專利名稱：預(yù)測對作用于生長激素受體的試劑所作出的治療應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)測受試者對作用于生長激素受體的試劑所作出的治療應(yīng)答程度的方法。優(yōu)選方面包括增加具有身材矮小癥的人類受試者的身高的方法，以及治療肥胖和肢端肥大癥的方法。
背景大多數(shù)有明顯身材矮小癥的兒童沒有如傳統(tǒng)地通過對激發(fā)性刺激的GH應(yīng)答而定義的生長激素缺乏(GHD)。一旦已知的身材矮小癥原因已被排除，這些受試者被用各種術(shù)語進(jìn)行分類，包括家族性身材矮小癥、體質(zhì)性生長延遲、‘極低出生體重’(VLBW)、“特發(fā)性”身材矮小癥(ISS)。父母身材正常，但出生的兒童身材矮小的情況被稱為‘宮內(nèi)發(fā)育遲緩’(IUGR)。對于其胎期來說出生的兒童身材矮小被稱為‘小于胎齡’(SGA)。盡管還沒有大規(guī)模縱向研究的結(jié)果報告，但某些并且假定大量這些兒童可能達(dá)不到他們身高的遺傳潛力。由于存在如此多的因素促使正常生長和發(fā)育，很可能患有如所定義的ISS、IUGR、SGA的受試者在他們的身材矮小癥病因方面是不同的。盡管沒有傳統(tǒng)的GH缺乏，但大多數(shù)ISS兒童對GH治療有應(yīng)答，雖然不是所有人都同樣良好。
許多研究者已調(diào)查這群受試者中的自發(fā)性GH分泌紊亂。一個假設(shè)提出，這些受試者中的某些在生理條件下具有不充分的內(nèi)源性GH分泌，但如在傳統(tǒng)的GH刺激試驗中一樣，能夠證實有響應(yīng)藥理學(xué)刺激的GH增加。這種病癥已被命名為“GH神經(jīng)分泌功能障礙”，并且其診斷依賴于在延長的血清取樣上的異常循環(huán)性GH模式的證實。眾多研究者已報告了此類研究的結(jié)果，并且已發(fā)現(xiàn)這種異常只是偶然出現(xiàn)。其他研究者已假定這些受試者具有“無生物活性的GH”；然而，這還未被最終證實。
當(dāng)克隆GH受體(GHR)時，顯示出血液中的大部分GH結(jié)合活性是由于一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)來源于與GHR相同的基因并且相應(yīng)于全長GHR的胞外域。幾乎所有具有生長激素不敏感(或Laron)綜合征(GHIS)的受試者都缺乏生長激素受體結(jié)合活性并且在血液中缺乏或具有非常低的GH結(jié)合蛋白(GHBP)活性。此類受試者具有約-5至-6的平均身高標(biāo)準(zhǔn)差得分(SDS)，對GH治療具有抗性，并且具有增加的GH血清濃度和低的胰島素樣生長因子(IGF-1)血清濃度。他們對IGF-1治療有應(yīng)答。在GHR胞外域有缺陷的受試者中，循環(huán)中的功能性GHBP的缺乏可以充當(dāng)GH不敏感的標(biāo)記。
用外源性GH進(jìn)行治療的ISS受試者已經(jīng)顯示出對治療的不同的應(yīng)答率。特別是許多兒童對GH治療有一定程度但不完全的應(yīng)答。這些受試者具有增加的生長速率，所述生長速率的增加僅為完全應(yīng)答的兒童的大約一半。因此取決于治療持續(xù)時間，療程后這些兒童的總身高增益與完全應(yīng)答的兒童相比是減少的。改善應(yīng)答不完全的受試者的治療的途徑之一是增加GH劑量，這已導(dǎo)致一定程度得到改善的生長速率和總身高增益。然而，由于潛在的副作用，GH劑量增加不是所有受試者所希望的。GH劑量增加還使得費用增加。不幸的是目前在漫長的治療和觀察期之前還沒有鑒定受試者可能具有較低應(yīng)答性的方法。
因此本領(lǐng)域需要能夠用于鑒定對GH治療顯示應(yīng)答率減少的一亞群受試者的方法。還需要允許開發(fā)改良藥物以用于治療對外源性GH的應(yīng)答減少的受試者的方法。本領(lǐng)域還需要能夠用于鑒定對GH顯示應(yīng)答率增加的一亞群受試者的方法，并且需要允許開發(fā)改良藥物以用于治療對GH的應(yīng)答增加的受試者的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及作為引起對外源性GH的陽性應(yīng)答差異的重要因素的GHR等位基因和同種型的鑒定。因此本發(fā)明提供了預(yù)測對用經(jīng)由GHR途徑起作用的化合物，或優(yōu)選結(jié)合GHR的化合物例如GH組合物進(jìn)行治療所作出的陽性應(yīng)答程度的方法。該方法允許由因及果地將患者分為例如高或低應(yīng)答者。允許進(jìn)行適合于特殊受試者的治療導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)獲益和/或副作用減少(例如，來自適當(dāng)?shù)腉H組合物劑量的使用或來自受試者對其不顯示GHR應(yīng)答減少的化合物的使用)。
本發(fā)明證實GHRf1等位基因純合子受試者所顯示的響應(yīng)GH治療的生長速率和身高的改變比GHRd3等位基因雜合子或純合子受試者的更大。本發(fā)明進(jìn)一步證實GHRd3等位基因雜合子受試者所顯示的響應(yīng)GH治療的生長速度和身高的改變比GHRd3等位基因純合子受試者的更大。
因此本發(fā)明提供了測定或預(yù)測GHR介導(dǎo)的活性的方法，包括預(yù)測對治療所作出的GHR應(yīng)答的方法，以及鑒定受試者處于GHR活性減少的危險中或診斷與GHR活性減少相關(guān)的病狀的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了預(yù)測受試者對能夠與GHR多肽相互作用(例如結(jié)合)的試劑所作出的應(yīng)答的方法。
因此，在一個方面，本方面提供了預(yù)測受試者對能夠結(jié)合GHR蛋白的試劑所作出的應(yīng)答的方法，包括確定受試者中GHR基因的等位基因的存在或不存在，其中所述等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加或減少這種可能性相關(guān)，從而鑒定受試者具有增加或減少的對用所述試劑的治療作出應(yīng)答的可能性。優(yōu)選地，該方法包括確定受試者中GHR基因的GHRd3等位基因和/或GHRf1等位基因的存在或不存在，其中GHRd3等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答減少這種可能性相關(guān)而GHRf1等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加這種可能性相關(guān)。優(yōu)選地，所述試劑被用于增加受試者的高度或生長速率。
本發(fā)明還提供了預(yù)測受試者對為了增加受試者高度或生長速率的試劑所作出的應(yīng)答的方法，包括確定受試者中GHR基因的等位基因的存在或不存在，其中所述等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加或減少這種可能性相關(guān)，從而鑒定受試者具有增加或減少的對用所述試劑的治療作出應(yīng)答的可能性。優(yōu)選地，該方法包括確定受試者中GHR基因的GHRd3等位基因和/或GHRf1等位基因的存在或不存在，其中GHRd3等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答減少這種可能性相關(guān)而GHRf1等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加這種可能性相關(guān)。
本發(fā)明還提供了預(yù)測受試者對用于治療涉及GHR的疾病或病癥的試劑所作出的應(yīng)答的方法，所述方法包括確定受試者中GHR基因的等位基因的存在或不存在，其中所述等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加或減少這種可能性相關(guān)，從而鑒定受試者具有增加或減少的對用所述試劑的治療作出應(yīng)答的可能性。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法包括確定受試者中GHR等位基因的存在或不存在，所述GHR等位基因在外顯子3中有一個或多個核酸的缺失、插入或置換，或最優(yōu)選地基本上整個外顯子3缺失。在上述方法的一個優(yōu)選實施方案中，GHR基因的所述等位基因為GHRd3和/或GHRf1等位基因。
優(yōu)選地，所述受試者具有身材矮小癥。更優(yōu)選地，所述具有身材矮小癥的受試者為特發(fā)性身材矮小癥(ISS)、極低出生體重(VLBW)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)或小于胎齡(SGA)。更加優(yōu)選地，所述受試者為SGA。可替代地，所述受試者患有涉及GHR的任何疾病或病癥。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述GHRd3等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答減少這種可能性相關(guān)(與具有GHRf1等位基因的受試者相比)。在另一優(yōu)選實施方案中，所述GHRf1等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加這種可能性相關(guān)(與具有GHRd3等位基因的受試者相比)。在一個實施方案中，所述試劑為GHR拮抗劑，例如培維索孟。在另一實施方案中，所述試劑為GHR激動劑。優(yōu)選地，所述試劑為GH組合物，更優(yōu)選促生長激素。
本發(fā)明方法可以特別有利地用于這樣的治療方法，所述治療方法包括GHR基因的等位基因的基因分型，更優(yōu)選GHRd3和/或GHRf1等位基因。所述基因分型預(yù)示所述治療的有效性或治療獲益。在一個實施例中，本發(fā)明方法被用于確定待施用給受試者的藥物的量。在另一實施例中，所述方法被用于在臨床試驗中評估受試者的治療應(yīng)答或選擇可包括在臨床試驗中的受試者。例如，本發(fā)明方法可以包括測定受試者在GHR基因的外顯子3處的基因型，其中所述基因型將所述受試者放在臨床試驗的亞群中或臨床試驗包括的亞群中。
本發(fā)明還提供了治療患有涉及GHR的疾病或病癥的受試者的方法，該方法包括(a)確定受試者中GHR基因的等位基因的存在或不存在，其中所述等位基因與對能夠結(jié)合GHR蛋白或經(jīng)由GHR途徑起作用的試劑的陽性應(yīng)答增加或減少這種可能性相關(guān)；以及(b)選擇或確定待施用給所述受試者的所述試劑的有效量。
優(yōu)選地，該方法包括確定GHR基因的GHRd3等位基因和/或GHRf1等位基因的存在或不存在，其中GHRd3等位基因與對能夠結(jié)合GHR蛋白或經(jīng)由GHR途徑起作用的試劑的陽性應(yīng)答減少這種可能性相關(guān)而GHRf1等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加這種可能性相關(guān)。優(yōu)選地，所述試劑被用于增加受試者的身高或生長速率。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明公開了增加受試者生長的方法，該方法包括(a)確定受試者中GHR基因的等位基因的存在或不存在，其中所述等位基因與對能夠增加受試者生長的試劑的陽性應(yīng)答增加或減少這種可能性相關(guān)；以及(b)選擇或確定待施用給所述受試者的所述試劑的有效量。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明公開了增加人類受試者的生長速率的方法，所述方法包括(a)檢測該受試者的身高是否在對于年齡和性別來說的正常值之下小于約1個標(biāo)準(zhǔn)差，或更優(yōu)選小于約2個標(biāo)準(zhǔn)差，(b)檢測該受試者的DNA是否編碼GHRd3和/或GHRf1多肽；以及(c)對該受試者施用增加受試者生長速率的有效量的GH。
根據(jù)本發(fā)明的任何方法，能夠結(jié)合GHR蛋白或經(jīng)由GHR途徑起作用的試劑優(yōu)選為在治療涉及GHR的病癥或疾病中有效的試劑。在一個實施方案中，所述試劑或藥物為GHR拮抗劑。在另一實施方案中，所述試劑或藥物為GHR激動劑。所述試劑或藥物優(yōu)選為GH組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述試劑或藥物為促生長激素。在另一優(yōu)選實施方案中，所述試劑或藥物為培維索孟。
優(yōu)選地，所述受試者具有身材矮小癥。更優(yōu)選地，所述具有身材矮小癥的受試者為特發(fā)性身材矮小癥(ISS)、極低出生體重(VLBW)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)或小于胎齡(SGA)。更加優(yōu)選地，所述受試者為SGA。可替代地，所述受試者患有涉及GHR的任何疾病或病癥。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述GHRd3等位基因與對所述藥物的陽性應(yīng)答減少相關(guān)(與具有GHRf1等位基因的受試者相比)。在另一優(yōu)選實施方案中，所述GHRf1等位基因與對所述藥物的陽性應(yīng)答增加相關(guān)(與具有GHRd3等位基因的受試者相比)。
優(yōu)選地，所述治療人類受試者的方法包括對GHRd3等位基因純合子或雜合子受試者施用有效劑量的試劑或藥物，該有效劑量比將要給在其他方面相同的GHRf1等位基因純合子受試者施用的有效劑量大?？商娲?，所述治療人類受試者的方法包括對GHRd3等位基因純合子受試者施用有效劑量的試劑或藥物，該有效劑量比將要給在其他方面相同的GHRf1等位基因純合子或雜合子受試者施用的有效劑量大。
在優(yōu)選的方面，所述試劑為GH分子。優(yōu)選地，給受試者施用的GH的有效量在約0.001mg/kg/天-約0.2mg/kg/天之間；更優(yōu)選地，GH的有效量在約0.01mg/kg/天-約0.1mg/kg/天之間。在其他方面，給受試者施用的GH的有效量為至少約0.2mg/kg/周。在另一方面，GH的有效量為至少約0.25mg/kg/周。在另一方面，GH的有效量為至少約0.3mg/kg/周。優(yōu)選地，GH每天施用一次。優(yōu)選地，GH通過皮下注射施用。更優(yōu)選地，生長激素在約7.4-7.8的pH值處進(jìn)行配制。
本發(fā)明的另一方面與使用藥物的方法有關(guān)，所述方法包括從受試者獲得DNA樣品，確定DNA樣品是否包含與對藥物的陽性應(yīng)答增加相關(guān)的GHRf1等位基因和/或DNA樣品是否包含與對藥物的陽性應(yīng)答減少相關(guān)的GHRd3等位基因，以及如果DNA樣品包含與對藥物的陽性應(yīng)答增加相關(guān)的GHRf1等位基因和/或如果DNA樣品缺乏與對藥物的陽性應(yīng)答減少相關(guān)的GHRd3等位基因，則對受試者施用有效量的藥物。
如所討論的，該方法包括確定受試者中GHR等位基因的存在或不存在，所述GHR等位基因在外顯子3中有一個或多個核酸的缺失、插入或置換，或最優(yōu)選地基本上整個外顯子3缺失。與對藥物的陽性應(yīng)答減少相關(guān)的GHR基因的等位基因為缺少外顯子3的GHR等位基因，優(yōu)選GHRd3等位基因。與對藥物的陽性應(yīng)答增加相關(guān)的GHR基因的等位基因優(yōu)選為包含外顯子3的GHR等位基因(GHRf1)。
本發(fā)明還與藥物臨床試驗的方法有關(guān)，該方法包括(a)對一群個體施用藥物；以及(b)從所述群體中鑒定出其DNA編碼GHRd3多肽同種型的第一個個體亞群，以及其DNA不編碼GHRd3多肽同種型的第二個個體亞群。
可替代地，本發(fā)明與藥物臨床試驗的方法有關(guān)，該方法包括(a)對一群個體施用藥物；以及(b)從所述群體中鑒別出其DNA編碼GHRf1多肽同種型的第一個個體亞群，以及其DNA不編碼GHRf1多肽同種型的第二個個體亞群。
所述方法可進(jìn)一步包括(a)在所述第一個個體亞群中評估對所述藥物的應(yīng)答；和/或(b)在所述第二個個體亞群中評估對所述藥物的應(yīng)答。優(yōu)選地，在所述第一個和所述第二個個體亞群中評估對所述藥物的應(yīng)答。優(yōu)選地，所述應(yīng)答分開地在所述第一個和第二個個體亞群中進(jìn)行評估。對所述藥物的應(yīng)答的評估優(yōu)選包括測定受試者高度的變化。
本發(fā)明還與藥物臨床試驗的方法有關(guān)，該方法包括(a)鑒別其DNA編碼GHRd3多肽的第一個個體群體，以及其DNA不編碼GHRd3多肽的第二個個體群體；以及(b)對所述第一個和/或所述第二個個體群體的個體施用藥物。
在一個實施方案中，對所述第一個群體的個體但不對所述第二個群體的個體施用藥物。在一個實施方案中，對所述第二個群體的個體但不對所述第一個群體的個體施用藥物。在另一實施方案中，對所述第一個和所述第二個群體的個體施用藥物。
可替代地，本發(fā)明與藥物臨床試驗的方法有關(guān)，該方法包括(a)鑒別其DNA編碼GHRf1多肽的第一個個體群體，以及其DNA不編碼GHRf1多肽的第二個個體群體；以及
(b)對所述第一個和/或所述第二個個體群體的個體施用藥物。
在一個實施方案中，對所述第一個群體的個體但不對所述第二個群體的個體施用藥物。在一個實施方案中，對所述第二個群體的個體但不對所述第一個群體的個體施用藥物。在另一實施方案中，對所述第一個和所述第二個群體的個體施用藥物。
根據(jù)前述方法的藥物優(yōu)選為治療身材矮小癥、肥胖癥、感染或糖尿病；可能與生乳的、致糖尿病的、脂解的和蛋白質(zhì)合成代謝的作用相關(guān)的肢端肥大癥或巨人癥病狀；與鈉和水分滯留相關(guān)的病狀；代謝綜合征；情緒和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓的藥物。
本發(fā)明的一個優(yōu)選方面涉及藥物臨床試驗的方法，優(yōu)選能夠增加人類受試者生長速率的藥物，所述方法包括a)對一群個體施用藥物，優(yōu)選能夠增加人類受試者生長速率的藥物；以及b)從所述群體中鑒別出其DNA編碼GHRd3多肽同種型的第一個個體亞群，以及其DNA不編碼GHRd3多肽同種型的第二個個體亞群。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方面涉及藥物臨床試驗的方法，優(yōu)選能夠增加人類受試者生長速率的藥物，所述方法包括a)對一群個體施用藥物，優(yōu)選能夠增加人類受試者生長速率的藥物；以及b)從所述群體中鑒別出其DNA編碼GHRf1多肽同種型的第一個個體亞群，以及其DNA不編碼GHRf1多肽同種型的第二個個體亞群。
優(yōu)選地，所述受試者具有身材矮小癥。更優(yōu)選地，所述具有身材矮小癥的受試者為特發(fā)性身材矮小癥(ISS)、極低出生體重(VLBW)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)或小于胎齡(SGA)。更加優(yōu)選地，所述受試者為SGA?？商娲?，所述受試者患有涉及GHR的任何疾病或病癥。在一個實施方案中，對所述第一個群體的個體但不對所述第二個群體的個體施用藥物。在一個實施方案中，對所述第二個群體的個體但不對所述第一個群體的個體施用藥物。在另一實施方案中，對所述第一個和所述第二個群體的個體施用藥物。
評價對能夠增加人類受試者生長速率或能夠改善ISS、VLBW、IUGR或SGA的藥物的應(yīng)答包括評價個體身高的變化。增加人類受試者的生長速率不僅包括該受試者達(dá)到至少與用GH治療的GH缺乏性受試者(即，診斷有GHD的受試者)相同的最終高度的情況，還指該受試者在高度方面趕上與用GH治療的GH缺乏性受試者相同的生長速率，或者達(dá)到在目標(biāo)高度范圍內(nèi)的成人高度的情況，即，與他們的遺傳潛力相一致的最終高度，所述遺傳潛力由雙親中值目標(biāo)高度決定。
在本發(fā)明任何方法的一個方面，測定受試者的DNA是否編碼特別的GHR多肽同種型的步驟可以利用特異性結(jié)合GHR核酸分子的核酸分子來進(jìn)行。在另一方面，測定受試者的DNA是否編碼GHR多肽同種型的步驟可以利用特異性結(jié)合GHR核酸分子的核酸分子來進(jìn)行。優(yōu)選地，本發(fā)明方法包括測定個體的DNA是否編碼GHRd3蛋白或多肽。可替代地，本發(fā)明方法包括測定個體的DNA是否編碼GHRf1蛋白或多肽。然而，本發(fā)明方法可以包括測定個體的DNA是否編碼GHRd3和GHRf1蛋白或多肽。因此這可以包括測定個體的基因組DNA是否包含GHRd3或GHRf1等位基因，從個體獲得的mRNA是否編碼GHRd3或GHRf1多肽，或該受試者是否表達(dá)GHRd3或GHRf1多肽。
例如，在上述實施方案的任何一個中，測定個體的DNA是否編碼GHRd3或GHRf1多肽可以包括a)提供生物樣品；b)使所述生物樣品與下述物質(zhì)接觸ii)在嚴(yán)緊條件下與GHR等位基因雜交的多核苷酸，優(yōu)選GHRd3或GHRf1核酸；或iii)與GHR等位基因選擇性結(jié)合的可檢測的多肽，優(yōu)選GHRd3或GHRf1多肽；以及c)檢測所述多核苷酸與所述樣品內(nèi)的RNA種類之間的雜交的存在或不存在，或所述可檢測的多肽與所述樣品內(nèi)的多肽的結(jié)合的存在或不存在。
優(yōu)選地，使該生物樣品和在嚴(yán)緊條件下與GHRd3或GHRf1核酸雜交的多核苷酸或與GHRd3或GHRf1多肽選擇性結(jié)合的可檢測的多肽接觸，其中檢測到所述雜交或所述結(jié)合表明所述GHRd3或GHRf1在所述樣品內(nèi)表達(dá)。
優(yōu)選地，所述多核苷酸為引物，并且其中通過檢測包含所述引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在來檢測所述雜交。優(yōu)選地，所述基因分型步驟包括在聚丙烯酰胺電泳和銀染色法中分開走樣。優(yōu)選地，所述可檢測的多肽為抗體。GHRd3和GHRf1多肽或核酸的檢測可以通過任何合適的方法來進(jìn)行。例如，可以評估GHRd3或GHRf1的胞外域的血清水平(例如高親和力的GH結(jié)合蛋白)。與GHRd3的基因組或cDNA序列特異性雜交的寡核苷酸探針或引物，以及利用所述引物和探針的DNA擴(kuò)增和檢測方法也是本發(fā)明的一部分。
發(fā)明詳述如上文所討論的，GH活性由GH受體(GHR)介導(dǎo)。已經(jīng)顯示兩個GHR分子與單個GH分子相互作用(Cunningham等人，(1991)Science254821-825；de Vos等人，(1992)Science 255306-312；Sundstrom等人，(1996)J.Biol.Chem.27132197-32203；和Clackson等人，(1998)J.Mol.Biol.2771111-1128)。結(jié)合發(fā)生在GH上的兩個獨特的GHR結(jié)合位點以及兩個受體的胞外域上的共同結(jié)合袋處。GH分子上的位點1比位點2具有更高的親和力，并且受體二聚體化被認(rèn)為是順次發(fā)生的，一個受體與GH上的位點1結(jié)合，隨后募集第二個受體至位點2上。Cunningham等人(1991，同上)已經(jīng)提出受體二聚體化是導(dǎo)致信號激活的關(guān)鍵事件，并且該二聚體化由GH結(jié)合驅(qū)動(Ross等人，J.Clin.Endocrinol.& Metabolism(2001)86(4)1716-171723。配體結(jié)合后，GHRs被迅速內(nèi)在化(Maamra等人，(1999)J.Biol.Chem 27414791-14798；和Harding等人，(1996)J.Biol.Chem.2716708-6712)，一部分再循環(huán)至細(xì)胞表面(Roupas等人，(1987)Endocrinol.1211521-1530)。
更近以來發(fā)現(xiàn)了包含外顯子3缺失、被稱為GHRd3的GHR同種型(Urbanek M等人，Mol Endocrinol 1992 Feb；6(2)279-87；Godowski等人，(1989)PNAS USA 868083-8087)。該缺失被認(rèn)為是導(dǎo)致外顯子3保留或排除(相應(yīng)于全長GHRf1同種型或外顯子3缺失的GHRd3同種型)的可替代剪接事件的結(jié)果。幾種矛盾的結(jié)果在鑒定了GHRd3同種型之后而出現(xiàn)。有報告提出GHRd3同種型經(jīng)歷了組織特異性剪接，和表達(dá)模式隨發(fā)育過程而受到調(diào)控，而其他報告提出GHRd3同種型對個體特異。另一報告提出剪接由遺傳多態(tài)性引起，所述遺傳多態(tài)性作為孟德爾性狀被傳遞并改變剪接(Stallings-Mann等人，(1996)P.N.A.S U.S.A.9412394-12399)。最后，Pantel等人((2000)，J.Biol.Chem.275(25)18664-18669)分析GHR基因座后證實，在人類中GHRd3同種型轉(zhuǎn)錄自GHR等位基因，所述GHR等位基因攜帶了跨越外顯子3的2.7kb基因組缺失。Pantel進(jìn)一步鑒別出在來自僅表達(dá)GHRf1的個體的基因組DNA樣品中有兩個側(cè)翼逆轉(zhuǎn)錄因子(retroelement)，但在表達(dá)GHRd3的個體的DNA中僅有單個逆轉(zhuǎn)錄因子，提示外顯子3缺失是位于相同GHRf1等位基因上的兩個逆轉(zhuǎn)錄因子之間的同源重組事件的結(jié)果。
hGHRd3蛋白與全長hGHR(GHRf1)的差別在于受體胞外域內(nèi)22個氨基酸的缺失。GHRd3同種型編碼穩(wěn)定的和功能性的GHR蛋白(Urbanek等人，(1993)J.Biol.Chem.268(25)19025-19032)。而Urbanek等人(1993)報告，GHRd3同種型穩(wěn)定地整合到細(xì)胞膜內(nèi)并且與hGHR一樣有效地結(jié)合和內(nèi)在化配體，沒有鑒別出與GHRf1同種型的功能差別。
本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)，與不攜帶GHRd3等位基因的受試者相比，攜帶具有外顯子3缺失的生長激素受體(GHR)等位基因(GHRd3)的人類受試者對用經(jīng)由GHR途徑起作用的試劑的治療具有較低的陽性應(yīng)答。特別是，與不攜帶所述GHRd3等位基因的受試者相比，攜帶GHRd3等位基因的受試者對用重組生長激素(GH)的治療顯示出較低的陽性應(yīng)答。在重組GH療程后，與患有ISS、IUGR、VLBW或SGA并且不攜帶GHRd3等位基因的受試者相比，患有ISS、IUGR、VLBW或SGA并且攜帶GHRd3的受試者有生長速率的損失。更具體而言，SGA受試者顯示出約40％的生長速率損失。
事實上，對參加重組GH治療試驗的71名SGA兒童就共同GHR外顯子3變體與對GH治療的生長速度應(yīng)答的關(guān)聯(lián)進(jìn)行檢查。GHRd3等位基因存在于36名患者內(nèi)，其中9名為GHRd3/d3純合子而27名為GHRd3/f1雜合子。調(diào)整年齡、性別、rGH劑量后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用rGH進(jìn)行治療時攜帶GHRf1等位基因的兒童以較高的速率生長。治療一年后，與GHRd3/d3基因型兒童的9.12+/-0.50cm/年的生長速度相比，GHRf1/f1基因型兒童的生長速度為10.13+/-0.38cm/年，和GHRf1/d3基因型兒童的生長速度為9.56+/-0.27cm/年。該基因型組在其他醫(yī)學(xué)和治療特征方面是相當(dāng)?shù)?。因此GHR序列的基因組變異與rGH有效性的顯著不同相關(guān)。
如上文所討論的，本發(fā)明屬于其中將診斷測定法、預(yù)后測定法和監(jiān)控性臨床試驗用于預(yù)后(預(yù)測)目的從而治療個體的藥物基因組學(xué)和預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，本發(fā)明的一個方面涉及診斷測定法，其用于測定在生物樣品(例如血液、血清、細(xì)胞、組織)的范圍中GHR蛋白和/或核酸表達(dá)，從而確定個體的特別是對外源GH組合物治療的GHR應(yīng)答的性質(zhì)。這也可用于檢測個體是否被疾病或病癥折磨，或是否處于形成病癥的危險之中，所述病癥與GHR應(yīng)答或活性的減少相關(guān)。涉及GHR活性的病癥或病狀包括身材矮小癥、肥胖癥、感染或糖尿??；可能與生乳的、致糖尿病的、脂解的和蛋白質(zhì)合成代謝的作用相關(guān)的肢端肥大癥或巨人癥病狀；與鈉和水分滯留相關(guān)的病狀；代謝綜合征；情緒和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。本發(fā)明還提供了用于確定個體是否處于形成與GHR蛋白活性相關(guān)的病癥的危險之中的預(yù)后(或預(yù)測)測定法。例如，可以在生物樣品中測定GHRd3和GHRf1同種型。此類測定法可以用于預(yù)后或預(yù)測目的從而在以GHR應(yīng)答減少為特征或與之相關(guān)的病癥發(fā)作之前預(yù)防性地治療個體，例如通過施用有效量的GH從而使得受試者達(dá)到與他們的遺傳潛力相一致的最終高度。在其他方面，本發(fā)明提供了檢測調(diào)節(jié)GHRd3/GHRf1異源二聚體活性的試劑的方法。此類試劑可以用于治療涉及GHR活性的前述病狀或病癥。
定義術(shù)語“試劑”在本文中用于表示化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物大分子(優(yōu)選肽或蛋白質(zhì))、或由生物材料制成的提取物，所述生物材料例如為細(xì)菌、植物、真菌或動物(特別是哺乳動物)細(xì)胞或組織。
在本發(fā)明的范圍中，對藥物或試劑的“陽性應(yīng)答”或“陽性治療應(yīng)答”可以被定義為包括與疾病或病狀相關(guān)的癥狀的減輕。例如陽性應(yīng)答可以是施用試劑后高度或生長速率的增加。在本發(fā)明的范圍中，對藥物的“陰性應(yīng)答”可以被定義為包括對藥物缺乏陽性應(yīng)答，或?qū)е略谒幬锸┯煤笥^察到副作用。
術(shù)語“多肽”指與聚合物長度無關(guān)的氨基酸聚合物；因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)均包括在多肽的定義內(nèi)。這個術(shù)語還不指定或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，包括糖基基團(tuán)、乙?；鶊F(tuán)、磷酸基團(tuán)、脂質(zhì)基團(tuán)等的共價連接的多肽明顯被術(shù)語多肽涵蓋。同樣包括在這個定義中的是包含一個或多個氨基酸類似物(包括，例如，非天然發(fā)生的氨基酸、只在不相關(guān)的生物系統(tǒng)中天然發(fā)生的氨基酸、來自哺乳動物系統(tǒng)的被修飾的氨基酸等)的多肽、含替代的鍵以及本領(lǐng)域已知的天然發(fā)生和非天然發(fā)生的其他修飾的多肽。
術(shù)語“重組多肽”在本文中用于指已被人為設(shè)計并包含至少兩種多肽序列的多肽，所述兩種多肽序列被發(fā)現(xiàn)在它們的原始自然環(huán)境中不是鄰接的多肽序列，或指由重組多核苷酸表達(dá)的多肽。
術(shù)語“引物”表示與靶核苷酸序列互補(bǔ)并用來與靶核苷酸序列雜交的特異性寡核苷酸序列。引物充當(dāng)由DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶催化的核苷酸聚合的起始點。
術(shù)語“探針”表示可以用于鑒定樣品中存在的特異性多核苷酸序列的經(jīng)定義的核酸片段(或核苷酸類似物片段，例如如本文所定義的多核苷酸)，所述核酸片段包括與待鑒定的特異性多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
如本文所使用的，“測試樣品”指從目的受試者獲得的生物樣品。例如，測試樣品可以是生物學(xué)流體(例如血清)、細(xì)胞樣品或組織。
術(shù)語“性狀”和“表型”在本文中互換使用并且指任何臨床上可區(qū)別的、可檢測的或者可測量的生物體特性，例如疾病的癥狀或易感性。一般地，術(shù)語“性狀”或“表型”在本文中用于指個體對作用于GHR的試劑的應(yīng)答。
如本文所使用的，術(shù)語“基因型”指存在于個體或樣品中的等位基因的身份。在本發(fā)明的范圍中，基因型優(yōu)選指存在于個體或樣品中的等位基因的描述。術(shù)語就等位基因?qū)τ跇悠坊騻€體進(jìn)行“基因分型”涉及確定個體所攜帶的特異的等位基因。
術(shù)語“等位基因”在本文中用于指核苷酸序列的變體。例如，GHR核苷酸序列的等位基因包括GHRd3和GHRf1。
如本文所使用的，“同種型”和“GHR同種型”指由GHR基因的至少一個外顯子編碼的多肽。GHR同種型的實例包括GHRd3和GHRf1多肽。
如本文所使用的，術(shù)語“多態(tài)性”指在不同的基因組或個體之間或之中出現(xiàn)兩個或多個可選擇的基因組序列或等位基因?！岸鄳B(tài)性”指在群體中可以發(fā)現(xiàn)特殊基因組序列的兩個或更多個變異體的情況?！岸鄳B(tài)性位點”是變異發(fā)生的部位。多態(tài)性可以包括一個或多個核苷酸的置換、缺失或插入。單核苷酸多態(tài)性是單個堿基對的改變。
如本文所使用的，“外顯子”指呈現(xiàn)在成熟RNA產(chǎn)物中的經(jīng)中斷的基因的任何片段。
如本文所使用的，“內(nèi)含子”指不呈現(xiàn)在成熟RNA產(chǎn)物中的經(jīng)中斷的基因的片段。內(nèi)含子是原始核轉(zhuǎn)錄物的一部分但被剪接掉從而產(chǎn)生mRNA，所述mRNA隨后被輸送到細(xì)胞質(zhì)。
如本文所使用的，“生長激素”或“GH”指以自然序列或變體形式的并且來自任何來源的(無論是天然、合成還是重組的)生長激素。實例包括但不限于人生長激素(hGH)，它是含有人自然序列的天然或重組的GH(例如GENOTROPINTM、促成長素或促生長激素)，以及重組生長激素(rGH)，它指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的任何GH或GH變體，包括索嗎托諾、促生長素、促生長激素和培維索孟。GH分子可以是對于GHR的激動劑或拮抗劑。在一個特別的實施方案中，GH分子或其變體是經(jīng)修飾的，優(yōu)選是聚乙二醇化的。
如本文所使用的，“生長激素受體”或“GHR”指以自然序列或變體形式的并且來自任何來源的(無論是天然、合成還是重組的)生長激素受體。術(shù)語“GHR”涵蓋了GHRf1以及GHRd3同種型。實例包括人生長激素受體(hGHR)，它是含有人自然序列的天然或重組的GHR。如本文所使用的，“GHRd3”指外顯子3缺失的GHR同種型。術(shù)語“GHRf1”指包含外顯子3的GHR同種型。術(shù)語GHRd3包括但不限于Urbanek M等人，Mol Endocrinol 1992 Feb；6(2)279-87中所描述的多肽，所述文章引入本文作為參考。術(shù)語GHRf1包括但不限于Leung等人，Nature，330537-543(1987)中所描述的多肽，所述文章引入本文作為參考。
術(shù)語“GHR基因”，在本文中使用時，涵蓋了編碼任何GHR蛋白的基因組、mRNA和cDNA序列，包括基因組DNA的非翻譯調(diào)節(jié)區(qū)。術(shù)語“GHR基因”還涵蓋了GHR基因的等位基因，例如GHRd3等位基因和GHRf1等位基因。
術(shù)語“在嚴(yán)緊條件下”意指這樣的條件，即在該條件下探針將與其靶序列雜交至比其他序列可檢測地更大的程度(例如至少比背景高2倍)。嚴(yán)緊條件是依賴于序列的，并且在不同的環(huán)境下將是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)緊性，可以鑒別與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測)?？商娲?，可以調(diào)整嚴(yán)緊條件以允許序列中的某些錯配從而使得可檢測較低程度的相似性(異源探測)。一般地，探針的長度少于約1000個核苷酸，優(yōu)選少于500個核苷酸。
一般地，嚴(yán)緊條件將是這樣的條件，即在pH 7.0-8.3時鹽濃度低于約1.5M Na離子，一般約0.01-1.0M Na離子濃度(或其他鹽)，并且對于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度為至少約30℃而對于長探針(例如大于50個核苷酸)為至少約60℃。嚴(yán)緊條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達(dá)到。示例性低嚴(yán)緊條件包括在37℃在含30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液中雜交，并在50-55℃在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性中等嚴(yán)緊條件包括在37℃在40-45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中雜交，并在55-60℃在0.5×至1×SSC中洗滌。示例性高嚴(yán)緊條件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中雜交，并在60-65℃在0.1×SSC中洗滌。雜交持續(xù)時間一般少于約24小時，通常約4-約12小時。
術(shù)語對GHRf1或GHRd3等位基因“特異的”或“特異地”以及“選擇的”或“選擇地”指能夠區(qū)別這兩個等位基因的抗體或核酸。例如對GHRf1等位基因特異的抗體或核酸將不顯著結(jié)合GHRd3等位基因。優(yōu)選地，對于GHRf1∶GHRd3，抗體或核酸的結(jié)合比為1000∶1?！安伙@著地”優(yōu)選指通過目前使用的檢測手段是無法檢測該結(jié)合的。
術(shù)語“涉及GHR的疾病或病癥”優(yōu)選指選自下述的疾病和/或病癥生長激素缺乏(GHD)；成人生長激素缺乏(aGHD)；特納綜合征；身材矮小癥[其中尤其是小于胎齡(SGA)、特發(fā)性身材矮小癥(ISS)、極低出生體重(VLBW)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)]；普-韋綜合征(PWS)；慢性腎功能不全(CRI)；艾滋病消瘦；衰老；晚期腎功能衰竭；纖維囊泡癥；勃起功能障礙；HIV脂肪營養(yǎng)障礙；纖維肌痛；骨質(zhì)疏松癥；記憶障礙；抑郁；克羅恩?。还趋腊l(fā)育異常；創(chuàng)傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下出血；努南綜合征；唐氏綜合征；終末期腎臟疾病(ESRD)；骨髓干細(xì)胞救援；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素肌??；在兒童中由于糖皮質(zhì)激素治療引起的身材矮小癥；矮小早產(chǎn)兒生長追趕失??；肥胖癥；感染；糖尿病；可能與生乳的、致糖尿病的、脂解的和蛋白質(zhì)合成代謝的作用相關(guān)的肢端肥大癥或巨人癥病狀；與鈉和水分滯留相關(guān)的病狀；情緒和睡眠障礙；癌癥；心臟病和高血壓。涉及GHR的疾病和病癥優(yōu)選包括GHD、aGHD、SGA、ISS、VLBW、創(chuàng)傷性腦損傷、代謝綜合征和努南綜合征。
人GHR基因和蛋白人GHR基因是跨越90kb的5p13-12染色體區(qū)的單拷貝基因。它包含9個編碼性外顯子(編號為2-10)以及數(shù)個不翻譯的外顯子外顯子2編碼信號肽，外顯子3-7編碼胞外域，外顯子8編碼跨膜結(jié)構(gòu)域以及外顯子9和10編碼胞漿結(jié)構(gòu)域。如上文所討論的，hGHRd3蛋白與肝hGHR的差異在于受體胞外域內(nèi)22個氨基酸的缺失，Godowski等人(1989)。Genbank登錄號AF155912，該序列的公開內(nèi)容引入本文作為參考，提供了GHR基因外顯子3周圍的基因組DNA區(qū)域的核苷酸序列(例如GHRf1等位基因)。包含外顯子3以及內(nèi)含子2和3的一部分的這個6.8bp片段還包含兩個251bp重復(fù)元件。這些重復(fù)元件位于外顯子3的側(cè)翼，5’和3’重復(fù)元件位于外顯子上游577bp和下游1821bp。所述元件由171bp的長末端重復(fù)(LTR)片段組成，所述LTR片段來自屬于HERV-P家族的人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Boeke，J.D.，和Stoye，J.P.(1997)，Retroviruses(Coffin，J.M.，Hughes，S.H.，和Varmus，H.E.，編者)，pp.343-435，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)。LTR隨后為80bp來自中等重復(fù)頻率(medium reiteration frequency)MER4型序列(Smit，A.F.(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.6，743-748)。被稱為5’和3’重復(fù)的兩個251bp長的拷貝的序列有99％的同一性，只有在重復(fù)的位置14、245和246上的三個核苷酸不同。特別是，如Pantel等人(2000)所報告的，位于外顯子3上游的元件在位置14上攜帶胞嘧啶并在位置245和246上攜帶胸腺嘧啶，而位于外顯子3下游的元件在這些位置上攜帶鳥嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤。此外，在外顯子3側(cè)翼還發(fā)現(xiàn)了病毒來源的其他序列。
GHRd3等位基因缺失了外顯子3以及內(nèi)含子2和3的周圍部分。與GHRf1等位基因不同，GHRd3等位基因包含單個251bp LTR，它在序列上與在GHRf1等位基因上鑒定的3’拷貝的LTR元件是同一的。在外顯子3缺失區(qū)域中的GHRd3等位基因的基因組DNA序列顯示于Genbank登錄號AF210633中，該序列的公開內(nèi)容引入本文作為參考。
基于GHRd3和GHRf1序列，用于檢測GHR核酸或多肽的已知方法可以用于確定個體是否攜帶GHRd3等位基因。
缺失外顯子3的GHRd3蛋白與全長hGHR(GHRf1)的差別在于受體胞外域內(nèi)22個氨基酸的缺失。因此任何已知方法可用于檢測GHRd3或GHRf1蛋白的存在。GHRd3和GHRf1還可以以其未截短的形式，或以截短的形式，作為“高親和力的生長激素結(jié)合蛋白”、“高親和力的GHBP”或“GHBP”進(jìn)行檢測，在幾個物種中將在血液中循環(huán)并起作用的GHR胞外域稱為GHBP(Ymer和Herington，(1985)Mol.Cell.Endocrinol.41153；Smith和Talamantes，(1988)Endocrinology，1231489-1494；Emtner和Roos，Acta Endocrinologica(Copenh.)，122296-302(1990)，包括man.Baumann等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，62134-141(1986)；EP 366，710；Herington等人，J.Clin.Invest.，771817-1823(1986)；Leung等人，Nature，330537-543(1987)。存在的用于測量血清中功能性GHBP的各種方法是可利用的，而優(yōu)選方法是配體介導(dǎo)的免疫功能測定(LIFA)，其描述于美國專利號5,210,017和更進(jìn)一步的本文中。
診斷、治療和藥物遺傳學(xué)中的GHRd3和/或GHRf1因此本發(fā)明提供了檢測和診斷個體中GHR應(yīng)答或GHR活性減少的方法，所述個體為GHRd3等位基因純合子或雜合子。GHR活性的減少可以是例如GHR水平、表達(dá)或蛋白質(zhì)活性減少的結(jié)果。還提供了檢測和診斷個體中GHR應(yīng)答或GHR活性增加的方法，所述個體為GHRf1等位基因純合子或雜合子。GHR活性增加或減少的檢測預(yù)期用于治療各種利用經(jīng)由GHR途徑起作用的治療試劑能夠治療的病癥。優(yōu)選地，所述病癥是涉及GHR的疾病或病癥。實例包括身材矮小癥(例如優(yōu)選ISS、IUGR、VLBW或SGA)、肥胖癥、感染或糖尿??；可能與生乳的、致糖尿病的、脂解的和蛋白質(zhì)合成代謝的作用相關(guān)的肢端肥大癥或巨人癥病狀；與鈉和水分滯留相關(guān)的病狀；代謝綜合征；情緒和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓的治療。優(yōu)選實例包括結(jié)合GHR蛋白的試劑，例如作為GHR激動劑或拮抗劑起作用的重組GH組合物。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及測定受試者是否表達(dá)與對治療的應(yīng)答增加或減少相關(guān)或者與GHR活性增加或減少相關(guān)的GHR等位基因。測定受試者是否表達(dá)GHR等位基因可以通過檢測GHR蛋白或核酸來進(jìn)行。
優(yōu)選地，治療、診斷或評估受試者的方法包括評估或測定受試者是否表達(dá)GHRd3和/或GHRf1等位基因，例如測定受試者是GHRf1等位基因純合子(GHRf1/f1)、GHRd3等位基因純合子(GHRd3/d3)還是雜合子(GHRd3/f1)。因此本發(fā)明優(yōu)選涉及測定生物樣品內(nèi)是否表達(dá)GHRd3和/或GHRf1，所述測定包括a)將所述生物樣品與下述物質(zhì)接觸ii)在嚴(yán)緊條件下與GHRd3核酸特異性雜交的多核苷酸和/或在嚴(yán)緊條件下與GHRf1核酸特異性雜交的多核苷酸；或iii)與GHRd3多肽選擇性結(jié)合的可檢測的多肽和/或與GHRf1多肽選擇性結(jié)合的可檢測的多肽；以及b)檢測所述多核苷酸與所述樣品內(nèi)的RNA種類之間的雜交的存在或不存在，或所述可檢測的多肽與所述樣品內(nèi)的多肽的結(jié)合的存在或不存在。
檢測出與對GHRd3核酸特異的多核苷酸的所述雜交或GHRd3選擇性多肽的所述結(jié)合顯示，所述GHRd3等位基因或同種型在所述樣品內(nèi)表達(dá)。類似地，檢測出與對GHRf1核酸特異的多核苷酸的所述雜交或GHRf1選擇性多肽的所述結(jié)合顯示，所述GHRf1等位基因或同種型在所述樣品內(nèi)表達(dá)。優(yōu)選地，多核苷酸為引物，并且其中所述雜交通過檢測包含所述引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在來檢測，或可檢測的多肽為抗體。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺電泳以及隨后溴化乙錠和/或銀染色來檢測。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過兩個分開的聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行分析，其中第一個電泳用溴化乙錠染色而第二個用銀染色。
檢測生物樣品中GHRd3蛋白或核酸的存在或不存在的示例性方法涉及從測試受試者獲得生物樣品，和將生物樣品與能夠檢測GHRd3蛋白或編碼GHRd3蛋白的核酸(例如mRNA、基因組DNA)的化合物或試劑接觸，從而檢測生物樣品中GHRd3蛋白或核酸的存在。檢測GHRd3mRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑是能夠與GHRd3 mRNA或基因組DNA雜交的經(jīng)標(biāo)記的核酸探針。核酸探針可以是例如人類核酸或其部分，例如長度為至少15、30、50、100、250或500個核苷酸并足以在嚴(yán)緊條件下與GHRd3 mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸。在本發(fā)明的診斷測定法中有用的其他合適的探針在本文中得到描述。
類似地，檢測生物樣品中GHRf1蛋白或核酸的存在或不存在的示例性方法涉及從測試受試者獲得生物樣品，和將所述生物樣品與能夠檢測GHRf1蛋白或編碼GHRf1蛋白的核酸(例如mRNA、基因組DNA)的化合物或試劑接觸，從而檢測生物樣品中GHRf1蛋白或核酸的存在。檢測GHRf1 mRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑是能夠與GHRf1 mRNA或基因組DNA雜交的經(jīng)標(biāo)記的核酸探針。核酸探針可以是例如人類核酸或其部分，例如長度為至少15、30、50、100、250或500個核苷酸并足以在嚴(yán)緊條件下與GHRf1 mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸。在本發(fā)明的診斷測定法中有用的其他合適的探針在本文中得到描述。
檢測GHRd3蛋白的優(yōu)選試劑是能夠與GHRd3蛋白特異性結(jié)合的抗體。檢測GHRf1蛋白的優(yōu)選試劑是能夠與GHRf1蛋白特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，抗體具有可檢測的標(biāo)記。抗體可以是多克隆的，或更優(yōu)選是單克隆的?？梢岳猛暾目贵w或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。術(shù)語“經(jīng)標(biāo)記的”，涉及探針或抗體時，希望涵蓋通過將可檢測的物質(zhì)與探針或抗體偶聯(lián)(即物理連接)而直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與經(jīng)直接標(biāo)記的另一種試劑的反應(yīng)性而間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實例包括利用經(jīng)熒光標(biāo)記的第二抗體來檢測第一抗體，以及用生物素對DNA探針進(jìn)行末端標(biāo)記從而使得它可以用經(jīng)熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白來檢測。
術(shù)語“生物樣品”希望包括從受試者中分離的組織、細(xì)胞和生物學(xué)流體，以及存在于受試者內(nèi)的組織、細(xì)胞和流體。即，本發(fā)明的檢測方法可以用于在體外和體內(nèi)檢測生物樣品中的候選mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，檢測候選mRNA的體外技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。檢測候選蛋白質(zhì)的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)、Western印跡法、免疫沉淀和免疫熒光。檢測候選基因組DNA的體外技術(shù)包括Southern雜交。此外，檢測GHRd3或GHRf1蛋白的體內(nèi)技術(shù)包括將經(jīng)標(biāo)記的抗抗體導(dǎo)入受試者內(nèi)。例如，該抗體可以用放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，所述放射性標(biāo)記物在受試者中的存在和定位可以通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)進(jìn)行檢測。
在一個實施方案中，生物樣品包含來自測試受試者的蛋白質(zhì)分子?？商娲?，生物樣品可以包含來自測試受試者的mRNA分子或來自測試受試者的基因組DNA分子。優(yōu)選的生物樣品為通過常規(guī)手段從受試者中分離的血清樣品。
本發(fā)明還涵蓋了用于檢測生物樣品中GHRd3和/或GHRf1蛋白、mRNA或基因組DNA存在的試劑盒。例如，該試劑盒可以包括能夠檢測生物樣品中GHRd3蛋白或mRNA的經(jīng)標(biāo)記的化合物或試劑和/或能夠檢測生物樣品中GHRf1蛋白或mRNA的經(jīng)標(biāo)記的化合物或試劑；用于檢測樣品中GHRd3和/或GHRf1蛋白或mRNA的量的手段；以及用于將樣品中GHRd3和/或GHRf1蛋白、mRNA或基因組DNA的量與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較的手段?；衔锘蛟噭┛梢员话b在合適的容器中。該試劑盒可以進(jìn)一步包括關(guān)于利用該試劑盒來檢測GHRd3和/或GHRf1蛋白或核酸的說明書。
最優(yōu)選地，本文所描述的測定法，例如前述的診斷測定法或后述的測定法，可以用于鑒別出具有或處于形成GHR應(yīng)答減少的危險之中的受試者。特別是，GHRd3純合子或雜合子受試者被鑒別為具有或處于形成GHR應(yīng)答減少的危險之中。在其他方面，本文所描述的診斷方法可以用于鑒別具有或處于形成疾病、病癥或性狀的危險之中的受試者，所述疾病、病癥或性狀與異常的或更具體而言減少的GHR水平、表達(dá)或活性相關(guān)。例如，本文所描述的測定法，例如前述的診斷測定法或后述的測定法，可以用于鑒別具有或處于形成與GHR水平、表達(dá)或活性減少相關(guān)的性狀的危險之中的受試者。在另一實施方案中，本文所描述的測定法可以用于鑒別具有或處于形成與GHR水平、表達(dá)或活性減少相關(guān)的性狀的危險之中的受試者。如所討論的，與GHRd3/d3純合子相比，GHRf1/f1純合子和GHRf1/d3雜合子被預(yù)期具有增加的GHR應(yīng)答或GHR活性。類似地，與GHRf1/d3雜合子相比，GHRf1/f1純合子被預(yù)期具有增加的GHR應(yīng)答或GHR活性。
本文所描述的預(yù)后測定法可以用于確定受試者是否和/或根據(jù)哪個給藥方案將被施用通過GHR途徑起作用的試劑來治療疾病和病癥。因此，本發(fā)明提供了用于確定受試者用通過GHR途徑起作用的試劑治療是否有效的方法，其中獲得測試樣品并檢測GHRd3和/或GHRf1蛋白或核酸表達(dá)或活性。任選地，只檢測GHRf1蛋白或核酸表達(dá)或活性。可替代地，只檢測GHRd3蛋白或核酸表達(dá)或活性。還可檢測GHRd3和GHRf1蛋白或核酸表達(dá)或活性。如所討論的，相對于不顯示GHRd3蛋白或核酸的受試者，顯示GHRd3蛋白或核酸的受試者被預(yù)期對所述試劑有減少的陽性應(yīng)答。
在很大程度上由于施用通過GHR介導(dǎo)的途徑起作用的試劑可以適合于對試劑有較高或較低反應(yīng)性的受試者，所以檢測個體中對于GHR活性減少的易感性是非常重要的。所述試劑無需直接作用于GHR蛋白，而是可以作用于GHR蛋白的上游，例如作用于最終與GHR蛋白相互作用的另一種分子。在一個優(yōu)選實施方案中，該試劑為直接作用于GHR蛋白的試劑。最優(yōu)選地，該試劑為結(jié)合GHR蛋白并作為激動劑或拮抗劑起作用的試劑。最優(yōu)選地，該試劑為能夠激活GHR蛋白的GH蛋白或其變體，例如促生長激素。在其他實施方案中，該試劑為能夠結(jié)合但不激活GHR蛋白的GH蛋白，例如培維索孟。
從待測個體中獲得DNA樣品以確定該DNA是否編碼GHRd3蛋白和/或GHRf1蛋白。分析DNA樣品以確定它是否包含GHRd3序列和/或GHRf1序列。編碼GHRd3蛋白的DNA將與對藥物治療的陽性應(yīng)答減少有關(guān)，而當(dāng)與GHRd3個體比較時，缺少編碼GHRd3等位基因的DNA與更大的陽性應(yīng)答相關(guān)。
本發(fā)明方法還可以用于評估藥物和進(jìn)行藥物的臨床試驗。相應(yīng)地，該方法包括鑒別對所述藥物應(yīng)答陽性的第一個個體群體以及對所述藥物應(yīng)答陰性或與所述第一個個體群體相比對所述藥物的陽性應(yīng)答減少的第二個個體群體。在一個實施方案中，如果DNA樣品包含與對藥物治療的陽性應(yīng)答相關(guān)的一個或多個等位基因的等位基因和/或如果DNA樣品缺少與對藥物治療的陰性應(yīng)答或減少的陽性應(yīng)答相關(guān)的一個或多個等位基因的等位基因，則可以在臨床試驗中給受試者施用該藥物。在另一方面，如果DNA樣品包含與對藥物治療的陰性應(yīng)答或減少的陽性應(yīng)答相關(guān)的一個或多個等位基因的等位基因和/或如果DNA樣品缺少與對藥物治療的陽性應(yīng)答或增加的陽性應(yīng)答相關(guān)的一個或多個等位基因的等位基因，則可以在臨床試驗中給受試者施用該藥物。
因此，利用本發(fā)明方法可以通過考慮藥物試驗受試者中GHR應(yīng)答的差異來評估藥物的有效性。需要時，用于評估藥物有效性的試驗可以在基本上由可能對藥物易于作出應(yīng)答的個體組成的群體中，或在基本上由與另一群體相比可能對藥物較不易作出應(yīng)答的個體組成的群體中進(jìn)行。例如，包含GH蛋白的組合物可以在GHRd3個體的群體中或在GHRf1個體的群體中進(jìn)行評估。在另一方面，設(shè)計用于治療患有GH應(yīng)答減少的個體的藥物可以有利地在GHRd3個體的群體中進(jìn)行評估。
GHRd3和GHRf1的檢測預(yù)期GHR基因的其他突變可以根據(jù)本發(fā)明通過檢測特殊核酸中核苷酸的改變來進(jìn)行鑒別(美國專利號4,988,617，引入本文作為參考)。在這個方面中考慮了各種不同的測定法，包括但不限于，熒光原位雜交(FISH；美國專利號5,633,365和美國專利號5,665,549，每個都引入本文作為參考)、直接的DNA測序、PFGE分析、Southern或Northern印跡法、單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、RNA酶保護(hù)測定、等位基因特異性寡核苷酸(ASO，例如美國專利號5,639,611)、斑點印跡分析、變性梯度凝膠電泳(例如美國專利號5,190,856，引入本文作為參考)、RFLP(例如美國專利號5,324,631，引入本文作為參考)和PCR-SSCP。用于在例如生物學(xué)流體中檢測和定量基因序列的方法在美國專利號5,496,699中得到描述，所述專利引入本文作為參考。
引物和探針如本文所定義的，術(shù)語引物意欲涵蓋在模板依賴性過程中能夠引發(fā)新生核酸合成的任何核酸。一般地，引物是長度為10-20個堿基對的寡核苷酸，但也可采用更長的序列。盡管單鏈形式是優(yōu)選的，但可以以雙鏈或單鏈的形式提供引物。盡管探針可以充當(dāng)引物，但它們被不同地定義。盡管探針也許能夠引發(fā)，但其被設(shè)計為與靶DNA或RNA結(jié)合而不必在擴(kuò)增過程中使用。
SEQ ID NOs3和4分別提供了GHR基因中在外顯子3或外顯子3缺失位置的周圍的基因組DNA序列。GHRf1 cDNA序列顯示于SEQ ID NO1中。GHRd3和GHRf1等位基因之間核苷酸序列的任何差異均可用于本發(fā)明方法中，以便檢測和區(qū)分個體中特別的GHR等位基因。為了鑒別GHRf1基因組DNA或cDNA分子，可以設(shè)計與外顯子3核酸雜交的引物。為了鑒別GHRd3基因組DNA，可以設(shè)計引物或探針以使得它跨越了在GHRd3等位基因的基因組DNA序列中發(fā)現(xiàn)的GHR基因內(nèi)含子2和3的連接處，從而區(qū)分包含外顯子3的GHRf1等位基因和不包含外顯子3的GHRd3等位基因。在另一實例中，GHRd3 cDNA分子可以通過設(shè)計跨越外顯子2和4的連接處的引物和探針進(jìn)行鑒別，從而區(qū)分包含外顯子3的GHRf1 cDNA分子和不包含外顯子3的GHRd3 cDNA分子。適合于檢測GHRd3的引物的其他實例列于Pantel等人(同上)和下文的實施例1中。
本發(fā)明涵蓋了在本發(fā)明方法中用作引物和探針的多核苷酸。這些多核苷酸可以由下列核苷酸組成，或基本上由下列核苷酸組成，或包含下列核苷酸來自本文所提供的任何序列以及與之互補(bǔ)的序列中的一個序列的鄰接范圍的核苷酸(“其互補(bǔ)物”)?！班徑臃秶?contiguousspan)”的長度可以為至少25、35、40、50、70、80、100、250、500或1000個核苷酸，直至這些長度的鄰接范圍與特別的Sequence ID的長度相一致的程度。應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明的多核苷酸不局限于具有位于目的靶序列周圍的確切側(cè)翼序列，其列舉于序列表中。更合適地，應(yīng)當(dāng)理解，多態(tài)性周圍的側(cè)翼序列或離標(biāo)記物更遠(yuǎn)的本發(fā)明的任何引物或探針可以被延長或縮短至與它們的預(yù)期用途相符的任何程度，并且本發(fā)明特別考慮了此類序列。應(yīng)當(dāng)理解本文所指的多核苷酸可以是與它們的預(yù)期用途相符的任何長度。此外，在鄰接范圍之外的側(cè)翼區(qū)不必與人類受試者中實際存在的天然側(cè)翼序列同源。特別考慮了加入與核苷酸的預(yù)期用途相符的任何核苷酸序列。優(yōu)選的多核苷酸可以由下列核苷酸組成，或基本上由下列核苷酸組成，或包含下列核苷酸來自SEQ ID No 1、3或4的序列以及與之互補(bǔ)的序列的鄰接范圍的核苷酸。“鄰接范圍”的長度可以為至少8、10、12、15、50、70、80、100、250、500或1000個核苷酸。
對于本領(lǐng)域已知的任何方法，特別是允許測試本文所公開的特殊序列或標(biāo)記物是否存在的方法，本發(fā)明的探針可以從公開的序列進(jìn)行設(shè)計?？梢栽O(shè)計一組優(yōu)選探針以便用于采用本領(lǐng)域已知的任何方式的本發(fā)明雜交測定中，從而使得它們在任何特殊的一組測試條件下與多態(tài)性的一個等位基因選擇性結(jié)合但不與另一個結(jié)合。
需要時，可以通過導(dǎo)入標(biāo)記物來標(biāo)記本發(fā)明的任何多核苷酸，所述標(biāo)記物可利用分光術(shù)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測。例如，有用的標(biāo)記物包括放射性物質(zhì)、熒光染料或生物素。優(yōu)選地，多核苷酸在它們的3’和5’末端進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物還可以用于捕獲引物，以便促進(jìn)引物或引物延伸產(chǎn)物例如被擴(kuò)增的DNA在固體支持物上的固定。捕獲標(biāo)記物與引物或探針連接，并且可以是特異性結(jié)合成員，它與固相試劑的特異性結(jié)合成員形成結(jié)合對(例如生物素和鏈霉抗生物素蛋白)。因此取決于多核苷酸或探針?biāo)鶖y帶的標(biāo)記類型，它可以被用于捕獲或檢測靶DNA。進(jìn)一步地，應(yīng)當(dāng)理解本文所提供的多核苷酸、引物或探針自身可以充當(dāng)捕獲標(biāo)記物。例如，在固相試劑的結(jié)合成員為核酸序列的情況下，它可以被如此選擇，即它與引物或探針的互補(bǔ)部分結(jié)合，從而使引物或探針固定在固相上。在多核苷酸探針自身充當(dāng)結(jié)合成員的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到該探針將包含不與靶互補(bǔ)的序列或“尾部”。在多核苷酸引物自身充當(dāng)捕獲標(biāo)記物的情況下，該引物的至少一部分將與固相上的核酸自由雜交。DNA標(biāo)記技術(shù)是技術(shù)人員眾所周知的。
本發(fā)明的任何多核苷酸、引物和探針可以方便地固定在固體支持物上。固體支持物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括反應(yīng)盤的孔壁、試管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝化纖維素帶、膜、微粒例如膠乳顆粒、綿羊(或其他動物)紅細(xì)胞、duracytes及其他。固體支持物并非關(guān)鍵且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。因此，膠乳顆粒、微粒、磁性的或非磁性的珠、膜、塑料管、微量滴定板的孔壁、玻璃或硅芯片、綿羊(或其他合適的動物的)紅細(xì)胞和duracytes都是合適的實例。將核酸固定在固相上的合適的方法包括離子、疏水、共價相互作用等。如本文所使用的，固體支持物指不可溶解的或可以通過后續(xù)反應(yīng)成為不可溶解的任何材料。固體支持物可以根據(jù)其吸引并固定捕獲試劑的內(nèi)在能力進(jìn)行選擇。可替代地，固相可以保留具有吸引并固定捕獲試劑的能力的附加的受體。附加的受體可以包括與捕獲試劑自身或與和捕獲試劑綴合的帶電物質(zhì)電荷相反的帶電物質(zhì)。作為另一替代，受體分子可以是固定在(連接在)固體支持物上的任何特異性結(jié)合成員，并且它具有通過特異性結(jié)合反應(yīng)固定捕獲試劑的能力。受體分子使得捕獲試劑與固體支持物材料在進(jìn)行測定之前或在測定進(jìn)行過程中能夠間接結(jié)合。因此固相可以是塑料、衍生的塑料、磁性的或非磁性的金屬、試管的玻璃或硅表面、微量滴定板孔、薄片、珠、微粒、芯片、綿羊(或其他合適的動物的)紅細(xì)胞、duracytes以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的多核苷酸可以個別地連接至或固定在固體支持物上，或以至少2、5、8、10、12、15、20或25個不同的本發(fā)明多核苷酸的組與單個固體支持物進(jìn)行連接或固定。此外，除本發(fā)明的那些以外的多核苷酸可以與本發(fā)明的一個或多個多核苷酸連接在同一固體支持物上。
本文所提供的任何多核苷酸可以連接在固體支持物的重疊區(qū)域或隨機(jī)位置處?？商娲?，本發(fā)明的多核苷酸可以以有序陣列的方式進(jìn)行連接，其中每個多核苷酸被連接在固體支持物的不同區(qū)域，它與任何其他多核苷酸的連接位點不重疊。優(yōu)選地，多核苷酸的此類有序陣列被設(shè)計為“可尋址的(addressable)”，其中不同的位置被記錄并且能夠作為測定程序的一部分被存取?？蓪ぶ返亩嗪塑账彡嚵幸话惆ㄔ诓煌阎恢门c基質(zhì)表面偶聯(lián)的多個不同的寡核苷酸探針。對于每個多核苷酸位置的精確定位的了解使得這些“可尋址的”陣列在雜交測定中特別有用。本領(lǐng)域已知的任何可尋址的陣列技術(shù)可以用于本發(fā)明的多核苷酸。這些多核苷酸陣列的一個特別實施方案已知為Genechips，并且已在美國專利號5,143,854；PCT公開WO 90/15070和92/10092中被概括描述。這些陣列一般可利用機(jī)械合成方法或光定向合成方法來生產(chǎn)，它整合了照相平板印刷法和固相寡核苷酸合成的組合(Fodor等人，Science，251767-777，1991)。寡核苷酸陣列在固體支持物上的固定已經(jīng)由于開發(fā)了一般稱為“超大規(guī)模固定多聚物合成”(VLSIPS)的技術(shù)而成為可能，其中探針一般以高密度陣列的形式固定在芯片的固體表面上。在美國專利號5,143,854和5,412,087中以及在PCT公開WO 90/15070、WO 92/10092和WO 95/11995中提供了VLSIPS技術(shù)的實例，其描述了通過技術(shù)例如光定向合成技術(shù)形成寡核苷酸陣列的方法。在旨在提供固定在固體支持物上的核苷酸陣列的設(shè)計策略中，開發(fā)了進(jìn)一步的呈現(xiàn)策略，以便在最大化雜交模式和序列信息的努力中有序排列和顯示寡核苷酸陣列。此類呈現(xiàn)策略的實例被公開于PCT公開WO 94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212和WO97/31256中。
模板依賴性擴(kuò)增方法許多模板依賴性方法可用于擴(kuò)增存在于給定的模板樣品中的標(biāo)記序列。最佳的已知擴(kuò)增方法之一為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(被稱為PCR)，它被詳細(xì)描述于美國專利號4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等人，PCR Protocols，Academic Press，Inc.San DiegoCalif.，1990.中，它們中的每一個均整體引入本文作為參考。
簡言之，在PCR中，制備與在標(biāo)記序列的相對互補(bǔ)鏈上的區(qū)域互補(bǔ)的兩個引物序列。向反應(yīng)混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。如果標(biāo)記序列存在于樣品中，引物將與標(biāo)記結(jié)合并且聚合酶將促使引物沿著標(biāo)記序列通過增加核苷酸而進(jìn)行延伸。通過升高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物將與標(biāo)記解離而形成反應(yīng)產(chǎn)物，剩余引物將與標(biāo)記和與反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合并且重復(fù)該過程。
為了確定所擴(kuò)增的mRNA的量可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增操作。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的方法是眾所周知的，并在Sambrook等人，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.2d Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中得到描述。逆轉(zhuǎn)錄的可替代方法采用熱穩(wěn)定的依賴于RNA的DNA聚合酶。這些方法在WO 90/07641中得到描述。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
另一種擴(kuò)增方法為連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”，美國專利號5,494,810、5,484,699，EPO No.320 308，每一個均引入本文作為參考)。在LCR中，制備兩個互補(bǔ)探針對，并且在靶序列存在下，每一對將與靶的相對互補(bǔ)鏈結(jié)合從而使得它們毗連。在連接酶存在下，這兩個探針對將連接形成單個單位。
與在PCR中一樣，通過溫度循環(huán)，結(jié)合的經(jīng)連接的單位與靶解離并隨后充當(dāng)剩余探針對的連接的“靶序列”。美國專利號4,883,750描述了使探針對與靶序列結(jié)合的類似于LCR的方法。
Qbeta復(fù)制酶，一種RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，可以用作本發(fā)明的另一擴(kuò)增方法。在這個方法中，在RNA聚合酶存在下將具有與靶區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的RNA復(fù)制序列加入到樣品中。該聚合酶將拷貝該隨后可以被檢測的復(fù)制序列。美國專利號4,786,600中也描述了類似方法，所述專利引入本文作為參考，并且涉及重組RNA分子，所述RNA分子能夠充當(dāng)模板以用于由RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶來合成互補(bǔ)的單鏈分子。
如此形成的產(chǎn)物分子也能夠充當(dāng)模板以用于合成原始重組RNA分子的另外拷貝。
在其中限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶被用于完成靶分子擴(kuò)增的等溫擴(kuò)增法也可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸，所述靶分子在限制性酶切位點的一條鏈上包含核苷5’-[α-硫]三磷酸(Walker等人，(1992)，Proc.Nat′l Acad Sci.USA，89392-396；美國專利號5,270,184，引入本文作為參考)。美國專利號5,747,255(引入本文作為參考)描述了用于檢測多核苷酸的利用可切割的寡核苷酸的等溫擴(kuò)增。在本文所描述的方法中，提供了包含彼此互補(bǔ)的序列并包含至少一個易分割的鍵的寡核苷酸的分開群體，只要當(dāng)形成了包含該鍵的完全匹配的雙鏈體，該鍵就被切割。當(dāng)靶多核苷酸接觸第一個寡核苷酸時，切割發(fā)生并且產(chǎn)生可以與第二個寡核苷酸雜交的第一個片段。這樣的雜交后，切割第二個寡核苷酸從而釋放第二個片段，它反過來可以與第一個寡核苷酸以類似于靶多核苷酸的那種方式進(jìn)行雜交。
鏈置換擴(kuò)增(SDA)是另一種進(jìn)行核酸的等溫擴(kuò)增的方法，它涉及多個回合的鏈置換和合成，即切口翻譯(例如，美國專利號5,744,311；5,733,752；5,733,733；5,712,124)。被稱為修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RCR)的類似方法涉及在整個作為擴(kuò)增的靶的區(qū)域上進(jìn)行幾種探針的退火，隨后為其中只出現(xiàn)4種堿基中的2種的修復(fù)反應(yīng)。為了易于檢測，可以加入作為生物素化衍生物的另外2種堿基。類似方法被用于SDA中。還可以利用循環(huán)探針反應(yīng)(CPR)檢測靶特異性序列。在CPR中，具有非特異性DNA的3’和5’序列以及特異性RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA進(jìn)行雜交。雜交后，用RNA酶H處理反應(yīng)物，并且探針產(chǎn)物被鑒定為在消化后被釋放的特征性產(chǎn)物。原始模板與另一個循環(huán)探針退火并且重復(fù)該反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明可以使用在GB申請?zhí)? 202 328和PCT申請?zhí)朠CT/US89/01025中描述的另一種擴(kuò)增方法，其中的每一篇文獻(xiàn)均整體引入本文作為參考。在前一申請中，“經(jīng)修飾的”引物被用于PCR樣的模板和酶依賴性合成中。可以通過用捕獲部分(例如生物素)和/或檢測部分(例如酶)進(jìn)行標(biāo)記來修飾引物。在后一申請中，向樣品中加入過量的經(jīng)標(biāo)記的探針。在靶序列存在下，探針結(jié)合并且被催化切割。切割后，靶序列被完整釋放以被剩余探針結(jié)合。經(jīng)標(biāo)記的探針的切割標(biāo)志著靶序列的存在。
其他核酸擴(kuò)增操作包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR(Kwok等人，(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，861173；以及W0 88/10315，其整體引入本文作為參考)。在NASBA中，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的酚/氯仿抽提、臨床樣品的熱變性、用裂解緩沖液和微型旋轉(zhuǎn)柱(minispin columns)處理以分離DNA和RNA或者RNA的氯化胍抽提來制備用于擴(kuò)增的核酸。這些擴(kuò)增技術(shù)涉及具有靶特異性序列的引物的退火。聚合后，用RNA酶H消化DNA/RNA雜交物，而雙鏈DNA分子再次熱變性。在任一情況下，通過添加第二個靶特異性引物并隨后聚合，而將單鏈DNA制備成完整的雙鏈。雙鏈DNA分子隨后通過RNA聚合酶例如T7或SP6進(jìn)行成倍轉(zhuǎn)錄。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，RNA′s被逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA，它隨后轉(zhuǎn)換為雙鏈DNA，并隨后用RNA聚合酶例如T7或SP6再次進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。所得到的產(chǎn)物，無論是被截短的還是完整的，提示了靶特異性序列。
Davey等人，EPO No.329 822(其整體引入本文作為參考)公開了涉及循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA；以及雙鏈DNA(dsDNA)的核酸擴(kuò)增方法，它可以根據(jù)本發(fā)明被使用。ssRNA是第一個引物寡核苷酸的模板，所述第一個引物寡核苷酸通過逆轉(zhuǎn)錄酶(依賴于RNA的DNA聚合酶)來延長。隨后通過核糖核酸酶H(RNA酶H，對含DNA或RNA的雙鏈體中的RNA特異的RNA酶)的作用去除所得到的DNARNA雙鏈體中的RNA。得到的ssDNA是第二個引物的模板，所述第二個引物還在其與模板的同源區(qū)的5′端包括RNA聚合酶的啟動子(例證為T7RNA聚合酶)的序列。這個引物隨后通過DNA聚合酶(例證為大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)進(jìn)行延伸，得到雙鏈DNA(“dsDNA”)分子，其具有與引物間的原始RNA序列相同的序列并且另外在一端具有啟動子序列。通過合適的RNA聚合酶可以利用這個啟動子序列制造DNA的許多RNA拷貝。這些拷貝隨后再進(jìn)入循環(huán)導(dǎo)致非?？焖俚臄U(kuò)增。通過酶的正確選擇，這個擴(kuò)增可以等溫完成而無需在每個循環(huán)中添加酶。由于這個方法的循環(huán)特性，可以選擇DNA或RNA形式的起始序列。
PCT申請WO 89/06700(其整體引入本文作為參考)公開了一種核酸序列擴(kuò)增方案，其基于啟動子/引物序列與靶單鏈DNA(“ssDNA”)雜交并隨后轉(zhuǎn)錄該序列的許多RNA拷貝。這個方案不是循環(huán)的，即新的模板不由得到的RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生。其他擴(kuò)增方法包括“RACE”和“單側(cè)PCR”(Frohman，PCR Protocols.A Guide To Methods AndApplications，Academic Press，N.Y.，1990；以及O’hara等人，(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，865673-5677；每一個均整體引入本文作為參考)。
基于在具有所得到的“雙寡核苷酸(di-oligonucleotide)”序列的核酸存在下兩個(或更多個)寡核苷酸連接從而擴(kuò)增雙寡核苷酸的方法也可用于本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中。(Wu等人，(1989)Genomics，4560，引入本文作為參考)。
Southern/Northern印跡法印跡技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。Southern印跡法涉及利用DNA作為靶，而Northern印跡法涉及利用RNA作為靶。盡管cDNA印跡法在許多方面類似于RNA種類的印跡法，但每種提供不同類型的信息。
簡言之，探針用于靶向DNA或RNA種類，所述DNA或RNA種類已固定在合適的基質(zhì)通常為硝化纖維素濾紙上。不同的種類應(yīng)當(dāng)在空間上隔開以便有利于分析。這通常通過核酸種類的凝膠電泳并隨后在濾紙上“印跡”來完成。
隨后，被印跡的靶與探針(通常為經(jīng)標(biāo)記的)在促進(jìn)變性和再雜交的條件下進(jìn)行孵育。因為探針被設(shè)計為含靶的堿基對，所以在復(fù)性條件下探針將與靶序列的一部分進(jìn)行結(jié)合。隨后去除未結(jié)合的探針，并如上所述完成檢測。
分離方法通常希望在一個或另一個階段從模板和剩余引物中分離擴(kuò)增產(chǎn)物以確定是否已發(fā)生特異性擴(kuò)增。在一個實施方案中，利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。參見Sambrook等人，1989。
可替代地，可以采用色譜技術(shù)完成分離。有多種色譜法可以用于本發(fā)明吸附、分配、離子交換和分子篩，以及許多為了利用它們的專門技術(shù)包括柱、紙、薄層和氣相色譜(Freifelder.PhysicalBiochemistry Applications to Biochemistry and MolecularBiology，2nd ed.Wm.Freeman and Co.，New York，N.Y.，1982)。
檢測方法可以顯現(xiàn)產(chǎn)物以便確定標(biāo)記序列的擴(kuò)增。一個典型的顯現(xiàn)方法涉及用溴化乙錠對凝膠進(jìn)行染色并在UV光下進(jìn)行顯現(xiàn)?？商娲?，如果擴(kuò)增產(chǎn)物用經(jīng)放射性或熒光計量術(shù)標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行整合標(biāo)記，那么分離后，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后可以暴露于X光片或在適當(dāng)?shù)拇碳す庾V下顯現(xiàn)。
在一個實施方案中，間接地達(dá)到顯現(xiàn)。擴(kuò)增產(chǎn)物分離后，使經(jīng)標(biāo)記的核酸探針與擴(kuò)增出的標(biāo)記序列接觸。探針優(yōu)選與生色團(tuán)綴合但也可以進(jìn)行放射標(biāo)記。在另一實施方案中，探針與一個結(jié)合配偶體例如抗體或生物素進(jìn)行綴合，和結(jié)合對的另一成員攜帶可檢測的部分。
在一個實施方案中，通過經(jīng)標(biāo)記的探針進(jìn)行檢測。涉及的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且可以在許多關(guān)于分子操作規(guī)程的權(quán)威書中找到。參見Sambrook等人，1989。例如，生色團(tuán)或放射標(biāo)記探針或引物在擴(kuò)增過程中或之后鑒定出靶。
前述的一個實例在美國專利號5,279,721中得到描述，所述專利引入本文作為參考，它公開了自動化電泳和核酸轉(zhuǎn)移的裝置和方法。該裝置允許無需凝膠的外部操作而進(jìn)行電泳和印跡，并理想地適合于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。
此外，可以對上述擴(kuò)增產(chǎn)物實施序列分析以利用標(biāo)準(zhǔn)序列分析技術(shù)來鑒定特定種類的變異。在某些方法中，利用設(shè)計用于最佳測序的引物組通過序列分析進(jìn)行詳盡的基因分析(Pignon等人，(1994)Hum.Mutat.，3126-132，1994)。本發(fā)明提供了通過其可以使用任何或所有這些類型的分析的方法。利用本文所公開的序列，可以設(shè)計寡核苷酸引物以允許擴(kuò)增遍及GHR基因的序列，它隨后通過直接測序進(jìn)行分析。
通過將樣品的序列與相應(yīng)的野生型(對照)序列進(jìn)行比較，本領(lǐng)域已知的各種測序反應(yīng)中的任何一種均可用于直接測序GHR基因。測序反應(yīng)的實例包括基于由Maxam和Gilbert((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463)所發(fā)展的技術(shù)的那些。還預(yù)期當(dāng)進(jìn)行診斷測定法時各種自動化測序操作中的任何一種均可被利用。
試劑盒組分檢測和測序GHR及其變體所需要的所有基本材料和試劑可以一起組裝在試劑盒內(nèi)。這一般會包括預(yù)先選擇的引物和探針。還可以包括適合擴(kuò)增核酸的酶包括各種聚合酶(RT、Taq、SequenaseTM等)，脫氧核苷酸和緩沖液以提供擴(kuò)增必需的反應(yīng)混合物。此類試劑盒一般還會以適當(dāng)?shù)姆绞桨ㄓ糜诿糠N單個試劑和酶以及用于每種引物或探針的不同容器。
相對定量RT-PCRTM的設(shè)計和理論考慮RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并隨后進(jìn)行相對定量PCR(RT-PCR)可以用于測定從受試者中分離的特定mRNA種類的相對濃度。通過確定特定mRNA種類的濃度發(fā)生改變，顯示編碼該特定mRNA種類的基因為差異表達(dá)。定量PCR可以用于例如檢查將用經(jīng)由GHR途徑起作用的試劑治療的受試者中GHRd3和GHRf1 mRNA的相對水平，被懷疑患有GHR活性減少，或優(yōu)選患有身材矮小癥、肥胖癥、感染或糖尿?。豢赡芘c生乳的、致糖尿病的、脂解的和蛋白質(zhì)合成代謝的作用相關(guān)的肢端肥大癥或巨人癥病狀；與鈉和水分滯留相關(guān)的病狀；代謝綜合征；情緒和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓的受試者中GHRd3和GHRf1 mRNA的相對水平。
在PCR中，被擴(kuò)增的靶DNA分子數(shù)目以每個反應(yīng)循環(huán)接近兩倍的程度增加直到某些試劑變得有限。此后，擴(kuò)增速度變得越來越小直到在循環(huán)之間被擴(kuò)增的靶沒有增加。如果描繪一張其中X軸為循環(huán)數(shù)目而Y軸為被擴(kuò)增的靶DNA濃度的對數(shù)的圖，那么通過將被標(biāo)繪的點連接起來就形成了特征形狀的曲線。在第一個循環(huán)的開始，曲線的斜度是正的而且是穩(wěn)定的。這被稱為曲線的線性部分。當(dāng)試劑變?yōu)橛邢薜暮?，線的斜度開始減少并且最終變?yōu)榱?。在這個點上被擴(kuò)增的靶DNA的濃度變得漸近某一固定值。這被稱為曲線的平臺部分。
在PCR擴(kuò)增的線性部分中的靶DNA的濃度與反應(yīng)開始前的靶起始濃度成正比。通過測定PCR反應(yīng)中靶DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度可以測定原始DNA混合物中特定靶序列的相對濃度，所述PCR反應(yīng)已完成相同數(shù)目的循環(huán)并在它們的線性范圍內(nèi)。如果DNA混合物是由從不同組織或細(xì)胞分離的RNAs合成的cDNAs，那么可以測定在各個組織或細(xì)胞中靶序列從其中來源的特定mRNA的相對豐度。PCR產(chǎn)物濃度和相對的mRNA豐度之間的這個正比關(guān)系僅在PCR反應(yīng)的線性范圍內(nèi)是正確的。在曲線平臺部分中靶DNA的最終濃度由反應(yīng)混合物中試劑的可利用性決定并且不依賴于靶DNA的原始濃度。因此，在可以通過RT-PCR測定收集的RNA群體中mRNA種類的相對豐度之前必須滿足的第一個條件是當(dāng)PCR反應(yīng)在它們曲線的線性部分時，必須采樣被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的濃度。
對于RT-PCR實驗成功測定特定mRNA種類的相對豐度必須滿足的第二個條件是可擴(kuò)增的cDNAs的相對濃度必須對于某些獨立的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。RT-PCR實驗的目標(biāo)是確定樣品中一個特定mRNA種類相對于所有mRNA種類的平均豐度的豐度。在下文所描述的實驗中，GHRf1的mRNAs可以用作與之進(jìn)行比較的GHRd3 mRNAs相對豐度的標(biāo)準(zhǔn)。
大多數(shù)競爭性PCR的方案采用大約與靶一樣豐富的內(nèi)部PCR標(biāo)準(zhǔn)。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是在它們的線性期被取樣的，那么這些策略就是有效的。如果產(chǎn)物是當(dāng)反應(yīng)接近平臺期時被取樣的，那么較不豐富的產(chǎn)物變得相對過多表現(xiàn)。對許多不同RNA樣品進(jìn)行的相對豐度的比較，例如當(dāng)就差異表達(dá)檢查RNA樣品時的情況，以此類方式變得被扭曲，即使得RNAs相對豐度的差異看起來小于它們實際上的差異。如果內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)比靶豐富得多，這不是一個嚴(yán)重的問題。如果內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)比靶更豐富，則可以在RNA樣品之間進(jìn)行直接線性比較。
上述討論描述了關(guān)于RT-PCR測定法對于臨床來源材料的理論考慮。臨床樣品固有的問題在于它們的量是不同的(使得標(biāo)準(zhǔn)化成為問題)，并且它們的質(zhì)也是不同的(使得可靠內(nèi)部對照的共擴(kuò)增成為必要，優(yōu)選具有比靶更大的尺寸)。如果RT-PCR作為含內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的相對定量RT-PCR來進(jìn)行就可以克服這兩個問題，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是大于靶cDNA片段的可擴(kuò)增的cDNA片段，并且其中編碼內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的mRNA的豐度比編碼靶的mRNA大約高5-100倍。這個測定法測量各個mRNA種類的相對豐度，而不是絕對豐度。
可以利用更方便的含外部標(biāo)準(zhǔn)方案的相對定量RT-PCR測定法來進(jìn)行其他研究。這些測定法在其擴(kuò)增曲線的線性部分對PCR產(chǎn)物進(jìn)行取樣。對于每種靶cDNA片段，必須憑經(jīng)驗來確定取樣的最佳PCR循環(huán)數(shù)。此外，從各種組織樣品中分離的每個RNA群體的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物必須小心地標(biāo)準(zhǔn)化為相等濃度的可擴(kuò)增的cDNAs。這個考慮非常重要，因為該測定法測量mRNA絕對豐度。mRNA絕對豐度僅在標(biāo)準(zhǔn)化的樣品中可以用作差異基因表達(dá)的量度。雖然根據(jù)經(jīng)驗確定擴(kuò)增曲線的線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)化cDNA的制備是單調(diào)且耗時的過程，但所得到的RT-PCR測定法可以優(yōu)于來源于含內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的相對定量RT-PCR測定法的那些。
這個優(yōu)點的原因之一是沒有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)/競爭者，在擴(kuò)增曲線的線性范圍內(nèi)所有試劑均可轉(zhuǎn)化成單個PCR產(chǎn)物，因此增加了測定的靈敏度。另一個原因是只有一種PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物在電泳凝膠上的顯示或另一種顯示方法變得較不復(fù)雜，具有較少的背景并且更易于解釋。
芯片技術(shù)本發(fā)明人特別考慮的是基于芯片的DNA技術(shù)，例如由Hacia等人((1996)Nature Genetics，14441-447)以及Shoemaker等人((1996)Nature Genetics 14450-456)所描述的那些。簡言之，這些技術(shù)涉及快速且精確地分析大量基因的定量方法。通過用寡核苷酸給基因加上標(biāo)簽或利用固定的探針陣列，可以采用芯片技術(shù)來分離靶分子成為高密度陣列并在雜交的基礎(chǔ)上篩選這些分子。同樣參見Pease等人((1994)Proc.Nat′l Acad Sci.USA，915022-5026)；Fodor等人((1991)Science，251767-773)。
檢測GHRd3或GHRf1蛋白的方法通過技術(shù)例如ELISAs和Western印跡法，抗體可以用于表征組織的GHRd3和/或GHRf1含量。獲得GHRd3和GHRf1多肽的方法可以利用已知方法進(jìn)行。同樣，能夠選擇性結(jié)合GHRd3和GHRf1同種型的抗體的制備方法在本文中得到進(jìn)一步的描述。
在一個實施例中，考慮了可以在ELISA測定中使用GHR抗體，包括GHRd3抗體、GHRf1抗體以及不區(qū)分GHRd3和GHRf1的GHR抗體。例如，將抗GHR抗體固定在所選擇的表面上，優(yōu)選顯示蛋白親和力的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。洗滌去除未完全吸附的材料后，希望用非特異性蛋白來結(jié)合或包被測定板孔，所述非特異性蛋白已知對于測試抗血清是抗原中性的，例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。這允許阻斷固定表面上的非特異性吸附位點并從而減少由表面上的抗原非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景。
抗體與孔結(jié)合，用非反應(yīng)性材料包被以減少背景，并洗滌以去除未結(jié)合的材料后，將固定表面以有利于免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的方式與待測樣品接觸。
測試樣品和被結(jié)合的抗體之間的特異性免疫復(fù)合物形成并隨后進(jìn)行洗滌后，通過對第二抗體實施同樣步驟可以確定免疫復(fù)合物形成的出現(xiàn)和平均量，所述第二抗體具有不同于第一抗體的GHR特異性。適當(dāng)?shù)臈l件優(yōu)選包括用稀釋劑例如BSA、牛丙種球蛋白(BGG)和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)/Tween來稀釋樣品。這些被添加的試劑也趨于幫助減少非特異性背景。隨后允許分層的抗血清優(yōu)選在相當(dāng)于約25℃-約27℃下孵育約2-約4小時。孵育后，洗滌抗血清接觸面以便去除非免疫復(fù)合的材料。優(yōu)選的洗滌操作包括用溶液例如PBS/Tween或硼酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌。
為了提供檢測手段，第二抗體將優(yōu)選含有相關(guān)聯(lián)的酶，所述酶在與合適的生色底物孵育后將產(chǎn)生顯色。因此，例如，將希望在有利于免疫復(fù)合物形成發(fā)展的條件下用綴合有脲酶或過氧化物酶的抗人IgG接觸并孵育結(jié)合有第二抗體的表面一段時間(例如在室溫下在含有PBS的溶液例如PBS/Tween中孵育2小時)。
與經(jīng)酶標(biāo)記的第二抗體一起孵育并隨后洗滌以去除未結(jié)合的材料后，通過與生色底物例如尿素和溴甲酚紫或2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和H2O2(在過氧化物酶作為酶標(biāo)記的情況下)一起孵育來確定標(biāo)記物的量。隨后通過測量顏色產(chǎn)生的程度例如利用可見光譜分光光度計來完成量化。
通過首先將樣品與測定板結(jié)合可以改變前述形式。然后，第一抗體與測定板一起孵育，隨后利用對第一抗體特異的經(jīng)標(biāo)記的第二抗體來檢測被結(jié)合的第一抗體。
各種其他有用的免疫檢測方法的步驟已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中得到描述，例如Nakamura等人，Handbook of Experimental Immunology(4thEd.)，Weir.E.，Herzenberg，L.A.Blackwell，C.，Herzenberg，L.(eds).Vol.1.Chapter 27，Blackwell Scientific Publ.，Oxford，1987；引入本文作為參考)。免疫測定法，以其最簡單和直接的意義，是結(jié)合測定法。某些優(yōu)選的免疫測定法是各種類型的放射免疫測定法(RIA)和免疫珠捕獲測定法。利用組織切片的免疫組織化學(xué)檢測也特別有用。然而，應(yīng)當(dāng)很容易理解檢測不局限于此類技術(shù)，并且Western印跡法、斑點印跡法、FACS分析等也可與本發(fā)明結(jié)合使用。
在一個優(yōu)選實例中，GHRd3水平可以利用GHRd3特異性抗體采用上述方法進(jìn)行檢測。在其他方法中，測定GHR的總量而不區(qū)分GHRd3和GHRf1，并測定GHRf1的量。未區(qū)分的GHR量與GHRf1量的差別表明GHRd3存在的量。
在一個可替代的實例中，GHRf1水平可以利用GHRf1特異性抗體采用上述方法進(jìn)行檢測。在其他方法中，測定GHR的總量而不區(qū)分GHRf1和GHRd3，并測定GHRd3的量。未區(qū)分的GHR量和GHRd3量的差別表明GHRf1存在的量。
在另一實例中，GHRd3水平可以利用GHRd3特異性抗體進(jìn)行檢測，而GHRf1水平可以利用GHRf1特異性抗體進(jìn)行檢測。
優(yōu)選地，此類方法檢測循環(huán)中的GHBP(例如GHRd3或GHRf1的胞外部分)。優(yōu)選的方法實例允許檢測未區(qū)分的GHR(例如由總的未區(qū)分的GHR與GHRf1的比較中推斷出GHRd3)，檢測GHRd3和/或檢測GHRf1。此類方法包括ELISA測定、配體介導(dǎo)的免疫功能測定(LIFA)和放射免疫測定(RIA)。
用于檢測未區(qū)分的(例如GHRd3或GHRf1)GHR的LIFA可以根據(jù)Pflaum等人((1993)Exp.Clin.Endocrinol.101(Suppl.1)44)以及Kratzsch等人((2001)Clin.Endocrinol.5461-68)的方法來進(jìn)行。簡言之，在一個實例中，未區(qū)分的GHR利用包被微量滴定板的單克隆抗rGHBP抗體進(jìn)行檢測。血清樣品或糖基化的rGHBP標(biāo)準(zhǔn)與10ng/孔的hGH和作為生物素化示蹤物的針對hGH的單克隆抗體一起孵育。信號通過經(jīng)銪標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增并利用熒光計進(jìn)行測量。在另一實例中，如Kratsch等人((1995)Eur.J.Endocrinol.132306-312)中所描述的，利用抗rhGHBP抗體、rhGHBP標(biāo)準(zhǔn)和125I-rhGHBP作為經(jīng)標(biāo)記的抗原，進(jìn)行競爭性放射免疫測定(RIA)以檢測未區(qū)分的GHBP。
在Kratzsch等人((2001)Clin.Endocrinol.5461-68)所描述的另一實例中，通過下列方式來檢測未區(qū)分的GHBP用100μl在pH 9.6的50mmol/l磷酸鈉緩沖液中的單克隆抗體10B8包被微量滴定板，所述抗體在hGH結(jié)合位點之外結(jié)合GHBP(Rowlinson等人(1999))。洗滌步驟后，加入在75μl測定緩沖液(50mM Tris-(羥甲基)-氨基甲烷、150mM NaCl、0.05％NaN3、0.01％Tween40、0.5％BSA、0.05％牛丙種球蛋白、20μmol/l二亞乙基三胺五乙酸)中的25μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)以及50ng經(jīng)生物素標(biāo)記的抗GHGBP mAb 5C6(它在hGH結(jié)合位點內(nèi)結(jié)合GHBP(Rowlinson等人(1999))并孵育過夜。隨后利用對含有外顯子3的f1型GHBP特異的抗體來檢測GHRf1的量。簡言之，與未區(qū)分的GHBP的情況一樣，將mAb 10B8固定在微量滴定板上。洗滌步驟后，如Kratzsch等人(2001)所描述的加入25μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)以及75μl針對GHRd3肽的兔多克隆抗體(1∶10000稀釋)并孵育過夜。向每個孔中加入20ng經(jīng)生物素化的鼠抗兔IgG并孵育2小時，隨后反復(fù)沖洗。信號通過經(jīng)銪標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增并利用熒光計進(jìn)行測量。利用在綿羊血清中稀釋的重組非糖基化hGHBP作為標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)本發(fā)明使用的GHRd3特異性抗體可以利用已知方法獲得。利用制備多克隆和單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，分離的GHRd3蛋白或其部分或片段可以用作免疫原以產(chǎn)生結(jié)合GHRd3的抗體?？梢岳肎HRd3蛋白用作免疫原，或可替代地本發(fā)明提供了用作免疫原的GHRd3的抗原性肽片段。
利用已知手段，通過從由個體獲得的生物樣品中純化或更優(yōu)選地作為重組多肽可以制備GHRd3多肽。GHRf1氨基酸序列顯示于SEQ IDNO2中，GHRd3與其的差異在于由外顯子3編碼的22個氨基酸的缺失。GHRd3的抗原性肽優(yōu)選包含SEQ ID NO2中顯示的氨基酸序列的至少8個氨基酸殘基，其中至少一個氨基酸在所述外顯子3編碼的氨基酸殘基之外。所述抗原性肽涵蓋了GHRd3的表位從而使得所產(chǎn)生的針對該肽的抗體與GHRd3形成了特異性免疫復(fù)合物。優(yōu)選地，該抗體選擇性或優(yōu)先與GHRd3結(jié)合并且基本上不與GHRf1結(jié)合。優(yōu)選地，該抗原性肽包括至少10個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少15個氨基酸殘基，更加優(yōu)選至少20個氨基酸殘基，和最優(yōu)選至少30個氨基酸殘基。
由該抗原性肽涵蓋的優(yōu)選表位是位于蛋白表面的GHRd3的區(qū)域，例如親水區(qū)。
GHRd3免疫原一般用于通過用該免疫原免疫適當(dāng)?shù)氖茉囌?例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳動物)來制備抗體。適當(dāng)?shù)拿庖咴灾苿┛乖梢园?，例如重組表達(dá)的GHRd3蛋白或化學(xué)合成的GHRd3多肽。該制劑可以進(jìn)一步包括佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。用免疫原性GHRd3制劑免疫適當(dāng)?shù)氖茉囌哒T導(dǎo)了多克隆抗GHRd3抗體應(yīng)答。
因此，本發(fā)明的另一方面與抗GHRd3抗體有關(guān)。如本文所使用的，術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原結(jié)合位點的分子，所述抗原結(jié)合位點特異性結(jié)合抗原例如GHRd3(與之進(jìn)行免疫反應(yīng))。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括F(ab)和F(ab′)2片段，它們可以通過用酶例如胃蛋白酶處理抗體來產(chǎn)生。本發(fā)明提供了結(jié)合GHRd3的多克隆和單克隆抗體。如本文所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指僅包含一個種類的抗原結(jié)合位點的抗體分子的群體，所述抗原結(jié)合位點能夠與GHRd3的特定表位進(jìn)行免疫反應(yīng)。因此單克隆抗體組合物一般對與之免疫反應(yīng)的特定GHRd3蛋白顯示單一的結(jié)合親和力。
本發(fā)明涉及抗體組合物，其是多克隆或單克隆的，能夠選擇性結(jié)合或選擇性結(jié)合至包含表位的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO2的至少6個氨基酸，優(yōu)選至少8-10個氨基酸，更優(yōu)選至少12、15、20、25、30、40、50或100個氨基酸的鄰接范圍，所述鄰接范圍優(yōu)選包括由GHR基因的外顯子3編碼的所述22個氨基酸跨度范圍之外的至少一個氨基酸。
如上所述通過用GHRd3免疫原免疫適當(dāng)?shù)氖茉囌呖梢灾苽涠嗫寺〉目笹HRd3抗體?？梢岳霉潭ǖ腉HRd3通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，隨著時間進(jìn)程監(jiān)控被免疫的受試者中抗GHRd3抗體的滴度。需要時，針對GHRd3的抗體分子可以從哺乳動物中(例如從血液中)分離，并通過眾所周知的技術(shù)例如A蛋白色譜法進(jìn)行純化以獲得IgG級分。在免疫后的適當(dāng)時間，例如當(dāng)抗GHRd3抗體滴度最高時，可以從受試者中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，所述技術(shù)例如為最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497所描述的雜交瘤技術(shù)(也參見Brown等人(1981)J.Immunol.127539-46；Brown等人(1980)J.Biol.Chem.2554980-83；Yeh等人(1976)PNAS 762927-31；以及Yeh等人(1982)Int.J.Cancer 29269-75)、更近以來的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人(1983)Immunol Today472)、EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人(1985)，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.，pp.77-96)或三源雜交瘤(trioma)技術(shù)。產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的(一般參見R.H.Kenneth，Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，N.Y.(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402；M.L.Gefter等人(1977)Somatic Cell Genet.3231-36)。簡言之，將永生細(xì)胞系(一般為骨髓瘤)與來自哺乳動物的淋巴細(xì)胞(一般為脾細(xì)胞)融合，所述哺乳動物如上所述用GHRd3免疫原進(jìn)行免疫，并且篩選所得到的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液以鑒別產(chǎn)生結(jié)合GHRd3的單克隆抗體的雜交瘤。
用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的許多眾所周知方案中的任何一種均可應(yīng)用于產(chǎn)生抗GHRd3單克隆抗體的目的(參見，例如G.Galfre等人，(1977)Nature 26655052；Gefter等人，Somatic Cell Genet.，引用同上；Lerner，Yale J Biol.Med，引用同上；Kenneth，Monoclonal Antibodies，引用同上)。此外，普通技術(shù)人員將理解存在許多也會有用的此類方法的變化形式。一般地，永生細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)來源于與淋巴細(xì)胞相同的哺乳動物種類。例如，通過將來自用本發(fā)明免疫原性制劑免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與永生化的小鼠細(xì)胞系融合可以制備鼠雜交瘤。優(yōu)選的永生細(xì)胞系為小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，它對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感。眾多骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種均可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合配偶體，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。這些骨髓瘤系可以從ATCC獲得。一般地，利用聚乙二醇(“PEG”)將對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合。隨后利用HAT培養(yǎng)基選擇由融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，所述HAT培養(yǎng)基殺死未融合的以及非增殖性地融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞在幾天后死亡，因為它們未經(jīng)轉(zhuǎn)化)。例如利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定，通過就結(jié)合GHRd3的抗體來篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液，從而檢測產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
可替代地，為了制備分泌單克隆抗體的雜交瘤，通過用GHRd3篩選重組組合型免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)從而分離結(jié)合GHRd3的免疫球蛋白文庫的成員，可以鑒別并分離單克隆的抗GHRd3抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是商業(yè)上可獲得的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP.TM.Phage Display Kit，目錄號240612)。此外，特別適合用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例可以在下述文獻(xiàn)中找到，例如Ladner等人，美國專利號5,223,409；Kang等人，PCT國際公開號WO 92/18619；Dower等人，PCT國際公開號WO 91/17271；Winter等人，PCT國際公開WO92/20791；Markland等人，PCT國際公開號WO 92/15679；Breitling等人，PCT國際公開WO 93/01288；McCafferty等人，PCT國際公開號WO 92/01047；Garrard等人，PCT國際公開號WO 92/09690；Ladner等人，PCT國際公開號WO 90/02809；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse等人(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等人(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clarkson等人(1991)Nature 352624-628；Gram等人(1992)PNAS 893576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc.Acid Res.194133-4137；Barbas等人(1991)PNAS 887978-7982；和McCafferty等人，Nature(1990)348552-554。
抗GHRd3抗體(例如單克隆抗體)可以用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離GHRd3，所述技術(shù)例如為親和層析或免疫沉淀?？笹HRd3抗體可以促進(jìn)從細(xì)胞中純化天然GHRd3和純化在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的GHRd3。此外，抗GHRd3抗體可以用于檢測GHRd3蛋白(例如在細(xì)胞裂解液或細(xì)胞上清液中)以便評估GHRd3蛋白的豐度和表達(dá)模式?？笹HRd3抗體在診斷學(xué)上作為臨床檢測程序的一部分可以用于監(jiān)控組織中的蛋白水平，以例如確定給定的治療方案的有效性。通過將抗體與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)可以促進(jìn)檢測。可檢測的物質(zhì)的實例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料以及放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；以及合適的放射性材料的實例包括125I、131I、35S或3H。
在一個優(yōu)選實施例中，獲得基本上純化的GHRd3蛋白或多肽。例如通過在Amicon過濾裝置上進(jìn)行濃縮，將最終制劑中的蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至每毫升幾微克的水平。針對該蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體隨后可以如下所述進(jìn)行制備通過雜交瘤融合制備單克隆抗體。根據(jù)Kohler和Milstein(Nature，256495，1975)的傳統(tǒng)方法或其衍生方法(參見Harlow和Lane，Antibodies A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，pp.53-242，1988)可以從鼠雜交瘤制備針對GHRd3或其一部分中的表位的單克隆抗體。
簡言之，用幾微克的GHRd3或其一部分在幾周的時間段內(nèi)反復(fù)接種小鼠。隨后將小鼠殺死，并分離產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞。通過聚乙二醇將脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過讓系統(tǒng)在包含氨基蝶呤的選擇培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)上生長來破壞剩余未融合的細(xì)胞。將成功融合的細(xì)胞進(jìn)行稀釋，并將等分量的稀釋物放置在微量滴定板的孔內(nèi)，在那里培養(yǎng)物繼續(xù)生長。如最初由Engvall，E.，Meth.Enzymol.70419(1980)所描述的，通過免疫測定操作例如ELISA來檢測孔上清液中的抗體，從而鑒別產(chǎn)生抗體的克隆。可以將所選擇的陽性克隆擴(kuò)展并收集它們的單克隆抗體產(chǎn)物用于使用。關(guān)于單克隆抗體產(chǎn)生的詳細(xì)操作在Davis，L.等人，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，New York.Section 21-2中得到描述。
本發(fā)明的抗體組合物將在免疫印跡或Western印跡分析中發(fā)現(xiàn)極大的用途。抗體可以作為高親和力的第一種試劑用于鑒別固定在固體支持物基質(zhì)上的蛋白質(zhì)，所述基質(zhì)例如為硝化纖維素、尼龍或其組合。連同免疫沉淀反應(yīng)，隨后為凝膠電泳，這些抗體可以被用作單個步驟試劑以用于檢測這樣的抗原，即在所述抗原的檢測中使用的針對該抗原的第二種試劑產(chǎn)生不利的背景。與Western印跡法一起使用的基于免疫學(xué)的檢測方法包括針對毒素部分的具有酶、放射性標(biāo)記或熒光的標(biāo)簽的第二抗體，它們被認(rèn)為在這個方面特別有用。與此類標(biāo)記物的使用有關(guān)的美國專利包括美國專利號3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149以及4,366,241，每一個均引入本文作為參考。當(dāng)然，如本領(lǐng)域所已知的，通過使用第二種結(jié)合配體例如第二抗體或生物素/抗生物素蛋白配體結(jié)合安排可以發(fā)現(xiàn)另外的優(yōu)點。
GH組合物的施用依照本發(fā)明使用的GH可以是自然序列或變體形式，并且來自任何來源，無論是天然的、合成的還是重組的。實例包括人生長激素(hGH)，它是含有人自然序列的天然或重組的GH(例如GENOTROPINTM、促生長素或促生長激素)，以及重組生長激素(rGH)，它指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的任何GH或GH變體，包括索嗎托諾、促生長素和促生長激素。本文優(yōu)選用于人類的是在其N末端含或不含甲硫氨酸的重組人自然序列、成熟的GH。最優(yōu)選的是GENOTROPINTM(Pharmacia，U.S.A.)，它是重組人GH多肽。同樣優(yōu)選的是通過下述方法在大腸桿菌中產(chǎn)生的甲硫氨酰人生長激素(met-hGH)，所述方法例如描述于1988年7月5日公布的美國專利號4,755,465，以及Goeddel等人，Nature，282544(1979)中。作為PROTROPINTM(Genentech，Inc.U.S.A.)出售的Met-hGH與天然多肽相同，除了存在N末端的甲硫氨酸殘基。另一實例是作為NUTROPINTM(Genentech，Inc.，U.S.A.)出售的重組hGH。這個后面的hGH缺少這個甲硫氨酸殘基并且具有與天然激素的氨基酸序列相同的氨基酸序列。參見Gray等人，Biotechnology 2161(1984)。GH的另一實例為hGH變體，如美國專利號4,670,393所描述的，它是含身體生長(somatogenic)活性并且不含生乳活性的胎盤形式的GH。還包括GH變體，例如WO 90/04788和WO 92/09690中所描述的那些。其他實例包括充當(dāng)GHR拮抗劑的GH組合物，例如培維索孟(SOMAVERTTM，Pharmacia，U.S.A.)，它可以用于治療肢端肥大癥。
通過任何合適的技術(shù)可以將GH直接施用于受試者，所述技術(shù)包括腸胃外、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、口服或通過皮膚吸收。它們可以局部或全身地施用。腸胃外給藥的實例包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥。優(yōu)選地，它們通過每天皮下注射給藥。
考慮到個體受試者的臨床情況(特別是單獨用GH治療的副作用)、GH組合物的輸送位置、給藥方法、給藥時間表以及從業(yè)醫(yī)師已知的其他因素，在治療中使用的GH將以與良好的醫(yī)療實踐相一致的方式被配制和按劑量給予。因此用于本文的每種組分的“有效量”是通過此類考慮確定的并且是增加受試者生長速率的量。
對于GH，優(yōu)選采用大于約0.2mg/kg/周，更優(yōu)選大于約0.25mg/kg/周，和更加優(yōu)選大于或等于約0.3mg/kg/周的劑量。在一個實施方案中，GH的劑量范圍為0.3-1.0mg/kg/周，而在另一實施方案中，為0.35-1.0mg/kg/周。
優(yōu)選地，GH為每天皮下給藥一次。在優(yōu)選的方面，GH的劑量為約0.001-0.2mg/kg/天。更加優(yōu)選地，GH的劑量為約0.010-0.10mg/kg/天。
如所討論的，GHRf1等位基因純合子或雜合子受試者被預(yù)期對GH治療具有比GHRd3等位基因純合子受試者更大的陽性應(yīng)答。在優(yōu)選的方面，施用于GHRd3等位基因純合子受試者的劑量以及施用于GHRd3等位基因雜合子受試者的劑量將大于施用于GHRf1等位基因純合子受試者的劑量。
GH適合于連續(xù)或不連續(xù)地施用，例如在特定時間(例如一天一次)以特定劑量注射的形式，其中在注射時血漿GH濃度將上升，并且隨后血漿GH濃度下降直到下次注射時。另一非連續(xù)給藥方法起因于PLGA微球體和許多可獲得的植入裝置的使用，它們提供了活性成分的不連續(xù)釋放，例如最初破裂，并隨后在活性試劑釋放之前滯后。參見例如美國專利號4,767,628。
GH還可以被如此施用，即在血液中具有連續(xù)的存在，所述存在維持在GH施用的持續(xù)時間內(nèi)。這最優(yōu)選借助于經(jīng)由例如微型泵例如滲透性微型泵的連續(xù)輸注來完成?？商娲?，通過使用頻繁注射GH(即超過一天一次，例如一天兩次或三次)來適當(dāng)?shù)赝瓿伞?br> 在另一實施方案中，可以利用長效GH制劑來施用GH，它延遲GH從血液中的清除或?qū)е翯H從例如注射位點緩慢釋放。延長GH血漿清除的長效制劑可以是GH與大分子復(fù)合或共價綴合(通過可逆的或不可逆的結(jié)合)的形式，所述大分子例如為一種或多種其結(jié)合蛋白(WO92/08985)或選自PEG和聚丙二醇均聚物和聚氧乙烯多元醇的水溶性聚合物，即在室溫下溶解于水的那些?？商娲?，GH可以與聚合物復(fù)合或結(jié)合以增加其循環(huán)半壽期。對于這個用途有用的聚乙烯多元醇和聚氧乙烯多元醇的實例包括聚氧乙烯甘油、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇、聚氧乙烯葡萄糖等。聚氧乙烯甘油的甘油主鏈?zhǔn)且愿视蛦巍㈦p或三酯形式出現(xiàn)在例如動物和人類中的相同的主鏈。
該聚合物無需具有任何特別的分子量，但優(yōu)選分子量在約3500-100,000之間，更優(yōu)選在5000-40,000之間。優(yōu)選地，該PEG均聚物是非取代的，但它也可在一端被烷基取代。優(yōu)選地，該烷基為C1-C4烷基，并最優(yōu)選甲基。最優(yōu)選地，該聚合物為非取代的PEG均聚物、一甲基取代的PEG均聚物(mPEG)或聚氧乙烯甘油(POG)，并且具有約5000-40,000的分子量。
GH是經(jīng)由GH的一個或多個氨基酸殘基與聚合物上的末端反應(yīng)基團(tuán)共價鍵合的，主要取決于反應(yīng)條件、聚合物的分子量等。含反應(yīng)基團(tuán)的聚合物在本文中被稱為活化的聚合物。反應(yīng)基團(tuán)選擇性地與GH上的游離氨基或其他反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。然而，將理解為了獲得最佳結(jié)果而選擇的反應(yīng)基團(tuán)的類型和量以及所采用的聚合物的類型，將取決于所采用的特定GH以避免該反應(yīng)基團(tuán)與GH上太多特別有活性的基團(tuán)反應(yīng)。由于這個不可能完全避免，一般推薦取決于蛋白質(zhì)濃度而采用每摩爾蛋白質(zhì)約0.1-1000摩爾，優(yōu)選2-200摩爾的活化的聚合物。每摩爾蛋白質(zhì)的活化的聚合物的最終量是維持最佳活性的平衡點，如果可能，還同時優(yōu)化蛋白質(zhì)的循環(huán)半壽期。
雖然殘基可以是蛋白質(zhì)上的任何反應(yīng)性氨基酸，例如一個或兩個半胱氨酸或N末端的氨基酸基團(tuán)，但優(yōu)選該反應(yīng)性氨基酸為賴氨酸，它通過它的游離ε-氨基基團(tuán)與活化的聚合物的反應(yīng)基團(tuán)連接，或為谷氨酸或天冬氨酸，它通過酰胺鍵與聚合物連接。
可以通過一般用于將生物活性材料與惰性聚合物反應(yīng)的任何合適方法來進(jìn)行共價修飾反應(yīng)，優(yōu)選在約pH 5-9，更優(yōu)選7-9，如果GH上的反應(yīng)基團(tuán)是賴氨酸基團(tuán)。一般地，該方法涉及制備活化的聚合物(含有至少一個末端羥基基團(tuán))，從該聚合物制備活性基質(zhì)，并隨后使GH與該活性基質(zhì)反應(yīng)以產(chǎn)生適合于配制的GH。上述修飾反應(yīng)可以通過幾種方法來進(jìn)行，所述方法可以涉及一個或多個步驟?？梢杂糜谠谝徊椒磻?yīng)中產(chǎn)生活化的聚合物的修飾試劑的實例包括氰尿酸氯化物(2，4，6-三氯-S-三嗪)和氰尿酸氟化物。
在一個實施方案中，該修飾反應(yīng)以兩步發(fā)生，其中聚合物首先與酸酐例如琥珀酸酐或戊二酸酐反應(yīng)以形成羧酸，并且該羧酸隨后與能夠與該羧酸反應(yīng)的化合物反應(yīng)以形成含反應(yīng)性酯基團(tuán)的能夠與GH反應(yīng)的活化的聚合物。此類化合物的實例包括N-羥基琥珀酰亞胺、4-羥基-3-硝基苯磺酸等，并優(yōu)選使用N-羥基琥珀酰亞胺或4-羥基-3-硝基苯磺酸。例如一甲基取代的PEG可以在升高的溫度，優(yōu)選約100-110℃下與戊二酸酐反應(yīng)4小時。由此產(chǎn)生的一甲基PEG-戊二酸隨后在碳二亞胺試劑例如二環(huán)己基或異丙基碳二亞胺存在下與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)以產(chǎn)生活化的聚合物，甲氧基聚乙二醇-N-琥珀酰亞胺戊二酸酯，它隨后可與GH反應(yīng)。這個方法詳細(xì)描述于Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)中。在另一實例中，一甲基取代的PEG可以與戊二酸酐反應(yīng)，隨后在二環(huán)己基碳二亞胺存在下與4-羥基-3-硝基苯磺酸(HNSA)反應(yīng)產(chǎn)生活化的聚合物。HNSA在下列文獻(xiàn)中描述Bhatnagar等人，PeptidesSynthesis-Structure-Function，Proceedings of the SeventhAmerican Peptide Symposium；Rich等人(編者)(Pierce Chemical Co.，Rockford，III.，1981)，p.97-100；以及Nitecki等人，High-Technology Routeto Virus Vaccines(American Society forMicrobiology1986)，標(biāo)題為“Novel Agent for Coupling SyntheticPeptides to Carriers and Its Applications”。
產(chǎn)生與PEG綴合的GH的具體方法包括在關(guān)于PEG-GH的美國專利號4,179,337中和在美國專利號4,935,465中所描述的方法，后者公開了與GH可逆地但共價連接的PEG。
GH還可以通過持續(xù)釋放系統(tǒng)來適當(dāng)?shù)厥┯谩１疚闹杏杏玫某掷m(xù)釋放組合物的實例包括以成形物品形式的半可透性聚合物基質(zhì)，例如，薄膜或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)包括聚交酯化合物(美國專利號3,773,919，EP 58，481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚(2-羥乙基異丁烯酸酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羥丁酸(EP 133,988)或PLGA微球體。
持續(xù)釋放的GH組合物還包括脂質(zhì)體包裹的GH。包含GH的脂質(zhì)體通過自身已知的方法進(jìn)行制備DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請83-118008；美國專利號4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。通常，脂質(zhì)體為小的(約200-800埃)單層類型，其中脂質(zhì)含量為大于約30摩爾％的膽固醇，所選擇的比例被調(diào)整用于最佳治療。此外，如美國專利號4,857,505中所描述的，生物學(xué)活性的持續(xù)釋放制劑可以由與活化的多糖共價結(jié)合的GH的加合物制成。此外，美國專利號4,837,381描述了用于緩釋的脂肪或蠟或其混合物與GH的微球體組合物。
在另一實施方案中，如上鑒別的受試者也用有效量的IGF-1進(jìn)行治療。作為一般建議，每一劑量中腸胃外給藥的IGF-I的總藥物學(xué)上有效量將在約50-240μg/kg受試者體重/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選100-200μg/kg受試者體重/天，盡管如上所述，這將以大量治療判斷為條件。此外，優(yōu)選IGF-I每天皮下注射給藥一次或兩次。在一個進(jìn)一步的實施方案中，IGF-I和GH均可以每個以有效量，或每個以次優(yōu)但組合時有效的量施用于受試者。優(yōu)選地，施用約0.001-0.2mg/kg/天，或更優(yōu)選約0.01-0.1mg/kg/天的GH。優(yōu)選地，利用例如靜脈內(nèi)或皮下方式注射施用IGF-I和GH。更優(yōu)選地，IGF-I和GH通過皮下注射施用，最優(yōu)選每天注射。
應(yīng)當(dāng)指出設(shè)計IGF-I和GH劑量的從業(yè)醫(yī)師應(yīng)當(dāng)考慮用這些激素的治療的已知副作用。對于GH，副作用包括鈉滯留和細(xì)胞外容積膨脹(Ikkos等人，Acta Endocrinol.(Copenhagen)，32341-361(1959)；Biglieri等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，21361-370(1961)，以及高胰島素血癥和高血糖癥。IGF-I的主要的明顯副作用為低血糖癥。Guler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，862868-2872(1989)。事實上，IGF-I和GH的組合可以導(dǎo)致兩種試劑的有害副作用減少(例如IGF-I的低血糖癥和GH的高胰島素血癥)，并恢復(fù)GH的血液水平，GH的分泌被IGF-I抑制。
對于腸胃外給藥，在一個實施方案中，一般通過將所需純化程度的GH以可注射的單位劑量形式(溶液、懸浮液或乳狀液)與藥物學(xué)上可接受的載體混和來配制GH，所述藥物學(xué)上可接受的載體即在所采用的劑量和濃度上對受者是無毒的并且與制劑的其他成分相容的載體。例如，該制劑優(yōu)選不包括氧化劑和已知對多肽有害的其他化合物。一般地，通過將GH與液體載體或精細(xì)分割的固體支持物或兩者接觸來制備該制劑。隨后，必要時，將產(chǎn)物成形為所需制劑。優(yōu)選地，該載體為腸胃外載體，更優(yōu)選與受者血液等滲的溶液。此類載體媒介物的實例包括水、鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。非水性媒介物例如不揮發(fā)性油和油酸乙酯以及脂質(zhì)體在本文中同樣有用。
該載體適當(dāng)?shù)匕倭刻砑觿├缭鰪?qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。此類材料在所采用的劑量和濃度下對受者是無毒的，并且包括緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸和其他有機(jī)酸或其鹽；抗氧化劑例如抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)的多肽，例如多精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖及其他糖類，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；鰲合劑例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；抗衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或PEG。
GH一般單獨在此類媒介物中以約0.1mg/mL-100mg/mL，優(yōu)選1-10mg/mL的濃度，在pH為約4.5-8時進(jìn)行配制。GH優(yōu)選在pH 7.4-7.8時。將理解某些前述賦形劑、載體或穩(wěn)定劑的使用將導(dǎo)致GH鹽的形成。
雖然GH可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行配制，但GH的優(yōu)選制劑如下對于優(yōu)選的hGH(GENOTROPINTM)，單劑量注射劑包含0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg或2.0mg的重組促生長激素。所述GENOTROPINTM注射劑還包含0.21mg甘氨酸、12.5mg甘露醇、0.045mg磷酸二氫鈉(monoatriumphosphate)、0.025mg磷酸氫二鈉和水至0.25ml。
對于met-GH(PROTROPINTM)，預(yù)凍干的本體溶液包含2.0mg/mLmet-GH、16.0mg/mL甘露醇、0.14mg/mL磷酸鈉以及1.6mg/mL磷酸鈉(單堿價一水合物)，pH 7.8。met-GH的5mg管形瓶包含5mgmet-GH、40mg甘露醇和1.7mg總磷酸鈉(干重)(二堿價，無水的)，pH 7.8。10mg管形瓶包含10mg met-GH、80mg甘露醇和3.4mg總磷酸鈉(干重)(二堿價，無水的)，pH 7.8。
對于無甲硫氨酸的GH(NUTROPINTM)，預(yù)凍干的本體溶液包含2.0mg/mL GH、18.0mg/mL甘露醇、0.68mg/mL甘氨酸、0.45mg/mL磷酸鈉以及1.3mg/mL磷酸鈉(單堿價一水合物)，pH 7.4。5mg管形瓶包含5mg GH、45mg甘露醇、1.7mg甘氨酸和1.7mg總磷酸鈉(干重)(二堿價，無水的)，pH 7.4。10mg管形瓶包含10mg GH、90mg甘露醇、3.4mg甘氨酸和3.4mg總磷酸鈉(干重)(二堿價，無水的)。
可替代地，對于NUTROPINTMhGH可以采用液體制劑，例如5.0.+-.0.5mg/mL rhGH；8.8.+-.0.9mg/mL氯化鈉；2.0.+-.0.2mg/mL聚山梨醇酯20；2.5.+-.0.3mg/mL苯酚；2.68.+-.0.3mg/mL二水檸檬酸鈉；以及0.17.+-.0.02mg/mL無水檸檬酸(總無水檸檬酸鈉/檸檬酸為2.5mg/mL或10mM)；pH 6.0.+-.0.3。這個配方適合放在10mg管形瓶中，它是2.0mL的上述制劑填充在3cc玻璃小瓶中?？商娲?，包含上述制劑的10mg(2.0mL)藥筒可以放置在注射筆中以用于將液體GH注射給受試者。
用于治療性施用的GH組合物優(yōu)選是無菌的。通過經(jīng)無菌過濾膜(例如0.2微米膜)的過濾很容易完成滅菌。治療性GH組合物一般放置在具有無菌入口的容器內(nèi)，例如具有塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或管形瓶，所述塞子可被皮下注射針頭刺穿。
GH通常將會作為水溶液或作為用于重構(gòu)的凍干制劑儲存在單位或多劑量容器內(nèi)，例如密封的安瓿瓶或管形瓶。作為凍干制劑的一個實例，用無菌過濾的GH水溶液(w/v)填充管形瓶，并將所得到的混合物凍干。通過使用抑菌性注射用水重構(gòu)凍干的GH來制備輸注溶液。
參照下列實施例將更充分地理解本發(fā)明。然而，它們不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。所有的文獻(xiàn)和專利引用均特別明確地引入本文作為參考。
實施例實施例1GHRd3和GHRf1的基因分型根據(jù)Lahiri和Nurnberger(Nucl Ac Res 1991；195444)所描述的方法從外周血中獲得來自患者的基因組DNA。進(jìn)行關(guān)于GHR基因的外顯子3周圍區(qū)域的3248 bp片段的擴(kuò)增以研究SGA患者中可能的GHR依賴性生長激素應(yīng)答，所述片段包含由Stalling-Mann等人(ProcNat Acad Sci USA 1996；9312394-12399)報告的GHRf1-GHRd3多態(tài)性。利用具有改動的由Pantel等人(J Biol Chem 2000；2518664-18669)描述的多元策略通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA。簡言之，將200ng基因組DNA加入50μl含1.5mM MgCl2、0.5mM的每種dNTP、0.2μM的每種引物以及0.5 U Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes，Espoo，F(xiàn)inland)的反應(yīng)混合物中。G1、G2和G3引物被描述于GenBankTM登錄號155912中。循環(huán)條件如下起始變性步驟為98℃ 30秒，隨后為由98℃ 10秒；60℃ 30秒；72℃，1分30秒組成的40個循環(huán)，隨后為7分鐘的最后延伸步驟。
通過在預(yù)制的48孔含溴化乙錠的1.2％瓊脂糖凝膠(Ready-to-run Agarose Gel，Amersham Biosciences，San Francisco，CA)上電泳(25℃的室溫下，90v，15分鐘)來分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
當(dāng)檢測到純合子GHRd3/GHRd3基因型時，如果在多元反應(yīng)中被略微擴(kuò)增，在相同的條件下從DNA進(jìn)行只使用G1和G3的新的PCR擴(kuò)增，從而顯示935bp的產(chǎn)物。
評述我們通過自動化測序來驗證對于每種變體選自純合子DNA的兩種PCR產(chǎn)物的同一性。
這個測定中使用的Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes，Espoo，F(xiàn)inland)允許在較短的時間和較高的變性溫度(98℃)下強(qiáng)烈擴(kuò)增。
在第一系列中，我們在PAGE上進(jìn)行第二次電泳并隨后銀染色，以更好地顯現(xiàn)某些有疑問的雜合子樣品中的935bp的輕微條帶。我們進(jìn)一步驗證對疑問樣品用G1和G3引物的第二次PCR擴(kuò)增可以有確定的結(jié)果，并因而推薦執(zhí)行這個第二次PCR以確定GHRd3/GHRd3基因型。這個驗證更精確、更快速并且更便宜。
實施例2與GH應(yīng)答相關(guān)的GHRd3等位基因的檢測對參加重組GH治療試驗的71名SGA患者檢查共同的GHR外顯子3變體與對GH治療的生長速度應(yīng)答的關(guān)聯(lián)。參加本研究的患者根據(jù)下列選錄和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇選錄標(biāo)準(zhǔn)1.出生時被評估為體重和/或身高＜P10(Delgado等人，Anal EspPed.
Medicina Fetal y Neonatológica 1996；.4450-59)的有IGR史的男孩或女孩。
2.當(dāng)通過回波描記術(shù)或最后一次月經(jīng)的日期(DLP)以及新生兒的臨床評估確定時，胎齡超過35周。
3.實足年齡超過3歲。
4.目前身高等于或小于3個百分點或-1.88 SDS(Hernández，.Madrid.Editorial Garsi，1988)。
5.根據(jù)實足年齡，目前生長速度等于或小于50個百分點(Hernández，.Madrid.Editorial Garsi，1988)。
6.女孩為正常核型。
7.從患者/法定代理人處獲得書面試服志愿書。
排除標(biāo)準(zhǔn)1.局部缺血后的新生兒腦病。
2.伴隨的內(nèi)分泌病理，除了使用替代療法的甲狀腺機(jī)能減退之外。
3.長期的類固醇治療。
4.嚴(yán)重的慢性疾病(血液病理、肺部疾病、肝臟病理、吸收不良、神經(jīng)學(xué)改變等)。
5.贅生物。
6.顱內(nèi)放射史。
7.除Sylver-Russell之外的綜合征(骨發(fā)育不良、胎兒酒精綜合征、特納綜合征、塞克爾綜合征及其他異形性綜合征)。
8.染色體改變。
9.父母以前用生長激素治療過。
利用實施例1中所描述的方法，確定71名患者組的GHRd3基因型。結(jié)果見于表1和表2。
表1SGA患者中的GHRd3基因型分布
表2SGA患者中根據(jù)性別的GHRd3基因型分布
以1.4(U.kg.周)的劑量用rhGH治療患者。在用rhGH治療的過程中于1年的時期內(nèi)追蹤生長速率(表3)。攜帶GHRd3變體的患者在用rGH治療時以較慢的速率生長。因此GHR序列的基因組變異與rGH治療后生長速度的增量的顯著差異有關(guān)。
表33種基因型組的生長速率
序列表<110>Pharmacia&Upjohn<120>預(yù)測對作用于生長激素受體的試劑所作出的治療應(yīng)答的方法<130>GH response<150>60/586，380<151>2004-07-08<160>7<170>PatentIn vetsion 3.1<210>1<211>4414<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(44)..(1960)<223>
<400>1ccgcgctctc tgatcagagg cgaagctcgg aggtcctaca ggt atg gat ctc tgg55Met Asp Leu Trp1cag ctg ctg ttg acc ttg gca ctg gca gga tca agt gat gct ttt tct103Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser Asp Ala Phe Ser5 10 15 20gga agt gag gcc aca gca gct atc ctt agc aga gca ccc tgg agt ctg151Gly Set Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp Ser Leu25 30 35caa agt gtt aat cca ggc cta aag aca aat tct tct aag gag cct aaa199Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu Pro Lys40 45 50ttc acc aag tgc cgt tca cct gag cga gag act ttt tca tgc cac tgg247
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1.一種預(yù)測受試者對能夠結(jié)合GHR蛋白的試劑所作出的應(yīng)答的方法，包括確定受試者中GHR基因的GHRd3等位基因和/或GHRf1等位基因的存在或不存在，其中所述GHRd3等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答減少這種可能性相關(guān)而GHRf1等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加這種可能性相關(guān)，從而鑒定所述受試者具有減少或增加的對用所述試劑的治療作出應(yīng)答的可能性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者為特發(fā)性身材矮小癥(ISS)、極低出生體重(VLBW)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)或小于胎齡(SGA)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述受試者為SGA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項的方法，其中所述試劑為GHR激動劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述GHR激動劑為GH，優(yōu)選促生長激素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑為GHR拮抗劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述GHR拮抗劑為培維索孟。
8.一種治療患有涉及GHR的疾病或病癥的受試者的方法，所述方法包括(a)確定受試者中GHR基因的GHRd3等位基因和/或GHRf1等位基因的存在或不存在，其中所述GHRd3等位基因與對能夠結(jié)合GHR蛋白或經(jīng)由GHR途徑起作用的試劑的陽性應(yīng)答減少這種可能性相關(guān)而GHRf1等位基因與對所述試劑的陽性應(yīng)答增加這種可能性相關(guān)；以及(b)選擇或確定待施用給所述受試者的所述試劑的有效量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中具有身材矮小癥的所述受試者為特發(fā)性身材矮小癥(ISS)、極低出生體重(VLBW)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)或小于胎齡(SGA)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述受試者為SGA。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任何一項的方法，其中所述試劑為GHR激動劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述GHR激動劑為GH，優(yōu)選促生長激素。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述試劑為GHR拮抗劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述GHR拮抗劑為培維索孟。
15.根據(jù)權(quán)利要求8-14中任何一項的方法，其進(jìn)一步包括(c)對所述受試者施用所述有效量的所述試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)測受試者對作用于生長激素受體的試劑所作出的治療應(yīng)答程度的方法。優(yōu)選方面包括增加具有身材矮小癥的人類受試者的高度的方法，以及治療肥胖和肢端肥大癥的方法。
文檔編號G01N33/74GK1981056SQ200580022888
公開日2007年6月13日 申請日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者L·A·帕羅蒂 申請人:法瑪西雅厄普約翰有限責(zé)任公司