專利名稱：：以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定bod的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境污染監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，涉及到水體有機(jī)污染的快速監(jiān)測(cè)，具體是利用固定化釀酒酵母carew/ae)作為BOD快速測(cè)定儀的生物識(shí)別元件，拓寬對(duì)廢水中有機(jī)污染物的測(cè)量范圍，提高測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，并延長(zhǎng)生物識(shí)別元件的使用壽命的一種以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定BOD的方法。
背景技術(shù)：
：水中的有機(jī)污染物種類繁多，難以分別測(cè)定各種組分的定量數(shù)值，因此在水質(zhì)評(píng)價(jià)過程中，生化需氧量(biochemicaloxygendemand,BOD)是一個(gè)重要的參數(shù)，它是指一定體積水體中的有機(jī)物在微生物作用下氧化所消耗的溶解氧的量，單位是mg/L。從以上定義可以看出，BOD代表水體中有機(jī)污染物的污染程度。由于BOD可間接表示微生物氧化有機(jī)物的含量，所以BOD成為水污染控制領(lǐng)域最廣泛采用的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。目前國(guó)內(nèi)外均采用5天20"c培養(yǎng)法測(cè)定水樣中的BOD值，它包括水樣采集、水樣充氧、培養(yǎng)、測(cè)定等步驟。簡(jiǎn)單地說，就是將水樣密封于試驗(yàn)瓶中，在20±1。C下培養(yǎng)5天，然后分別測(cè)定樣品培養(yǎng)前后的溶解氧，這兩者之差即為5d的生化需氧量B0D5。這種方法存在許多不足之處，如測(cè)定周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、重現(xiàn)性差、不宜現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等。因此，迫切需要一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、自動(dòng)化程度高、適用范圍廣的新方法來測(cè)定BOD。BOD生物傳感器快速測(cè)定儀就是利用生物傳感器的原理，以微生物作為識(shí)別材料，當(dāng)樣品進(jìn)入測(cè)量室時(shí)，水樣中的有機(jī)物與微生物接觸并被微生物分解。微生物在分解有機(jī)物的過程中會(huì)消耗水中的溶解氧，導(dǎo)致溶解氧濃度降低，利用相應(yīng)的換能器可以檢測(cè)到溶解氧濃度的變化，產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)。這一信號(hào)變化的大小與樣品中BOD濃度存在一定的線形關(guān)系，通過對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理，可以得到水樣的B0D值。由于測(cè)定過程在較高溫度(一般為20-30。c)下進(jìn)行，同時(shí)對(duì)水樣進(jìn)行曝氣，因此微生物反應(yīng)速度加快，大幅度縮短了BOD的測(cè)定時(shí)間。這就是生物傳感器BOD快速測(cè)定儀的基本原理。1977年，日本學(xué)者Kariibe等利用微生物傳感器原理研制出BOD測(cè)定儀。該儀器由固定化土壤菌群與氧電極構(gòu)成，可在15min內(nèi)測(cè)得廢水的BOD值。但由于微生物酶對(duì)固定化微生物膜的破壞，10d后，傳感器便失去活性。此后，Clark等改用多孔醋酸纖維素膜固定微生物制成BOD傳感器,主要用于測(cè)定高濃度廢水，可連續(xù)使用17d?；谏飩鞲衅髟淼腂OD測(cè)定方法和測(cè)定儀器具有快速、測(cè)試簡(jiǎn)單方便、便于攜帶等特點(diǎn)，因此，自1977年以來，BOD快速測(cè)定儀獲得了廣泛的研究，并取得了很大進(jìn)展。BOD生物傳感器的基本組成主要包括生物識(shí)別元件和換能器。生物識(shí)別元件是BOD生物傳感器的核心部件，其中包含了生化反應(yīng)所需要的微生物。因此，生物識(shí)別元件在很大程度上決定了BOD傳感器的性能和測(cè)定的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)外在BOD傳感器識(shí)別元件的選擇方面做了大量的研究。目前，用作BOD生物傳感器識(shí)別原件的微生物主要有丁酸梭菌("as^^必i/范6^7ri'w/2)、假單孢菌(/^e〃ob/ff朋assp.)、異常漢遜氏酵母菌(Zfe/7se刀"7aa/70/aaJa)、皮狀絲孢酵母菌(Wc力。砂o/W2c由"i咖)等o生物傳感器可以縮短水體BOD測(cè)定周期，節(jié)省人力、物力和財(cái)力，更重要的是能及時(shí)反映地表水、工業(yè)廢水和生活污水的污染程度，為管理和決策部門掌握水體污染現(xiàn)狀(尤其是事故發(fā)生時(shí))提供科學(xué)的決策依據(jù)，同時(shí)也為工業(yè)企業(yè)的廢水治理，污水處理廠的工藝設(shè)計(jì)、控制、改進(jìn)處理效率等及時(shí)提供參數(shù)。因此，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、適合我國(guó)國(guó)情的、性能優(yōu)越且價(jià)格合理的生物傳感器B0D快速測(cè)定儀是一項(xiàng)非常必要和迫切的任務(wù)，為我國(guó)水體有機(jī)污染的快速監(jiān)測(cè)及廢水處理廠的運(yùn)行控制提供技術(shù)保障，并產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和社會(huì)效益。我們經(jīng)過多年研究，發(fā)明了一種BOD快速測(cè)定方式(發(fā)明專利生化需氧量生物傳感器，專利號(hào)ZL00132125.0)以及利用固定化技術(shù)制備微生物顆粒的方法(發(fā)明專利一種聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，專利號(hào)ZL00132126.9;發(fā)明專利一種抑制聚乙烯醇固定化微生物顆粒水溶膨脹性的方法，專利號(hào)ZL200610011608.X)，并研制出B0D快速測(cè)定儀。本發(fā)明提出了一種利用釀酒酵母作為測(cè)定B0D的生物識(shí)別元件,力求拓寬對(duì)于多種廢水的測(cè)定范圍，滿足更多行業(yè)的使用需要。此外，利用PVA固定化釀酒酵母制備活性高、選擇性強(qiáng)的生物識(shí)別元件，以提高生物響應(yīng)的穩(wěn)定性，并保證識(shí)別元件的一致性，從而提高B0D傳感器的商品化程度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出了以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定B0D的方法，其特征在于，該方法包括選擇釀酒酵母作為生物識(shí)別元件、利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識(shí)別元件工藝和利用PVA固定化釀酒酵母生物識(shí)別元件對(duì)BOD的快速測(cè)定；所述選擇釀酒酵母作為生物識(shí)別元件是選擇釀酒酵母作為快速測(cè)定B0D生物識(shí)別材料的主要原因如下1)釀酒酵母是一種高活性的好氧微生物，同化碳水化合物的能力很強(qiáng)，目前已廣泛應(yīng)用于高濃度有機(jī)工業(yè)廢水的綜合治理；2)釀酒酵母自身無毒害作用，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染；3)釀酒酵母的培養(yǎng)條件要求不高，并生長(zhǎng)迅速，因此宜于獲得；4)釀酒酵母可以長(zhǎng)期干燥保存，并能長(zhǎng)久保持酶的活力；5)釀酒酵母細(xì)胞具有耐滲透壓的特點(diǎn)，可適用于海洋污染的監(jiān)測(cè)；所述利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識(shí)別元件工藝將釀酒酵母細(xì)胞懸浮于去離子水中，其濃度為10—20g/100mL(w/v)，然后與溶解好的PVA溶液混合，得到均勻的混合液，PVA的最終濃度為8—10%(w/v)，將該混合液滴入飽和硼酸溶液500mL中，充分交聯(lián)反應(yīng)10—12小時(shí)后取出，用去離子水沖洗3遍，得到作為生物識(shí)別元件的固定化釀酒酵母顆粒，放置冰箱中冷藏備用；所述利用PVA固定化釀酒酵母生物識(shí)別元件對(duì)BOD的快速測(cè)定測(cè)量時(shí)，固定化微生物顆粒與待測(cè)樣品在測(cè)量室中混合，用微量曝氣管進(jìn)行攪拌和曝氣，使其中溶解氧飽和，固定化微生物顆粒在分解有機(jī)污染物的過程中分解水體中可生物降解的有機(jī)污染物，并且消耗水體中的溶解氧，使溶解氧濃度不斷降低，導(dǎo)致溶解氧逐級(jí)降低至一個(gè)新的穩(wěn)定狀態(tài)；根據(jù)兩個(gè)穩(wěn)態(tài)之間的溶解氧差值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出所測(cè)水樣的BOD值。其中兩個(gè)穩(wěn)態(tài)是指第一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)設(shè)定為水樣達(dá)到預(yù)定的測(cè)量溫度時(shí)，第二個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)設(shè)定為連續(xù)3次電流值讀數(shù)的變化范圍小于0.001)LiA。所述固定化微生物顆粒為固定化釀酒酵母顆粒。本發(fā)明的有益效果是與目前使用的BOD快速測(cè)定儀的生物識(shí)別元件相比，本發(fā)明提出的釀酒酵母彌補(bǔ)了其諸多不足(1)釀酒酵母的代謝活性高，分解有機(jī)污染物的能力強(qiáng)，拓寬了對(duì)多種廢水的測(cè)量范圍；(2)根據(jù)水樣的污染程度不同，改變固定化微生物顆粒的量可以調(diào)整有效測(cè)量范圍；(3)固定化微生物顆粒的使用壽命更長(zhǎng)，微生物的活化和保存也更簡(jiǎn)單、方便；(4)固定化釀酒酵母細(xì)胞具有耐滲透壓的特點(diǎn)，因此，以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件適用于對(duì)海洋水體有機(jī)污染的快速監(jiān)測(cè)。圖1是B0Ds為5-50mg/L范圍的海水的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明-實(shí)施例1用本發(fā)明提出的釀酒酵母作為B0D快速測(cè)定的生物識(shí)別元件，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)B0D樣品的測(cè)定。分別配置B0D濃度為5，20,25，40，50，75，100，125，150，175，200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)GGA溶液，測(cè)定條件為溫度控制在30±1*€，曝氣量為200-500mL/min。利用固定化釀酒酵母顆粒為生物識(shí)別材料，利用溶解氧電極測(cè)定上述BOD標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。測(cè)定結(jié)果表明，DO值的變化與樣品的BOD值之間具有良好的線性關(guān)系，線形相關(guān)系數(shù)大于0.99，滿足BOD快速測(cè)量要求。實(shí)施例2用本發(fā)明提出的釀酒酵母作為BOD快速測(cè)定的生物識(shí)別元件，配置BOD濃度為50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)GGA溶液，測(cè)定條件為溫度控制在30士廠C，去離子水稀釋，曝氣量為200mL/inin。測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性如表1所示。表1固定化釀酒酵母對(duì)BODs為50mg/L的GGA溶液響應(yīng)的重現(xiàn)性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以看出，重現(xiàn)性試驗(yàn)的測(cè)量次數(shù)為8次，溶解氧降低值的平均值為0.34mg/L，最大相對(duì)偏差為10.7%，滿足BOD快速測(cè)量要求。實(shí)施例3用本發(fā)明提出的釀酒酵母作為BOD快速測(cè)定的生物識(shí)別材料，進(jìn)行了海水BOD標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定。海水BOD標(biāo)準(zhǔn)樣品的配置步驟完全與GGA溶液的配置步驟相同(實(shí)施例l)，僅將配置所用去離子水換為標(biāo)準(zhǔn)海水。此標(biāo)準(zhǔn)海水取自遠(yuǎn)海海平面下50m處，然后進(jìn)行沙濾，最后進(jìn)行紫外線消毒。測(cè)定條件為溫度控制在30±1t:,去離子水稀釋，曝氣量為200-500mL/min。測(cè)定結(jié)果如圖l所示。可以看出，DO值的變化與樣品的BOD值之間具有良好的線性關(guān)系，線形相關(guān)系數(shù)大于0.99，滿足BOD快速測(cè)量要求。實(shí)施例4用本發(fā)明提出的釀酒酵母作為BOD快速測(cè)定的生物識(shí)別材料，進(jìn)行了實(shí)際生活污水樣品的BOD測(cè)定。實(shí)驗(yàn)所用生活污水取自清華大學(xué)學(xué)生區(qū)的生活污水。采用GGA標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定過的測(cè)試系統(tǒng)對(duì)所取的生活污水進(jìn)行測(cè)量，測(cè)得該生活污水的BOD值分別為48.5mg/L，采用五日標(biāo)準(zhǔn)稀釋法的測(cè)定結(jié)果為42.4mg/L?？梢钥闯?，利用本發(fā)明的釀酒酵母作為BOD快速測(cè)定的生物識(shí)別材料，BOD快速測(cè)定值與五日BOD標(biāo)準(zhǔn)稀釋測(cè)定值在生活污水的測(cè)定中結(jié)果是近似的。權(quán)利要求1.一種以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定BOD的方法，其特征在于，該方法包括選擇釀酒酵母作為生物識(shí)別元件、利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識(shí)別元件工藝和利用PVA固定化釀酒酵母生物識(shí)別元件對(duì)BOD的快速測(cè)定；所述選擇釀酒酵母作為生物識(shí)別元件是選擇釀酒酵母作為快速測(cè)定BOD生物識(shí)別元件的主要原因如下1)釀酒酵母是一種高活性的好氧微生物，同化碳水化合物的能力很強(qiáng)，目前已廣泛應(yīng)用于高濃度有機(jī)工業(yè)廢水的綜合治理；2)釀酒酵母自身無毒害作用，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染；3)釀酒酵母的培養(yǎng)條件要求不高，并生長(zhǎng)迅速，因此宜于獲得；4)釀酒酵母可以長(zhǎng)期干燥保存，并能長(zhǎng)久保持酶的活力；5)釀酒酵母細(xì)胞具有耐滲透壓的特點(diǎn)，可適用于海洋污染的監(jiān)測(cè)；所述利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識(shí)別元件的工藝將釀酒酵母細(xì)胞懸浮于一定量的去離子水中(濃度范圍10-20g/100mL(w/v)為)，然后與溶解好的PVA溶液混合，得到均勻的混合液，PVA的最終濃度為8-10％(w/v)，將該混合液滴入飽和硼酸溶液500mL中，充分交聯(lián)反應(yīng)10-12小時(shí)后取出，用去離子水沖洗3遍，得到作為生物識(shí)別元件的固定化釀酒酵母顆粒，放置冰箱中冷藏備用；所述利用PVA固定化釀酒酵母生物識(shí)別元件對(duì)BOD的快速測(cè)定測(cè)量時(shí)，固定化微生物顆粒與待測(cè)樣品在測(cè)量室中混合，用微量曝氣管進(jìn)行攪拌和曝氣，使其中溶解氧飽和，加熱控制溫度條件，使固定化微生物顆粒在分解有機(jī)污染物的過程中分解水體中可生物降解的有機(jī)污染物，并且消耗水體中的溶解氧，使溶解氧濃度不斷降低，導(dǎo)致溶解氧逐級(jí)降低至一個(gè)新的穩(wěn)定狀態(tài)；根據(jù)兩個(gè)穩(wěn)態(tài)之間的溶解氧差值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線-線性回歸方程即可計(jì)算出所測(cè)水樣的BOD值。2.權(quán)利要求1所述以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定B0D的方法，其特征在于，所述固定化微生物顆粒為固定化釀酒酵母顆粒。3.權(quán)利要求1或2所述以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定B0D的方法，其特征在于，所述固定化釀酒酵母顆粒可用于天然水體、工業(yè)廢水、生物污水以及海水中B0D值的快速測(cè)定，水樣不經(jīng)稀釋直接測(cè)量的范圍為B0D值為5—200mg/L。全文摘要本發(fā)明公開了屬于環(huán)境污染監(jiān)測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
的以釀酒酵母作為生物識(shí)別元件快速測(cè)定BOD的方法。該方法包括選擇釀酒酵母作為生物識(shí)別元件、利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識(shí)別元件工藝和利用PVA固定化釀酒酵母生物識(shí)別元件對(duì)BOD的快速測(cè)定；本發(fā)明選擇釀酒酵母作為測(cè)定BOD的識(shí)別元件，可以拓寬對(duì)多種廢水的測(cè)定范圍、BOD的快速測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好；利用PVA固定化釀酒酵母制備活性高、選擇性強(qiáng)的生物識(shí)別元件，可以提高生物響應(yīng)的穩(wěn)定性，并保證識(shí)別元件的一致性、機(jī)械強(qiáng)度和使用壽命，生物識(shí)別元件的使用壽命達(dá)到3-6個(gè)月。本發(fā)明可應(yīng)用于天然水體、工業(yè)廢水、生物污水以及海水中BOD值的快速測(cè)定。文檔編號(hào)G01N33/18GK101644702SQ20091009064公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年9月2日優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日發(fā)明者王建龍,俊胡申請(qǐng)人:清華大學(xué)