專利名稱：：一種豬囊蟲病金標(biāo)快速診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測豬囊蟲病(Cystkercosis)的快速診斷試劑以及這種快速診斷試劑的制備方法。本發(fā)明的這種診斷試劑是一種膠體金檢測試紙條。
背景技術(shù)：
：豬囊蟲病(Cysticercosis)是由豬帶絳蟲(faem'aso/!'wm)的幼蟲一豬囊尾蚴(C""creAro^c^/"/osae)寄生于人或豬、野豬等中間宿主而引起的一種食源性人獸共患寄生蟲病。該病在世界范圍內(nèi)普遍存在，在中國大部分地區(qū)是一個重要的公共衛(wèi)生問題。在我國該病被列為肉類進(jìn)出口、屠宰動物以及我國政府提出讓人民吃上"放心肉"必檢的人獸共患病。據(jù)衛(wèi)生部2004年完成的全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查顯示，全國帶絳蟲的平均感染率為0.28%，較1990年完成的全國人體寄生蟲分布調(diào)查發(fā)現(xiàn)的0.18%上升了52.47%,推算全國帶絳蟲感染的人數(shù)為55萬，其中囊蟲病調(diào)査了96008人，陽性率達(dá)0.58%。囊蟲寄生于人體的肌肉和各組織器官對人的健康產(chǎn)生危害，通常引發(fā)癲癇發(fā)作、顱壓增高、精神障礙、失明等癥狀，如不及時治療或治療不當(dāng)往往會使人致殘甚至危及生命。另外囊蟲病還制約著養(yǎng)豬業(yè)及肉食品加工業(yè)的發(fā)展。目前為止，國內(nèi)普遍采用宰后剖檢或免疫學(xué)方法檢測血清中的循環(huán)抗體來實(shí)現(xiàn)豬囊蟲病的檢疫。其中血清學(xué)檢測用抗原均來源于囊液或蟲體抗原，存在的突出問題是蟲體的采集受到客觀條件的限制(如獲得途徑困難，來源短缺，數(shù)量有限)，純化抗原的制備繁瑣，數(shù)量及特異性和敏感性降低，在血清學(xué)試驗(yàn)中常易于出現(xiàn)假陽性和假陰性的問題。利用基因工程重組抗原制備診斷試劑是解決囊蟲病免疫診斷的一種理想途徑。囊蟲大分子蛋白在診斷中由于與其它絳蟲有交叉反應(yīng)，特異性低，因而目前主要側(cè)重于低分子量蛋白(通常小于30ku)囊蟲診斷抗原的研究，如8ku蛋白，參見KathyHancock,AzraKhan，F(xiàn)atimaB.Williams,Wa/.Characterizationofthe8-KilodaltonAntigensofraem.aso/ZwrnMetacestodesandEvaluationofTheirUseinanEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayforSerodiagnosis[J].JournalofClinicalMicrobiology.2003,41(6):2577-2586，1Oku蛋白，參見ChungJY,BahkYY，HuhS，"a/.Arecombinant1OkDaproteinofT^rew'aso/z'訓(xùn)metacestodesspecifictoactiveneurocysticercosis[J].TheJournalofInfectiousdisease,2000，181(5):1870-1872，14ku蛋白，參見MarciaRamosMonteirodaSilva，Ant6nioAugustoMendesMaia，da/.Recombinantexpressionof7^ew/aso/Z畫TS14antigenanditsutilizationforimmunodiagnosisofneurocysticercosis[J].ActaTropica,2006，100(3):192-198，24ku蛋白，參見KathyHancock,SowmyaPattabhi，F(xiàn)atimaW,e/1CharacterizationandcloningofT24，a7^ew/aso/Z謹(jǐn)antigendiagnosticforcysticercosis[J].MolecularandBiochemicalParasitology,2006,147(1):109-117等。囊蟲病的生前診斷很困難，現(xiàn)有的免疫學(xué)診斷方法如間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶聯(lián)免疫印漬(ELIB)等方法在操作程序上和適應(yīng)性方面存在一定的不足，如ELISA檢測對檢測設(shè)備、環(huán)境條件、操作技能要求較高，同時還受檢測周期長、小批量檢測成本高等因素的限制，目前還難于在生豬屠宰企業(yè)中推廣應(yīng)用。為此，尋找一種簡便、快速、準(zhǔn)確、可實(shí)施現(xiàn)場操作的檢測方法，是有效實(shí)施畜產(chǎn)品安全監(jiān)管和確保這些法律法規(guī)實(shí)施的一個重要技術(shù)保障。膠體金免疫層析技術(shù)是近十多年來迅速發(fā)展的一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)、層析分析技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的一種新型體外診斷技術(shù)。它具有簡單快速、結(jié)果明確、無需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，并有"濃縮的ELISA"之稱，己成為臨床及檢疫診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個新方向。該技術(shù)是在免疫滲濾技術(shù)基礎(chǔ)上建立而成，它只是將原來的縱向滲濾作用改為橫向?qū)游鲎饔?，但正是這一改進(jìn)帶動了定性診斷試劑的革命。國內(nèi)應(yīng)用膠體金技術(shù)檢測豬囊蟲病的報道主要有張洪花等(張洪花,王昌源,葛凌云等.金標(biāo)特異抗原單克隆抗體斑點(diǎn)免疫金染色用于檢測腦囊蟲病循環(huán)抗原的研究[J]中國寄生蟲病防治雜志.1994，7(1):35-37.)應(yīng)用金標(biāo)記豬囊蟲囊液抗原，利用單克隆抗體檢測腦囊蟲患者腦脊液中的循環(huán)抗原，陽性率可達(dá)88.09%。劉玉冰(劉玉冰，徐宏秀，王昌源等.金標(biāo)免疫滲濾法在腦囊蟲病診斷中的應(yīng)用[J〗地方病通報.2001,16(2):11-13.劉玉冰，張洪花，徐洪秀，等.滴金免疫測定法用于檢測囊蟲病患者循環(huán)抗原的研究[J].中國人獸共患病雜志.2002,18(2):84-86.)應(yīng)用抗豬囊蟲囊液抗原的2株單抗，建立了金標(biāo)免疫滲濾法，檢測腦脊液中的循環(huán)抗原，陽性率達(dá)77.893.75%;后來又建立了金標(biāo)免疫層析法，檢測活動性腦囊蟲病人血清陽性率達(dá)80.77%，非活動性腦囊蟲病人血清陽性率達(dá)55%。于庭等(于庭，劉素舫，黃晶，等.快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測血清中囊蟲抗體的研究[J].中國公共衛(wèi)生.2000，16(12):1139-1140.)用金標(biāo)法與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對比檢測57份囊蟲患者血清標(biāo)本，2法均為陽性的54份，2法均為陰性的l份，總符合率為95%。黃炳成等(黃炳成，李桂萍，賈鳳菊，等.金標(biāo)抗人單抗浸測實(shí)驗(yàn)對腦囊蟲病診斷與療效評價的研究[J].中國寄生蟲病防治雜志.2000,13(4):273-275.)用金標(biāo)抗人IgG4單抗檢測活動性腦囊蟲病患者80例，陽性率為91.3%;檢測非活動性患者19例，2例陽性。袁建華等(袁建華，甘紹伯，陳志勇.囊蟲IgG膠體金診斷試劑盒(層析法)的研制和考核[J].中國人獸共患病雜志.2001,17(6):59-61.)在國內(nèi)外率先開發(fā)成功用于囊蟲病診斷的IgG金標(biāo)層析法(一步法)診斷試劑盒，經(jīng)臨床考核其敏感性為93.23%，特異性為97.37%，該試劑盒檢測包蟲血清的交叉反應(yīng)率為45%,與血吸蟲、肝吸蟲、肺吸蟲等寄生病人血清無交叉反應(yīng)。唐雨德等(唐雨德，周東明，陸承平.快速檢測豬囊蟲抗體的金免疫層析法的建立及應(yīng)用[J].中國人獸共患病雜志.2003,19(5):77-79.)建立了快速檢測豬囊蟲抗體的金免疫層析法，以ELISA為對照，兩者檢測囊蟲抗體的相符率達(dá)96.8%。以上方法均提示免疫膠體金快速診斷法簡便、快速、適于基層推廣應(yīng)用，可用于囊蟲病的診斷及流行病學(xué)調(diào)查。中國發(fā)明專利申請200610050841.9公開了一種診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒及其制備及應(yīng)用方法，該專利申請是以硝酸纖維素膜為固相載體，吸附豬的待檢血樣，以豬囊蟲抗原與膠體金結(jié)合物為液相，并同時作為探針和指示劑，當(dāng)抗原與相應(yīng)的抗體配體結(jié)合，金顆粒在抗體配體位點(diǎn)大量聚集，便形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)。該專利申請的試劑盒在應(yīng)用時將被檢豬血樣干紙浸出液或血清稀釋液I)liL點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，加洗滌液IO(VL，再滴加豬囊蟲抗原膠體金100jLiL，2-3分鐘內(nèi)即形成或不形成紅色斑點(diǎn)，其結(jié)果判斷較為容易，檢測成本低，具有敏感、特異、檢出率高，省工、省時、采血樣方便等優(yōu)點(diǎn)，適用于豬囊蟲病診斷與流通市場檢疫等領(lǐng)域應(yīng)用。但上述報道所用的診斷抗原均為囊液抗原或蟲體抗原，存在的突出問題是抗原來源困難，純化繁瑣，易于出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題。而制備抗豬囊蟲囊液抗原的單克隆抗體，生產(chǎn)成本較高，而且單抗細(xì)胞株保存要求較高，易于出現(xiàn)丟失現(xiàn)象。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的豬囊蟲膠體金檢測試紙條及其制備方法。本發(fā)明的試紙條包括首尾銜接依次固定于PVC襯板材料上的用多孔纖維材料構(gòu)成的加樣吸水層、位于加樣吸水層尾端并與加樣吸水層相連的吸附有豬囊蟲金標(biāo)抗原的金標(biāo)結(jié)合墊、與金標(biāo)結(jié)合墊尾端相連由硝酸纖維素膜構(gòu)成的反應(yīng)墊和與反應(yīng)墊尾端相連的由吸水材料構(gòu)成的吸收層，其中在反應(yīng)墊上分別包被有由豬囊蟲抗原構(gòu)成的檢測區(qū)和位于檢測區(qū)下游的由豬囊蟲抗體構(gòu)成的質(zhì)控區(qū)。本發(fā)明所用的豬囊蟲抗原采用了人工克隆制備的豬帶絳蟲重組抗原，所用的抗豬囊蟲免疫球蛋白是用人工克隆制備的豬帶絳蟲重組抗原免疫動物獲得。在本發(fā)明的豬囊蟲金標(biāo)試紙條所使用的豬囊蟲抗原可以為人工制備的豬帶絳蟲六鉤呦的TSOL18重組抗原。而這種豬帶絳蟲六鉤呦的TSOL18重組抗原是采用基因工程技術(shù)將源于豬帶絳蟲六鉤呦的18ku編碼基因進(jìn)行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到真核表達(dá)載體上得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌株，再將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，用此蛋白制備金標(biāo)抗原和包被檢測區(qū)；應(yīng)用基因工程技術(shù)將源于豬帶絳蟲六鉤呦的18ku基因進(jìn)行PCR，再將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫動物，提取免疫動物的血清，從中分離得到抗融合蛋白抗體，用此多克隆抗體包被質(zhì)控區(qū)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所用的豬囊蟲抗原是將源于豬帶絳蟲六鉤蚴的18ku基因進(jìn)行RT-PCR，所得產(chǎn)物構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到的重組蛋白；并應(yīng)用基因工程技術(shù)將源于豬帶絳蟲六鉤呦的18ku基因進(jìn)行PCR,再將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-l，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-TSOL18/BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫動物，提取免疫動物的血清，從中分離得到抗融合蛋白抗體，用此多克隆抗體包被質(zhì)控區(qū)。本發(fā)明的豬囊蟲金標(biāo)試紙條上還可以在加樣吸水層設(shè)置有全血過濾裝置。本發(fā)明的豬囊蟲金標(biāo)試紙條制備方法是a.收集豬帶絳蟲蟲卵，用化學(xué)法孵化和激活后，提取六鉤蚴總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增TSOU8編碼基因，并根據(jù)TSOL18基因的核酸序列設(shè)計(jì)并合成表達(dá)引物；b.回收步驟a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到真核表達(dá)載體上得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌株，再將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)得到重組抗原蛋白；c.回收a步驟所得PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫動物，提取免疫動物的血清，從中分離得到抗融合蛋白多克隆抗體；d.制備膠體金，再用所制備的膠體金和由b所得重組抗原制備出金標(biāo)抗原；e.將d所得的金標(biāo)重組抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金標(biāo)結(jié)合墊；f.在硝酸纖維素膜的反應(yīng)墊上分別設(shè)定由b所得重組抗原包被的檢測區(qū)和由c步驟所得多克隆抗體包被的質(zhì)控區(qū)，并按設(shè)計(jì)要求使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)之間留有一段空白的區(qū)域；g.將吸水材料、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜反應(yīng)墊和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的襯底上，使各材料間保持首尾銜接，并使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)位于加樣側(cè)，按設(shè)計(jì)要求將固定好的襯底切成所需的條狀物，得到所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條。本發(fā)明給出的實(shí)施例中，豬囊蟲金標(biāo)試紙條制備方法是a.以豬帶絳蟲六鉤呦的總RNA為模板，以上游引物R:5'TCTCTCCGAAACAATGAGTTA3'和下游引物F:5'TAATAGATACCCATTTTCATCACA3'進(jìn)行RT-PCR，所得產(chǎn)物純化回收；b.以a所得豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18構(gòu)建克隆載體pGEX-TSOL18;c.以pGEX-TSOL18質(zhì)粒為模板，以上游引物PI:5，CGAGAATTCGACATTTTCGTTCCATACCTT3，EcoRI下游弓I物P2:5，TAGCGGCCGCTCACTACGATCTTCGGACCTTC3，Notl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物純化回收；d.取C步驟所得純化產(chǎn)物與pPIC9K載體質(zhì)粒分別用五coRI/U雙酶切，再用AgaroseGelDNAExtractionKit回收后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到pPIC9K-TSOL18質(zhì)粒，再用SalI單酶切線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到重組多拷貝菌株pPIC9K-TSOL18/GS115;e.將pPIC9K-TSOL18/GS115在發(fā)酵罐中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，得到TSOL18重組蛋白；f.用b步驟所得pGEX-TSOL18為模板，擴(kuò)增TSOL18編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-TSOL18/BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，純化后免疫兔，采集并分離免疫兔血清，純化得到兔抗TSOL18-GST多克隆抗體的IgG;g.制備膠體金，再用所制備的膠體金和由e所得重組抗原制備出金標(biāo)抗原；h.將g所得的金標(biāo)重組抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金標(biāo)結(jié)合墊;i.在硝酸纖維素膜的反應(yīng)墊上分別設(shè)置由e所得重組抗原包被的檢測區(qū)和由f步驟所得多克隆抗體包被的質(zhì)控區(qū)，并按設(shè)計(jì)要求使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)之間留有一段空白的區(qū)域；j.將吸水材料、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜反應(yīng)墊和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的襯底上，使各材料間保持首尾銜接，并使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)位于加樣側(cè)，按設(shè)計(jì)要求將固定好的襯底切成所需的條狀物，得到所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條。本發(fā)明的豬囊蟲金標(biāo)試紙條制備方法還可在加樣吸水層上還設(shè)置全血過濾裝置。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)1本發(fā)明采用人工克隆制備重組囊蟲抗原，解決了現(xiàn)有技術(shù)中抗原來源困難，純化繁瑣，易于出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題，采用人工克隆制備囊蟲抗原不但來源容易、成本低廉，還可發(fā)酵批量生產(chǎn)，質(zhì)量易于控制。特別是本發(fā)明利用的豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組抗原制備檢測盒，其抗原不僅具有成分單一、特異性較強(qiáng)、成本低廉以及可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量制備等優(yōu)點(diǎn)，并且可以方便地解決抗原來源的問題。2在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18/GS115，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)蛋白的糖基化修飾，獲得了具有天然蛋白特性的重組蛋白TSOL18，且具有良好的免疫活性。在發(fā)酵罐水平可以高效表達(dá)，每升發(fā)酵液可獲得TSOL18重組蛋白量為2.54g/L;經(jīng)SephacrylS畫300HR純化后，獲得大小約16ku的單一條帶，薄層掃描分析純度超過90%。這種具有天然蛋白特性、能大批量生產(chǎn)的TSOL18在用于制備檢測豬囊蟲檢測試紙或其它的檢測裝置中均具有良好的應(yīng)用前景和推廣價值。3本發(fā)明所制備的用于免疫動物的重組抗原較TSOL18分子量大，因此具有更好的免疫原性，在免疫家兔后易得到高效價的兔抗TSOL18-GST多克隆抗體。4國內(nèi)目前未見有應(yīng)用TSOL18作為診斷抗原檢測豬囊蟲病的報道。有報道的重組蛋白均來自于豬帶滌蟲囊尾蚴階段，而且采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不能糖基化，影響了重組蛋白的抗原活性，且融合蛋白的載體部分易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，造成假陽性。選擇真核表達(dá)系統(tǒng)則可克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。5本發(fā)明的金標(biāo)試紙條檢測豬囊蟲病時采用一步法，具有較高的特異性和敏感性，其檢測快速，結(jié)果判定在10-15min中內(nèi)完成，無需專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)施、實(shí)驗(yàn)條件和專門的操作人員。6本發(fā)明的試紙條制備方法具有制作簡便，穩(wěn)定性、重復(fù)性好的特點(diǎn)。特別是本發(fā)明的試紙條上設(shè)置有全血過濾裝置，可以極大地現(xiàn)場方便使用。圖1為本發(fā)明的工藝路線2為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖，其中l(wèi)為手持端吸水濾紙層，2為NC膜反應(yīng)墊層，3為金標(biāo)重組抗原墊層，4為測試端玻璃纖維吸水層，5為質(zhì)控線，6為檢測線，7為PVC襯板。圖3為本發(fā)明的結(jié)果判定示意圖，其中十表示豬標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)結(jié)果；士表示可疑豬血清樣品反應(yīng)結(jié)果；一表示豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清反應(yīng)結(jié)果；失效是指質(zhì)控區(qū)無任何顯示，這種情況下試紙條失效，不能用于檢測。圖4為真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18/GSH5的構(gòu)建圖。圖5為TSOL18基因PCR擴(kuò)增圖，圖中1為DL2000核酸Marker;2為RT-PCR獲得的TSOL18基因。圖6為重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-TSOL18酶切鑒定及PCR分析，其中1為TSOL18的PCR產(chǎn)物；2為EcoRI和NotI雙酶切pPIC9K-TSOL18的PCR產(chǎn)物；3為DL2000核酸Marker。圖7為重組菌株的PCR鑒定，其中1為pPIC9K-TSOL18/GS115重組菌的PCR產(chǎn)物；2為DL2000核酸Marker。圖8為TSOL18表達(dá)蛋白及純化后的SDS-PAGE電泳圖，圖中M是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1是5L發(fā)酵罐中甲醇誘導(dǎo)72h的表達(dá)產(chǎn)物TSOL18;2是SephacrylS-300HR柱層析純化后的TSOL18蛋白。圖9為TSOL18-GST的表達(dá)產(chǎn)物及純化SDS-PAGE電泳圖，圖中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為親和純化的TSOL18-GST融合蛋白；2為誘導(dǎo)后菌體裂解上清；3為誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀。圖10為純化兔抗TSOL18-GSTIgGSDS-PAGE電泳圖，其中M是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1是純化的兔抗TSOL18-GST蛋白的IgG。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例一(重組診斷抗原制備實(shí)施例)豬帶絳蟲六鉤呦TSOL18基因的克隆及其真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18/GS115的構(gòu)建1豬帶絳蟲六鉤呦TSOL18基因的克隆I.IPCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GeneBank上登錄的豬帶絳蟲六鉤呦TSOL18核苷酸序歹U(AF017788)，用DNAStar軟件設(shè)計(jì)一對引物R和F。上游引物R從編碼區(qū)起始密碼子開始，下游引物F為3'端非編碼區(qū)序列。上、下游引物之間所擴(kuò)增片段包括TSOL18基因的完整閱讀框架。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。上游引物R:5'TCTCTCCGAAACAATGAGTTA3'下游引物F:5'TAATAGATACCCATTTTCATCACA3'1.2豬帶絳蟲六鉤呦TSOL18編碼基因的擴(kuò)增與回收收集豬帶絳蟲蟲卵，用化學(xué)法孵化和激活后，經(jīng)Trizol法提取六鉤蚴總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增TSOL18基因。RT-PCR擴(kuò)增體系為TotalRNA懸液10^1，OligodT引物lpl，混勻后85°C預(yù)變性5min，迅速置于冰浴5min。然后加入5x反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4pl，RNasin(50u/pl)0.5(il，2.5mMdNTPMixtureljil，反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)(lOu/pl)l|al，滅菌DEPC水加至20p1,混勻后，42""C水浴反應(yīng)lh，之后95°C5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。雙鏈cDNAPCR擴(kuò)增體系為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10pl，10xPCRbuffer(Mg2+free)5(il，2.5mMdNTPMixture2pl，上、下游引物(50pmol/pl)各lpl，25mMMgCl23(il，滅菌雙蒸水加至50pl。PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min后,加入1(^1(5U4il)TaqDNA聚合酶，進(jìn)行30個循環(huán)(94。Clmin，55。C30s，72。C5min)，最后72°C延伸5min。擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5^1用1.2%瓊脂糖凝膠(含0.5|ig/ml溴化乙錠，EB)電泳分析，擴(kuò)增到一條大小約393bp的TSOL18基因片段(圖5);PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠快速回收試劑盒純化回收。2豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18克隆載體pGEX-TSOL18的構(gòu)建取pGEM-Teasy克隆載體(購自Promega公司)1^1(5(ag4d)與膠回收純化目的片段3pL混合后，加入2xrapidligasebuffer5^1,T4DNA連接酶lpl(3u4d)，混勻后置4'C過夜連接；轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆子，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，證實(shí)其大小與預(yù)期相符，經(jīng)上海晶泰生物技術(shù)公司測序證實(shí)該片段無堿基錯配。用DNAstar軟件對序列進(jìn)行分析，并與己發(fā)表的序列進(jìn)行同源性比較，證實(shí)同源性為99.45%。3豬帶絳蟲六鉤呦TSOL18真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18/GS115的構(gòu)建3.1表達(dá)引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已測序TSOL18基因的核酸序列，用DNAStar軟件在其閱讀框外側(cè)設(shè)計(jì)表達(dá)引物，除去位于5'末端的51bp的信號肽序列(這樣做即不會對編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能有太大的影響，還可在一定程度上增加可溶性表達(dá))，并按照畢赤酵母密碼子的偏愛性(參見趙翔，霍克克，李育陽.畢赤酵母的密碼用法分析.生物工程學(xué)報，2000，16(3):308-311)，在不改變其氨基酸序列的前提下，將低利用率密碼子GAT、GTG同義突變?yōu)楦呃寐拭艽a子GAC和GTT，表達(dá)引物5'端分別加入EcoRI和Notl酶切位點(diǎn)及6個保護(hù)性堿基。上下游引物之間所擴(kuò)增片段為342bp。引物由寶生物(大連)工程公司合成。TSOL18基因上游弓i物Pl:5,CGAGAATTCGACATTTTCGTTCCATACCTT3,EcoRI下游弓I物P2:5,TAGCGGCCGCTCACTACGATCTTCGGACCTTC3，NotlpPIC9K質(zhì)粒載體引物5'AOX1，5,-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'3'A0X1，5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'pPIC9K質(zhì)粒載體引物用以重組多拷貝菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來證明TSOL18基因是否整合到了GS115染色體DNA中。3.2表達(dá)載體pPIC9K-TS0L18/GS115的構(gòu)建以測序正確的pGEX-TSOL18質(zhì)粒為模板，用帶酶切位點(diǎn)的P1、P2為引物擴(kuò)增TSOL18片段。PCR擴(kuò)增體系50)iL，內(nèi)含模板lpL，IOxPCRbuffer5pL，P1、P2引物(20pM)各0.5pL，Taq酶1ul，2.5mMdNTP4pL，25mMMgCl24pL，滅菌雙蒸水加至50fiL。擴(kuò)增條件95'C預(yù)變性，5min;35個循環(huán)(94°C，50s;56°C，40s;72°C，lmin);再72。C延伸10min。擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5pL用1.0。/。瓊脂糖凝膠(含0.5^ig/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測，獲得342bp的特異性DNA片段；PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠快速回收試劑盒純化回收。將PCR純化產(chǎn)物和pPIC9K載體質(zhì)粒分別用五coRI/MZ/雙酶切，用AgaroseGelDNAExtractionKit回收后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(CaCl2法制備)。連接體系酶切目的片段7jiiL、酶切載體lpL，10xLigationbuffer1pL、T4DNA(3u4iL)連接酶1^L，混勻置16。C連接12h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,篩選陽性克隆子，堿裂解法小量提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pPIC9K-TSOL18經(jīng)PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶￡coRIA狄oI雙酶切鑒定后，出現(xiàn)342bp的特異性條帶，與預(yù)期的目的片段的大小相符(圖6)。經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組菌株送大連寶生物工程有限公司測序，結(jié)果與預(yù)期完全吻合。將pPIC9K-TSOL18用Sall單酶切線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，在MD培養(yǎng)基上生長的菌落為His+轉(zhuǎn)化子，影印法逐級篩選G418抗性菌株即目的基因高拷貝重組菌株。以重組多拷貝菌株基因組DNA為模板，對整合到畢赤酵母GS115染色體DNA中的TSOL18基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系10xbuffer2.5pL、5'AOXl引物(50pmol4iL)0.5pL、3'AOXl引物(50pmol/nL)0.5pL、基因組DNA模板2.5pL、Taq酶0.5pL、dNTP2pL、滅菌水補(bǔ)體積至25pL;擴(kuò)增條件.'95°C預(yù)變性，5min;35個循環(huán)(94°Clmin、55°Clmin、72。Clmin);再72。C延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束，取5pL反應(yīng)液用瓊脂糖凝膠電泳得到834bp大小的特異片段(空白菌株應(yīng)為492bp)，表明轉(zhuǎn)化子基因組中確實(shí)整合有TSOL18基因(圖7)，表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18/GS115的構(gòu)建過程見圖4。4豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化4.1TSOL18重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)重組酵母pPIC9K-TSOL18/GS115在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，工作體積3L，培養(yǎng)過程如下-挑種子培養(yǎng)物的單克隆接種于20mL的YPD培養(yǎng)基中，2S。C搖床培養(yǎng)2處后轉(zhuǎn)接種于200mLYPD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)18h左右，增菌達(dá)到25個OD6()()單位時，再轉(zhuǎn)接種于5L發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)過程中由電腦控制各物質(zhì)含量，氧含量不低于50%，pH值5.0。整個發(fā)酵過程中控制甲醇濃度為誘導(dǎo)的前24h甲醇流加量為3mL/L/h，誘導(dǎo)的前48h甲醇流加量為6mL/L/h，誘導(dǎo)8h后甲醇流加量為9mL/L/h，共誘導(dǎo)約72h。誘導(dǎo)結(jié)束后10000r/min離心30min取上清經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示菌液的上清中含有大小約16ku的表達(dá)產(chǎn)物(圖8)。將菌液上清濃縮凍干，注明批號，4。C保存?zhèn)溆?。每批次發(fā)酵可獲得重組蛋白2.54g/L。如此實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的可溶性高效表達(dá)，為后續(xù)的蛋白純化工藝奠定了基礎(chǔ)。4.2TS0L18重組蛋白的純化將預(yù)處理的SephaciylS-300(聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠S-300)裝柱后，再用0.01MPBS(pH7.2)緩沖液充分平衡至電導(dǎo)率、紫外吸收基線、pH均穩(wěn)定。取重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物0.5mL(約含蛋白含量25mg)，用同樣的緩沖液洗脫，流速為0.7mL/min，壓力0.2Mpa，收集峰樣品。利用紫外分光光度計(jì)測定蛋白含量，校正公式如下蛋白含量(mg/mL)氣1.45xOD280—0.74xOD260)x稀釋倍數(shù)經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白的純度，結(jié)果表明純化后的目的蛋白呈現(xiàn)單一條帶(圖8)，且蛋白回收量較大，每1000mL培養(yǎng)物上清可得到純化蛋白約為0.854g。實(shí)施例二(兔抗TS0L18-GSTIgG的制備及純化實(shí)施例)1.TSOL18-GST融合蛋白的制備目的蛋白TSOL18編碼基因的克隆及克隆載體pGEX-TSOL18的構(gòu)建同實(shí)施例一，其所用的表達(dá)載體引物設(shè)計(jì)為P3-5，ccgg^^^agcggtgaccgtacattcgg3，EcoRIP4:5"ccgctcgagctacgaacggcggaccttcttgt35XhoI將TSOL18目的基因克隆到表達(dá)載體pPGEX-4T-l，構(gòu)建原核表達(dá)載體pPGEX-TSOL18/BL21。經(jīng)O.lmmol/L的IPTG于28。C誘導(dǎo)表達(dá)6h后收集菌液；超聲破菌上清再經(jīng)GST-FF親和柱純化后，得到高純度、分子量約38ku的TSOL18-GST融合蛋白(圖9);該蛋白相比較TSOL18分子量較大，具有更好的免疫原性，免疫家兔后易得到高效價的兔抗TSOL18-GST多克隆抗體，該多抗將用于質(zhì)控線的制備。2兔抗TSOL18-GST融合蛋白多克隆抗體的制備選擇健康青年雌性青紫藍(lán)兔10只，體重約3kg/只。將純化的同一批次TSOL18-GST重組抗原依抗原劑量二倍遞增法分別與弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑配伍，制成疫苗常規(guī)免疫家兔，免疫間隔為3周，于最后1次免疫后10d進(jìn)行瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)，效價達(dá)1:32-1:64即可心臟采血，分離血清。3兔抗TSOL18-GST融合蛋白IgG的純化高免血清IgG的提純采用飽和硫酸銨沉淀法和SephacrylS-300HR凝膠層析法相結(jié)合進(jìn)行純化。具體操作如下取高免血清10mL，經(jīng)50%及33%飽和硫酸銨逐次沉淀初步提純后，再采用SephacrylS-300HR凝膠層析法進(jìn)一步純化兔高免血清IgG。SDS-PAGE分析在分子質(zhì)量略小于66ku處僅有一條帶，應(yīng)為Y球蛋白，即純化IgG條帶。經(jīng)薄層掃描其純度達(dá)90%以上，說明IgG純度滿足試紙條制備的要求(圖10)。該抗體用于包被硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線。實(shí)施例三(試紙條/卡組裝制備例)豬囊蟲病金標(biāo)快速診斷試劑組裝及制備方法1試劑的組裝參照圖2，豬囊蟲病金標(biāo)快速診斷試劑的組裝是在PVC襯板(7)的兩端分別粘貼手持端吸水層(1)的濾紙和測試端吸水層(4)的玻璃纖維，并在其中段粘貼硝酸纖維素膜制成NC膜反應(yīng)墊層(2)，在測試端玻璃纖維吸水層(4)與NC膜反應(yīng)墊層(2)之間夾貼金標(biāo)重組抗原墊層(3)的玻璃纖維，其4/5部分夾在測試端吸水層(4)，1/5部分壓在反應(yīng)墊層(2)的NC膜上，然后在手持端吸水層(1)與NC膜反應(yīng)墊層(2)之間附上不干膠的彩色手柄紙，在測試端玻璃纖維吸水層(4)與NC膜反應(yīng)墊層(2)之間附上不干膠的MAX線膠條固定，經(jīng)斬切機(jī)切成3mm寬的條帶，或制作成卡式盒，置干燥筒中存放于4'C。所述的金標(biāo)重組抗原墊層(3)的制備包括i膠體金的制備，在濃度為0.01%-0.03%的氯金酸中加入其體積的0.6°/。、濃度為1%的檸檬酸三鈉，煮沸5-10min，還原成20-40nm的膠體金原子液，調(diào)pH值8.0-8.2;iiTSOL18重組抗原的膠體金標(biāo)記，在lOOmL膠體金溶液中加入l.OmgTSOL18重組抗原，再在上述膠體金溶液中加入終濃度為0.05%的PEG20000溶液，最后2000rpm離心10min去沉淀，取上清再經(jīng)10000rpm離心lh得沉淀物，將沉淀物按8mL/100mL溶于0.02M、pH7.4Tris-HCl溶液得抗原膠體金溶液其中含0.25%牛血清白蛋白、0.02%的疊氮鈉；iii將金標(biāo)TS0L18重組抗原用點(diǎn)膜機(jī)均勻浸入玻璃纖維，然后在37"C下干燥得到金標(biāo)重組抗原墊層(3)。所述NC膜反應(yīng)墊層(2)的制備是用點(diǎn)膜機(jī)將濃度為2mg/mLTSOL18重組蛋白和兔抗TSOL18-GSTIgG噴在硝酸纖維素膜上形成檢測區(qū)(6)和質(zhì)控區(qū)(5)，檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)之間相距為5mm;再用0.01MpH7.0PBS液含10%小牛血清封閉30min，漂洗、干燥得NC膜反應(yīng)墊層(2)。經(jīng)以上所述制備的試紙條上還可在加樣吸水層上還設(shè)置全血過濾裝置，其具體的做法可參見。本發(fā)明的試紙條的使用方法如下1血清樣品的準(zhǔn)備自豬頸靜脈采血，置37。C溫育30min后，于4。C放置2h，使血清充分析出。將待檢豬血清經(jīng)3000rpm離心15min，盡量避免殘留血細(xì)胞和溶血現(xiàn)象。用于生豬屠宰檢驗(yàn)時可在屠宰時直接采血并分離血清。如果所用的試紙條上設(shè)有全血過濾裝置，可以直接檢測全血。2操作方法將試紙條(卡)取出平放于桌面；取50jiL待檢血清用樣品稀釋液(0.02MPB，pH7.4)作2倍稀釋后，用滴管緩慢加入膠體金試紙條的加樣孔上，10-15min觀察結(jié)果。3結(jié)果判定如圖3所示，檢測區(qū)、質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶者為陽性結(jié)果；檢測區(qū)無條帶、質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅色條帶者為陰性結(jié)果；質(zhì)控區(qū)均未出現(xiàn)紅色條帶者為無效結(jié)果。實(shí)施例四(豬血清樣品的檢測)本實(shí)施例中試紙條的檢測方法按照實(shí)施例三所述操作步驟進(jìn)行，其中特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn)均以全囊蟲ELISA檢測方法作為對照進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的評價。其檢測結(jié)果見表l、表2和表3。攻蟲試驗(yàn)內(nèi)容選擇健康的3月齡長白仔豬，每頭豬一次性經(jīng)口感染20000枚豬帶絳蟲成熟蟲卵，90天后逐漸發(fā)育為成熟的囊蟲(囊尾呦)。在攻蟲感染后不同時間剖殺，計(jì)數(shù)每頭豬的蟲體數(shù)，同時采血、分離血清，用試紙條檢測陰、陽性。其中3頭豬在攻蟲感染后1.5年剖檢；7頭豬在攻蟲感染后90天剖檢；6頭在攻蟲感染后70天剖檢。所有感染豬剖檢后，均檢出了不同數(shù)量有活力的蟲體，部分豬的蟲體己發(fā)生鈣化。攻蟲試驗(yàn)豬血清以宰后剖檢計(jì)數(shù)法和全囊蟲ELISA檢測方法作為對照進(jìn)行符合率評價。其檢測結(jié)果見表4。表1試紙條的特異性及敏感性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2試紙條與ELISA檢測的靈敏度結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>1:64,0.262±0.121;陰性對照0.168表3試紙條的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>備注4'C保存至180天時，檢測線和質(zhì)控線均清晰，金釋放完全，層析速度快；室溫保存至60天時，金釋放速度開始減慢，但層析速度良好；37'C保存至120天時,質(zhì)控線模糊，金釋放緩慢，層析速度良好。表4試紙條檢測攻蟲試驗(yàn)豬血清的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1特異性及敏感性試驗(yàn)結(jié)果，該試紙條與ELISA測定54頭份豬血清的陽性符合率為78.9%(15/19)，陰性符合率為89.5%(17/19)，總符合率為85.0%(17/20)。但均與豬細(xì)頸囊尾呦有交叉(此問題在國內(nèi)尚無標(biāo)準(zhǔn)方法解決)，其交叉反應(yīng)率為33.3%(4/12)。證實(shí)該試紙條與ELISA法檢出特異性相近。表2靈敏度試驗(yàn)表明，該試紙條檢出豬囊蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的最大稀釋度為1:16，檢測強(qiáng)陽性血清時其靈敏度較ELISA靈敏度低1-2個滴度，表明該試紙條具有接近ELISA法的靈敏度。表3試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，在37'C條件下，試紙條可穩(wěn)定保存120d有效；試紙條的最佳存放條件為4'C保存，可明顯延長有效期。另外對隨機(jī)挑取的同批次試紙條進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，檢測結(jié)果相一致，說明該方法穩(wěn)定性好，變異程度不大。表4結(jié)果表明，該試紙條與宰后檢蟲計(jì)數(shù)法的陽性符合率為80.0%(12/15);與ELISA試劑盒的陽性符合率為75.0%(12/16)，其中不包括試紙條判定為可疑的2份樣品。由上述各指標(biāo)的測定結(jié)果可見，該豬囊蟲快速診斷試紙條具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，檢測效果近似于全囊蟲ELISA診斷試劑盒，使用更加方便、快速、安全，適用于豬囊蟲病的快速診斷，特別是生豬屠宰的快速檢疫工作。權(quán)利要求1、豬囊蟲金標(biāo)試紙條，包括首尾銜接依次固定于PVC襯板材料上的用多孔纖維材料構(gòu)成的加樣吸水層、位于加樣吸水層尾端并與加樣吸水層相連的吸附有豬囊蟲金標(biāo)抗原的金標(biāo)結(jié)合墊、與金標(biāo)結(jié)合墊尾端相連由硝酸纖維膜構(gòu)成的反應(yīng)墊和與反應(yīng)墊尾端相連的由吸水材料構(gòu)成的吸收層，其中在反應(yīng)墊上分別包被有由豬囊蟲抗原構(gòu)成的檢測區(qū)和位于檢測區(qū)下游的由豬囊蟲抗體構(gòu)成的質(zhì)控區(qū)，其特征在于本發(fā)明所用的豬囊蟲抗原為人工克隆制備的豬帶絳蟲重組抗原，所用的抗豬囊蟲免疫球蛋白是用人工克隆制備的豬帶絳蟲重組抗原免疫動物獲得。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條，其特征是所使用的豬囊蟲抗原為人工制備的豬帶絳蟲六鉤呦的TSOL18重組抗原。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條，其特征是a.所使用的豬囊蟲抗原是采用基因工程技術(shù)將源于豬帶絳蟲六鉤蚴的18ku基因進(jìn)行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到真核表達(dá)載體上得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌株，再將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，用此蛋白制備金標(biāo)抗原和包被檢測區(qū)；b.所用的抗體是用基因工程技術(shù)將源于豬帶絳蟲六鉤蚴的18ku基因進(jìn)行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體構(gòu)建原核表達(dá)載體，再將原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到融合蛋白，用融合蛋白免疫動物，提取免疫動物的血清，從中分離得到抗融合蛋白抗體，用此抗體包被質(zhì)控區(qū)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條，其特征是a.所用的豬囊蟲抗原是將源于豬帶絳蟲六鉤呦的18ku基因進(jìn)行RT-PCR，構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18，所得產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到的重組蛋白；b.所用的抗體是用基因工程技術(shù)將源于豬帶絳蟲六鉤蚴的18ku基因進(jìn)行PCR，再將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-l,構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-TSOL18/BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到融合蛋白，用純化的融合蛋白免疫動物，提取免疫動物的血清，從中分離得到抗融合蛋白抗體，用此抗體包被質(zhì)控區(qū)。5、根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的任一豬囊蟲金標(biāo)試紙條，其特征是在加樣吸水層設(shè)置有全血過濾裝置。6、權(quán)利要求3所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條制備方法，其特征是a.收集豬帶絳蟲蟲卵，用化學(xué)法孵化和激活后，提取六鉤呦總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增TSOL18編碼基因，并根據(jù)TSOL18基因的核酸序列設(shè)計(jì)并合成表達(dá)引物；b.回收步驟a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到真核表達(dá)載體上得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌株，再將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)得到重組抗原;c.回收a步驟所得PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫動物，提取免疫動物的血清，從中分離得到抗融合蛋白抗體；d.制備膠體金，用所制備的膠體金和由b所得重組抗原制備出金標(biāo)抗原；e.將d所得的金標(biāo)重組抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金標(biāo)結(jié)合墊；f.在硝酸纖維素膜的反應(yīng)墊上分別設(shè)定由b所得重組抗原包被的檢測區(qū)和由c步驟所得抗體包被的質(zhì)控區(qū)，并按設(shè)計(jì)要求使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)之間留有一段空白的區(qū)域；g.將吸水材料、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜反應(yīng)墊和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的襯底上，使各材料間保持首尾銜接，并使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)位于加樣側(cè)，按設(shè)計(jì)要求將固定好的襯底切成所需的條狀物，得到所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條制備方法，其特征是a.以豬帶絳蟲六鉤蚴的總RNA為模板，以上游引物R:5'TCTCTCCGAAACAATGAGTTA3'和下游引物F:5'TAATAGATACCCATTTTCATCACA3'進(jìn)行RT-PCR，所得產(chǎn)物純化回收；b.以a所得豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18構(gòu)建克隆載體pGEX-TSOL18;c.以pGEX-TSOL18質(zhì)粒為模板，以上游引物PI:5，CGAGAATTCGACATTTTCGTTCCATACCTT3，EcoRI下游引物P2:5，TAGCGGCCGCTCACTACGATCTTCGGACCTTC3，NotlPCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物純化回收；d.取C歩驟所得純化產(chǎn)物與pPIC9K載體質(zhì)粒分別用五coRI/7VW/雙酶切，再用AgaroseGelDNAExtractionKit回收后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到pPIC9K-TSOL18質(zhì)粒，再用SalI單酶切線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到重組多拷貝菌株pPIC9K-TSOL18/GS115;e.將pPIC9K-TSOL18/GS115在發(fā)酵罐中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，得至UTSOL18重組蛋白；f.用b步驟所得pGEX-TSOL18為模板，擴(kuò)增TSOL18編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-TSOL18/BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，純化后免疫兔，采集并分離免疫兔血清，純化獲得兔抗TSOL18-GST多克隆抗體的IgG;g.制備膠體金，再用所制備的膠體金和由e所得重組抗原制備出金標(biāo)抗原；h.將g所得的金標(biāo)重組抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金標(biāo)結(jié)合墊;i.在硝酸纖維素膜的反應(yīng)墊上分別設(shè)置由e所得重組抗原包被的檢測區(qū)和由f步驟所得多克隆抗體包被的質(zhì)控區(qū)，并按設(shè)計(jì)要求使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)之間留有一段空白的區(qū)域；j.將吸水材料、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜反應(yīng)墊和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的襯底上，使各材料間保持首尾銜接，并使反應(yīng)墊上的檢測區(qū)位于加樣側(cè)，按設(shè)計(jì)要求將固定好的襯底切成所需的條狀物，得到所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條。8、權(quán)利要求6或7所述的豬囊蟲金標(biāo)試紙條制備方法，其特征是在加樣吸水層上還設(shè)置全血過濾裝置。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于檢測豬囊蟲病(Cysticercosis)的快速診斷試劑以及這種快速診斷試劑的制備方法。本發(fā)明的這種診斷試劑是一種膠體金檢測試紙條。本發(fā)明所用的豬囊蟲抗原采用了人工克隆制備的豬帶絳蟲重組抗原，所用的抗豬囊蟲免疫球蛋白是用人工克隆制備的豬帶絳蟲重組抗原免疫動物獲得。文檔編號G01N33/558GK101241137SQ20081000841公開日2008年8月13日申請日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日發(fā)明者張少華,才學(xué)鵬,景志忠,李克生,竇永喜,韜蔣,袁改玲,賈萬忠,鄭亞東,郭愛疆,駱學(xué)農(nóng)申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所