可檢測的。根據(jù)以下發(fā)明詳述以及附圖，將會更加充分地理解本發(fā)明實施方案的這些和其它 的特征和優(yōu)勢。要注意的是，權(quán)利要求的范圍是由其中的描述所限定，而不是由本發(fā)明說明 書所述特征和優(yōu)勢的具體討論而限定。附圖簡述

圖1圖示說明了一個實施方案，其中選擇性靶標結(jié)合劑(例如抗體)修飾的分散 的載體顆粒、與靶標結(jié)合劑(例如抗體)連接的酶和含有靶標的樣品在相互作用后，產(chǎn)生復 合的載體顆粒，其在濃縮和洗滌之后，從不可檢測底物中產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。圖2圖示說明了一個實施方案，其中選擇性靶標結(jié)合劑(例如抗體)修飾的分散 的載體顆粒、與靶標結(jié)合劑(例如抗體)連接的酶和不含靶標的樣品在相互作用后，不產(chǎn)生 復合的載體顆粒，其在濃縮和洗滌之后，不從不可檢測底物中產(chǎn)生任何可檢測的產(chǎn)物。圖3圖示說明IMS對含有鄰硝基苯酚_ β -D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的樣品以及各 種陰性對照和陽性對照的響應(yīng)。圖4圖示說明IMS對含有磷酸對硝基苯酚(PPNP)的樣品以及各種陰性對照和陽 性對照的響應(yīng)。技術(shù)人員將會理解，附圖中的要素是為了簡便和清楚的目的進行闡明，并且沒有 必要擴大規(guī)模。本發(fā)明實施方案的詳述當它涉及用汽相和/或氣相分析對液相生物學測定中產(chǎn)生的小分子進行分析時， 本文所公開的是用于提高效率的方法。作為實例，將具體提及通過非競爭性ELISA所產(chǎn) 生的小分子，其使用離子淌度光譜法(IMS)(在本文也稱為離子阱淌度光譜法(ion trap mobility spectrometry, ITMS))進行分析。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，所述方法可 用于任何液相測定，所述測定使用具有已知靶標選擇性的識別部分，并且所述測定以競爭 性或非競爭性形式來操作，其中測定結(jié)果導致存在的可檢測分子的數(shù)量的變化，或者通過 可檢測分子的產(chǎn)生或者消耗，其取決于靶標的存在或濃度。同樣，由液相測定調(diào)整的小分子 可用其它類型的汽相或氣相分析來分析，包括但不限于光譜法、質(zhì)譜法、微分遷移率光譜法(differential mobility spectrometry)、氣相色譜以及結(jié)合選擇性分析化合物和質(zhì)量、 電學、光學和/或熱傳導等的其它分析方法。

所述方法通常包括靶標物質(zhì)與靶標結(jié)合劑修飾的轉(zhuǎn)化物部分以及靶標結(jié)合劑修 飾的載體顆粒這兩者結(jié)合，其中所述載體顆粒是微米或納米尺寸的顆粒，其功能是在生物 學測定中作為捕獲相。載體顆粒配置成具有允許標記轉(zhuǎn)化物類物質(zhì)濃縮的物理和/或化學 性能。這形成載體顆粒復合物，如圖1的具體實施方案所示。重要的是，如果靶標不存在， 載體顆粒復合物就不會形成并且可檢測的化合物的數(shù)量就沒有變化，如圖2的具體實施方 案所示?？捎煤线m的封閉劑例如酪蛋白先將非特異性結(jié)合位點封閉起來。在非競爭性測定 形式中，測定標記了具有轉(zhuǎn)化物類物質(zhì)的載體顆粒捕獲的靶標，所述轉(zhuǎn)化物類物質(zhì)將分子 轉(zhuǎn)化為氣相分析可檢測的形式或不可檢測的形式。在競爭性測定形式中，測定從支持物上 置換了轉(zhuǎn)化物類物質(zhì)標記或者轉(zhuǎn)化物類物質(zhì)必須與靶標競爭性結(jié)合支持物，其中結(jié)合的轉(zhuǎn) 化物類物質(zhì)將分子轉(zhuǎn)化為氣相分析可檢測形式或不可檢測形式。此外，使用載體顆粒作為 底物，為待發(fā)生的反應(yīng)提供了增加的表面積；增加了靶標結(jié)合動力學；增加了洗滌步驟的 便利性；允許將增加的表面積濃縮成更小的反應(yīng)體積，用于轉(zhuǎn)化不可檢測或可檢測的分子； 并且，允許增加有待引入氣相分析儀的測定成分與交互緩沖液基質(zhì)(conversation buffer matrix)的比率。因為更小的反應(yīng)體積，前體小分子轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物小分子的轉(zhuǎn)化將會以較快 速率發(fā)生，因為在文獻中已經(jīng)顯示酶催化在顆粒上比在固體底物上更快。此外，不僅是小分 子產(chǎn)生得更快，而且濃度將更快地增加，因為反應(yīng)發(fā)生在較小體積中，導致小分子達到臨界 濃度更快，此時小分子可在溶液上開始建立分壓。減少的反應(yīng)體積也允許整個溶液更快蒸 發(fā)并允許可檢測小分子從液相中更快地釋放到汽相中。另外，減少的反應(yīng)體積能提高測定 成分與支持緩沖液之間的比率，這等于更少反應(yīng)體積成分進入汽相，因此減少了背景信號/ 噪聲。在液相測定方法中使用所述分散的載體顆粒，將會通過改進檢測限和靈敏度(通 過增加的表面積和更容易將產(chǎn)物釋放到汽相和/或氣相中，以進行上述檢測)而影響最終 用戶，將會減少洗滌步驟的數(shù)目以及減少測定步驟的總數(shù)目；并且它將會減少進行測定的 時間。與現(xiàn)有技術(shù)的支持物相反，測定的生物識別動力學在所述分散的載體顆粒上更快，小 分子轉(zhuǎn)化動力學更快，而且可檢測的小分子將會以更大的數(shù)量、更快地釋放到汽相和/或 氣相中。在測定期間，將載體顆粒分散到測定溶液中。選擇載體顆粒，使得顆?？梢酝ㄟ^光 作用力(optical force)、電力、磁力、重力或壓力而從測定溶液中快速分離。在一個實施方 案中，載體顆粒是磁性的，其可通過施加磁場而從測定溶液中容易地分離和/或濃縮。在非競爭性測定形式中，測定樣品的制備通常包括將目標靶標例如抗原與靶標結(jié) 合劑修飾的分散的載體顆粒和具有共價連接的轉(zhuǎn)化物部分的靶標結(jié)合劑在合適液體通常 是水基液體中混合，形成復合的載體顆粒，如圖1的一個實施方案所示。或者，在競爭性測 定形式中，測定樣品的制備類似于非競爭性測定，除了靶標結(jié)合劑修飾的轉(zhuǎn)化物部分或者 被靶標從復合物中置換或者與靶標競爭性結(jié)合至載體顆粒之外。因此，載體顆粒上存在的 轉(zhuǎn)化物部分的數(shù)量與存在的靶標的數(shù)量呈負相關(guān)性。在這兩種測定形式中，再將復合的和 未復合的載體顆粒從上清液中分離出來。例如，如圖1所示，對于磁性顆粒，將顆粒在磁性 顆粒濃縮器中放置一段時間，讓磁性顆粒有效地沿側(cè)壁收集，這通常需要大約幾分鐘至約30分鐘，然后停止?jié)饪s器內(nèi)的磁場并除去上清液。在該方式中，相對于現(xiàn)有技術(shù)方法而言， 分離時間基本上是減少了。載體顆粒，一旦分離，就在合適的水性緩沖液中洗滌一次或多 次。然后，將濃縮的顆粒分散到酶的底物中，以產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物，如果靶標存在，因此允許 形成復合的載體顆粒。如果靶標不存在，復合的載體顆粒不形成，并且第二 溶液中不存在 酶，因而沒有可檢測的產(chǎn)物產(chǎn)生，如圖2所示。在所有情況下，將包含復合的顆粒、未復合的 顆粒、未反應(yīng)的底物和可檢測的產(chǎn)物的樣品等分試樣然后引入汽相光譜儀例如IMS中。在 IMS的情況下，首先收集相應(yīng)的可檢測產(chǎn)物的漂移時間。將樣品加熱并定量測定可檢測的產(chǎn) 物。應(yīng)當注意，在以上給出的實例中，第二抗體是不需要的，如果在載體顆粒上孵育的捕獲 抗體與酶綴合。然而，使用第二抗體綴合物可避免損失所產(chǎn)生的酶聯(lián)抗體，所述抗體用于可 能希望檢測的各抗原。載體顆粒并不打算限制在任何具體類型，雖然不同類型可提供不同益處。載體顆 粒可以是磁性的并通過施加磁場，在處理期間從測定中分離出來；可以是帶電荷的并通過 施加電場而從測定中分離出來；相對于測定溶液具有獨特的折射率，使得光子可用于提供 用于分離的光作用力，例如光阱、光鑷(optical tweezer)等；或者可以具有相對高的密 度，使得重力或離心力可用于濃縮顆粒。分離過程將會允許濃縮測定的轉(zhuǎn)化物部分并改進 轉(zhuǎn)化處理方面并改進氣相分析設(shè)備的界面方面。在利用載體顆粒密度的應(yīng)用中，密度范圍 為約 0. lmg/mL 至約 lmg/mL。載體顆?？梢猿嗜魏魏线m形式，對顆粒的大小和/或形狀并無任何限制。在一個 實施方案中，顆?；旧鲜乔蛐蔚摹＠?，可以使用直徑介于約5納米至100微米之間的球 形顆粒。在其它實施方案中，可以使用平均直徑介于約50納米至5微米之間的球形顆粒。 粒度分布形態(tài)可以是單峰、雙峰或多峰。顆粒大小可影響許多參數(shù)。例如，如果使用較小的 顆粒，最大可達到的陣列密度(array density)相應(yīng)更大。然而，具有較大直徑的顆粒的較 大表面積允許每個顆粒上連接更多靶標，對于每個顆粒來說，導致更低的檢測限和更高的 分析靈敏度和潛在更高的信號強度。在一個實施方案中，顆粒可包括任何合適的磁性材料，例如鐵(Fe)、鈷(Co)或 鎳-鐵合金。本文所用的術(shù)語磁性材料包括順磁性材料。顆?？砂ǚ谴判圆牧希缇?苯乙烯，其中包埋了磁性亞顆粒(例如Fe3O4顆粒)。這樣的顆?？衫绶稚⒃谡麄€非磁性 材料中或者可形成非磁性材料的核心或其表面下的殼。對于生物學應(yīng)用，優(yōu)選至少顆粒表 面是由生物相容性材料制成?？捎糜谕扛苍诜巧锵嗳菪圆牧侠玷F的表面的非磁性生物 相容性材料包括聚合物材料例如聚苯乙烯、膠乳和本領(lǐng)域眾所周知的許多其它材料。在某些實施方案中，使用順磁性顆粒。順磁性材料僅當存在外部磁場時才會磁 化，因此順磁性顆粒表現(xiàn)出最小的簇集。生物相容性順磁性顆?？傻米远嗉抑圃焐?例如 Dynal,Bangs Labs，Spherotech)。這些顆粒廣泛用于各種生物學用途，并且已充分建立起 用于偶聯(lián)生物學分子例如核酸和蛋白質(zhì)的方案。另外，可得到預(yù)先綴合各種結(jié)合配體的順 磁性顆粒。超順磁性顆粒在商業(yè)應(yīng)用上已有超過15年的已證明的記錄。這類顆粒是通過在 聚合時將鐵氧體晶體分布在整個聚苯乙烯顆粒中而制得。所述晶體是鐵磁體，但因其具有 納米尺寸，所以它們的表現(xiàn)不是鐵磁性的，而是順磁性的(該現(xiàn)象被稱為超順磁性)。據(jù)信 定向晶體如此小，以至于它們在室溫下因熱效應(yīng)而隨機排列。這樣的顆粒排列基本上沒有剩磁；在施加的磁場中它基本上線形磁化，而當去掉外場時，磁性基本上完全消失。該特征導致最小聚集。當與酶一起使用時，為了效力可將所述顆粒包封(例如以避免接觸含鐵的 分子)并且表面可容易的修飾，以共價連接生物分子例如核酸或蛋白質(zhì)或有機小分子。顆?？砂蓹z測材料(例如染料、著色劑、雜交標記)，或具有特定折射率，使所 述顆粒可在陣列上得以檢測并可在其它顆粒以及測定溶液中得以鑒別。可檢測材料可摻入 到顆粒中，可存在于表面上，和/或可與顆粒連接。具體的可檢測材料或其組合可對應(yīng)于與 顆粒連接的具體的探針，使得可檢測材料的鑒定也可鑒定該探針。在某些實施方案中，具 體的可檢測材料可對應(yīng)于具體靶標，使得可檢測材料的鑒定也可鑒定與探針相互作用的靶 標。市售顆粒(磁性和非磁性的)的范圍巨大?？傻玫接稍S多不同材料和尺寸制備的 顆粒。摻入各種分子例如熒光染料的顆粒、與各種部分綴合的顆粒或具有表面修飾而便于 所述綴合的顆粒都可得到。用于液相測定的合適的靶標包括活(living)靶標和非活(non-living)靶標。靶 標的實例包括但不限于原核細胞、真核細胞、細菌、病毒、蛋白質(zhì)、多肽、毒素、脂質(zhì)體、顆粒、 配體、氨基酸、核酸、激素、藥物、有毒工業(yè)化學品、有毒工業(yè)材料和其它小分子，它們或者是 單獨的或者為其任何組合。靶標包括上述活靶標或非活靶標的提取物。原核細胞的實例包括但不限于細菌，也包括其提取物。真核細胞的實例包括但不 限于酵母細胞、動物細胞和組織。毒素的實例包括但不限于炭疽。顆粒的實例包括但不限 于膠乳、聚苯乙烯、二氧化硅和塑料。術(shù)語“肽”是指任何長度的低聚物或聚合物，其中組成單體為通過酰胺鍵連接的α 氨基酸，并包括氨基酸二聚體以及多肽、肽片段、肽類似物、天然存在的蛋白質(zhì)、突變蛋白、 變體蛋白或化學修飾蛋白、融合蛋白等。肽分子的氨基酸可以是20種常規(guī)氨基酸中的任何 氨基酸、常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、常規(guī)氨基酸的結(jié)構(gòu)變體(例如異纈氨 酸)或非天然存在的氨基酸，例如α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、β-丙氨酸、萘 基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羥基脯氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲?；?硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸和正亮氨酸。另外，術(shù)語“肽”包括具有翻譯后修飾 的肽，所述修飾例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”包括任何長度的核苷酸聚合形式，或者是核糖核苷酸 或者是脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括三鏈、雙鏈和單鏈 的DNA，以及三鏈、雙鏈和單鏈的RNA。該術(shù)語也包括寡核苷酸的修飾形式(例如通過甲基 化和/或通過加帽子)和寡核苷酸的非修飾形式。更具體地講，該術(shù)語包括聚脫氧核糖核 苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它類型的多核苷酸(其 是嘌呤堿基或嘧啶堿基的N-糖苷或C-糖苷)、以及含有非核苷酸主鏈的其它聚合物例如 聚酰胺(例如肽核酸(PNA))和聚嗎啉(作為Neugene商業(yè)上可得自Anti-Virals，Inc.， Corvallis, Oregon)聚合物和其它合成的序列特異性核酸聚合物，條件是所述聚合物含有 核堿基(nucleobase)，其構(gòu)型允許堿基配對和堿基堆積，例如在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的那樣。 術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”彼此在長度上沒有區(qū)別，這些術(shù)語僅 指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語包括例如3'-脫氧-2' ,5' -DNA、寡脫氧核糖核苷 酸N3' P5'氨基磷酸酯、2' -0-烷基-取代的RNA、雙鏈和單鏈DNA、以及雙鏈和單鏈RNA、DNAiRNA雜合體，和PNA與DNA或RNA之間的雜合體，并且還包括已知類型的修飾，例如本領(lǐng) 域已知的標記、甲基化、“帽子”、用類似物對一個或多個天然存在的核苷酸的取代、核苷酸 內(nèi)修飾，例如具有不帶電荷鍵的那些(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯 等)、具有帶負電荷鍵的那些(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和具有帶正電荷鍵的那 些(例如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)、含有側(cè)鏈部分的那些，例如蛋白質(zhì)(包 括核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、具有嵌入劑的那些(例如吖啶、補骨脂素 等)、含有鰲合劑的那些(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含有烷化劑的那些、 具有修飾鍵的那些( 例如α-端頭異構(gòu)核酸等)、以及無修飾形式的多核苷酸或寡核苷酸。 該術(shù)語也包括其它類型的核酸，例如但不限于鎖核酸(LNA)。術(shù)語“核苷”和“核苷酸”也包括已經(jīng)被修飾的那些部分，這些部分不僅含有已知 嘌呤堿基和嘧啶堿基，而且還含有其它雜環(huán)堿基。這類修飾包括甲基化嘌呤或甲基化嘧啶、 ?；堰驶蝓；奏せ蚱渌s環(huán)。修飾的核苷或核苷酸也可包括在糖部分上的修飾，例如 其中一個或多個羥基被鹵素、脂族基團取代，或者經(jīng)官能化成為醚、胺等。術(shù)語“核苷酸單元 (nucleotidic unit) ”將包括核苷和核苷酸。此外，對核苷酸單元的修飾包括重排、添加、取代或嘌呤堿基或嘧啶堿基上官能團 的其它改變，所述堿基與相應(yīng)互補嘧啶或嘌呤形成氫鍵。所得到的修飾核苷酸單元任選可 與其它這類修飾的核苷酸單元形成堿基對，但不與A、T、C、G或U形成堿基對?？蓳饺氩粫?阻礙多核苷酸功能的堿基位點(Basic site)。任選可通過一種或多種方式，對多核苷酸中 的某些或全部殘基進行修飾。本文所用的術(shù)語“抗體”包括得自多克隆和單克隆制備的抗體、以及雜合(嵌合) 抗體分子；F (ab' )2和F(ab)片段；Fv分子(非共價雜二聚體)；單鏈Fv分子(sFv) ；二聚 體和三聚體的抗體片段構(gòu)建物；人源化抗體分子；和得自所述分子的任何功能性片段，其 中所述片段保留母體抗體分子的特異性結(jié)合特性。靶標與顆粒的結(jié)合受到顆粒表面化學的控制。顆粒的表面化學可用于通過非特異 性相互作用而結(jié)合靶標物質(zhì)，所述相互作用例如靜電相互作用、范德華相互作用(van der Waals interaction)、偶極-偶極相互作用和/或氫鍵相互作用?；蛘?，載體顆?？山?jīng)化學 修飾，以包含與靶標物質(zhì)選擇性相互作用的特異性結(jié)合物質(zhì)?？墒褂玫慕Y(jié)合物質(zhì)的代表性 實例包括但不限于抗原、抗體、適配體、多肽、肽、核酸、蛋白質(zhì)受體、配體、寡核苷酸、鏈霉抗 生物素、抗生物素蛋白、生物素、凝集素等。靶標-結(jié)合部分可直接或間接地與靶標連接。連接的實例包括但不限于靜電連 接、化學連接和物理連接。靶標_結(jié)合部分的實例包括但不限于單獨的或者為其任何組合 的抗體、適配體、多肽、肽、核酸、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、以及抗生物素蛋白和鏈霉抗 生物素的衍生物。靶標-結(jié)合部分的其它非限制性實例包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、多肽、糖蛋白、選 擇配體、脂蛋白、磷脂、寡核苷酸等，例如酶、免疫調(diào)節(jié)劑、受體蛋白、抗體和抗體片段，其優(yōu) 先結(jié)合標記物質(zhì)，所述標記物質(zhì)是由靶標位點產(chǎn)生或與靶標位點相關(guān)。已知蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合標記物質(zhì)，所述標記物質(zhì)是由損傷產(chǎn)生或與損傷相關(guān)。例如， 抗體可用于針對癌癥相關(guān)物質(zhì)，以及針對表現(xiàn)出增加的或獨特的抗原性標記的任何病理性 損傷，例如針對心血管損傷相關(guān)物質(zhì)，例如血管凝塊，包括血栓和栓塞、心肌梗塞和其它器官梗塞，和動脈粥樣硬化斑塊；炎性損傷；和感染性因子(agent)和寄生性因子。

癌癥狀態(tài)包括癌癥、黑素瘤、肉瘤、成神經(jīng)細胞瘤、白血病、淋巴瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨 髓瘤和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。感染性疾病包括由侵入體內(nèi)的微生物或寄生蟲引起的那些?？捎米靼袠私Y(jié)合部分的蛋白質(zhì)物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、肽、多肽、糖蛋白、脂蛋白等；例 如，激素、淋巴因子、生長因子、白蛋白、細胞因子、酶、免疫調(diào)節(jié)劑、受體蛋白、抗體和抗體片 段。特別有興趣的蛋白質(zhì)物質(zhì)是抗體和抗體片段。術(shù)語“抗體”和“抗體片段”一般是指與 抗原特異性結(jié)合而形成免疫復合物的免疫球蛋白或其片段?？贵w可以是任何類型的全免疫球蛋白；例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、具有抗原或 表位的雙特異性或多特異性的嵌合或雜合抗體。它可以是多克隆抗體，尤其是人源化抗體 或來自人的親和純化抗體。它可以是來自合適動物的抗體；例如來自靈長類動物、山羊、兔、 小鼠等。如果抗原決定區(qū)(paratope region)得自非人類物種，靶標可以經(jīng)人源化，以降低 非人類抗體的免疫原性，用于人類診斷或治療用途。這樣的人源化抗體或其片段稱為“嵌合 的”。例如，嵌合抗體包括非人類(例如鼠)可變區(qū)和人類恒定區(qū)。嵌合抗體片段在人可變 區(qū)構(gòu)架區(qū)內(nèi)可包括可變的結(jié)合序列或源自非人類抗體的互補決定區(qū)(“CDR”)。單克隆抗 體也是合適的，因為它具有高特異性。有用的抗體片段包括F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、 Fv等，包括雜合片段。特定的片段是Fab'、F(ab' ) 2、Fab和F (ab) 2。也可使用保留免疫 球蛋白超變的抗原結(jié)合區(qū)并具有類似于或小于Fab'片段的大小的任何亞片段?？贵w片段 可包括基因工程蛋白和/或重組蛋白，無論是單鏈或多鏈，其與抗原_結(jié)合位點結(jié)合并且以 與天然免疫球蛋白片段基本相同的方式在體內(nèi)起到固定化靶標結(jié)合部分的作用。也可通過 基因工程來產(chǎn)生片段。選擇性配體的實例包括卟啉、乙二胺四乙酸(EDTA)和鋅指。選擇性配體是指對一 種或多種特定靶標具有選擇性的配體?？梢允褂每贵w和免疫球蛋白類的混合物，如可使用雜合抗體。有時需要多特異性 (包括雙特異性)和雜合的抗體和抗體片段用于檢測和治療損傷，并且包括至少兩種明顯 不同的單特異性抗體或抗體片段，其中至少兩種抗體或抗體片段特異性結(jié)合至至少兩種不 同抗原(其是由靶向損傷產(chǎn)生或與靶向損傷相關(guān))或者標記物質(zhì)的至少兩種不同表位或分 子(其由靶向損傷產(chǎn)生或與靶向損傷相關(guān))?？梢灾苽漕愃朴诳鼓[瘤標記雜合體的多特異 性抗體和雙特異性抗體片段。針對引起人類大部分感染的微生物(細菌、病毒、原生動物、其它寄生蟲)的合適 MAb可用于體外診斷目的。這些抗體和更新的MAb也適合使用?？捎糜跈z測和/或治療心血管損傷的蛋白質(zhì)包括血纖蛋白特異性蛋白；例如血纖 蛋白原、可溶性血纖蛋白、抗血纖蛋白抗體和片段、片段E1 (是通過交聯(lián)血纖蛋白的受控纖 溶酶消化而制得的一種人類血纖蛋白的60kDa片段)、纖溶酶(血液中負責溶解新鮮血栓的 一種酶)、纖溶酶原激活物(例如尿激酶、鏈激酶和組織纖溶酶原激活物)、肝素和纖連蛋白 (一種450kDa的粘性血漿糖蛋白)和血小板指導的蛋白質(zhì)；例如，血小板、抗血小板抗體和 抗體片段、抗活化血小板抗體和抗活化血小板因子。在一個實施方案中，靶標_結(jié)合部分包括識別血纖蛋白單體β "鏈氨基端的七肽 并與之結(jié)合的MAb或其片段。當凝血酶從血纖蛋白原切割兩對小肽時，產(chǎn)生血纖蛋白單體。 血纖蛋白單體自發(fā)聚集成不溶性凝膠，其進一步穩(wěn)定形成血凝塊。
可用于產(chǎn)生針對它們的特異性抗體的各種抗原或生物標記(并且從中可制備抗 體片段)的公開內(nèi)容僅僅是作為實例，不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明。以競爭性或非競爭性形式，用所述分散的載體顆?？蛇M行測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的是，非競爭性測定將會導致轉(zhuǎn)化反應(yīng)中存在更多轉(zhuǎn)化物部分，而競爭性測定將 會導致轉(zhuǎn)化反應(yīng)中存在更少轉(zhuǎn)化部分。競爭性或非競爭性測定的結(jié)果是，對于任何給定轉(zhuǎn) 化物部分，因靶標類物質(zhì)的濃度增加，可檢測分子的數(shù)量的變化將會是相反的并可因此進 行監(jiān)測。轉(zhuǎn)化物部分通過但不限于靜電方式、化學方式和/或物理方式而與靶標結(jié)合部分 直接連接。轉(zhuǎn)化物部分負責或者產(chǎn)生或者抑制氣相分析的可檢測分子。這些分子的非限制 性實例包括允許氧化還原轉(zhuǎn)化、電子轉(zhuǎn)化或酶促轉(zhuǎn)化的無機、有機或生物的催化劑。轉(zhuǎn)化物部分起到放大器的作用；即使僅有少量與結(jié)合部分連接的轉(zhuǎn)化物部分保持 結(jié)合，轉(zhuǎn)化物部分將會轉(zhuǎn)化許多信號分子。本公開并不限于任何具體的轉(zhuǎn)化物部分，并且將 會一般取決于可檢測的/不可檢測的分子；其選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。轉(zhuǎn)化物部分可起到如下作用或者從不可檢測形式的不可檢測類物質(zhì)產(chǎn)生可檢測 類物質(zhì)(例如用半乳糖苷酶水解來自可檢測類物質(zhì)的糖基)，或者從可檢測形式產(chǎn)生不可 檢測的形式(例如用過氧化物酶產(chǎn)生這樣的基團所述基團聚合或結(jié)合兩分子的可檢測形 式)。在這些情況的每一種下，氣相分析設(shè)備將監(jiān)測可檢測類物質(zhì)的產(chǎn)生或減少，并且涉及 存在 的轉(zhuǎn)化物部分的存在(定性)或數(shù)量(定量)。也可以理解，也包括這樣的反應(yīng)流程 所述反應(yīng)流程在轉(zhuǎn)化物部分的作用下開始，最終影響可檢測類物質(zhì)的形式?！暗孜铩笔侵赣赊D(zhuǎn)化物部分轉(zhuǎn)化為“產(chǎn)物”的分子的起始形式或者在轉(zhuǎn)化物部分作 用之后的分子的最終形式。底物和產(chǎn)物必須能夠通過氣相分析儀來區(qū)分。在優(yōu)選的實施方 案中，或者底物或者產(chǎn)物將不能被氣相分析儀檢測，而它們中的另一種成分則是可檢測的。氣相離子光譜儀是指檢測氣相離子的任何儀器。氣相離子光譜儀包括提供氣相離 子的離子源。氣相離子光譜儀包括例如質(zhì)譜儀、離子淌度光譜儀和總離子流檢測設(shè)備。在 一個實施方案中，IMS用于檢測并隨后表征測定的可檢測產(chǎn)物。將液相中的載體顆粒和底 物放入IMS內(nèi)，并加熱至約25°C至約600°C的溫度，取決于可檢測的分子，例如通過酶-底 物反應(yīng)(其中底物本身是不可檢測的)而產(chǎn)生的產(chǎn)物。以下實施例舉例說明了本公開的特征，而不應(yīng)視為對本公開的限制。在實施例中， 以爆發(fā)性模式設(shè)定運行軟件版本8. 12的Itemiser3 ITMS儀器(GE Security, Bradenton, FL)或運行軟件版本 3. 19 的 VaporTracer2 ITMS 儀器(GE Security, Bradenton, FL)，默認 采樣時間7秒鐘，解吸器溫度220°C，檢測器溫度205°C。所有實驗運行之前，按照出售者說 明書，以雙重模式，使用校準器(calibration trap，部件#M0001319)來校準單元。用適當 位置的半透膜(部件#PA005007)并用系統(tǒng)內(nèi)存在的爆發(fā)性摻雜劑(二氯甲烷(methlyene chloride)，部件#MP005810)來運行系統(tǒng)。
實施例在實施例中，使用以下化學品和試劑。磷酸二氫鈉、2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、 甘氨酸、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris)、吐溫-20、牛血清白蛋白(BSA)、Triton X-100、鄰硝基苯酚-β -D-半乳吡喃糖苷(ONPG)、磷酸對硝基苯酚(PNPP)、鄰硝基苯酚(ONP)、對硝基苯酚(PNP)得自Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)并且按收到時的原樣 使用。氯化鈉、氫氧化鈉和鹽酸(濃)得自Fisher Scientific Inc. (Pittsburgh, PA)并 且按收到時的原樣使用。用18MΩMilli-Q/JC (Millipore，Billerica, ΜΑ)制備以下緩沖 液并用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)至合適的pH;10mM磷酸鹽、137mM NaCl,0. 1% (w/w)Triton Χ-100、0· 1% (w/w)疊氮化鈉(ρΗ7·4) ；20mM Tris、500mM NaClU % BSA.O. 吐溫 _20(pH 7.6) ； IOOmM 甘 氨酸、125mM NaClUmM MgClUmM ZnCl2 (pH 10. 0) ；25mM MES (pH 6.0)。購 買Dynabeads抗大腸桿菌0157，并按出售者方案，在磷酸緩沖液中洗滌，用于ONPG測定， 或在Tris緩沖液中洗滌，用于PNPP測定，并且稀釋至 IXlO8顆粒/mL(Invitrogen, Carlsbad, CA)。親和純化的山羊抗大腸桿菌0157:H7、磷酸酶標記的親和純化的山羊抗大 腸桿菌0157:H7(0. lmg/ml)和大腸桿菌0157:H7陽性對照，得自KPL(Gaithersburg，MD)并 在50%水50%甘油中再水化并貯存于4°C直到需要時。購買β-半乳糖苷酶綴合的鏈 霉抗生物素(Rockland，Gilbertsville，PA)，并且按收到時的原樣使用。按照出售者方案， 將 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-生物素(Thermo-Pierce，Rockford, IL)用于 25mM MES，使 山羊抗大腸桿菌抗體生物素化。用Microcon YM-50旋轉(zhuǎn)濾器(Millipore)，用磷酸緩沖液， 完成純化步驟。將摩爾比4 1的生物素化抗體鏈霉抗生物素修飾的酶混合，并讓其在 4V反應(yīng)4小時，得到溶于磷酸緩沖液的抗體終濃度 0. lmg/mL。配制lmg/mL濃度的下列底物溶液和產(chǎn)物溶液溶于磷酸緩沖液的ONPG ；溶于磷酸 緩沖液的ONP ；溶于甘氨酸緩沖液的PNPP ；溶于甘氨酸緩沖液的PNP。ONPG測定將以下成分在600 μ L聚丙烯微量離心管(Fisher Scientific)中混 合150 μ L磷酸緩沖液、IOyL山羊抗大腸桿菌磁性顆粒/磷酸緩沖液、IOyL IXlO9細胞 /mL大腸桿菌陽性對照、10 μ L 0. lmg/mL山羊抗-大腸桿菌-生物素-鏈霉抗生物素-半 乳糖苷酶/磷酸緩沖液。對這些成分進行短時間的渦旋振蕩并在室溫下，在旋轉(zhuǎn)臺上振搖 30分鐘。在此時間點，將微量離心管放入磁性顆粒濃縮器架(Dynal)中1分鐘，使磁性顆 粒沿側(cè)壁收集。除去上清液，并更換為300 μ L磷酸緩沖液，通過輕微渦旋振蕩使顆粒重懸 于其中。將該步驟再重復2次，最后將顆粒分散在100 μ L lmg/mL ONPG底物/磷酸緩沖液 中，并在37°C加熱30分鐘。PNPP測定將以下成分在600 μ L聚丙烯微量離心管(Fisher Scientific)中混 合150 μ L Tris緩沖液、10 μ L山羊抗大腸桿菌磁性顆粒/Tris緩沖液、10 μ L IX IO9細 胞/mL大腸桿菌陽性對照、10 μ L 0. lmg/mL山羊抗-大腸桿菌-磷酸酶/Tris緩沖液。對 這些成分進行短時間的渦旋振蕩，并在室溫下，在旋轉(zhuǎn)臺上振搖30分鐘。在此時間點，將微 量離心管放入顆粒濃縮器架中1分鐘，使所有磁性顆粒沿側(cè)壁收集。除去上清液并更換為 300 μ L Tris緩沖液，通過輕微渦旋振蕩使顆粒重懸于其中。將該步驟再重復2次，最后將 顆粒分散在100 μ L lmg/mL PNPP底物/甘氨酸緩沖液中，并在37°C加熱30分鐘。具體地講，將IOyL樣品溶液用移液管移至織造“金”樣品捕獲器(部件 #M0001249,GE Security，Bradenton，F(xiàn)L)上，并立即插入到儀器的“微粒”采樣口。然后觸 發(fā)系統(tǒng)以獲取樣品。通過儀器啟動后，取出樣品捕獲器并丟棄。所收集的數(shù)據(jù)組由70條光 譜或等離子體色譜組成，它們被100ms的間隔分隔開，將它們?nèi)勘４娌⒃趩为毜挠嬎銠C 上進行分析。在檢查半乳糖苷酶或磷酸酶測定樣品之前，以檢查測定樣品的類似方法，檢查lmg/mL ONP/磷酸緩沖液和lmg/mL PNP/甘氨酸緩沖液，以測定產(chǎn)物分子各自的漂移時間。 另外，對lmg/mL ONPG/磷酸緩沖液和lmg/mL PNPP/甘氨酸緩沖液采樣，以確保這些底物分 子不能被IMS單元檢測。通過IMS單元分析測定溶液之后，檢查所收集的數(shù)據(jù)并收集產(chǎn)物分子相關(guān)光譜的 峰高。對于測定相關(guān)的各種樣品，產(chǎn)物漂移時間相關(guān)的峰高見圖3和圖4所示，顯示了在測 定中，用IMS分析使用磁性顆粒的能力。圖3和圖4也顯示了幾種陰性對照和陽性對照。有利的是，使用本文所述分散的載體顆粒允許增加存在的表面積的數(shù)量，以產(chǎn)生 產(chǎn)物；它允許表面積濃縮成小的反應(yīng)體積，這使得通過分壓的正常發(fā)展或通過增加揮發(fā)的
容易性，小分子更容易釋放到汽相和/或氣相中。此外，它也減少了測定過程中的總步驟數(shù)目?？梢岳斫?，當一個要素稱作在另一要素“上”，它可以是直接在另一要素上，或者兩 者之間可存在中間要素。相反，當一個要素稱為“分散在”或“形成在”另一要素上，應(yīng)當理 解為所述要素至少部分彼此接觸，除非另有說明。本文所用的術(shù)語僅僅是為了描述具體實施方案的目的，不應(yīng)視為對本發(fā)明的限 制。本文使用的單數(shù)形式“一”和“該”也將包括復數(shù)形式，除非上下文另有明確指示。使用 術(shù)語“第一”、“第二”等并不意味著任何特定次序，而是為了區(qū)別單個要素而包括在內(nèi)。還 應(yīng)理解，本說明書所用的術(shù)語“包含”和/或“包括”或“含有”表明所述特征、區(qū)域、整數(shù)、步 驟、操作、要素和/或成分的存在，但不排除一種或多種其它特征、區(qū)域、整數(shù)、步驟、操作、 要素、成分和/或其組合的存在或添加。除非另有定義，否則本文所用的所有術(shù)語(包括技術(shù)和科學術(shù)語)都具有本發(fā)明 實施方案所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。還應(yīng)理解，術(shù)語例如在常用詞典 中定義的那些，應(yīng)當解釋為具有與相關(guān)領(lǐng)域和本公開上下文中的含義一致的含義，而不能 以理想化的或過份形式化的含義來解釋，除非在本文中確有如此定義。盡管，已經(jīng)參考示例性實施方案描述了本發(fā)明的實施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解，在不背離本發(fā)明實施方案的范圍下，可以進行各種改變并且對其要素而言，可替 換等同實施方案。另外，可以進行許多修改，使具體情況或材料適應(yīng)本發(fā)明實施方案的教 授，而不背離其基本范圍。因此，當考慮實施本發(fā)明的最佳方式時，本發(fā)明的實施方案將不 限于公開的具體實施方案，但是本發(fā)明的實施方案將包括落入所附權(quán)利要求范圍之內(nèi)的所 有實施方案。
權(quán)利要求
1.一種用于測定樣品中的靶標的方法，所述方法按順序包括進行測定，其中該測定在第一含水液體中包括與具有已知靶標選擇性的第一靶標結(jié)合 劑結(jié)合的分散的載體顆粒，與轉(zhuǎn)化物部分結(jié)合的第二靶標結(jié)合劑，以及可含有靶標的試驗 樣品；其中所述轉(zhuǎn)化物部分與所述靶標選擇性結(jié)合，所述靶標與載體顆粒選擇性結(jié)合，其用 量取決于試驗樣品中靶標的濃度；從第一含水液體中濃縮和分離所述載體顆粒；用體積為第一含水液體體積的一部分的第二含水液體替代第一含水液體，并將載體顆 粒分散在其中；將底物施用到第二含水液體中的分散的載體顆粒上，并使帶有轉(zhuǎn)化物部分的底物轉(zhuǎn)化 形成產(chǎn)物；和用汽相和/或氣相分析技術(shù)檢測所述底物和/或產(chǎn)物中的變化。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶標增加所述轉(zhuǎn)化物部分與所述載體顆粒的締合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶標減少所述轉(zhuǎn)化物部分與所述載體顆粒的締合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒是磁性顆粒，且所述從第一液體中分離載體 顆粒包括施加磁場。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒是帶電荷顆粒，且所述從第一液體中分離載 體顆粒包括施加電場。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒相對于第一含水液體的折射率允許使用光作 用力從第一液體中濃縮和分離所述載體顆粒。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒的平均粒度為約5納米至約100微米。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述從第一含水液體中分離載體顆粒的時間小于約30分鐘。
9.權(quán)利要求1的方法，其中由所述底物通過轉(zhuǎn)化物部分的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的產(chǎn)物是可檢測 產(chǎn)物，而所述底物是不可檢測的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中用汽相和/或氣相分析技術(shù)對所述底物和/或產(chǎn)物中的變 化進行的所述檢測包括將具有所述載體顆粒和所述可檢測的產(chǎn)物的第二含水液體等分試 樣插入到離子淌度光譜儀中。
11.權(quán)利要求1的方法，其中由所述底物通過轉(zhuǎn)化物部分的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的產(chǎn)物是不可 檢測產(chǎn)物，而所述底物是可檢測的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中用汽相和/或氣相分析技術(shù)對所述底物和/或產(chǎn)物中的 變化進行的所述檢測包括將具有載體顆粒和可檢測的底物的第二含水液體等分試樣插入 到離子淌度光譜儀中。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述汽相和/或氣相分析技術(shù)產(chǎn)生所述樣品中所選擇靶標 的存在或數(shù)量的定量或定性測定輸出。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶標包括抗體或抗原。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二靶標結(jié)合劑包括至少一種選自以下的化 學部分抗原、抗體、適配體、多肽、肽、核酸、蛋白質(zhì)受體、配體、寡核苷酸、鏈霉抗生物素、抗 生物素蛋白、生物素、凝集素等。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二靶標結(jié)合劑相同。
17.一種用汽相和/或氣相分析來分析液相生物學測定中產(chǎn)生的可檢測產(chǎn)物的方法， 所述方法包括將用第一選擇性靶標結(jié)合劑修飾的磁性載體顆粒和用第二選擇性靶標結(jié)合劑修飾的 轉(zhuǎn)化物部分分散到測定溶液中，其中所述磁性載體顆粒的平均粒度為5納米至100微米，其 中所述轉(zhuǎn)化物部分是酶，并且其中所述測定溶液包含有待檢測靶標的樣品；產(chǎn)生復合物，該復合物由至少一種磁性載體顆粒、至少一種靶標和通過所述第二選擇 性靶標結(jié)合劑連接的至少一種酶組成，如果所述靶標存在；施加磁場，從未復合的酶和測定溶液中濃縮復合的和未復合的磁性載體顆粒； 將所述濃縮的磁性載體顆粒再次分散在第二溶液中，其中所述第二溶液含有用于與復 合的酶反應(yīng)產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的底物；和通過將所述反應(yīng)溶液等分試樣插入到氣相和/或汽相分析儀中來檢測可檢測的產(chǎn)物， 其中所述反應(yīng)溶液含有可檢測的產(chǎn)物、未反應(yīng)底物、復合的磁性載體顆粒和未復合的磁性 載體顆粒，并且其中所述底物本身通過氣相和/或汽相分析儀是不可檢測的。
18.權(quán)利要求17的方法，所述方法包括在與有待檢查所述靶標的樣品混合之前封閉非 特異性結(jié)合位點。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)生復合物是競爭性的，使得所述復合物存在的數(shù) 量與樣品中存在的所述靶標的數(shù)量負相關(guān)。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)生復合物是非競爭性的，使得所述復合物存在的 數(shù)量與樣品中存在的所述靶標的數(shù)量正相關(guān)。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述氣相和/或汽相分析儀是離子淌度光譜儀。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述氣相和/或汽相分析儀是離子阱淌度光譜儀。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述氣相和/或汽相分析儀提供樣品中所選擇靶標的存 在或數(shù)量的定量或定性測定輸出。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述靶標包括抗體或抗原。
25.權(quán)利要求17的方法，其中從第一含水液體中分離載體顆粒的時間小于約30分鐘。
26.權(quán)利要求17的方法，其中所述選擇性靶標結(jié)合劑包括至少一種選自以下的化學部 分抗原、抗體、適配體、多肽、肽、核酸、蛋白質(zhì)受體、配體、寡核苷酸、鏈霉抗生物素、抗生物 素蛋白、生物素、凝集素等。
27.一種用汽相和/或氣相分析來分析在液相生物學測定中產(chǎn)生的可檢測產(chǎn)物的方 法，所述方法包括將用第一選擇性靶標結(jié)合劑修飾的磁性載體顆粒和用第二選擇性靶標結(jié)合劑修飾的 轉(zhuǎn)化物部分分散到測定溶液中，其中所述磁性載體顆粒的平均粒度為5納米至100微米，并 且所述轉(zhuǎn)化物部分是酶，其中所述測定溶液包含有待檢查所述靶標的樣品；產(chǎn)生復合物，該復合物由至少一種磁性顆粒、至少一種靶標和通過相應(yīng)的靶標結(jié)合劑 連接的至少一種酶組成，如果所述靶標存在；施加磁場，并從未復合的酶和測定溶液中濃縮復合的和未復合的磁性載體顆粒； 將所述濃縮的磁性載體顆粒再次分散在反應(yīng)溶液中，其中所述溶液含有用于與復合的 酶反應(yīng)產(chǎn)生不可檢測產(chǎn)物的可檢測底物；和通過將所述反應(yīng)溶液的等分試樣插入到氣相和/或汽相分析儀中來檢測可檢測的底物，其中所述反應(yīng)溶液含有產(chǎn)物、未反應(yīng)底物、復合的磁性載體顆粒和未復合的磁性載體顆 粒，其中產(chǎn)物本身通過氣相和/或汽相分析儀是不可檢測的。
28.權(quán)利要求27的方法，所述方法包括在與樣品混合之前封閉非特異性結(jié)合位點。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述施加磁場從測定溶液中分離磁性載體顆粒，然后停 止磁場，將所述磁性顆粒再次分散到反應(yīng)溶液中。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述產(chǎn)生復合物是競爭性的，使得所述復合物存在的數(shù) 量與樣品中存在的所述靶標的數(shù)量負相關(guān)。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述產(chǎn)生復合物是非競爭性的，使得所述復合物存在的 數(shù)量與樣品中存在的所述靶標的數(shù)量正相關(guān)。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述氣相和/或汽相分析儀是離子淌度光譜儀。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述氣相和/或汽相分析儀是離子阱淌度光譜儀。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述氣相和/或汽相分析儀提供樣品中所選擇靶標的存 在或數(shù)量的定量或定性測定輸出。
35.權(quán)利要求27的方法，其中所述靶標包括抗體或抗原。
36.權(quán)利要求27的方法，其中所述施加磁場和所述再次分散測定溶液的載體顆粒的時 間小于約30分鐘。
37.權(quán)利要求27的方法，其中所述靶標結(jié)合劑包括至少一種選自以下的化學部分抗 原、抗體、適配體、多肽、肽、核酸、蛋白質(zhì)受體、配體、寡核苷酸、鏈霉抗生物素、抗生物素蛋 白、生物素、凝集素及其組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了涉及小分子分析時用于提高效率的方法，所述小分子在分析溶液中的濃度取決于通過用汽相和/或氣相分析的液相生物學測定所測靶標的濃度。所述方法一般包括靶標物質(zhì)競爭性或非競爭性結(jié)合到在生物學測定中用作底物的載體顆粒上。使用所述載體顆粒作為底物，為所發(fā)生的反應(yīng)提供了增加的表面積，提高了洗滌步驟的便利性，并允許將增加的表面積濃縮成更小的反應(yīng)體積，然后引入汽相光譜儀和/或氣相光譜儀例如離子淌度光譜儀中。
文檔編號G01N33/538GK102066933SQ200980105788
公開日2011年5月18日 申請日期2009年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月13日
發(fā)明者A·D·普里斯 申請人:莫弗探測公司