專利名稱：用于改變血管功能的疾病的診斷和治療工具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在影響血管健康的疾病和炎性疾病中特別有用的診斷和治療工具及 應(yīng)用。具體來說，所述診斷和治療工具利用了內(nèi)皮糖萼(glycocalyx)的適當檢測或調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
血管疾病是現(xiàn)代人類社會中發(fā)病和死亡的主因。盡管心血管和腦血管疾病，例如 充血性心力衰竭和心肌梗塞的災(zāi)難性事件、心源性猝死或中風(fēng)，已被廣泛認知，但血管機能 障礙也可能阻塞向其他器官或身體部分例如腸、腎臟、上肢或下肢的血液供應(yīng)(例如外周 動脈阻塞性疾病)。血管疾病的中心病因要素是動脈粥樣化形成，即在內(nèi)膜下層中粥樣斑塊的進行性 形成，這促成了動脈和微動脈中的炎性動脈粥樣硬化病變。斑塊沉積可以導(dǎo)致動脈狹窄，引 起由動脈提供給器官的血液供應(yīng)不足。更通常情況下，斑塊的炎癥可能造成纖維帽破裂，導(dǎo) 致血栓形成以及隨之而來的梗塞形成。對血管病原性變化，尤其包括內(nèi)皮機能障礙、血管滲透性增加、白細胞和血小板凝 集增加以及最終的動脈粥樣化形成和動脈粥樣硬化的發(fā)病和/或發(fā)展速度的易感性傾向， 可以由各種不同的風(fēng)險因子或疾病狀態(tài)增加或與它們相關(guān)，其中包括例如急性或慢性炎性 狀態(tài)和疾病，以及慢性血管激惹。例如，患有慢性炎性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性 紅斑狼瘡的患者，可能遭受加速的動脈粥樣化形成(Solomon等，2003. Circulation 107 1303-7 ;Roman等，2003. N Engl J Med 349:2399-406)；人類血流中內(nèi)毒素水平的升高已經(jīng) 與動脈粥樣硬化的風(fēng)險增加相關(guān)聯(lián)(Stoll等，2004. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24: 2227-36)；在高膽固醇飲食的兔中重復(fù)地給藥內(nèi)毒素，已顯示出增加了動脈粥樣硬化病變 (Lehr等，2001. Circulation 104 914-20)；甚至單一的炎性激惹例如疫苗接種、C反應(yīng)性 蛋白灌注或內(nèi)毒素給藥，也可能在人類中引起內(nèi)皮機能障礙。因此，對于能夠在特別是具有發(fā)生血管改變的風(fēng)險或已知患有血管病的對象和患 者組中檢測血管壁對致動脈粥樣化刺激的易感性的診斷工具，存在著迫切需求。此外，對于 允許增加血管壁對抗致動脈粥樣化刺激的保護能力，從而提供進一步治療和預(yù)防措施的新 的靶，也存在著需求。發(fā)明簡述本發(fā)明致力于上面討論的本技術(shù)領(lǐng)域中的需求。更具體來說，本發(fā)明進一步講述了用于檢測血管易感性和致病原因的診斷工具。 所述診斷工具與當前已知的用于血管疾病的診斷手段相比，優(yōu)選具有一種或多種優(yōu)點，例 如更高的檢測速度、靈敏度、特異性和/或簡便性，更早檢測到血管病理變化，同時檢測多 種相關(guān)參數(shù)，從較少的起始材料或從通過微創(chuàng)性或非創(chuàng)性技術(shù)獲得的起始材料進行檢測。本發(fā)明還進一步講述了用于減輕血管易感性和致病原因的方式。本發(fā)明的預(yù)防性 或治療性干預(yù)與當前已知的用于血管疾病的治療方法相比，優(yōu)選具有一種或多種優(yōu)點，例 如尤其是更高的治療效能、特異性和/或耐受性，在疾病的包括血管機能障礙發(fā)生前或早 期階段在內(nèi)的各種不同階段起作用，通過可能與現(xiàn)有療法互補的新的機制起作用。
具體來說，本發(fā)明人最終結(jié)論性地證實，促進血管易感性和疾病發(fā)生的激惹，如炎 性激惹，在內(nèi)皮糖萼中引起了可證實的改變，例如降低了系統(tǒng)的和微血管的糖萼的體積或 維度，增加了糖萼的滲透性，使糖萼成分例如透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素釋放，以及參與糖萼 代謝的酶的水平的改變。此外，鑒于內(nèi)皮完整性(包括糖萼功能)對血管健康的重要性，因此本發(fā)明人考慮 到，監(jiān)測與糖萼相關(guān)的參數(shù)或標志物，能夠提供關(guān)于血管機能障礙和疾病的風(fēng)險或存在，以 及對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性的有價值的信息。此外，本發(fā)明人還考慮到，旨在保護 和/或重建糖萼完整性(例如通過補充糖萼組成成分，刺激糖萼的產(chǎn)生，或通過抑制糖萼的 分解)的預(yù)防性和/或治療性干預(yù)，可以防止血管機能障礙和疾病，以及炎癥和對炎性激惹 的致動脈粥樣化易感性，或改善它們的預(yù)后。因此，一方面，本發(fā)明提供了用于在對象中診斷血管疾病或?qū)ρ芗膊〉囊赘行?的方法，包括在所述對象中檢測糖萼的狀態(tài)、體積或維度，糖萼的滲透性，糖萼的釋放和/ 或糖萼代謝的一種或多種酶的活性的變化。例如而非限制性的，糖萼體內(nèi)平衡的這些方面 的變化，可以與不具有血管疾病或?qū)ρ芗膊∫赘行缘膶φ諏ο蠡蚨鄠€對象進行比較，以 評估是否發(fā)生了可以指示病理表型的顯著差異。另一方面，本發(fā)明提供在用于在對象中診斷對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性的 方法，包括在所述對象中檢測糖萼的狀態(tài)、體積或維度，糖萼的滲透性，糖萼的釋放和/或 糖萼代謝的一種或多種酶的活性的變化。例如而非限制性的，糖萼體內(nèi)平衡的這些方面的 變化，可以與未暴露于炎性激惹的對照對象或多個對象進行比較，以評估是否發(fā)生了可以 指示病理表型的顯著差異。在實施方案中，糖萼的狀態(tài)、體積或維度，糖萼的滲透性，糖萼的釋放和/或糖萼 代謝的一種或多種酶的活性的所述擾動，可以在單個血管中(例如在單個動脈或微動脈 中)，在組織、身體部位、器官的水平上和/或系統(tǒng)水平上進行檢測，對此沒有限制。優(yōu)選情況下，在上面定義的診斷方法中，為了確定糖萼的狀態(tài)、體積或維度，糖萼 的滲透性，糖萼的釋放和/或糖萼代謝的一種或多種酶的活性所必需的測量，可以在從對 象取出的生物學(xué)樣品上進行。這樣的體外測定方法一般容易執(zhí)行，并可按照高通量分析進 行。適合的樣品包括但不限于從對象獲得的全血、血漿或血清樣品。這些體液在體內(nèi)直接 與血管內(nèi)皮組織接觸，因此對糖萼的擾動具有響應(yīng)性。此外，至少某些糖萼指示物，例如但 不限于與糖萼結(jié)合的凝集素樣蛋白，也可以在尿樣中檢測到。在實施方案中，可以在從對象取出的樣品、例如血液、血漿或血清樣品中診斷糖萼 的擾動，包括在所述樣品中檢測尤其是糖萼衍生的分子的存在和/或濃度，這些糖萼衍生 的分子是例如寡糖或多糖，糖胺聚糖，透明質(zhì)酸，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖；催化糖萼合成 代謝或分解代謝的酶，例如透明質(zhì)酸酶；和/或可以摻入或以其他方式結(jié)合糖萼的內(nèi)源或 外源(例如注入的)物質(zhì)，因此可以提供關(guān)于(系統(tǒng)性的)糖萼的體積或維度和/或其分 子可接近性的信息。例如而非限制性的，在樣品例如在血漿或尿樣中測定到的通常與糖萼 相關(guān)的內(nèi)源凝集素樣蛋白的分布情況，可以提供關(guān)于糖萼的體積或維度和/或其分子可接 近性的適合信息。例如而非限制性的，糖萼體內(nèi)平衡的指示物或標志物的改變，例如上面所 陳述的，可以與對照對象或多個對象進行比較，以評估是否發(fā)生了可以指示病理表型的顯 者差升。
在實施方案中，上述或其他糖萼標志物的存在和/或濃度，可以通過本技術(shù)領(lǐng)域 已知的測定技術(shù)相繼或同時檢測，所述技術(shù)為例如免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)， 放射免疫分析(RIA)，比色和熒光酶活性分析等。在本發(fā)明的另一個實施方案中，糖萼的狀態(tài)可以通過尺寸分布方法來確定，其中 測定了單個毛細血管的內(nèi)皮糖萼維度或糖萼寬度(GW)。此外，尺寸分布方法還可以提供對 血管中紅細胞寬度(RBCW)、血管直徑(VD)和毛細血管體積儲備(CVR)的測量。因此，不從 測試對象取出樣品。尺寸分布方法和技術(shù)的使用，可以帶來一種或多種優(yōu)點，例如通量速 度，患者的緊張和樣品收集人員的減少；較低成本的檢測，與參比的自動比較，便攜式裝置， 更快的檢測；和/或避免了麻煩的和對后勤有要求的基于實驗室的技術(shù)和人員等。本發(fā)明 的方法和裝置的另一個優(yōu)點是在家的個人化監(jiān)測，能夠例如通過與中央和/或操作工作站 的連接，(半)永久性地對狀態(tài)進行監(jiān)視。因此，本發(fā)明提供了對患者中血管疾病或?qū)ρ仔?激惹的致動脈粥樣化易感性的診斷。因此，本發(fā)明還提供了糖萼監(jiān)測(GM)裝置，該裝置被構(gòu)建用于檢測糖萼的狀態(tài)， 和/或化合物對糖萼、例如催化糖萼合成代謝和分解代謝的酶的狀態(tài)的影響，和/或可以被 摻入或以其他方式結(jié)合糖萼的內(nèi)源或外源物質(zhì)，例如通常與糖萼結(jié)合的內(nèi)源性凝集素樣蛋 白。此外，本發(fā)明涉及試劑盒，含有上面定義的糖萼監(jiān)測器，軟件，以及使用所述糖萼 監(jiān)測器執(zhí)行診斷方法所需的可選的一種或多種緩沖液、反應(yīng)試劑、校準被分析物、陽性和/ 或陰性對照，和/或使用說明書。在另一個優(yōu)選實施方案中，上述或其他糖萼標志物的存在和/或濃度，可以使用 生物傳感器裝置相繼或同時檢測。生物傳感器優(yōu)選情況下將靈敏和特異的生物成分(例如 與待測定被分析物以高親和性和特異性結(jié)合的受體；或催化涉及待測定被分析物的反應(yīng)的 酶；或待測定酶的底物)，與允許監(jiān)測生物學(xué)事件(例如所述結(jié)合或反應(yīng))的物理、化學(xué)或 生理化學(xué)檢測器相結(jié)合。生物傳感器技術(shù)的使用可以帶來一種或多種優(yōu)點，例如使用較小 的樣品體積，可以逐步提高通量并減少患者的緊張和樣品收集人員；在一個樣品中同時檢 測兩種或更多種標志物的可能性；一次性使用的、便攜的和潛在低成本的檢測；更快的檢 測；和/或避免了麻煩的和對后勤有要求的基于實驗室的技術(shù)等。因此，本發(fā)明還提供了生物傳感器裝置，它被構(gòu)建成用于在從對象獲取的樣品中 檢測糖萼衍生分子，催化糖萼合成代謝或分解代謝的酶，和/或可以被摻入或以其他方式 結(jié)合糖萼的內(nèi)源或外源物質(zhì)，例如通常與糖萼結(jié)合的內(nèi)源性凝集素樣蛋白的存在和/或濃度。此外，本發(fā)明涉及試劑盒，含有上面定義的生物傳感器裝置，以及使用所述生物傳 感器裝置執(zhí)行診斷方法所需的可選的一種或多種緩沖液、反應(yīng)試劑、校準被分析物、陽性和 /或陰性對照，和/或使用說明書。本發(fā)明還涉及在上面定義的本發(fā)明的用于在對象中診斷血管疾病或?qū)ρ仔约と?的致動脈粥樣化易感性的診斷方法中，使用上面定義的生物傳感器裝置或包含它的試劑
品.ο在其他實施方案中，某些診斷方法可能需要在對象身體上進行。例如但非限制性 的，可以通過實施例中顯示的舌下微循環(huán)的垂直偏振光譜(OPS)成像，在人類和其他對象中測量單個毛細血管中內(nèi)皮糖萼的狀態(tài)和/或厚度。另一個例子是，可以使用有創(chuàng)性顯微 鏡可視化技術(shù)在對象、主要是動物對象的單個血管中檢測糖萼，該技術(shù)包括注射與糖萼結(jié) 合蛋白相結(jié)合的熒光標記物或糖萼滲透示蹤分子。作為另一個例子，可以通過本發(fā)明的尺 寸分布方法，這是一種非創(chuàng)性的方法，來監(jiān)測或測定糖萼狀態(tài)。優(yōu)選情況下，尺寸分布方法 使用糖萼監(jiān)測器進行。另一方面涉及糖萼組成成分在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療血管疾病， 用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性，或用于治療炎性疾病。相關(guān)的方面涉及將糖 萼組成成分用作藥物，或用于治療血管疾病，用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性， 或用于治療炎性疾病。此外，還提供了含有糖萼組成成分的藥物組合物，特別是用于治療血 管疾病，用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性，或用于治療炎性疾病。同樣還公開了 在需要治療的對象中用于治療血管疾病，用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性，或 用于治療炎性疾病的方法，包括向所述對象給藥治療或預(yù)防有效量的糖萼組成成分。另一方面涉及糖萼分解代謝的酶的抑制劑在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治 療血管疾病，用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性，或用于治療炎性疾病。相關(guān)的方 面涉及將糖萼分解代謝的酶的抑制劑用作藥物，或用于治療血管疾病，用于降低對炎性激 惹的致動脈粥樣化易感性，或用于治療炎性疾病。還提供了含有糖萼分解代謝的酶的抑制 劑的藥物組合物，特別是用于治療血管疾病，用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性， 或用于治療炎性疾病。同樣還公開了在需要治療的對象中用于治療血管疾病，用于降低對 炎性激惹的致動脈粥樣化易感性，或用于治療炎性疾病的方法，包括向所述對象給藥治療 或預(yù)防有效量的糖萼分解代謝的酶的抑制劑。應(yīng)該認識到，上述的診斷方法和治療性干預(yù)可以組合或同步使用，特別是對個體 患者有利地定制治療方法。例如，當上述的診斷測定方法測定到患者中糖萼的一種或多種 特定組成成分顯著減少時，隨后在所述患者中進行的治療可以旨在補充所述組成成分。在 另一個例子中，當上述診斷測定方法測定到患者中一種或多種特定糖萼降解酶活性過高， 那么在所述患者中進行的治療可以旨在抑制所述酶。因此，在實施方案中，可以在本發(fā)明的 診斷測定的基礎(chǔ)上確定或決定本文中定義的適合的預(yù)防性或治療性干預(yù)。此外，本發(fā)明的診斷方法和裝置(例如生物傳感器，尺寸分布方法和/或糖萼監(jiān) 測器)，甚至可以在單個患者中，根據(jù)糖萼的狀態(tài)和參數(shù)例如體積或維度、滲透性、釋放、糖 萼代謝酶類的活性等，用于監(jiān)測任何對血管疾病或炎癥的治療性干預(yù)(例如本文公開的治 療；或其他治療，例如尤其是在糖尿病患者中改善胰島素敏感性的療法，癌癥患者中的肝素 療法，現(xiàn)有的被設(shè)計用于在炎性疾病中改善內(nèi)皮功能的治療等)的有效性。正如提到的，炎癥傾向于增加發(fā)生血管疾病的機會。因此，在實施方案中，上面定 義的用于確定血管疾病的存在或風(fēng)險，用于確定對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性的診斷 方法，和/或上面定義的涉及糖萼調(diào)節(jié)的血管疾病的治療，在患有炎癥的對象中，例如在具 有炎癥病癥或疾病的患者中，可能特別有用。正如還提到的，血管疾病可能與各種不同風(fēng)險因子和激惹、例如慢性血管激惹相 關(guān)。因此，在實施方案中，上面定義的用于確定血管疾病的存在或風(fēng)險的診斷方法，和/或 上面定義的涉及糖萼調(diào)節(jié)的血管疾病的治療，在具有一種或多種選自衰老、吸煙、高血糖癥 和血脂異常的風(fēng)險因子的對象中，和/或在患有一種或多種選自局部缺血_再灌注損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、胰島素抗性、代謝綜合征、血脂異常、高膽固醇血癥、高甘 油三酯血癥、高血壓、癌癥、傳染病和創(chuàng)傷的風(fēng)險疾病的對象中，可能特別有用。本發(fā)明的這些以及其他的方面和優(yōu)選實施方案，將在下面的部分和隨附的權(quán)利要 求書中描述。


圖la.在使用或不使用依那西普(Etanerc^pt)預(yù)處理的情況下，在內(nèi)毒素激惹之 前和之后測定了系統(tǒng)性糖萼的體積。數(shù)據(jù)被表示成平均值士SEM，*p < 0. 05，#p < 0. 01。圖lb.在基線下(空心菱形；實心菱形)、鹽水(實心正方形)和依那西普組(空 心正方形)中血漿葡聚糖40的清除曲線。在鹽水組中與在依那西普組中相比，在內(nèi)毒素注 入4小時后，葡聚糖40的血漿清除速度增加了。在每個時間點描述的值被表示成平均值 士 SEM。圖Ic和Id顯示了通過單個舌下毛細血管的直接成像測定的LPS (內(nèi)毒素)對糖 萼維度的影響。在內(nèi)毒素激惹之前(Ic)和之后(Id)測定了毛細血管糖萼的維度。X軸顯 示了毛細血管糖萼的維度(單位為微米)。圖2.在不使用(點)或使用(菱形)依那西普預(yù)處理的情況下，在用內(nèi)毒素激惹 的人類志愿者中血漿透明質(zhì)酸水平(圖2a)和透明質(zhì)酸酶活性(圖2b)。數(shù)據(jù)被表示成平 均值士 SEM Γ相對于基線ρ < 0. 05，#組之間ρ < 0. 05)。圖3.在人類志愿者中，在內(nèi)毒素激惹過程中通過血漿IL-6水平評估了炎性標志 物(圖3a，不使用(點)或使用(菱形)依那西普預(yù)處理)和血漿中CRP的血漿水平(圖 3b，不使用(黑色條)或使用(白色條)依那西普預(yù)處理)。顯示了凝結(jié)的激活(圖3c，通 過凝血酶原片段1+2評估)和纖維蛋白溶解(圖3d，通過D- 二聚體水平測定)參數(shù)；(點 LPS+鹽水，菱形LPS+依那西普)。數(shù)據(jù)被表示成平均值士SEMCn相對于基線P < 0. 05，卞 相對于基線ρ < 0. 01，#組之間ρ < 0. 05)。圖4.描繪了本發(fā)明的測量方法與現(xiàn)有技術(shù)的測量方法的比較。圖5.描繪了在存在和不存在硝酸甘油的情況下，血管直徑作為測量到的紅細胞 寬度(圖5a)、糖萼寬度(圖5b)和糖萼寬度相對于健康對照的變化(圖5c)的函數(shù)。圖6.描繪了血管直徑作為在健康對照對象和癌癥對象中測量到的紅細胞寬度 (圖6a)和糖萼寬度(圖6b)，以及糖萼寬度相對于健康對照的變化(圖6c)的函數(shù)。圖7.描繪了在用VEGF受體抑制性化合物處理后，血管直徑作為在健康對照對象 和癌癥對象中測量到的紅細胞寬度(圖7a)和糖萼寬度(圖7b)，以及糖萼寬度相對于健康 對照的變化(圖7c)的函數(shù)。圖8.描繪了血管直徑作為在健康對照對象和糖尿病對象中測量到的紅細胞寬度 (圖8a)和糖萼寬度(圖8b)，以及糖萼寬度相對于健康對照的變化(圖8c)的函數(shù)。圖9.描繪了在用糖模擬化合物處理后，血管直徑作為在健康對照對象和糖尿病 對象中測量到的紅細胞寬度(圖9a)和糖萼寬度(圖9b)，以及糖萼寬度相對于健康對照的 變化(圖9c)的函數(shù)。發(fā)明詳述定義
本文中使用的單數(shù)形式的“a”、“an”和“the”包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指稱物兩者，除非上 下文明確表明不是這樣。本文使用的術(shù)語“包含(comprising)”、“包含(comprises) ” 和“包含(comprised of)” 與“包括(including)”、“包括(includes)"或“含有(containing) ”、“含有 (contains)，，同義，是包含性的或開放性的，不排除其他的、沒有列舉的成員、元素或方法步 驟。應(yīng)該認識到，本文中使用的術(shù)語“包含(comprising)”、“包含(comprises) ”和“包含
(comprised of)”包含了術(shù)語“由......構(gòu)成(consisting of)”、“由......構(gòu)成(consists)，，
和“由......構(gòu)成(consists of)”。由終點值所敘述的數(shù)字范圍包括相應(yīng)范圍內(nèi)包含所有的數(shù)字和分數(shù)，以及所敘述 的終點值。本文使用的術(shù)語“大約”當指稱可測量的值例如參數(shù)、量、持續(xù)時間等時，意味著包 含具體值的或距離具體值的+/-10%或以下的偏差，優(yōu)選+/-5%或以下，更優(yōu)選+/-1%或 以下，更優(yōu)選+/-0. 或以下，在此范圍內(nèi)這樣的偏差適合于在本文公開的發(fā)明中執(zhí)行。應(yīng) 該理解，修飾詞“大約”所指稱的值，本身也被具體地、優(yōu)選地公開。所有在本說明書中引用的文獻，在此以其全文引為參考。除非另有定義，否則所有在公開的發(fā)明中使用的術(shù)語，包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有 本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員通常理解的意義。作為進一步的指導(dǎo)，包含了術(shù)語的 定義以更好地理解本發(fā)明的講述內(nèi)容。術(shù)語“對象”或“患者”優(yōu)選指稱作為治療、觀察或?qū)嶒灥膶ο蟮膭游?，更?yōu)選為溫 血動物，更優(yōu)選為脊椎動物，更優(yōu)選為哺乳動物，具體來說包括人類和非人類哺乳動物。術(shù) 語“哺乳動物”包括任何照此分類的動物，包括但不限于人類，家畜和農(nóng)畜，動物園動物，運 動動物，寵物動物，伴侶動物和實驗動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、狗、貓、豚鼠、牛、奶牛、 綿羊、馬、豬和靈長動物，例如猴和猿。特別優(yōu)選的是人類對象，包括其兩種性別和所有年齡 范圍的。本文中使用的詞組例如“需要治療的對象”包括從給定病癥例如血管疾病或炎癥 的治療獲益的對象。這樣的對象可以包括但不限于已經(jīng)被診斷患有所述病癥的對象，傾向 于發(fā)生所述病癥的對象，和/或?qū)⒁谄渲蓄A(yù)防所述病癥的對象。術(shù)語“樣品”一般是指從生物學(xué)來源獲得的未純化或純化形式的材料。生物學(xué)樣品 典型情況下可以從其生物學(xué)來源，例如從感興趣的對象，通過用于體液、組織、細胞等的收 集、抽取、活組織檢查或切除等的適合的方法來獲得。在本發(fā)明中特別有用的樣品包括源自 于對象的全血、血漿、血清和尿液。生物學(xué)樣品可以被進一步加工，以制備其適合的衍生物， 例如但不限于細胞或組織裂解液、勻漿液、上清液、級份等。樣品可以被細分，以分離或富 集其在本發(fā)明的診斷方法中將要使用的部分(例如預(yù)計含有感興趣的被分析物的部分)。 因此，樣品可以直接用于本發(fā)明的方法，或者在使用前可以被加工、提取或純化到不同的程 度。疾病病癥正如在概述部分中提到的，本發(fā)明描述了在血管疾病和炎癥中特別有用的診斷、 預(yù)防和治療工具和方法。具體來說，血管疾病和炎癥可以通過糖萼的狀態(tài)進一步表征。本文使用的術(shù)語“血管疾病”是指任何影響血管系統(tǒng)，包括心臟和血管的疾病、紊亂或病癥。血管疾病包括但不限于心血管疾病，腦血管疾病，外周血管疾病、動脈粥樣硬化 和動脈硬化血管疾病。術(shù)語包含了癥狀發(fā)生前的血管病變以及引起明顯癥狀的血管機能障 礙。例如，術(shù)語包括了由于粉瘤和動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生所引起的血管狹窄、阻塞或動脈 瘤導(dǎo)致的癥狀發(fā)生前的以及有癥狀的血管機能障礙，以及由此產(chǎn)生的疾病和紊亂。血管疾 病的具體例子包括但不限于動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、冠心病(CAD)、心源性猝死、心 肌梗塞、局部缺血、中風(fēng)、外周血管疾病例如外周動脈阻塞性疾病(PAOD)、靜脈血栓栓塞和 肺栓塞。術(shù)語“易感性”在指稱疾病時，是指對象對疾病例如血管疾病的易感性、可能性、易 損性或傾向性。術(shù)語“炎癥”具有本技術(shù)領(lǐng)域中給它的定義。作為進一步的指導(dǎo)，該術(shù)語一般是指 在血管化組織中對由物理、化學(xué)和/或生物學(xué)試劑引起的細胞或組織損傷的應(yīng)答，在急性 形式中其特征為典型的疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅、腫脹和功能喪失的結(jié)果，并用作啟動有害因子和/ 或受損組織的消除、稀釋或隔離的機制。在組織學(xué)上，炎癥涉及一系列復(fù)雜的事件，包括小 動脈、毛細血管和小靜脈的膨脹，伴隨有滲透性和血流的增加，流體包括血漿蛋白的滲出， 和白細胞遷移到炎性病灶中。此外，術(shù)語包含由由外部物理或化學(xué)損傷或由生物學(xué)試劑例如病毒、細菌、真菌、 原生動物或后生動物寄生蟲感染引起的炎癥，以及似乎未受刺激而引起的、例如在不存在 可證實的損傷或感染的情況下發(fā)生的炎癥，對自身抗原應(yīng)答的炎癥(自體免疫炎癥)，對移 植的異種或同種異體細胞、組織或器官應(yīng)答的炎癥，對過敏原應(yīng)答的炎癥等。該術(shù)語涵蓋了 急性炎癥和慢性炎癥二者。此外，術(shù)語包含了局部或局部化炎癥，以及系統(tǒng)性炎癥，即一種 或多種炎癥過程不局限于特定的組織，而是在內(nèi)皮和/或其他器官系統(tǒng)中普遍發(fā)生。本文使用的術(shù)語“炎癥”具體涵蓋了包含炎性成分的病變，尤其包括局部和系統(tǒng) 性、以及急性和慢性炎性狀態(tài)、病癥或疾病。優(yōu)選但不是限制性的，術(shù)語可以是指任何下述 病癥-惡病質(zhì)，例如與癌癥或傳染性疾病例如AIDS有關(guān)的惡病質(zhì)；-革蘭氏陰性膿毒病，內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克，膿毒性休克綜合征，系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜 合征或多器官機能障礙綜合征(MODS)；-免疫接種；_移植物抗宿主病變，例如移植物抗宿主病(GVHD)或排斥移植的異種或同種異體 組織和器官，例如排斥同種異體骨髓或臍帶血移植物；-急性和慢性感染性和寄生性過程，例如病毒、細菌或真菌性感染，和原生動物或 后生動物寄生蟲，優(yōu)選包括腦型瘧或腦膜炎球菌性腦膜炎；-過敏性病癥，例如過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，哮喘，濕疹，蕁麻疫，接觸性皮炎， 系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(過敏性反應(yīng))或過敏性休克，更優(yōu)選選自過敏性鼻炎和哮喘；-慢性炎性病癥(一般包括一組不同種類的病癥，典型情況下涉及一種或多種炎 性過程，和/或在缺少可證實的原因例如感染或組織損傷的情況下先天性或適應(yīng)性免疫成 分的慢性或復(fù)發(fā)性局部或系統(tǒng)性活性)，和/或自身免疫疾病(一般涉及針對自身組織或 組織成分即自身抗原的免疫應(yīng)答，包括自身抗體應(yīng)答或細胞介導(dǎo)的應(yīng)答，也包括器官特異 性和非器官特異性自身免疫病癥。優(yōu)選情況下，這樣的病癥可以選自急性感染后腦脊髓炎(ADEM)；阿狄森氏??；阿茨海默病(AD)；關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎；抗磷脂抗體綜合征(APS)；再 生障礙性貧血；動脈粥樣硬化；自體免疫胃炎；自體免疫肝炎；自體免疫血小板減少癥；貝 切特?。桓篂a；皮肌炎；I型糖尿?。籌I型糖尿?。患易逍缘刂泻?；家族性冷誘導(dǎo)的自體炎 性綜合征；古德帕斯丘綜合征；痛風(fēng)；假性痛風(fēng)；格雷夫斯??；吉-巴綜合征(GBS)；橋本??； 遺傳性周期熱；特發(fā)性血小板減少性紫癜；炎性腸病(IBD)，包括克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎； 局部缺血_再灌注損傷；川崎病；混合結(jié)締組織病；穆_韋綜合征；多發(fā)性腦硬化(MS)；重 癥肌無力；眼球陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)；視神經(jīng)炎；萎縮性甲狀腺炎；骨關(guān)節(jié)炎；帕金森 癥(PD)；天皰瘡；惡性貧血；結(jié)節(jié)性多動脈炎；多肌炎；手術(shù)后或創(chuàng)傷性炎癥；原發(fā)性膽汁 性肝硬化；原發(fā)性黏液水腫；銀屑??；銀屑病關(guān)節(jié)炎；風(fēng)濕熱；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；賴特爾綜合 征；硬皮病；舍倫格綜合征；中風(fēng)-局部缺血；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎 系統(tǒng)性發(fā)作；多發(fā)性大動脈炎；顳動脈炎；白癲風(fēng)；溫抗體型自身免疫性溶血性貧血；和韋 格納肉芽腫。炎癥和炎性疾病和病癥，例如上面列出的，可以構(gòu)成或產(chǎn)生炎性激惹，能夠以不同 的易感性導(dǎo)致患者中的動脈粥樣化形成。更具體來說，本發(fā)明涉及診斷、預(yù)防和/或治療性工具和/或方法，在其特征為糖 萼的狀態(tài)改變，例如糖萼寬度和/或毛細血管體積儲備的變化的病癥中特別有用。更優(yōu)選 情況下，病癥選自但不限于癌癥，糖尿病例如I型糖尿病或II型糖尿病，腎衰竭，早發(fā)動脈 粥樣硬化，膿毒癥，高血壓，惡性高血壓，先兆子癇。體本文中使用的“糖萼”一般是指血管內(nèi)皮細胞腔表面上富含多糖的細胞外基質(zhì)。糖 萼主要包含蛋白多糖、糖胺聚糖和糖蛋白(例如選擇蛋白，粘附分子等)，它們在體內(nèi)與水 和來自循環(huán)血液的大量分子、尤其包括血漿蛋白、脂類和酶結(jié)合?！疤禽嗟臓顟B(tài)”是指特定時間點時糖萼的狀況，包括相對位置。糖萼的狀態(tài)可以由 糖萼的參數(shù)定性。術(shù)語“變化”在指稱糖萼的參數(shù)(例如體積或維度，寬度，滲透性，酶活性 等)時，一般包含了任何方向(例如增加或減少)和程度的這種變化。例如，參數(shù)值的“減 少”可以包括與相關(guān)參比值、例如所述參數(shù)在對照(健康)對象中的值相比，減少了至少大 約10 %，或至少大約20 %，或至少大約30 %，或至少大約40 %，或至少大約50 %，或至少大 約60 %，或至少大約70 %，或至少大約80 %，或至少大約90 %。例如，參數(shù)值的“增加”可以 包括與相關(guān)參比值、例如所述參數(shù)在對照(健康)對象中的值相比，增加了至少大約10%， 或至少大約20 %，或至少大約40 %，或至少大約60 %，或至少大約80 %，或至少大約100 %， 或至少大約150%或200%，或甚至至少大約500%等。應(yīng)該認識到，糖萼參數(shù)的變化導(dǎo)致糖 萼狀態(tài)的變化。更典型情況下，涉及糖萼退化的病癥，其特征為糖萼體積或維度的減小，糖萼滲透 性的增加，糖萼釋放的增加(即導(dǎo)致糖萼層厚度的降低)，糖萼降解酶類活性的增加和/或 糖萼合成酶類活性的降低。理想情況下，例如本文公開的治療性干預(yù)，將逆轉(zhuǎn)這些趨勢。術(shù)語“糖萼代謝的酶”一般包括參與糖萼或其一個或多個組分的合成代謝(即形 成)或分解代謝(即降解)的酶。優(yōu)選但不是限制性的，術(shù)語包括透明質(zhì)酸酶、髓過氧化物 酶、肝素酶和其他外切和內(nèi)切糖苷酶。正如指出的，有利情況下，內(nèi)皮糖萼的上述特征，可以通過在從對象獲取的樣品中檢測一種或多種與糖萼相關(guān)的標志物來確定。具體來說，這樣的標志物可以包括糖萼衍生 分子，糖萼代謝酶類，和/或正常情況下與糖萼結(jié)合的內(nèi)源或外源物質(zhì)。特別適合用于本文的檢測的糖萼衍生分子，包括但不限于透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝 素、硫酸皮膚素、多配體聚糖-1和總血漿糖胺聚糖(GAG)成分。一般來說，這些分子可能由 于進行中的糖萼降解或釋放而釋放到血流中，因此可以指示糖萼的退化性變化。特別適合用于本文的檢測的糖萼代謝酶，包括但不限于透明質(zhì)酸酶、髓過氧化物 酶、肝素酶和其他外切和內(nèi)切糖苷酶。例如，這些酶的循環(huán)水平的增加或降低，可以指示正 在進行的由它們催化的酶反應(yīng)，允許評估糖萼的體內(nèi)平衡。特別適合用于本文的檢測的內(nèi)源或外源糖萼結(jié)合物質(zhì)，包括但不限于糖萼滲透示 蹤分子，例如尤其是葡聚糖40，或正常情況下與糖萼結(jié)合的內(nèi)源凝集素樣蛋白。例如，可選 地在注射或灌注后，這些物質(zhì)的循環(huán)量說明了糖萼從血流中排除這些物質(zhì)的能力，從而可 以估計糖萼的體積或維度和分子可接近性。牛物傳感器正如提到的，本發(fā)明還涉及被構(gòu)建用于在從對象獲取的樣品中檢測一種或多種與 糖萼相關(guān)的標志物、例如上面定義的標志物的生物傳感器裝置，以及所述生物傳感器在本 發(fā)明的診斷方法中的應(yīng)用。本文使用的術(shù)語“生物傳感器”，一般是指利用一種或多種固定化的生物敏感材料 (例如受體，抗體，酶，底物，細胞器或全細胞)，在被分析樣品中檢測和/或定量一種或多種 所需感興趣的被分析物的器件或裝置。固定化的生物敏感材料與所述所需被分析物之間的 結(jié)合或化學(xué)反應(yīng)，被轉(zhuǎn)換成可檢測的物理、化學(xué)或生理化學(xué)信號。在優(yōu)選實施方案中，所述固定化的生物敏感材料可以是能夠與本文定義的糖 萼衍生分子、糖萼代謝酶或內(nèi)源或外源糖萼結(jié)合物質(zhì)特異性結(jié)合的受體，例如但不限于 肽、多肽、蛋白，抗體，適配子或肽模擬物。這種結(jié)合優(yōu)選可以表現(xiàn)出高的親和性，即具 有的親和性常數(shù)(Ka)為Ka彡1 X愈1，更優(yōu)選Ka彡1 X虛1，例如Ka彡1 X虛1， 更優(yōu)選Ka彡1 X愈1，更優(yōu)選Ka彡1 X虛1，例如Ka彡1 X IO1V, Ka彡1 X IO11M"1或 Ka彡IX IO12M-1,或甚至更高，其中Ka= [R_A]/[R][A]，R表示受體，A表示所需被分析物。在另一個實施方案中，所述固定化的生物敏感材料，可以是能夠被打算檢測的糖 萼代謝酶作用并化學(xué)改變的物質(zhì)。在另一個實施方案中，所述固定化生物敏感材料，是能夠作用并化學(xué)改變上面定 義的糖萼衍生分子或內(nèi)源或外源糖萼結(jié)合物質(zhì)的酶。本發(fā)明考慮到了任何用于將固定化生物敏感材料與所需被分析物之間的結(jié)合或 反應(yīng)轉(zhuǎn)換成可檢測信號，以及檢測所述信號的適合的方式。具體來說，本發(fā)明的產(chǎn)生的信號和生物傳感器裝置的相應(yīng)檢測器元件，可以利用 生理化學(xué)、光學(xué)(例如使用表面等離子體激光共振，或基于吸光值或熒光的變化)、壓電、電 化學(xué)(例如使用電極檢測氧化還原反應(yīng))、溫度測量或磁性檢測方式，但不限于此。生物 傳感器的通用設(shè)計和使用在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，可以適用于本發(fā)明的應(yīng)用(參見例如 《生物傳感器實用方法》(第二版)(Biosensors =APractical Approach, 2nd ed. ), Cooper J 禾口 Cass T 主編，Oxford UniversityPress 2003，ISBN 0199638462 ；以及《生物傳感器 理論與應(yīng)用》(Biosensors Theory and Applications), DG Buerk, TechnomicPublishingCompany 1993，ISBN 0877629757)，在此特別引為參考。Μ 正如在概述部分中進一步解釋的，本發(fā)明也考慮到了通過糖萼組成成分，或使用 糖萼分解代謝的酶的抑制劑，進行血管和炎性病癥或疾病、例如上面敘述的相應(yīng)疾病的治 療，或進行降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性的治療。術(shù)語“治療(treat)”或“治療(treatment) ”既包括對已經(jīng)發(fā)生的病癥的治療，例 如已經(jīng)發(fā)生的血管或炎性疾病的療法，又包括其目的在于預(yù)防或減少不想要的疾病發(fā)生的 機會，例如防止血管或炎性疾病感染和發(fā)展的機會的預(yù)防性或阻抑性措施。有益的或所需 的臨床結(jié)果可以包括但不限于緩解一種或多種癥狀或一種或多種生物學(xué)標志物(例如炎 性細胞因子，發(fā)燒，粉瘤等)，降低疾病的程度，穩(wěn)定(即不惡化)疾病的狀態(tài)，延遲或減緩疾 病的的發(fā)展，緩解或緩和疾病狀態(tài)等。“治療”也可以意味著與如果不接受治療所預(yù)期的存 活相比，延長存活。術(shù)語“預(yù)防有效量”是指在對象中抑制或延遲研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他臨床醫(yī) 師所查找的病癥的發(fā)作的活性化合物或藥劑的量。本文中使用的“治療有效量”是指在對 象中引發(fā)研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師所查找的生物學(xué)或醫(yī)藥學(xué)應(yīng)答，可以尤其包 括緩解待治療疾病或病癥的癥狀的活性化合物或藥劑的量。用于確定治療或預(yù)防有效劑量 的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的?？捎糜谠谏厦娑x的疾病狀態(tài)中預(yù)防和/或治療性修復(fù)糖萼的糖萼組成成分，包 括優(yōu)選但不限于糖胺聚糖，肝素、尤其包括分級的肝素，糖模擬物，透明質(zhì)酸合成途徑的底 物或中間體，以及木糖苷(它引發(fā)GAG合成)。在上面定義的疾病狀態(tài)的治療中可用作進行抑制的靶的糖萼分解代謝酶類，包括 優(yōu)選但不限于透明質(zhì)酸酶、髓過氧化物酶、肝素酶和其他外切和內(nèi)切糖苷酶。術(shù)語“抑制”包括了糖萼分解代謝酶類、特別是其糖萼降解酶活性的任何程度的 抑制，例如與不存在抑制劑的情況下所述酶的活性相比，抑制了至少大約10%，至少大約 20 %，至少大約30 %，至少大約40 %，至少大約50 %，至少大約60 %，至少大約70 %，至少大 約80 %，至少大約90 %，或甚至大約100 %。這種抑制的程度可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的測 定方法來測量。術(shù)語“抑制劑”一般是指能夠獲得所需靶、例如糖萼分解代謝酶的抑制的物質(zhì)或分子。本發(fā)明考慮到了任何類型的抑制劑，例如既包括可逆抑制劑，即非共價地與酶和/ 或酶_底物復(fù)合物結(jié)合的抑制劑，又包括不可逆抑制劑，即共價地改變通常位于酶的活性 位點中的一個或多個氨基酸的抑制劑。在可逆抑制劑中，本發(fā)明考慮到了但不限于競爭性 抑制劑、非競爭性抑制劑、混合型抑制劑、部分競爭性抑制劑和反競爭性抑制劑。本文中使用的抑制劑的適合的類型包括優(yōu)選但不限于多肽或蛋白；抗體；肽；肽 模擬物；適配子；化學(xué)物質(zhì)，優(yōu)選為有機分子，更優(yōu)選為有機小分子；脂類；糖類；核酸等。本文中使用的術(shù)語“有機化合物”或“有機分子”是指它們在本技術(shù)領(lǐng)域中的廣泛 內(nèi)涵。術(shù)語涵蓋了作為天然產(chǎn)物以及半合成或全合成的有機分子。本文中使用的術(shù)語“有機小分子”是指其尺寸與藥物中常用的有機分子相當?shù)挠?機化合物。術(shù)語排除了生物大分子(例如蛋白，核酸等)。優(yōu)選的有機小分子尺寸范圍最高大約5000Da，例如最高大約4000，優(yōu)選最高3000Da，更優(yōu)選最高2000Da，更優(yōu)選最高大約 lOOODa，例如最高大約900、800、700、600或最高大約500Da。術(shù)語“抗體”在本文中以其最廣義的含義使用，一般是指任何免疫結(jié)合劑。術(shù)語具 體來說涵蓋了完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個完整抗體形成的多價(例如2_、 3-或更多價)和/或多特異性抗體(例如雙或多特異性抗體)，以及抗體片段(包括例如 Fab, Fab'，F(xiàn) (ab ‘ ) 2，F(xiàn)v和scFv片段；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子)，只要它們表 現(xiàn)出所需生物學(xué)活性(具體為特異性結(jié)合目標抗原的活性)，以及這些片段的多價和/或多 特異性復(fù)合物(雙抗體、三抗體和多抗體)。術(shù)語“抗體”不僅包括通過包含免疫接種的方 法產(chǎn)生的抗體，而且包括任何多肽例如重組表達的多肽，它們被制造成含有至少一個能夠 與目標抗原上的表位特異性結(jié)合的互補性決定區(qū)(CDR)。因此，術(shù)語適用于這樣的分子，不 論它們是體外還是體內(nèi)生產(chǎn)的。本文使用的術(shù)語“適配子”是指能夠與靶分子例如蛋白或肽，更典型為肽特異性結(jié) 合的單鏈或雙鏈寡聚DNA、寡聚RNA或寡聚DNA/RNA，或其任何類似物。有利情況下，適配 子對它們的靶可以顯示出相當高的特異性和親和性(例如Ka在IXlO9M-1的級別)。適配 子的生產(chǎn)描述在尤其是US 5，270，163 ；Ellington & Szostak 1990 (Nature346 :818_822)； Tuerk & Gold 1990 (Science 249:505-510)；或Klussmann 主編的《適配子手冊功能性寡 核昔酸禾口它們的應(yīng)用》(The AptamerHandbook functional Oligonucleotides and Their Applications), Wiley-VCH 2006，ISBN 3527310592，在此特別引為參考。本文中使用的術(shù)語“肽模擬物”是指與相應(yīng)的肽拓撲學(xué)類似的非肽類試劑。合理 地設(shè)計肽的肽模擬物的方法，在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。例如，基于硫酸酯化的8聚體肽 CCK26-33的三種肽模擬物、基于11聚體肽底物P的兩種肽模擬物的合理設(shè)計以及相關(guān)的肽 模擬物設(shè)計原理，描述在Horwell 1995 (Trends Biotechnol 13:132-134)中，在此特別引 為參考。藥物劑型為了治療血管和/或炎性疾病，有利情況下，本發(fā)明的活性物質(zhì)，例如特別是糖萼組成成分和/或糖萼分解代謝酶的抑制劑，被配制成藥物劑型。這種藥物組合物優(yōu)選包含本發(fā)明的一種或多種活性物質(zhì)，或其可藥用的形式例如 N-氧化物形式，加成鹽，藥物前體，其溶劑合物或立體化學(xué)異構(gòu)體形式，以及一種或多種可 藥用載體/賦形劑。術(shù)語“可藥用的鹽”是指可藥用酸或堿的加成鹽?？伤幱盟峄驂A的加成鹽是指包 含本發(fā)明的活性物質(zhì)并能夠形成的有治療活性的無毒性酸和無毒性堿的加成鹽形式。具有 堿性性質(zhì)的本發(fā)明的活性物質(zhì)，可以通過將所述堿形式用適合的酸處理，轉(zhuǎn)變成它們的可 藥用酸加成鹽。適合的酸包括例如無機酸例如氫鹵酸，例如鹽酸或氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸 和類似的酸；或有機酸例如乙酸，丙酸，羥基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸(即 丁二酸)，馬來酸，延胡索酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，對甲基苯磺 酸，環(huán)己烷氨基磺酸，水楊酸，對氨基水楊酸，撲酸等酸。具有酸性性質(zhì)的本發(fā)明的活性物 質(zhì)，可以通過將所述酸形式用適合的有機堿或無機堿處理，轉(zhuǎn)變成它們的可藥用堿加成鹽。 適合的堿鹽形式包括例如銨鹽，堿和堿土金屬鹽，例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣的鹽等，與有機堿的 鹽，例如芐星青霉素、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明鹽，以及與氨基酸例如精氨酸、賴氨酸等的鹽。本文使用的“載體”或“賦形劑”包括任何和所有的溶劑，稀釋劑，緩沖液(例如中 性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水)，增溶劑，膠體，分散介質(zhì)，介質(zhì)，填充劑，螯合劑(例如EDTA 或谷胱甘肽)，氨基酸(例如甘氨酸)，蛋白，崩解劑，粘合劑，潤滑劑，潤濕劑，乳化劑，甜味 劑，著色劑，調(diào)味劑，增香劑，增稠劑，用于獲得儲庫效應(yīng)的藥劑，包衣，抗真菌劑，防腐劑，抗 氧化劑，張力控制劑，吸收延遲劑等。這些用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用，在本技 術(shù)領(lǐng)域中是公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性物質(zhì)不相容的情況下之外，它在治療 組合物中的應(yīng)用都可以考慮。用于配制藥物組合物的說明性的、非限制性的載體包括例如水包油或油包水乳 液，包含或不包含適合于靜脈內(nèi)(IV)使用的有機助溶劑的水性組合物，脂質(zhì)體或含有表面 活性劑的囊泡，微球，微珠和微粒體，粉末，片劑，膠囊，栓劑，水性混懸液，氣溶膠，以及其他 對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員來說顯而易見的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成用于基本上任何給藥途徑，例如但不限于經(jīng)口給 藥(例如經(jīng)口攝入或吸入)，鼻內(nèi)給藥(例如鼻內(nèi)吸入或鼻內(nèi)粘膜給藥)，腸胃外給藥(例如 皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或胸骨內(nèi)注射或灌注)，透過皮膚或透過粘膜(例如口、舌下、 鼻內(nèi))給藥，局部給藥，直腸、陰道或氣管內(nèi)滴注等。通過這種方式，通過本發(fā)明的方法和組 合物可以獲得的治療效應(yīng)，依賴于本發(fā)明的給定應(yīng)用的具體需要，可以是例如系統(tǒng)性的、局 部的、組織特異性的等。例如，對于口服給藥來說，藥物組合物可以配制成丸劑，片劑，涂漆片劑，包衣(例 如糖包衣)片劑，顆粒，硬明膠膠囊和軟明膠膠囊，水性、醇性或油性溶液，糖漿，乳液或混 懸液。在非限制性例子中，口服劑型的制備，可以通過將適合量的粉末形式的活性物質(zhì)，以 及可選地包含細分散的一種或多種固體載體，均勻地充分地混合在一起，并將混合物配制 成丸劑、片劑或膠囊，來適合地完成。示例性而非限制性的固體載體包括磷酸鈣，硬脂酸鎂， 滑石粉，糖類(例如葡萄糖，甘露糖，乳糖或蔗糖)，糖醇(例如甘露糖醇)，糊精，淀粉，明 膠，纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，低熔點蠟和離子交換樹脂。含有藥物組合物的壓縮片劑，可以 通過將活性成分與例如上面描述的固體載體均勻充分地混合以提供具有必需的壓縮性質(zhì) 的混合物，然后將混合物在適合的機器中壓制成所需的形狀和尺寸，來制備。模制片劑可以 通過在適合的機器中模制用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀活性物質(zhì)的混合物，來制造。用 于軟明膠膠囊和栓劑的適合的載體是例如脂肪、蠟、半固體和液體多元醇、天然油或硬化油寸。例如，對于口用或鼻用氣溶膠或吸入給藥來說，藥物組合物可以用說明的載體配 制，例如與鹽水、聚乙二醇或二醇、DPPC、甲基纖維素配制成溶液，或與粉狀分散劑混合，并 進一步使用苯甲醇或其他適合的防腐劑，用于增加生物利用度的吸附促進劑，氟烴，和/或 其他本技術(shù)領(lǐng)域中已知的增溶劑或分散劑，配制成混合物。用于以氣溶膠或噴霧劑形式給 藥的適合的藥物劑型，是例如本發(fā)明的活性物質(zhì)或它們的生理可耐受鹽，在可藥用溶劑例 如乙醇或水、或這些溶劑的混合物中的溶液、混懸液或乳液。如果需要，劑型也可以附加地 包含其他藥物輔助劑，例如表面活性劑、乳化劑和穩(wěn)定劑以及推進劑。作為說明，投送可以 使用一次性使用的投送裝置，煙霧噴霧器，呼吸激活的粉末吸入器，氣溶膠劑量計量式吸入 器(MDI)，或任何其他可以在本技術(shù)領(lǐng)域中使用大量噴霧器投送裝置。此外，也可以使用煙霧探桿或通過氣管內(nèi)管直接給藥。通過粘膜局部給藥的載體的例子依賴于具體的途徑，例如經(jīng)口、舌下、鼻內(nèi)等。當 口服給藥時，說明性的例子包括藥品級甘露糖醇、淀粉、乳糖、硬脂酸鎂、糖鈉、纖維素、碳酸 鎂等，其中甘露糖醇是優(yōu)選的。當鼻內(nèi)給藥時，說明性的例子包括聚乙二醇，磷脂，二醇和 糖脂，蔗糖和/或甲基纖維素，帶有或不帶有增量劑例如乳糖和防腐劑例如苯扎氯銨、EDTA 的粉末混懸液。在具體的說明性實施方案中，使用大約0.01-0. 2%的磷脂1，2_ 二棕櫚 酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)作為等滲水性載體，用于以大約0. 1到3. Omg/ml的濃度 鼻內(nèi)給藥本發(fā)明的活性物質(zhì)。例如，對于腸胃外給藥來說，藥物組合物可以有利地用適合的溶劑、稀釋劑、增溶 劑或乳化劑等配制成溶液、混懸液或乳液。適合的溶劑包括但不限于水，生理鹽水溶液或醇 類，例如乙醇、丙醇、甘油，以及糖溶液，例如葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖、蔗糖或甘露糖醇溶液，或可選 地提到的各種溶劑的混合物?？勺⑸淙芤夯蚧鞈乙嚎梢园凑宅F(xiàn)有技術(shù)配制，使用適合的無 毒性、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑，例如甘露糖醇、1，3_ 丁二醇，水，Ringer' s溶液或等 滲氯化鈉溶液，或適合的分散劑或潤濕劑和助懸劑，例如無菌、無刺激、不揮發(fā)油，包括合成 的單脂?；蚨８视王?，以及脂肪酸，包括油酸。本發(fā)明的活性物質(zhì)及其可藥用鹽也可以 冷凍干燥，獲得的冷凍干燥物可用于生產(chǎn)注射或灌注制劑。例如，用于靜脈內(nèi)使用的載體的 一個說明性的例子包括10% USP乙醇，40% USP丙二醇或聚乙二醇600，以及補足量的USP 注射用水(WFI)的混合物。其他用于靜脈內(nèi)使用的說明性載體包括10% USP乙醇和USP WFI ；0. 01-0. 三乙醇胺在USP WFI中；或0. 01-0. 2%二棕櫚酰二磷脂酰膽堿在USP WFI 中；以及1-10%鯊烯或腸胃外植物油在水中的乳液。用于皮下或肌肉內(nèi)使用的載體的說 明性例子包括磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液，5%葡萄糖在WFI中，和0.01-0. 三乙醇胺在含 5%葡萄糖或0.9%氯化鈉的USP WFI中，或10% USP乙醇、40%丙二醇和補足量的可接受 的等滲溶液例如5%葡萄糖或0. 9%氯化鈉的1比2或1比4的混合物；或0. 01-0. 2%二 棕櫚酰二磷脂酰膽堿在USP WFI和1到10%鯊烯或腸胃外植物油在水中的乳液中。在水性劑型是優(yōu)選的情況下，它可以包含一種或多種表面活性劑。例如，組合物可 以采用包含至少一種適合的表面活性劑、例如磷脂表面活性劑的膠束分散體的形式。磷脂 的說明性的例子包括二?；字８视?，例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DPMG)、二棕櫚酰磷 脂酰甘油(DPPG)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二?；字Ｄ憠A，例如二肉豆蔻酰磷脂 酰膽堿(DPMC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC) ；二酰基磷脂 酸，例如二肉豆蔻酰磷脂酸(DPMA)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)；以 及二?；字Ｒ掖及?DPME)，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)。典型情況下，水性劑型中表面活性劑活性物質(zhì)的摩爾比率將為大約10 1到大 約1 10，更典型為大約5 1到大約1 5，但是任何有效量的表面活性劑可用于水性劑 型中，以最好地適合于特定的所需目標。當采取栓劑的形式直腸給藥時，這些劑型可以通過將本發(fā)明的活性物質(zhì)與適合的 非刺激性賦形劑、例如可可脂、合成的甘油酯或聚乙二醇進行混合來制備，這些賦形劑在通 常溫度下是固體，但是在直腸空腔中液化和/或溶解，以釋放藥物。適合用于微膠囊、植入物或桿的載體，是例如乙醇酸和乳酸的共聚物。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認識到，上面的描述是說明性的而不是徹底的。事實上，許多其他的配制技術(shù)和可藥用賦形劑和載體溶液是本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員熟知的，開 發(fā)適合的配藥和治療方式，以將本文描述的具體組合物用于各種不同的治療方式中，也同 樣是公知的。本發(fā)明的活性物質(zhì)可以單獨或與本技術(shù)領(lǐng)域任何已知的血管疾病或炎性疾病療 法組合(“組合療法”)使用。本文考慮到的組合療法可以包含給藥至少一種本發(fā)明的活性 物質(zhì)和至少一種其他的藥物或生物活性成分。所述本發(fā)明的活性物質(zhì)和所述藥物或生物活 性成分，可以在相同的或不同的藥物劑型中，同時或以任何次序相繼給藥。可選地與待給藥的一種或多種其他活性化合物組合使用的本發(fā)明的活性物質(zhì)的 劑量或量，依賴于具體的情況，并且通常適應(yīng)于具體的環(huán)境，以獲得最適效應(yīng)。因此，取決于 待治療病癥的本質(zhì)和嚴重性，也取決于待治療人類或動物的性別、年齡、體重、總體健康、飲 食、給藥方式和時間，以及個體響應(yīng)性，取決于給藥途徑、使用的化合物的作用效能、代謝穩(wěn) 定性和持續(xù)時間，取決于療法是急性還是慢性還是預(yù)防性的，或取決于其他活性化合物是 否與本發(fā)明的藥劑一起給藥。非限制性的，依賴于疾病的類型和嚴重性，典型的每日劑量可以在從大約1 μ g/kg 到100mg/kg體重或以上的范圍內(nèi)，取決于上面提到的因素。對于長達幾天或以上的重復(fù)給 藥來說，依賴于病癥，治療持續(xù)到疾病癥狀的所需抑制發(fā)生為止。本發(fā)明的活性物質(zhì)的優(yōu)選 劑量可以在從大約0. 05mg/kg到大約10mg/kg體重的范圍內(nèi)。因此，可以向患者給藥一劑 或多劑大約0. 5mg/kg、2. 0mg/kg、4. Omg/kg或10mg/kg (或其任何組合)。這樣的劑量可以 間歇地給藥，例如每周或每三周。尺寸分布方法在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明人確定了用于評估糖萼狀態(tài)的方法。糖萼 的狀態(tài)可以使用尺寸分布方法進行評估，其中確定了單個毛細血管的內(nèi)皮糖萼維度或糖萼 寬度(GW)。此外，尺寸分布方法還為血管中紅細胞的寬度(RBCW)、血管直徑(VD)和毛細血 管體積儲備(CVR)提供了測量。本文中使用的“紅細胞寬度(RBCW) ”被定義為在血管的微動脈區(qū)段處紅細胞寬度 的多次測量的平均值。因為微動脈區(qū)段的特征是僅僅便于灌注排成一線的紅細胞(如圖4 中所示)，因此可以進行單個紅細胞寬度的測量。本文使用的“血管直徑(VD) ”被定義為灌注有排成一線的紅細胞的血管的微動脈 區(qū)段的直徑。本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在測量RBCW的過程中，少量百分比的紅細胞伸展 到內(nèi)皮腔內(nèi)膜上的糖萼結(jié)構(gòu)域中，而大多數(shù)時間中它們是不含紅細胞的。因此，RBCW的測 量也提供了許多延伸到糖萼結(jié)構(gòu)域中的測量值，因此提供了血管直徑的值。已經(jīng)顯示，在微 動脈區(qū)段處對紅細胞寬度(RBCW)的多次測量的最大值，為血管直徑(VD)提供了精確的測 量。本文中使用的“糖萼寬度(GW) ”是紅細胞寬度與血管直徑之間的縫隙的維度。因 為糖萼寬度(GW)是指每個毛細血管的內(nèi)皮糖萼的維度，因此它指示了糖萼的狀態(tài)。本文中使用的“毛細血管體積儲備(CVR) ”被定義為RBCWmax的二次冪與RBCW的 二次冪的比率。CVR可以按照下式定義
RBCWmsx2CVR--5~
RBCW2
9
當VD等于或大于單個RBC的最大寬度時，RBCffmax等于VD。在所有其他情況下，RBCffmax等于單個RBC的最大寬度。尺寸分布測量可以在使用臨床顯微鏡獲得的圖像上進行。在第一種情況下，對血 管進行可視化，并捕獲流過血管的紅細胞的連續(xù)圖像。對于每個圖像，測量可視化的紅細胞 的RBCW，并獲得尺寸分布。對于給定的血管，測量方法測量至少10個，優(yōu)選超過50、100、 250、500、1000、2500、5000個或以上的1 01值。這些值的測量顯示，少量百分比的紅細胞伸 展到內(nèi)皮腔內(nèi)膜上的糖萼結(jié)構(gòu)域中，而大多數(shù)時間中它們是不含紅細胞的。因此，尺寸分布 測量提供了統(tǒng)計學(xué)分布，其中大部分測量值提供了血管中實際的RBCW值，而只有少量百分 比的測量值提供了實際血管直徑的測量。因此，來自尺寸分布測量的P50值提供了血管中 實際的平均RBCW值，而p99值提供了對應(yīng)于血管直徑值的最大RBCW值。本文中使用的術(shù) 語“P50值”表示實際值有50%的機會可能低于所述值，并且實際值也有50%的機會可能高 于所述值。因此，“P50值”是指平均RBCW值或?qū)?yīng)于RBCW中值。本文中使用的術(shù)語“p99 值”表示實際值有99%的機會可能低于所述值，并且實際值有的機會可能高于所述值。 因此，"p99值”對應(yīng)于RBCW最大值，因此對應(yīng)于血管直徑。本文中使用的“平均(average) ”值是指被測量值的平均值(mean)、中值或眾值。 本文中使用的平均值(mean)是指數(shù)據(jù)組的算術(shù)平均值。本文中使用的中值是指將數(shù)據(jù)組 的較大一半與較小一半分隔開的數(shù)值。本文中使用的眾值(mode value)，是指在數(shù)據(jù)組中 出現(xiàn)頻率最高的值。從實際RBCW值和血管直徑的測量值，可以確定糖萼寬度(GW)，因為糖萼寬度等于 [血管直徑減去實際RBCW值]除以2。通過確定糖萼寬度，尺寸分布方法提供了糖萼的狀 態(tài)。糖萼的狀態(tài)可以通過按照給出的式確定CVR值進行進一步評估。因為CVR值提供 了關(guān)于血管直徑和糖萼寬度二者的信息，因此該值也可用于評估糖萼的狀態(tài)。在糖萼寬度 保持不變但血管直徑減小或增加的情況下，與糖萼寬度值相反，CVR值將提供關(guān)于糖萼的狀 態(tài)的甚至更精確的信息。這種方法的優(yōu)點在于本發(fā)明提供了不需要鑒定血管壁腔內(nèi)面的準確位置就能測 定糖萼狀態(tài)的策略。此外，它不需要使用白細胞誘導(dǎo)的RBC寬度的暫時變寬(參見圖4)。因此，本發(fā)明的測量方法允許在臨床以及實驗性活體顯微鏡記錄中所有成像的 RBC灌注微血管中，自動化地、非創(chuàng)性地評估微血管紅細胞寬度、血管直徑、糖萼寬度和毛細 血管體積儲備。本文使用的術(shù)語“非創(chuàng)性”是指不機械穿透也不破裂皮膚的步驟。因此，步驟不需 要在身體中切口或取出生物學(xué)組織。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在給定微血管中，只需要幾秒鐘的紅細胞灌注就允許分析紅 細胞寬度、血管直徑、糖萼寬度，以及毛細血管體積儲備。此外，所有給定視野中的微血管可 以同時進行分析，因此記錄單個視野只花費幾秒鐘，記錄多個視野可以在一或幾分鐘時間 內(nèi)完成。因此，本發(fā)明的測量方法在短時間內(nèi)提供了來自超過100根血管的紅細胞寬度、血 管直徑、糖萼寬度和毛細血管體積儲備的精確分布。更優(yōu)選情況下，微血管是指具有小的直徑的血管，優(yōu)選情況下直徑小于100 μ m, 1EVtik 7Jn T 50 μ m, Mitife/hT" 25 μ m>20 μ m> 19 μ m> 18 μ m> 17 μ m> 16 μ m> 15 μ m> 14 μ m>13 μ m、12 μ m、11 μ m、10 μ m、9 μ m、8 μ m、7 μ m, ^EiX^h^^M^Xi^ 10 μ m。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還涉及用于評估糖萼的狀態(tài)的方法，包括下列步驟(a)測量血管、優(yōu)選微血管中紅細胞的寬度(RBCW)；(b)從紅細胞寬度測量值的尺寸分布確定糖萼的寬度(GW)，由此評估糖萼的狀 態(tài)。在更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還涉及用于評估糖萼的狀態(tài)的方法，包括下列步 驟(a)測量血管、優(yōu)選微血管中紅細胞的寬度(RBCW)；(al)確定測量的RBCW的尺寸分布(b)從測量的RBCW的尺寸分布確定糖萼的寬度(GW)，由此評估糖萼的狀態(tài)。此外，在步驟(a)中獲得的測量值的尺寸分布，可以進一步用于確定毛細血管體 積儲備。根據(jù)本發(fā)明的方法，糖萼寬度可以被定義為(血管直徑(VD)減去紅細胞寬度 (RBCff))除以 2。毛細血管體積儲備可以被定義為當糖萼體積可以被紅細胞獲得時，最大血管血液 體積的比率，按照下式確定
Γ ^d RBCWmax2CVR=--
RBCW2 ,當VD等于或大于單個RBC的最大寬度時，RBCffmax等于VD。在所有其他情況下，RBCffmax等于單個RBC的最大寬度。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于評估糖萼的狀態(tài)的方法，包括下列步驟(a)測量血管、優(yōu)選微血管中至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000、2500或 5000個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000個血管，優(yōu)選微血管，重復(fù)步
驟(a)；以及(c)從紅細胞寬度測量值的尺寸分布確定糖萼的寬度，由此評估糖萼的狀態(tài)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于評估糖萼的狀態(tài)的方法，包括下列步驟(a)測量血管、優(yōu)選微血管中至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000、2500或 5000個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000個血管，優(yōu)選微血管，重復(fù)步
驟(a)；以及(bl)確定測量的RBCW的尺寸分布(c)從尺寸分布確定糖萼的寬度，由此評估糖萼的狀態(tài)。在有兩個實施方案中，本發(fā)明的方法附加地包括下列步驟(d)從紅細胞寬度測量值的尺寸分布確定毛細血管體積儲備。在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于評估糖萼狀態(tài)的方法包括下列步驟(a)測量第一個血管、優(yōu)選微血管中至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000、 2500或5000個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000個血管，優(yōu)選微血管，重復(fù)步驟(a)；(c)確定RBCs的最大寬度值和中值寬度值；以及(d)確定最大寬度值與中值寬度值之間的差值；其中所述差值確定了糖萼寬度，并評估了糖萼的狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，測量可以在幾分鐘內(nèi)進行，因此本 發(fā)明能夠?qū)κ芸氐拇碳ぷ鞒鲰憫?yīng)，檢測紅細胞寬度、血管直徑、糖萼寬度和毛細血管體積儲 備的動態(tài)變化。因此，本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)節(jié)糖萼狀態(tài)的化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方 式因子的方法，包括下列步驟(a)在存在和不存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的條件下，測量 血管中至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000,2500或5000個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000個血管，重復(fù)步驟(a)；以及(c)按照本發(fā)明的方法評估糖萼的狀態(tài)，其中在存在和不存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的條件下糖萼 狀態(tài)的差異鑒定調(diào)節(jié)糖萼的狀態(tài)的所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于篩選化合物的方法，包括下列步驟(a)在存在至少一種化合物的情況下，測量血管、優(yōu)選微血管中至少10個、優(yōu)選超 過 50、100、250、500、1000、2500 或 5000 個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000個血管，優(yōu)選微血管，重復(fù)步
驟(a)；(c)對于至少一種其他的化合物重復(fù)步驟(a)和(b)的測量；(d)在不存在化合物的情況下重復(fù)步驟(a)和(b)的測量，由此建立對照測量；以 及(c)在存在和不存在所述化合物的情況下評估糖萼的狀態(tài)并確定GW，以及可選的 RBCff, VD 禾口 CVR ；其中相對于使用的化合物和對照測量來評估糖萼的狀態(tài)，由此篩選所述化合物調(diào) 節(jié)糖萼狀態(tài)的能力。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定調(diào)節(jié)糖萼和/或毛細血管體積儲備的 化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的方法，所述方法包括a)將定義了在不存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的情況下至少 一個血管中紅細胞(RBCs)的平均寬度值的信息，導(dǎo)入到計算機程序中，b)將定義了在存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的情況下至少一 個血管中紅細胞(RBCs)的平均和最大寬度值的信息，導(dǎo)入到計算機程序中，c)評估在存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的情況下的GW，是否 與不存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的情況下的GW不同，以及d)鑒定在C)中被評估為陽性的化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語心血管風(fēng)險因子和生活方式因子是指一種或多種選自衰老、吸 煙、高血糖癥和血脂異常的風(fēng)險因子；和/或在患有一種或多種選自局部缺血_再灌注損 傷、1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、胰島素抗性、代謝綜合征、血脂異常、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、高血壓、癌癥、傳染病和創(chuàng)傷的風(fēng)險疾病的對象中。因此，一方面，本發(fā)明提供了用于在對象中診斷癌癥和糖尿病或?qū)Π┌Y和糖尿病 的易感性的方法，包括在所述對象中檢測糖萼狀態(tài)的變化。例如而非限制性的，在被診斷患 有癌癥或糖尿病的對象中糖萼狀態(tài)的變化，可以與沒有被診斷為患有癌癥或糖尿病或不具 有對癌癥或糖尿病易感性的對照對象或多個對象進行比較，以評估是否發(fā)生了可以指示病 理表型的顯著差異。在其他實施方案中，某些診斷方法可能需要在對象身體上進行。例如而非限制性 的，正如實施例中所示，通過活體顯微鏡記錄成像，在人類和其他對象中，測量第一個血管、 優(yōu)選微血管中至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000、2500或5000個紅細胞的寬度， 并對于至少10個、優(yōu)選超過50、100、250、500、1000個血管重復(fù)該測量。應(yīng)該指出，這種類型的活體顯微鏡記錄測量技術(shù)是簡單快速的診斷方法，不需要 包括注射與糖萼結(jié)合蛋白結(jié)合的熒光標記物或糖萼通透示蹤分子的有創(chuàng)性顯微鏡可視化 技術(shù)。應(yīng)該認識到，上述的診斷方法和治療性干預(yù)可以組合或同步使用，特別是用于有 利地對個體患者定制治療。例如，當如上所述的診斷測定方法確定了患者中糖萼的狀態(tài)明 顯改變時，隨后在所述患者中進行的治療可以旨在恢復(fù)糖萼的狀態(tài)。此外，本發(fā)明的診斷方法可用于即使在單個患者中，監(jiān)測任何用于恢復(fù)糖萼狀態(tài) 的治療性干預(yù)(例如本文公開的治療；或其他治療，例如尤其是在糖尿病患者中改進胰島 素敏感性的療法，癌癥患者中的肝素療法，現(xiàn)有的被設(shè)計用于在炎性疾病中改善內(nèi)皮功能 的治療方法等)，對糖萼的狀態(tài)而言的有效性。本發(fā)明的另一個實施方案涉及儲存在計算機可讀介質(zhì)或類似的獨立計算機裝置 上的計算機程序，被構(gòu)造用于(a)讀取RBCW分布數(shù)據(jù)；以及(b)根據(jù)本發(fā)明的方法確定糖萼的狀態(tài)，由此確定GW以及可選的RBCW、VD和CVR。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有數(shù)據(jù)的計算機裝置，數(shù)據(jù)包括通過使用本 發(fā)明的方法獲得的在至少一個血管中紅細胞的平均寬度值。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有編碼手段的計算機程序，適合用于執(zhí)行下 述步驟，其中所述程序在數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)上運行或執(zhí)行(i)包含本發(fā)明的方法步驟或(ii)用于從RBCs寬度分布數(shù)據(jù)確定GW以及可選的RBCW、VD和CVR的方法步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本文描述的計算機程序，其中將尺寸分布數(shù)據(jù) 和GW，以及可選的RBCW、VD和CVR值與標準值進行比較。優(yōu)選情況下，所述標準值通過從 數(shù)據(jù)庫檢索獲得。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)糖萼的化合物的方法，所述方法包 括(a)將定義了在不存在所述化合物的情況下至少一個血管中RBCW值的信息，導(dǎo)入 到計算機程序中，(b)將定義了在存在所述化合物的情況下至少一個血管中RBCW值的信息，導(dǎo)入到 計算機程序中，
(c)按照本發(fā)明的方法確定糖萼的狀態(tài)，(d)評估在存在所述化合物的情況下糖萼的狀態(tài)，是否與不存在所述化合物的情 況下糖萼的狀態(tài)不同，以及(e)鑒定在d)中被評估為陽性的化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及操作數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的方法(i)包含本發(fā)明的方法步驟或(ii)用于從RBCW分布數(shù)據(jù)確定紅細胞寬度、血管直徑、糖萼維度和/或毛細血管 體積儲備的方法步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，包含了執(zhí)行本發(fā)明的方法步驟 和/或用于從RBCs寬度分布數(shù)據(jù)確定紅細胞寬度、血管直徑、糖萼維度和/或毛細血管體 積儲備的方法步驟的手段。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及計算機可讀介質(zhì)，其上儲存由編碼手段，適合于 執(zhí)行本發(fā)明的方法的每個步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有數(shù)據(jù)的計算機裝置，數(shù)據(jù)包括通過使用本 發(fā)明的方法獲得的紅細胞寬度、血管直徑、糖萼維度、毛細血管體積儲備和/或RBCs寬度分 布數(shù)據(jù)。應(yīng)該指出，本發(fā)明的裝置能夠可視化和確定所有種類動物的糖萼的狀態(tài)，包括小 鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔等，而且也可以在人類中。可視化可以在身體的任何可以對血管進 行可視化的部位上進行，優(yōu)選在舌、耳、皮膚、甲皺、眼睛等上進行。上述的方面和實施方案得到了下列非限制性實施例的支持。
實施例實施例1本實施例證明了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)在人類中導(dǎo)致糖萼體積或維度的減小，并 且腫瘤壞死因子-a (TNFa)在該過程中發(fā)揮作用。具體來說，健康的男性志愿者靜脈內(nèi)接 受了低劑量的內(nèi)毒素，進行(η = 8)或未進行(η = 13)可溶性TNF α受體依那西普的預(yù)處 理。估算了基線處和內(nèi)毒素激惹后4小時時的全身性和微血管糖萼材料與方法研究設(shè)計研究了 21位健康的高加索男性志愿者。研究得到了阿姆斯特丹醫(yī)學(xué)中心學(xué) 術(shù)管理審查委員會(Institutional Review Board of the AcademicMedical Centre， Amsterdam)的批準，從所有志愿者獲得了書面同意書。參加者沒有心血管疾病史。對象不吸 煙。沒有使用任何藥物，在研究前一個月沒有任何發(fā)熱疾病。醫(yī)學(xué)史、身體檢查、常規(guī)實驗室 檢查、心電圖和胸部X-射線都正常并可比。所有實驗在禁食過夜后進行。在所有對象中進 行了基線測量，包括系統(tǒng)性糖萼體積、微血管糖萼厚度和生物化學(xué)。5天后，分配對象進行鹽 7jc (n-13)或依西普(η = 8 ；Enbrel 50mg, Wyeth Pharmaceuticals,Madison, NJ,USA) 肌肉內(nèi)注射。48小時后，所有對象接受靜脈內(nèi)內(nèi)毒素彈丸注射(lng/kg體重，UnitedStates Pharmacopeial Convention Inc， Rockville，MD， USA)。正如以前發(fā)表的，記錄了與內(nèi)毒 素血癥有關(guān)的臨床癥狀的發(fā)病、時間和嚴重性(Suffredini等，1999. J Infect Dis 172 1278-82)。在內(nèi)毒素注入后，定期測量生命指征，包括血壓、心率和體溫。在內(nèi)毒素注入后 大約4小時，與基線測量處于一天的同一時間，測量了系統(tǒng)性糖萼體積和微血管糖萼厚度。系統(tǒng)性糖萼體積的估算系統(tǒng)性糖萼體積按照以前發(fā)表的，通過從糖萼可滲透的示蹤劑葡聚糖Dextran 40的血管內(nèi)分布體積中減去循環(huán)血漿體積來估算(Nieuwdorp M等，2006. Diabetes 55: 480-6 ；Suffredini等，1999，同上)。循環(huán)血漿體積使用以前發(fā)表的方法進行計算(Orth等， 1998. AnesthAnalg 87 :1234_8)。標記的自體紅細胞的血管內(nèi)分布體積被用于定量循環(huán)血 漿體積。抽取血液，以l，330rpm離心5分鐘。然后將熒光素鈉(熒光素二鈉25%，250mg/ ml, AZUA Pharmacy, Amsterdam, theNetherlands)添力口至Ij紅細胞級份中，放置 5 分鐘。在 仔細清洗后，將標記的紅細胞重新懸浮在鹽水中，恢復(fù)到初始體積(60ml)并重新注入。隨 后，在注入后第4、5、6和7分鐘抽取血液。使用標記的紅細胞在總紅細胞池中的分數(shù)，來估 算循環(huán)紅細胞體積(Veky)。注射前未標記的紅細胞用作陰性對照。標記的紅細胞在血液中 的分數(shù)使用 FACScan 分析儀(FACS Calibur Becton Dickinson, Mountain View, USA) 測量。計數(shù)至少 100，000 個細胞。數(shù)據(jù)通過 Cellquest (BectonDickinson，San Jose, CA, USA)分析。在將肝素處理過的血液在5分鐘內(nèi)在Hettich-Haematokrit離心機(Hettich， Tuttlingen，Germany)中以10，OOOrpm離心后，測量血細胞比容(Ht)。循環(huán)血漿體積使用 下式從Veky和大血管Ht計算循環(huán)血漿體積=([I-HtJx VEEY)/Ht.葡聚糖 40(Rheomacrodex ；NPBI International, Emmercompascuum, the Netherlands)被用作探針，用于評估血管內(nèi)體積，這包含了糖萼區(qū)的體積。在注入葡聚 H 40 之前，注身寸 IOml 葡聚ft 1 (Promiten ；NPBIInternational, Emmer-compascuum, the Netherlands)藥丸以減弱過敏性反應(yīng)的風(fēng)險。靜脈內(nèi)注射IOOml葡聚糖40，然后在第5、7、 10、15、20和30分鐘重復(fù)取血樣。通過在將葡聚糖40葡萄糖聚合物水解后測量注入后樣品 中葡萄糖濃度的增加，來計算葡聚糖40的濃度(Van Kreel等，1998. Clin Chim Acta 275 71-80)。每個時間點的葡萄糖濃度使用己糖激酶方法評估一式兩份(Gluco-quant，Hitachi 917 ；Hitachi)。為了確定葡聚糖40的初始血管內(nèi)分布體積，通過測量到的葡聚糖40濃度 的指數(shù)擬合來估算注射時葡聚糖40的濃度。指數(shù)時間常數(shù)(τ [min])被用于確定葡聚糖 40的系統(tǒng)清除速度(τ -1HiirT1)。微血管糖萼的估算單個毛細血管中內(nèi)皮糖萼的厚度，通過舌下微循環(huán)的垂直偏振光譜(OPS)成像進 行測量(Cytometrics, Philadelphia, PA, USA)，正如以前所發(fā)表的(Nieuwdorp 等，2006，同 上；Nieuwdorp等，2006. Diabetes55 1127-32)。簡單來說，在5個獨立的毛細血管中，在毛 細血管白細胞通過之前和之后立即測量流動的紅細胞的寬度。在健康的毛細血管中，糖萼 通過將紅細胞與已知作為紅細胞排除區(qū)的內(nèi)皮腔內(nèi)表面相分離，限制了毛細血管血液的填 充。在穩(wěn)態(tài)條件下，該紅細胞排除區(qū)代表了限制內(nèi)皮糖萼最大可能厚度的上限。因為白細 胞暫時壓縮毛細血管內(nèi)皮糖萼，因此相應(yīng)的毛細血管紅細胞柱的暫時變寬可用于估計毛細 血管糖萼的維度(Han 等，2006. Journal of Fluid Mechanics 554:217-35)。使用 5x 物鏡 收集了以728X576像素尺寸記錄的圖像，提供了 325X放大倍數(shù)，幀頻為25/秒。圖像的 分析由單個觀察人員使用 ImagePro Plus (Media Cybernetics, Silverspring, MD, USA)進 行，他對于參加者的臨床詳細情況不了解。在自發(fā)的毛細血管白細胞通過之前和之后，使用數(shù)字測徑器測量了毛細血管解剖學(xué)直徑和流動紅細胞柱的寬度。對于每個參加者，測定了 至少5個毛細血管中糖萼的維度。計算這些結(jié)果的平均值，并用于進一步分析。此外，作為 毛細血管密度的指示，對每個視野的毛細血管數(shù)量進行了計數(shù)。獲取血樣和實驗室方法在基線測量時，以及在內(nèi)毒素注入后t = 0和1/2、1、3、4和24小時時，從對象抽 取血液樣品。離心后，將等分試樣在液氮中快速冷凍，儲存在-80°C。白細胞血漿濃度以及 亞分數(shù)在EDTA血漿中使用標準化的流式細胞分析測定。血漿CRP水平使用可商購測定試 劑測量(Roche，Switzerland)。血漿可溶性2型TNF α受體(STNFR2)水平使用酶聯(lián)免疫 吸附分析(ELISA)進行測量(R&D Systems Inc，Minneapolis，MN，USA)，作為有效的依那西 普給藥的標志物。由TNF α活性誘導(dǎo)的細胞因子血漿IL-6的水平，使用細胞測量珠陣列技 術(shù)(Cytometric BeadArray technique) (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)測量。凝血 酶原活化片段Fl+2 (Dade Behring, Marburg, Germany)通過ELISA測量，以估算凝血酶產(chǎn) 生。使用自動化定量乳膠顆粒免疫分析(Biomerieux，Durham，NC，USA)測量了 D-二聚體水 平，作為纖維蛋白形成和隨后的內(nèi)源性纖維蛋白溶解的反映。定量血漿透明質(zhì)酸通過ELISA 測量(Echelon Biosciences, Salt Lake City，UT，USA)，它測定了透明質(zhì)酸(包括低和高 分子量)總量。硫酸乙酰肝素在將血漿用肌動蛋白酶E (Sigma，St. Louis, MO, USA)預(yù)處理 后通過ELISA測量(SeikagakuCorporation，Tokyo, Japan)?？傃獫{透明質(zhì)酸酶活性使用 以前發(fā)表的方法進行少量改動來測定(24)。簡單來說，將CovaLink板(Nunc，Wiesbaden, Germany)用生物素化的透明質(zhì)酸(0. 2mg/mL, HyluMed 無菌IUO透明質(zhì)酸鈉，Genzyme Corp, Cambridge, MA, USA)包被。將血漿樣品稀釋800倍，添加到板中，在pH3. 7下在37°C 放置2. 5小時。使用牛透明質(zhì)酸酶(Sigma，St. Louis, MO, USA)制作標準曲線。透明質(zhì)酸 的剩余量通過與親禾口素一生物素復(fù)合物(Vectastain, VectorLaboratories, Burlingame, CA,USA)的結(jié)合，然后添加鄰苯二胺(OPD)和30% H2O2來測定。板在讀板器中在OD 492nm 測量。單核細胞流式細胞術(shù)步驟將全血樣品收集在無熱源肝素鋰試管中，然后與9倍體積的冰冷的紅細胞裂解緩 沖液溫育10分鐘，在4°C離心10分鐘。將剩余的細胞用冰冷的PBS洗兩次。為了進行流式 細胞術(shù)分析，將0. 5X IO6個細胞溫育在混合有抗體的FACS緩沖液中。按照制造商的推薦對 所有反應(yīng)試劑進行滴定，以獲得最適的結(jié)果。細胞表面染色使用熒光素異硫氰酸酯(FITC) 標記的小鼠抗人類⑶14抗體(IgG2a)，別藻藍蛋白(APC)標記的抗人類⑶18抗體(IgGl) 和藻紅蛋白(PE)標記的抗人類CDllb抗體(IgGl)和抗CD62L抗體(IgGl) (R&D Systems, San Jose, CA, USA)來進行。適合的同種型對照抗體被用于校正非特異性抗體結(jié)合。染色 后，將細胞洗滌，固定在4%聚甲醛中，通過流式細胞術(shù)使用FACSCalibur流式細胞儀進行 分析。數(shù)據(jù)使用 CellQuest 軟件(BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)分析。統(tǒng)計學(xué)分析所有值提供為平均值士SEM。內(nèi)毒素_鹽水和內(nèi)毒素_依那西普組之間基線特征 的差異通過獨立樣品T-檢驗進行分析。處理組內(nèi)的變化通過單向方差分析法進行分析。處 理組之間的變化通過雙向方差分析法(相互作用處理和時間)進行分析。系統(tǒng)性糖萼體積 和其他參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性使用spearman秩相關(guān)檢驗(雙側(cè)檢驗)來計算。P < 0. 05被認為代表了統(tǒng)計學(xué)顯著的差異。結(jié)果使用或不使用依那西普預(yù)處理情況下對內(nèi)毒素注入的臨床響應(yīng)在內(nèi)毒素注入之前，在鹽水與依那西普組之間沒有觀察到臨床特征的差異。內(nèi)毒 素注入和系統(tǒng)性糖萼體積測量耐受良好，沒有遇到嚴重的不利反應(yīng)。內(nèi)毒素注入引起特征 性的臨床癥狀，例如寒戰(zhàn)、頭痛、肌痛和惡心。這些癥狀在兩個組中都是暫時的，但是在鹽 水組中與依那西普組中相比，發(fā)生得更頻繁和更強烈(數(shù)據(jù)未顯示)。在依那西普預(yù)處理 后，STNFR2水平顯著增加(從1. 8士0. 2至Ij 520士34ng/mL，p < 0. 0001)，表明依那西普已有 效給藥。在內(nèi)毒素注入后4小時，依那西普組中血漿水平保持升高(646士83ng/mL)，在鹽 水組中STNFR2血漿水平僅受輕微影響(從2. 1 士0. 3到內(nèi)毒素注入后4小時的5. 2士0. 5， P < 0. 01)。在鹽水組中，內(nèi)毒素注入后4小時，血壓、心率和體溫顯著變化(收縮壓從 127 士 11 到 119 士 5mmHg，ns ；舒張壓從 67 士8 到 51 士9mmHg，ρ < 0. 01 ；心率從 59 士6 到 82士5，ρ < 0.01 ；以及體溫從 36.6士0. 5°C到 38. 3士0.4°C，ρ < 0. 01，所有參數(shù)都是與 基線相比)。依那西普減弱了這些變化(收縮壓從125士7到123士 lOmmHg，ns ；舒張壓 從 69士6 到 67士6mm Hg，ns ；心率從 62士4 到 69士3，ns ；以及體溫從 36. 6士0. 5°C 到 37. 3 士0. 5°C，ns，所有參數(shù)都是與基線相比)。依那西普減弱由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的糖萼擾動在兩個組之間比較了基線系統(tǒng)性糖萼的體積(鹽水組1. 6士0. 6對依那西普組 1.7士0.5升，ns)。在內(nèi)毒素注入后，鹽水組中系統(tǒng)性糖萼的體積顯著減小(到0.8士0.4升， ρ < 0. 01)，這主要是由于葡聚糖40分布體積的減小(4. 7士0. 6到4. 1 士0. 9升，ρ < 0. 05， 參見圖Ia和lb)。循環(huán)血漿體積增加(從3. 1 士 0.4到3. 3 士 0.7升，ρ <0.05)，并伴有血 細胞比容值的少量下降(0. 44士0. 03到0. 41 士0. 03%, ρ < 0. 01) 0此外，內(nèi)毒素導(dǎo)致葡 聚糖40的系統(tǒng)清除速度(τ -1)的兩倍的增加(從0. 008 士0. 005到0. 015 士0. OOSmirT1，ρ
<ο. 01)。依那西普減弱了由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的糖萼體積的喪失(到1. 1 士0. 2升，P < 0. 01)， 其基礎(chǔ)在于降低了葡聚糖40分布體積(4. 6士0. 6到3. 9士0. 5升，ρ < 0. 05)，而不影響循 環(huán)血漿體積(2. 9 士 0. 5到2. 8 士 0. 6升，ns)，血細胞比容值(0. 43 士 0. 02到0. 42 士 0. 02%， ns)或葡聚糖 40 的系統(tǒng)清除速度(0. 009士0. 002 到 0. 009士0. OOlmin-1, ns)。對于微血管糖萼來說，內(nèi)毒素注入導(dǎo)致鹽水組中微血管糖萼中值厚度的降低(從 1. 1到0.4 μ m，ρ <0.01，參見圖Ic和Id)。糖萼的喪失導(dǎo)致毛細血管血液填充的輕微增 加，正如由白細胞通過之前毛細血管紅細胞柱的寬度的增加(從4. 9 士 0. 2到5. 3 士 0. 3 μ m， ns)所反映的。此外，糖萼的喪失伴隨有毛細血管解剖學(xué)直徑的減小(從7.0士0.2到 6.2 士 0.3μπι，ρ < 0. 05) 0在內(nèi)毒素激惹后毛細血管密度顯著降低(從每個視野60 士 18 到44士 16，ρ < 0.01)，在依那西普預(yù)處理組中具有類似的變化(從59士7到43士 15，ρ
<0. 01)。內(nèi)毒素注入后糖萼成分的改變在內(nèi)毒素注入后第一個小時內(nèi)，鹽水組中糖萼釋放的標志物即血漿透明質(zhì)酸水平 顯著上升(從62士 18到85士24ng/mL，p < 0. 05)，而依那西普減少了由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的釋放 (從58士 13到46士 10ng/mL，p < 0. 05)(圖2a)。在內(nèi)毒素注入后4小時，鹽水組中血漿透 明質(zhì)酸酶活性顯著降低(與基線相比-56士20%，ρ <0.01)，而在依那西普組中透明質(zhì)酸酶活性沒有受到影響(與基線相比_8士 14%，ns ；圖2b)。值得注意的是，在內(nèi)毒素激惹后 4小時期間，硫酸乙酰肝素的血漿水平?jīng)]有顯著變化，不論對于何種預(yù)處理來說(鹽水組 從 5. 3 士 1. 1 到 5. 5 士 1. 2μ g/mL 對依那西普組從 5. 4 士 1. 3 到 5. 1 士 1. 0μ g/mL，ns，與基 線相比)。但是，在內(nèi)毒素注入24小時后，在鹽水組中血漿硫酸乙酰肝素水平增加得更多 (11. 2 士 2. 1 μ g/mL 對依那西普組的 7. 4士 1.5 μ g/mL，ρ <0.01)。依那西普處理降低了由TNF α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和凝結(jié)反應(yīng)在內(nèi)毒素激惹后，鹽水組中的炎性標志物升高(IL-6 從4. 2士6. 3到678士427pg/ mL, CRP 從0. 5 士 0. 4到26. 7 士 7. 6mg/L, ρ < 0. 01，與基線相比，參見圖3a禾口 3b)。依那西 普顯著降低了這種增加(IL-6 從4. 6士3. 1到127士98pg/mL，p < 0. 05，與基線相比，CRP 從0. 6士0. 4到16. 0士3. 4mg/L, ρ < 0. 01，與基線相比，圖3a和3b)。與此平行地，在內(nèi)毒 素后4小時，在兩個處理組中，與基線相比循環(huán)白細胞的數(shù)量加倍。對于內(nèi)毒素注入后白細胞的分化來說，在4小時時在鹽水組中觀察到了單核細胞 計數(shù)的76士29%的顯著下降(與基線相比ρ < 0.01)，而依那西普與51 士32%的程度較低 的下降相關(guān)(與基線相比P <0.05)。在兩個組之間，在CD14+單核細胞計數(shù)之間沒有區(qū)別 (27士 10對26士 13%，ns)。但是，在鹽水后與依那西普相比，⑶lib+/⑶18+(Mac-I復(fù)合物) 單核細胞計數(shù)較高(中值0. 82士0. 2對0. 65士0. l，p < 0. 01)。最后，在內(nèi)毒素后4小時， 在鹽水組中表達⑶62L+(L-選擇蛋白)的單核細胞的百分率降到最低，而在依那西普組中， 觀察到了增加(_8士37%對+66士42%，ρ < 0.05)。于此平行，從內(nèi)毒素激惹后3小時開始，鹽水組中由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的凝血酶的產(chǎn)生 和隨后的纖維蛋白溶解的標志物明顯增加(F1+2 從0. 3士0. 1到2. 8士 1. 5nmol/L, D- 二 聚體從· 2士0. 1到0. 4士0. lmg/L, ρ < 0. 05，與基線相比；圖3c和3d)，然而依那西普明 顯降低了這種增加(F 1+2 從0.3士0. 1到2. 1 士0. 9nmol/L，以及D-二聚體從0. 2士0. 1 到0. 3士0. lmg/L,ρ < 0. 05)。當將兩個組的基線和內(nèi)毒素注入后4小時的數(shù)據(jù)合并時，在 系統(tǒng)性糖萼體積與F1+2或D- 二聚體水平之間之間存在反相關(guān)性(分別為r = -0. 74和r =-0. 60，二者 ρ < 0. 01)。結(jié)論這些數(shù)據(jù)證明，部分由TNFa介導(dǎo)的炎性活性導(dǎo)致了內(nèi)皮糖萼的擾動。這種機制 造成了血管易感性的炎性誘導(dǎo)的增加。與本發(fā)明的數(shù)據(jù)相一致，本發(fā)明提供了炎性和血管 疾病的診斷和治療方法，包括檢測和調(diào)節(jié)糖萼的健康。實施例2本實施例提供了本發(fā)明的方法和兩種現(xiàn)有技術(shù)的方法之間的比較例。本發(fā)明的方 法與(1)其中使用了由白細胞誘導(dǎo)的RBC寬度的暫時變寬的現(xiàn)有技術(shù)方法，以及(2)其中 使用了示蹤劑評估糖萼狀態(tài)的現(xiàn)有技術(shù)方法進行了比較(參見圖4)。本發(fā)明的方法(圖4A和4C)通過執(zhí)行確定了紅細胞寬度(RBCW)、血管直徑(VD)、 毛細血管體積儲備和糖萼寬度(GW)的尺寸分布測量，測量了灌注有紅細胞(3)的單個毛細 血管⑴中內(nèi)皮糖萼⑵的狀態(tài)。對于進行單個測量來說，血管需要可視化5秒，其中在至 少10個血管中進行了超過100個RBCW測量。通過可視化大約1分鐘，測量的數(shù)量可以增 加至少10倍。測量的RBCW值的尺寸分布能夠精確地評估糖萼的狀態(tài)。2.1由白細胞誘導(dǎo)的RBC寬度的短晳變寬
基于白細胞誘導(dǎo)的RBC寬度的短暫變寬的現(xiàn)有技術(shù)方法(圖4B)，在所有可視化血 管中每次測量測量了大約2個白細胞，因此在收集到足夠確定糖萼狀態(tài)的數(shù)據(jù)之前，需要 至少10分鐘的可視化時間。此外，應(yīng)該指出，這種類型的測量只能夠在稀少的允許白細胞 (4)通過的血管上進行。對于小血管例如微血管來說，需要極其長的可視化時間。首先，使用這種方法獲得的糖萼寬度的數(shù)據(jù)，可以與使用本發(fā)明的方法進行的測 量相比。但是，應(yīng)該指出，本發(fā)明的數(shù)據(jù)相對于現(xiàn)有技術(shù)的方法，誤差容限較小，即百分置信 度較高。這可以由個體白細胞寬度的差異來解釋。其次，使用本發(fā)明的方法，與基于白細胞誘導(dǎo)的RBC寬度的短暫變寬的現(xiàn)有技術(shù) 方法相比，數(shù)據(jù)的獲得快10-100倍。2. 2示蹤劑方法使用在血流中添加示蹤劑，進行了現(xiàn)有技術(shù)的糖萼狀態(tài)的測量。該方法需要從患 者獲取血液，將血液在患者外部標記，并將標記的血液注入患者。幾小時，通常4小時后，從 患者抽取血液并分析。該分析提供了關(guān)于糖萼狀態(tài)的信息。與本發(fā)明的方法相比(1)該現(xiàn)有技術(shù)方法是非常勞動密集的，花費長時間；(2)該現(xiàn)有技術(shù)方法對于患者來說是非常令人不快的。事實上，某些患者對示蹤劑 發(fā)生了過敏反應(yīng)，將患者的生命置于危險之中。(3)此外，因為某些較小的血管只允許被紅細胞有限灌注，因此該現(xiàn)有技術(shù)方法只 能提供可能不精確的糖萼狀態(tài)的一個測量。實施例3本實施例證明了通過本發(fā)明的方法確立糖萼的狀態(tài)，能夠快速檢測糖萼狀態(tài)的變 化。材料與方法通過執(zhí)行尺寸分布測量，從而確定紅細胞寬度(RBCW)、血管直徑(VD)、毛細血管 體積儲備和糖萼寬度(GW)，測量了單個毛細血管中內(nèi)皮糖萼的狀態(tài)。使用MicroScan視頻 顯微鏡系統(tǒng)(MicroVision Medical, The Netherlands)，獲得了臨床舌下視頻顯微圖像。系 統(tǒng)是手持式視頻顯微鏡，具有LED照明，裝備有5x放大倍數(shù)。為了改善紅細胞速度的評估， 引入了頻閃觀測照明。系統(tǒng)具有標準視頻輸出(PAL或NTSC)，與AD捕獲裝置相連，以便將 圖像轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號，直接記錄到計算機硬盤驅(qū)動器上。這里，紅細胞寬度(RBCW)被呈現(xiàn)為在便于單排紅細胞注入的微血管區(qū)段處進行 的紅細胞寬度的多次測量的中值。血管直徑(VD)是在便于單排紅細胞注入的微血管區(qū)段 處進行的紅細胞寬度的多次測量的最大值或P99值，糖萼寬度是紅細胞寬度與血管直徑之 間的間隙的維度。毛細血管體積儲備(CVR)是(VD)~2/(RBCW)~2的比率。通過執(zhí)行尺寸分布測量，從而從臨床顯微鏡獲得的圖像確定RBCW，確定了糖萼的 狀態(tài)。對于測量來說，使用了直接從給定血管中紅細胞柱寬度的連續(xù)測量值推演紅細胞寬 度、血管直徑、糖萼寬度和毛細血管體積儲備的本發(fā)明的新算法。該方法分析了給定血管中 超過1000個RBCW值的分布，從而顯示出很少百分比的RBCW測量延伸到了內(nèi)皮腔內(nèi)膜上的 糖萼結(jié)構(gòu)域中，該結(jié)構(gòu)域中一般不包含RBCs。在給定的微血管中，只需要幾秒鐘的RBC灌 注，就允許分析糖萼的狀態(tài)，并且給定視野中所有的微血管被同時分析。記錄單個視野只花費數(shù)秒，多個視野的記錄在一分鐘或幾分鐘內(nèi)完成。結(jié)果，獲得了來自100個以上血管的紅 細胞寬度、血管直徑、糖萼寬度和毛細血管體積儲備的精確分布。結(jié)果在舌下噴灑三硝酸甘油酯處理的對象與未處理的對照對象之間，比較了糖萼狀態(tài) 的測量值。舌下噴灑三硝酸甘油酯提供了受控的刺激，因為已知三硝酸甘油酯引起糖萼的 損傷。如圖5a和5b中所示，可以在處理和未處理對象的糖萼狀態(tài)之間看到明顯的區(qū)別。如 在本實施例中進行的糖萼狀態(tài)的動態(tài)變化的檢測，可以在幾分鐘內(nèi)進行檢測。糖萼的狀態(tài) 與RBCW直接相關(guān)(圖5a對5b)。結(jié)果還顯示，只分析100個RBCs，提供了類似的結(jié)果。結(jié)論這些數(shù)據(jù)證明，可以使用本發(fā)明的方法進行糖萼的狀態(tài)的檢測。此外，顯示出本發(fā) 明的方法提供了檢測糖萼狀態(tài)的動態(tài)變化的快速和準確的方法。實施例4本實施例證明了通過使用實施例2中描述的方法建立糖萼的狀態(tài)，本發(fā)明能夠區(qū) 分癌癥和健康對照情況下糖萼的狀態(tài)。結(jié)果在被診斷患有癌癥的對象與健康對照對象之間，比較了糖萼狀態(tài)的測量。如圖6a 和6b中所示，可以在健康和癌癥對象的糖萼狀態(tài)之間看到明顯的區(qū)別。如在本實施例中進 行的糖萼狀態(tài)的動態(tài)變化的檢測，可以在幾分鐘內(nèi)進行檢測。在用VEGF受體抑制化合物治療診斷的對象后，該治療的效果可以被可視化，如圖 7a禾口 7b中所示。結(jié)論這些數(shù)據(jù)證明，糖萼的狀態(tài)可用于診斷對糖萼的損傷，在本實施例中損傷由癌癥 引起。此外，可以評估使用特定化合物治療癌癥的效果。實施例5本實施例證明了通過使用實施例2中描述的方法建立糖萼的狀態(tài)，本發(fā)明能夠區(qū) 分糖尿病和健康對照情況下糖萼的狀態(tài)。此外，也可以評估治療的效果。21名不吸煙，患有2型糖尿病，沒有大血管疾病的明顯病征的男性患者，被用作糖 尿病組，其中大血管疾病的明顯病癥被定義為在身體檢查時的心肌梗塞、中風(fēng)、外周血管疾 病史，或大血管疾病的病征。13名血糖正常、不吸煙、健康的男性對象，用作對照組。結(jié)果在被診斷患有糖尿病的對象(沒有微蛋白尿)和健康對照對象之間，比較了糖萼 狀態(tài)的測量。如圖8a和8b中所示，可以在健康和糖尿病對象的糖萼狀態(tài)之間看到明顯的 區(qū)別。正如在本實施例中進行的糖萼狀態(tài)的動態(tài)變化的檢測，可以在幾分鐘內(nèi)進行檢測。在用糖模擬物化合物治療經(jīng)診斷的對象后，該治療的效果可以被可視化，如圖9a 和9b中所示。結(jié)論這些數(shù)據(jù)證明，糖萼的狀態(tài)可用于診斷對糖萼的損傷，在本實施例中損傷由糖尿 病引起。此外，可以評估使用特定化合物治療糖尿病的效果。
權(quán)利要求
用于評估糖萼的狀態(tài)的方法，包括下列步驟(a)測量血管中至少10個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個血管重復(fù)步驟(a)；以及(c)從紅細胞寬度測量值的尺寸分布確定糖萼的寬度，由此評估糖萼的狀態(tài)。
2.權(quán)利要求1的方法，附加地包括下列步驟(d)從紅細胞寬度測量值的尺寸分布確定毛細血管體積儲備。
3.用于鑒定調(diào)節(jié)糖萼狀態(tài)的化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的方法，包括下 列步驟(a)在存在和不存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的條件下，測量血管 中至少10個紅細胞的寬度；(b)對于至少10個血管重復(fù)步驟(a)；(c)按照權(quán)利要求1或2的方法評估糖萼的狀態(tài)，其中在存在和不存在所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子的條件下糖萼狀態(tài) 的差異鑒定調(diào)節(jié)糖萼的狀態(tài)的所述化合物、心血管風(fēng)險因子或生活方式因子。
4.儲存在計算機可讀介質(zhì)或類似的獨立計算機裝置上的計算機程序，被構(gòu)造用于(a)讀取RBCW分布數(shù)據(jù)；以及(b)根據(jù)權(quán)利要求1到3任何一項的方法確定糖萼的狀態(tài)。
5.用于在對象中診斷血管疾病或?qū)ρ芗膊〉囊赘行缘姆椒?，包括在所述對象中檢測 糖萼的體積或維度、糖萼的滲透性、糖萼的釋放、和/或糖萼代謝的一種或多種酶的活性的變化。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述診斷在下述對象中進行(a)具有炎性狀況或疾病的對象；(b)具有一種或多種選自衰老、吸煙、高血糖癥和血脂異常的風(fēng)險因子的對象；和/或(c)患有一種或多種選自局部缺血-再灌注損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、胰 島素抗性、代謝綜合征、血脂異常、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、高血壓、癌癥、傳染病和 創(chuàng)傷的風(fēng)險疾病的對象。
7.用于在對象中診斷對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性的方法，包括在所述對象中檢 測糖萼的體積或維度、糖萼的滲透性、糖萼的釋放，和/或糖萼代謝的一種或多種酶的活性 的變化。
8.權(quán)利要求5或6任何一項的方法，其中確定所述糖萼的體積或維度、糖萼的滲透性、 糖萼的釋放，和/或糖萼代謝的一種或多種酶的活性的測量，在從對象取出的樣品上進行。
9.權(quán)利要求8的方法，包括在所述樣品中檢測下列物質(zhì)的存在和/或濃度糖萼衍生 的分子，包括寡糖或多糖，糖胺聚糖，透明質(zhì)酸，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖；催化糖萼合成代 謝或分解代謝的酶，包括透明質(zhì)酸酶，髓過氧化物酶，肝素酶和其他外切和內(nèi)切糖苷酶；和 /或內(nèi)源或外源糖萼結(jié)合物質(zhì)，包括一般與糖萼結(jié)合的內(nèi)源凝集素樣蛋白。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述檢測通過生物傳感器裝置進行。
11.一種生物傳感器裝置，被構(gòu)造用于檢測下列物質(zhì)的存在和/或濃度糖萼衍生的分 子，包括寡糖或多糖，糖胺聚糖，透明質(zhì)酸，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖；催化糖萼合成代謝或 分解代謝的酶，包括透明質(zhì)酸酶，髓過氧化物酶，肝素酶和外切和內(nèi)切糖苷酶；和/或內(nèi)源或外源糖萼結(jié)合物質(zhì)，包括一般與糖萼結(jié)合的內(nèi)源凝集素樣蛋白。
12.試劑盒，包括權(quán)利要求11的生物傳感器裝置，以及可選的一種或多種緩沖液、反應(yīng) 試劑、校準被分析物、陽性和/或陰性對照，和/或使用說明書。
13.糖萼組成成分在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療血管疾病或炎性疾病，或用 于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性。
14.糖萼分解代謝的酶的抑制劑在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療血管疾病或 炎性疾病，或用于降低對炎性激惹的致動脈粥樣化易感性。
全文摘要
本發(fā)明涉及在影響血管健康的疾病和炎性疾病中特別有用的診斷和治療工具及應(yīng)用。具體來說，所述診斷和治療工具利用了內(nèi)皮糖萼的適當檢測或調(diào)節(jié)。
文檔編號G01N33/68GK101918845SQ200880118620
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者埃里克·舒爾德·赫拉德·斯特羅斯, 漢斯·芬克 申請人:馬斯特里赫特大學(xué);馬斯特里赫特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心