專利名稱：黃花蒿中青蒿素含量快速檢測技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及青蒿素快速檢測技術。具體講涉及通過索氏提取法快速從黃花蒿中提 取青蒿素，并用高效液相色譜技術(HPLC)對青蒿素含量進行快速檢測的技術。涉及化學檢 測技術領域。
背景技術：
青蒿素是利用我國特有的植物資源黃花蒿研制成功的一種全新的抗瘧有效單體。 由于其結(jié)構獨特，抗瘧機理特別，對抗氯喹的惡性瘧和腦性瘧有特效，且有高效低毒的特 點，而被WHO稱為“世界上目前唯一有效的瘧疾治療藥物”。青蒿素是一種白色針狀晶體，分 子式為C15H2205。1976年通過化學反應、光譜數(shù)據(jù)和X射線單晶衍射方法證明其為一種含有 過氧基的新型倍半萜內(nèi)酯。由于其具有特殊的過氧基團，它對熱不穩(wěn)定，易受濕、熱和還原 物質(zhì)的影響而分解。青蒿素是種具有過氧鍵和內(nèi)酯環(huán)的倍半萜內(nèi)酯，由于其不具有共扼結(jié)構，且化學 性質(zhì)不活潑，給定量測定帶來一定困難。但自從青蒿素發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過科研工作者的不懈努 力，已經(jīng)發(fā)展出了一系列基于青蒿素各項物理化學性質(zhì)的分析測定方法。但檢測方法要與 一定的分離提取方法相聯(lián)系，才能有效地應用在研究、生產(chǎn)工作中。由傳統(tǒng)的薄層色譜法、 紫外分光光度法以及柱前衍生化-HPLC檢測法向直接HPLC法檢測過渡勢在必行。青蒿素有多個手性碳原子，使得合成步驟非常復雜，產(chǎn)率低、成本高，很難應用于 工業(yè)化生產(chǎn)。所以目前藥用青蒿素主要從黃花篙植株中提取。因此，準確定量測定青蒿素含 量，對于黃花篙品種選育、青蒿素藥物生產(chǎn)以及藥理藥效研究都有重要的意義。不同栽培條 件和地理環(huán)境青蒿素含量差別很大，青蒿素生產(chǎn)企業(yè)收購農(nóng)戶青蒿時，需測定青蒿素含量， 才能確定收購價格。青蒿干葉中提取青蒿素一般提取時間較長，需Mh以上，檢測方法也不 成熟。由于收購時間比較集中，農(nóng)戶送來青蒿需等2-3周才能得到檢測結(jié)果，在生產(chǎn)上極為 不便，限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，本發(fā)明研究的青蒿素含量快速檢測技術在青蒿素產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中 也具有重要價值和應用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立青蒿素高效液相色譜(HPLC)快速檢測技術。本發(fā)明的內(nèi)容包括以青蒿為原料，通過索氏提取法快速提取青蒿素，確定高效液 相色譜技術的色譜條件，建立青蒿素快速檢測技術體系。本發(fā)明建立青蒿素快速檢測技術體系，檢測時間短(Ih)，結(jié)果可靠，是適于青蒿素 生產(chǎn)企業(yè)檢測原料中青蒿素含量的成熟技術。(1)從青蒿中提取青蒿素的索氏提取條件為70%乙醇于65°C _85°C水浴，索氏提 取提取時間為 l-2h ；6-8h ； 12-14h ； 18_20h ；24_26h。(2)HPLC 檢測色譜條件為色譜柱Agilent Eclipse XDB C8 柱(5 μ m， 4. 6X 150mm)；流動相為以下配方選基一乙睛醋酸緩沖液=20 80;乙睛醋酸緩沖液=25 75 ；乙睛醋酸緩沖液=30 70 ；溫度25_;35°C ；流速l-2mL/min ；波長 220nm。本發(fā)明解決技術問題的方案分以下四個步驟完成(1)青蒿中青蒿素索氏提取稱取IOOg青蒿鮮樣，研碎，將樣品裝入濾紙?zhí)淄?中，把套筒小心地插入索氏提取器中，取300mL70 %乙醇加入600mL平底燒瓶中，加入幾粒 沸石。水浴加熱 65 °C -85 °C，連續(xù)提取 1 -Mh，分別在 0. 5-Ih，1 -2h，3-4h，6-8h，12-14h， 18-20h，22-24h收集提取液，并以鹽酸中和。(2)樣品提純提取液加熱至70°C后經(jīng)2% (w/v)活性炭脫色，攪拌30min，靜置后 以3000r/min離心IOmin后收集上清液，再用1/5體積的10%三氯乙酸除蛋白，以3000r/ min離心去除變性蛋白，上清液真空蒸發(fā)濃縮。濃縮后的殘渣以200mL70%乙醇沉淀， 3000r/min離心后取上清液真空濃縮至30mL。(3)HPLC檢測樣品處理方法1 %醋酸水溶液99mL，加入Iml濃縮液，攪拌混勻 后，取不同提取時間的提取液20yL做HPLC分析。標準曲線為以峰面積⑴與對照標準 品濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程為y = 2395. 3χ-1. 3591，R = O. 987，根據(jù)回歸方程計算出青蒿素濃度。(4)取不同來源的青蒿干葉樣品6份，重復5次，用(1)，(2)步驟方法提取后，用 (3)步驟計算出提取l-2h ；6-8h ； 12-14h ；18_20h后青蒿素含量。
具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1取重慶恒星生物制藥有限責任公司基地種植的青蒿，稱取IOOg青蒿葉干樣， 研碎，將樣品裝入濾紙?zhí)淄仓?，把套筒小心地插入索氏提取器中，?00mL70 %乙醇加入 600mL平底燒瓶中，加入幾粒沸石。水浴加熱，分別在提取lh，6h，12h，18h，Mh收集提取 液，重復3次。提取液以鹽酸中和后加熱至70°C后經(jīng)2% (w/v)活性炭脫色，攪拌30min， 靜置后以3000r/min離心IOmin后收集上清液，再用1/5體積的10%三氯乙酸除蛋白，以 3000r/min離心去除變性蛋白，上清液真空蒸發(fā)濃縮。濃縮后的殘渣以200mL70%乙醇沉 淀，3000r/min離心后取上清液真空濃縮至30mL。濃縮樣品采用以下方式處理醋酸水 溶液99mL，加入ImL提取液，攪拌混勻后，做HPLC分析。精密量取20ul注入液相色譜儀，記 錄色譜圖；色譜條件為色譜柱:Agilent Eclipse XDB C8柱(5 μ m，4. 6X 150mm)；流動相 為乙睛醋酸緩沖液=25 75 ；溫度25°C;流速lmL/min ；波長260nm。標準曲線以峰 面積(Y)與對照品濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程為y = 2395. 3χ-1. 3591,R = 0. 987。 根據(jù)公式計算出不同提取時間青蒿素含量占干重的比例為提取lh，占0. 113% ；提取6h， 占 0. 261% ；提取 12h,占 0. 415% ；提取 18h,占 0. 614% ；提取 24h,占 0. 619% ；。提取 Ih 后與充分提取(24h)的比值為0. 183取從重慶市黔江區(qū)農(nóng)戶收集的青蒿干葉3份，重慶酉陽農(nóng)戶收集的青蒿干葉3份， 分別提取Ih ；6h ； 12h ； 18h ；24h后，提取液提純后用HPLC檢測。通過計算得到6份樣品 提取Ih后青蒿素含量占干重的比例分別為0. 123%,0. 117%,0. 128%,0. 210,0. 197%, 0. 173%，不同來源青蒿中青蒿素含量差異極顯著。不同來源青蒿干葉中青蒿素含量提取Ih后與充分提取(24h)的比值分別為0. 180,0. 179,0. 185,0. 178,0. 182,0. 184，差異不顯著， 其平均值0. 181，可用來作為青蒿素充分提取時含量推算。實施例2索氏提取過程按實施例1進行，所不同之處在于HPLC分析色譜條件為色譜條件 為色譜柱=AgilentEclipse XDB C8柱(5 μ m,4. 6X 150mm)；流動相為乙睛醋酸緩沖液 =30 70;溫度30°C;流速1.5mL/min;波長260nm。不同來源青蒿干葉提取Ih后青蒿 素含量與充分提取的比值，差異不顯著，平均值為0. 180。
權利要求
1.青蒿素含量快速檢測技術，該技術包括(1)青蒿素索氏快速提取和純化；( 高效液 相(HPLC)檢測。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于以青蒿干葉為原料采用索氏提取法提取青 蒿素，提取條件為70%乙醇水浴65°C-85°C，提取時間為1-池，根據(jù)其含量與充分提取Mh 后含量的比值0. 181，推算出青蒿干葉的青蒿素含量。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于高效液相(HPLC)檢測的色譜條件為色譜 柱Agilent EclipseXDB C8柱(5 μ m，4. 6X 150mm)；流動相為以下配方選基一乙睛醋 酸緩沖液=25 75 ；乙睛醋酸緩沖液=30 70 ；乙睛醋酸緩沖液=25 75 ；溫度 25-350C ；流速:l-2mL/min ；波長260nm。
全文摘要
本發(fā)明提出一種青蒿素含量快速檢測技術。該技術是以青蒿干葉為原料，通過索氏提取法快速提取青蒿素，確定高效液相色譜技術的色譜條件，計算出提取1-2h青蒿素含量與充分提取后青蒿素含量比值，確定青蒿素快速檢測技術。提取條件為70％乙醇水浴65℃-85℃，提取時間為1-2h。提取液用活性炭脫色和三氯乙酸除蛋白后，用70％乙醇沉淀，取上清液，進行HPLC檢測，色譜條件為色譜柱AgilentEclipseXDB C8柱(5μm，4.6×150mm)；流動相為以下配方選基一乙睛∶醋酸緩沖液＝23∶77；乙睛∶醋酸緩沖液＝30∶70；乙睛∶醋酸緩沖液＝25∶75；溫度25-35℃；流速1-2mL/min；波長260nm。
文檔編號G01N30/08GK102053121SQ200910191258
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月29日
發(fā)明者冉義坤, 冉輝, 劉成林, 張梅 申請人:重慶恒星生物技術有限責任公司