專利名稱：用于奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過測定配種后奶牛的乳汁孕酮含量進行奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測方法，屬于膠體金免疫診斷技術領域。
背景技術：
提高牛奶產量，盡量縮短空懷期是奶牛飼養(yǎng)管理的目標之一。因此奶牛早期妊娠診斷是促進奶牛業(yè)發(fā)展的重要措施。簡便而有效的奶牛早期妊娠診斷方法，是養(yǎng)牛生產者及畜牧獸醫(yī)工作者長期以來亟待解決的問題。因為奶牛早期妊娠診斷是改善奶牛飼養(yǎng)管理，提高繁殖率的一項重要措施。如果奶牛配種后不能及時診斷是否妊娠，就可導致產犢間隔延長、繁殖率降低、奶產量減少，飼養(yǎng)管理成本增高，大大影響經(jīng)濟效益。據(jù)報道，如延誤1個情期(一般是21天)，每頭牛將減少奶產量168-315kg；另據(jù)專家估計，每頭多喂1天將在飼料、人工、能源等方面多耗20-32元，多喂一個發(fā)情周期將增加成本420-672元。若利用此方法能及時對奶牛妊娠進行診斷，則其經(jīng)濟效益十分顯著。目前我國奶牛的第一情期受孕率僅40-60％，多數(shù)奶牛需配種(授精)2-3次才能受孕，以延誤1-2個發(fā)情周期計算，減奶168-630kg。
可見，奶牛早期妊娠診斷技術的研究，對縮短空懷期和產犢間隔，提高繁殖率，進一步促進奶牛業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟意義。
乳汁孕酮(MP4)濃度的變化是標示母牛卵巢活動的一項特異指征。應用放射免疫測定法(RIA)測定MP4，證明了MP4的變化所反映的發(fā)情周期階段與直檢卵巢的評估結果相一致。因此，可以通過MP4的濃度來監(jiān)測母牛的生殖活動。MP4濃度隨著母牛所處的生殖生理階段不同具有特征性變化，根據(jù)文獻報道曾憲垠等。應用雙抗EIA檢測奶牛發(fā)情周期中奶孕酮含量。四川農業(yè)大學學報，1996，14(3)453-456.其變化規(guī)律為配種后1-5天，乳汁中孕酮含量低，小于3ng/ml。隨著配種后天數(shù)的增加，孕酮含量也逐漸增加。配種后11天，孕酮含量迅速升高。配種后11-19天，孕酮含量維持在較高水平，均大于8ng/ml。配種后1-19天，孕與非孕牛奶中孕酮含量無明顯差異。20天以后，非孕牛奶中孕酮含量開始下降，配種后21天陡降到低水平(小于1ng/ml)，而孕牛奶中孕酮含量則繼續(xù)維持在較高水平。經(jīng)統(tǒng)計學T檢驗，配種后21-24天，孕牛乳汁孕酮含量顯著高于非孕牛(p＜0.01)。孕與非孕牛配種后0-29天乳汁孕酮含量變化圖式不相同，非孕牛配種后25天起，乳中孕酮含量又逐漸上升。因此采集配種后25-30天乳樣并測定其MP4含量，對早孕診斷是切實可行的。
目前在奶牛早期妊娠診斷中常用的幾種方法有直腸診斷法，超聲波診斷法，孕酮的放射免疫法和孕酮的酶標免疫法。其中直腸診斷法要求操作者必須具有一定的臨床經(jīng)驗，較為費時費力，有時還會引起疾病傳染或流產，而且兩個半月才能檢測出懷孕的征象，做出診斷。超聲波診斷法由于儀器昂貴和專業(yè)技術人員操作而使其廣泛應用受限；孕酮的放射免疫法又具有放射性污染，需要特殊防護設備、價格昂貴的儀器和訓練有素的人員，而且操作費時等弊端，樣品的測試僅限于專門的實驗室；孕酮酶標免疫法是近年來使用較多的方法，但仍需要專業(yè)人員或經(jīng)培訓的人員操作，并且檢測時間長，步驟多，試劑盒也需冷藏。

發(fā)明內容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中存在的一些缺點，提供了一種通過膠體金免疫法來檢測配種后奶牛乳汁中的孕酮含量，現(xiàn)場診斷奶牛早孕的檢測試紙及其檢測方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的在奶牛早期妊娠診斷試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和孕酮單克隆抗體金標墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在孕酮單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。關于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標墊的組合方法已是公知技術。萬華普曼生物工程有限公司于1995年已獲雙抗夾心法檢測人絨毛膜促性腺激素診斷試紙的國藥批準文號國藥準字S10950049號；1998年獲得競爭法檢測嗎啡試紙的國藥字批準文號國藥準字S19990038號，并將產品投放市場。
方案1雙抗夾心法由于孕酮分子有不同的結合位點，用不同的方法來合成不同結合位點的免疫原，將免疫原進行免疫，篩選出兩種不同孕酮單克隆抗體，兩種不同抗體能夠識別同一抗原并以夾心的方式結合于同一孕酮分子的不同位點，利用雙抗夾心法原理制成的試紙一種抗體稱為I用于包被試驗線，另一種抗體稱為II用于膠體金標記。
把奶牛早期妊娠診斷試紙的樣品吸液層端放入待測的奶牛乳汁中(液面不得超過MAX線圖中8)，由于毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當移動至孕酮單克隆抗體II金標墊時，樣品中的孕酮與孕酮單克隆抗體金標探針發(fā)生特異結合，當移動至固定有孕酮單克隆抗體I試驗線時，樣品中的孕酮另一位點又與試驗線中的孕酮單克隆抗體相結合，因此其膠體金滯留于試驗線上，試驗線處顯示紅色，為陽性；相反如果樣品中沒有孕酮，抗孕酮單克隆抗體金標探針就不會與試驗線上的孕酮單克隆抗體I發(fā)生特異結合，沒有膠體金滯留，即僅有一條紅色控制線為陰性，這就是雙抗夾心法原理。根據(jù)此原理，兩條線為陽性，一條線為陰性得出診斷。
方案2競爭法試驗線是由孕酮-BSA包被。把奶牛早期妊娠診斷試紙的樣品吸液層端放入奶牛乳汁中，由于毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當移動至孕酮單克隆抗體金標墊時，樣品中的孕酮與孕酮單克隆抗體金標探針發(fā)生特異結合，當移動至固定有孕酮-BSA聯(lián)結物試驗線時，由于孕酮單克隆抗體金標墊中的抗體與樣品中孕酮優(yōu)先結合成復合物而失去其與孕酮-BSA結合，因此其膠體金不能滯留于試驗線上，試驗線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽性；相反如果樣品中沒有孕酮，孕酮單克隆抗體金標墊中的抗體移動到試驗線上，孕酮單克隆抗體就會與孕酮-BSA聯(lián)結物發(fā)生特異結合，使膠體金滯留于試驗線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競爭法原理。試驗線的顏色深淺與樣品中孕酮含量高低成反比。從陽性過渡到陰性，由于所測孕酮含量不同，試驗線的顏色也不同，形成一個紅色顏色梯度差，以這種原理檢測出OD值，從而推斷出試驗線所反應的實際孕酮ng水平，從而得出診斷。
方案1或方案2中，當移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無孕酮，標記的金標探針都會與已設定好的羊抗鼠多克隆抗體結合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產生則代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過期。
由于采用上述技術方案，本發(fā)明所提供的奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法具有這樣的有益效果，即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。


圖1為本發(fā)明奶牛早期妊娠診斷試紙的主視結構圖。
圖2為發(fā)明圖1的側視結構圖。
圖3為本發(fā)明方案1雙抗夾心法的應用于檢測時顯示為陰性結果圖；發(fā)明方案2競爭法的應用于檢測時顯示的陽性結果圖。
圖4為本發(fā)明方案1雙抗夾心法應用于檢測時顯示為陽性結果圖；發(fā)明方案2競爭法的應用于檢測時顯示的陰性結果圖。
圖5為本發(fā)明方案2競爭法所制試紙比色用的檢測色標。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體金標墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實施例1.孕酮免疫原合成(1)抗原I的合成半抗原I的合成將10.45g(0.033mol)孕烯醇酮與10.45g(0.082mol)(0-羰基甲基)羥胺鹽酸鹽，溶于517ml含有46.5ml 2N KOH乙醇溶液中，將此溶液回流3小時，旋轉蒸除溶劑，向體系中添加150ml水，用2N KOH溶液調pH值在10～10.5范圍，用乙酸乙酯萃取2次，再用濃HCl酸化水相到pH值至2左右，于冰箱中放置24h，過濾后用水洗滌沉淀，產物A約為13g，再用乙酸乙酯重結晶，得到產物12g。
將0.68g A加入到50ml乙酸乙酯中，加入10ml乙醚和重氮甲烷的混合溶液，有氣泡放出，反應體系常溫攪拌過夜，過量的重氮甲烷用少量的冰醋酸除去，旋轉蒸除反應體系中的溶劑，得到0.6g晶體B。
取2.57g(6.4mmol)B加入95ml無水丙酮和25ml無水苯，加熱回流，加入異丙醇鋁溶液(4.73g異丙醇鋁溶于100ml無水苯中)，反應液回流8h后，轉移到分液漏斗中，并添加25ml苯。用40ml 50％羅氏鹽溶液洗滌混合液，濾出固體并分出苯層，用水洗滌三次，用無水硫酸鈉干燥，過濾出干燥劑后，旋轉蒸除溶劑，得到1.62g粘稠狀固體，將該固體用少量苯稀釋，通過硅膠柱純化，重結晶后得到中間體C。
取2.18gC溶于78.5ml甲醇中，加入8.7ml(0.1N)NaOH，室溫下攪拌反應，每隔1h取出少量反應液，用水稀釋后進行TLC檢測，3h后基本反應完全。濃縮反應物，用蒸餾水稀釋，用50ml乙醚洗滌兩次。水層用1NHCl調pH值至2左右，冷藏過夜后過濾，用水洗滌濾餅，在真空干燥箱中(90～95℃)干燥2小時，得到粗品。用水和甲醇重結晶2次，得到產物D。
取2.33gD溶于350ml丙酮中，并冷卻到10℃，通N2，滴加瓊斯鉻酸氧化劑并將反應溫度保持在15℃左右，直至出現(xiàn)橄欖綠色沉淀，加入2L含20ml甲醇的水溶液，使沉淀完全。過濾、水洗、風干，得到2.28g產物E，將其溶于150ml甲醇中，加5滴10％KOH溶液，冷藏過夜，用HCl調pH值至2左右，添加足夠的水使沉淀完全，用乙酸乙酯萃取，用水洗滌酯層，無水Na2SO4干燥，旋轉蒸除溶劑。用丙酮-石油醚重結晶得1.9g孕酮半抗原I(P4I)。P4免疫抗原I和檢測抗原I的合成1.2g的孕酮半抗原I(P4I)和0.75ml三正丁胺溶于30ml二氧六環(huán)中，冷卻至8℃，加入0.4ml氯甲酸異丁酯。這個反應在8℃下進行35min，而后混合溶液被添加到BSA溶液中(4.2g BSA、110ml H2O、80ml二氧六環(huán)、4.8ml 1N NaOH)，此時pH值為9，冷卻、攪拌。溶液開始時混濁，20min后變清，測pH值降到6.8左右。用1N NaOH溶液將反應液pH值調到7.5左右，攪拌30min，加入0.5ml此濃度NaOH溶液。反應進行4.5h后，用蒸餾水透析過夜，用1N HCl調pH值至4.5，過濾，沉淀冷凍24小時，將連接物(沉淀)加到200ml水中，用1N NaOH調pH值至7左右，再加300ml丙酮用1N HCl調pH值至5左右，連接物又變成沉淀。冷藏3小時后離心連接物，得到兩個相似沉淀。
用蒸餾水透析5天，每天更換透析液2次，冷凍干燥后得到P4免疫抗原I(P4I-BSA)。
同法合成P4檢測抗原I(P4I-OVA)。
(2)抗原II的合成半抗原II的合成稱取1.0g 11α-羥基孕酮溶解于40ml無水吡啶中，加入3g琥珀酸酐，在120℃下回流24h，用簿層色譜(TLC)法檢測，反應完全。冷卻，向反應體系中添加200ml蒸餾水。先用乙醚萃取反應液(100mL×2)，用水洗一次乙醚相(1/20vol)，再用飽和碳酸鈉溶液洗滌一次。分離水相，用10％的鹽酸酸化水相pH值至4左右，再用乙酸乙酯萃取3遍，無水Na2SO4干燥有機相。旋轉蒸除溶劑，得到的黃色油狀物用乙酸乙酯和石油醚重結晶，得到11α-羥基孕酮半琥珀酸，即半抗原II(P4II)。
P4免疫抗原II和檢測抗原II的合成稱取11α-羥基孕酮半抗原(P4II)215mg溶于2ml無水二氧六環(huán)中，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)113mg溶于1ml無水二氧六環(huán)中，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)57.5mg溶于1ml無水二氧六環(huán)中。三種溶液混合，室溫攪拌2h。
過濾(除尿素)，用無水二氧六環(huán)洗滌(總體積8ml)。取6.4ml濾液逐滴滴加到BSA溶液(500mg BSA溶于10ml 0.2mol/L磷酸緩沖液)中，添加水和二氧六環(huán)防止產成沉淀，室溫下攪拌過夜。
過濾反應液，用蒸餾水于4℃下透析5天，每天換液2次，冷凍干燥后得到P4免疫抗原II(P4II-BSA)。
同法合成P4檢測抗原II(P4II-OVA)。
2.孕酮單克隆抗體的制備。
(1)將制備的兩種不同結合位點的孕酮-BSA分別免疫BALB/c小鼠。用SP20細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得與孕酮分子不同位點結合的兩種孕酮單克隆抗體I、II，II可用于雙抗夾心法的膠體金標記和競爭法的膠體金標記。
3.膠體金的制備及與孕酮單克隆抗體的結合。
(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90～95℃，加入適量枸櫞酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把孕酮單克隆抗體標記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合按公知技術組合。
使用方法授精后25-30天為早孕最佳檢測時間。把奶牛早期妊娠診斷試紙的樣品吸液層端放入新采的牛奶中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，雙抗夾心為5分鐘時觀察結果，競爭法為15分鐘時觀察結果。
結果判斷方案1利用雙抗夾心法制成試紙的反應線顏色為紅色，即顯色區(qū)為兩條紅色線時為陽性；只有一條紅色控制線時為陰性；如果顯色區(qū)有兩條線，其中試驗線未變紅色時則判斷為可疑。
方案2利用競爭法制成試紙其檢測色標所標定的深紅色代表的陰性值為孕酮濃度4ng/ml以下，淺紅色代表陽性值為孕酮濃度8ng/ml以上，顏色在兩者之間為可疑。光電儀器的標準值，其中陽性值代表孕酮濃度在8ng/ml以上，陰性值代表孕酮濃度在4ng/ml以下，在兩值之間的值判定為可疑。
權利要求
1.一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，試紙是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、孕酮單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和孕酮單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在孕酮單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層，其特征在于利用免疫膠體金法來進行奶牛的早期妊娠診斷，進而確定所測奶牛是否懷孕。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于此試紙可用兩種不同的方法制成，一種是由雙抗夾心原理制成，另一種是由競爭法原理制成。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，當樣品通過膠體金標記的孕酮單克隆抗體移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，控制線便顯示紅色。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于由于孕酮分子有不同的結合位點，用不同的方法來合成不同結合位點的免疫原，將免疫原進行免疫，篩選出兩種不同孕酮單克隆抗體，兩種不同抗體能夠識別同一抗原并以夾心的方式結合于同一孕酮分子的不同位點，利用雙抗夾心法原理制成的試紙一種抗體稱為I用于包被試驗線，另一種抗體稱為II用于膠體金標記。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于利用競爭法原理所制成的試紙由孕酮-BSA包被試驗線，篩選一種特異性強、靈敏度高的單克隆抗體作為膠體金標記。
6.根據(jù)權利要求1或4所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于利用雙抗夾心法制成試紙的試驗線顏色深淺與檢測樣品中孕酮含量高低成正比。
7.根據(jù)權利要求1或5所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于利用競爭法制成試紙的試驗線顏色深淺與檢測樣品中孕酮含量高低成反比。
8.根據(jù)權利要求4所述一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于利用雙抗夾心法制成試紙的反應線顏色為紅色，即顯色區(qū)為兩條線時為陽性；只有一控制線為紅色時為陰性；如果顯色區(qū)有兩條線，其中試驗線未變紅色時則判斷為可疑。
9.根據(jù)權利要求5所述一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測方法，其特征在于利用競爭法制成試紙其檢測色標所標定的深紅色代表陰性值為孕酮濃度4ng/ml以下，淺紅色色標代表陽性值為孕酮濃度8ng/ml以上，顏色在深淺色標之間為可疑；光電儀器的標準值，其中陽性值代表孕酮濃度在8ng/ml以上，陰性值代表孕酮濃度在4ng/ml以下，在兩值之間的值判定為可疑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過測定配種后牛的乳汁孕酮含量進行奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測方法，屬于膠體金免疫檢測領域。試紙是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、孕酮單克隆抗體金標墊、樣品吸液層組成；利用雙抗夾心和競爭兩種不同的方法制成試紙，檢測授精后25－30天的奶牛乳汁，根據(jù)顯色區(qū)的不同顏色變化來判斷所測奶牛是否懷孕。奶牛早期妊娠診斷試紙?zhí)禺愋詮?，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。
文檔編號G01N33/52GK1796998SQ20051010916
公開日2006年7月5日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權日2004年12月30日
發(fā)明者萬積成 申請人:萬積成