專利名稱：用于檢測和/或診斷宮頸癌和其它癌癥的來自人乳頭瘤病毒16和18的e2、e6和e7蛋白的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及肽領(lǐng)域，所述肽對于針對人類乳頭瘤病毒(HPV)形成的抗體具有活性，更具體地，本發(fā)明是涉及從HPV的E2、E6和E7癌蛋白的早期編碼區(qū)分離、純化或衍生出的新穎的肽，以及通過免疫測定法(immunoassay)來檢測和/或診斷與HPV相關(guān)的上皮細(xì)胞異常(epithelial cell abnormalities)、癌前期狀況(precancerousconditions)和癌癥的方法。
背景技術(shù)：
人類乳頭瘤病毒(HPV)實質(zhì)上可以引起所有的子宮頸癌，如此命名人類乳頭瘤病毒的原因在于某些類型可誘導(dǎo)疣或乳頭瘤(Nobbenhuis等人，“Relation of human papillomavirus status to cervicallesions and consequences for cervical-cancer screeninga prospectivestudy，”The Lancet，35420-25，1999；Cuzick等人，“A systematic reviewof the role of human papilloma virus(HPV)testing within a cervicalscreening programmesummary and conclusions，”British Journal ofCancer，83561-565，2000)。這些癌癥不僅包括鱗狀細(xì)胞癌(Nobbenhuis等人，1999)，而且包括腺癌(Pirog等人，“Prevalence of humanpapillomavirus DNA in different histological subtypes of cervicaladenocarcinoma，”American Journal of Pathology，1571055-1062，2000)。這些病毒也與如下癌癥密切相關(guān)外陰和陰道癌(Frisch等人，“Humanpapillomavirus-associated carcinomas in Hawaii and the mainland US，”Cancer 881464-1469，2000；Sugase等人，“Distinct manifestations ofhuman papillomaviruses in the vagina，”International Journal of Cancer，72412-415，1997)，以及肛門癌(Frisch等人，2000)和陰莖癌(Gregoire等人，“Preferential association of human papillomavirus with high-gradehistologic variants of penile-invasive squamous cell carcinoma，”Journal ofthe National Cancer Institute，871705-1709，1995)。
而且，HPV可能是造成頭部和頸部區(qū)域中某些癌癥的原因(Mellin等人，“Human papillomavirus(HPV)DNA in tonsillar cancerclinicalcorrelates，risk of relapse，and survival，”International Journal of Cancer，89300-304，2000；Zumbach等人，“Antibodies against oncoproteins E6 andE7 of human papillomavirus types 16 and 18 in patients withhead-and-neck squamous-cell carcinoma，”International Journal of Cancer，85815-818，2000)，似乎與更致命的黑素瘤有關(guān)(Dreau等人，“Humanpapillomarivus in melanoma biopsy specimens and its relations tomelanoma progression，”Annals of Surgery，231664-671，2000)，在肺癌(Soini等人，“Presence of human papillomavirus DNA and abnormal p53protein accumulation in lung carcinoma，”Thorax 51887-893，1996)以及可能在其它癌癥中也起著作用。
子宮頸癌是全世界婦女中第二常見的癌癥。每年全球大約有450,000名婦女被診斷出患有子宮頸癌，接近300,000名婦女死于這一癌癥。由于五十年前通過細(xì)胞學(xué)進(jìn)行的有組織的子宮頸癌篩選的出現(xiàn)，在發(fā)達(dá)國家子宮頸癌的死亡率已經(jīng)顯著地下降。事實上，子宮頸癌被認(rèn)為是可以預(yù)防的。在這一點上，預(yù)防的關(guān)鍵在于通過可以實施的和支付得起的篩選程序和方法及時鑒別和控制癌前期病變或者早期癌癥。
目前，在全球范圍內(nèi)大約有百分之十二(12％)的女性癌癥是由子宮頸的HPV感染引起的。在醫(yī)學(xué)界中存在這樣的共同看法，即致癌HPV的檢測將是鑒別癌癥受害者或那些對該疾病存在高風(fēng)險的個體的一種有效的方式。特別地，HPV檢測將有助于癌癥或細(xì)胞異常的早期檢測，在癌癥或細(xì)胞異常處于更易于治愈階段的某一時刻時，及時提示癌癥。
用于子宮頸癌的公共衛(wèi)生篩選的主要方法一直是帕帕尼科拉烏(Pap)涂片(Papanicolaou’s smear)。由于多種原因，帕帕尼科拉烏涂片不是一種理想的篩選測試。缺點包括獲得樣品比較困難，假陰性的比率高(高達(dá)百分之二十(20％))，以及要求經(jīng)過高級訓(xùn)練的人員來進(jìn)行專業(yè)化的實驗。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)開發(fā)了核酸篩選方法，但這樣的方法也不理想，主要是由于其高成本和對經(jīng)過高級訓(xùn)練人員的類似要求。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員開發(fā)的另一種檢測方法涉及所謂的“DNA雜交捕獲(DNA Hybrid Capture)”。然而該方法往往要遭遇高成本和取樣困難，從而使其作為理想的篩選檢驗有點不太適宜。
最近，為了診斷目的，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)開發(fā)了用于檢驗HPV的方法。更具體地，針對HPV獲得的IgA、IgG和IgM抗體已經(jīng)被用于檢測HPV的感染，以及用于診斷癌癥或其前期階段。使用這些現(xiàn)有技術(shù)，已經(jīng)確定從HPV分離的免疫反應(yīng)性肽具有可與人類血清反應(yīng)的表位(epitope)。然而，現(xiàn)有技術(shù)沒有公開本發(fā)明的肽，也沒有教導(dǎo)抗體-表位復(fù)合體的多重組合可以產(chǎn)生具有改進(jìn)的靈敏度和/或特異性的診斷檢測方法。
用于癌癥篩選的現(xiàn)有技術(shù)方法由于其成本、取樣程序、準(zhǔn)確度、設(shè)備和人員要求而受到限制。因此，正如本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所容易理解的那樣，可以在容易獲得的個體樣品上進(jìn)行的低成本以及簡單、靈敏和特異性的檢測方法將是本技術(shù)領(lǐng)域的一個顯著進(jìn)步。此處公開且要求保護(hù)這樣的檢測方法。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，正如此處所具體且廣泛描述的，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案包括新穎的肽，其序列是由HPV 16和18的E2、E6和E7癌蛋白的早期編碼區(qū)的仔細(xì)分析分離出來的。所述肽可以使它們進(jìn)行高度靈敏和特異的診斷性免疫測定。在那些被HPV相關(guān)的腫瘤感染的個體中可以發(fā)現(xiàn)E2、E6和E7癌蛋白的抗體。
本發(fā)明的肽，在進(jìn)行修改之前，大小范圍為大約17個氨基酸殘基到大約23個氨基酸殘基，它們可以通過化學(xué)方法很容易地合成，并且可以達(dá)到高于95％的純度。盡管可以通過其它方法獲得所述肽，但是它們以純化形式存在時，與隨機(jī)抗體發(fā)生的不希望的交叉反應(yīng)的可能性通常會極大降低。因此，本發(fā)明的純化肽可以使它們適合于具有高度特異性的診斷性免疫測定。本發(fā)明的診斷免疫測定方法的一個優(yōu)選實施方案可以包括如下步驟(1)獲取可能含有抗體的體液或組織樣品；(2)如果存在抗體，使樣品與本發(fā)明的一種或多種肽反應(yīng)；和(3)測定反應(yīng)后的樣品是否存在抗體-肽反應(yīng)。
使用了從HPV 16和18的E6和E7癌蛋白分離、純化或衍生的肽的免疫測定可以作為已經(jīng)發(fā)生的與HPV相關(guān)的惡性腫瘤或惡化前細(xì)胞轉(zhuǎn)化(premalignant cell transformation)的可靠指示。同樣地，使用了從HPV 16和18的E2區(qū)分離、純化或衍生的某些肽的免疫測定可以作為與HPV相關(guān)的感染、惡性腫瘤或惡化前細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可靠指示。
本發(fā)明的最有用的改進(jìn)或方面之一是在于診斷子宮頸癌，包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，以及與致癌性HPV感染相關(guān)的任何上皮細(xì)胞異常，包括但不限于，細(xì)胞中空(koilocytosis)；過度角化；包括上皮內(nèi)瘤形成或上皮內(nèi)損害在內(nèi)的癌前期狀況；高度發(fā)育異常(high-gradedysplasias)；以及侵入性(invasive)或惡性癌癥。除了其在子宮頸癌診斷中的用途，發(fā)現(xiàn)由HPV 16和18的E2、E6和E7癌蛋白分離、純化或衍生的肽的抗體在檢測頭頸部癌癥、小細(xì)胞肺癌、陰莖和肛門癌癥、黑素瘤和其它由HPV引起或與HPV相關(guān)的癌前期或癌癥狀況中也是有用的。


根據(jù)下述描述和所附的權(quán)利要求，結(jié)合考慮附圖，本發(fā)明的前述和其它目的和特征將更加完全地顯而易見。應(yīng)該理解的是，這些附圖僅僅描繪了本發(fā)明的典型實施方案，因此，這些附圖不應(yīng)該被認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明將通過使用附圖對其它特異性和細(xì)節(jié)進(jìn)行描述，其中圖1是一個表，該表顯示了Pap涂片細(xì)胞學(xué)和應(yīng)用了HPV DNA雜交捕獲的診斷性免疫測定的結(jié)果，這些測定的對象患有或未患有與HPV相關(guān)的發(fā)育異常或其它的惡化前狀況和癌癥；圖2是一個表，該表進(jìn)一步顯示了應(yīng)用了本發(fā)明的肽的診斷性免疫測定的結(jié)果，所述測定的對象患有或未患有與HPV相關(guān)的發(fā)育異?；蚱渌膼夯盃顩r和癌癥。
優(yōu)選實施方案應(yīng)該理解到，正如此處在圖中所描述和說明的那樣，本發(fā)明的分離的蛋白序列和方法，可以以大量不同的方式被安排和設(shè)計。當(dāng)然，正如所描述的，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該意識到，此處的細(xì)節(jié)可以在不背離本發(fā)明必要特征的情況下做出各種修改。因此，下面的如圖1和2中所表示的對本發(fā)明的分離的蛋白序列和方法的實施方案的更詳細(xì)描述的目的不在于限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍，僅僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的代表。
HPV以不同的基因類型或基因型存在，它們通過數(shù)字來表示，對于這些基因型，只有一部分是致癌的或引起癌癥的。已經(jīng)鑒別出多于100種HPV基因型。這些HPV基因型有時被稱作HPV病毒株或HPV病毒類型，通常僅僅通過數(shù)字或通過“HPV#”來指定或提及，其中“#”是致癌的或引起癌癥的基因型的數(shù)字標(biāo)識。癌癥主要由HPV 16和18導(dǎo)致，但也可能與HPV 31、33、35、45、51、52、56和58有關(guān)。病毒感染子宮頸和其它通常支持病毒繁殖的細(xì)胞，在這些地方病毒可能引起能導(dǎo)致對生命構(gòu)成威脅的惡性腫瘤的異常細(xì)胞變化。
HPV感染能夠復(fù)制它們的DNA的細(xì)胞，特別是那些基底表皮層中的細(xì)胞。HPV通過將基底增殖細(xì)胞暴露于表面的微小損傷進(jìn)入基底表皮層。病毒附著于細(xì)胞表面受體，從而進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)中。具有感染性的HPV顆粒含有7000到8000個堿基對的閉環(huán)雙鏈DNA基因組，包括8個早期轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框，即E1到E8，有時被稱作早期編碼區(qū)，它們在各HPV基因型中的表現(xiàn)并不是同等的，HPV基因組還包括兩個晚期開放閱讀框和一個非編碼長控制區(qū)。
關(guān)于HPV DNA如何整合到宿主染色體中，以及E1和E2癌蛋白質(zhì)如何參與到該過程中已經(jīng)有很多發(fā)現(xiàn)。免疫學(xué)診斷的關(guān)聯(lián)性在于，針對E1和E2基因產(chǎn)物的抗體可能是HPV感染已經(jīng)發(fā)生的跡象。
HPV感染導(dǎo)致癌癥的方式包括E6和E7基因產(chǎn)物的細(xì)胞相互作用。換一種說法，編碼氨基酸的E6和E7基因被翻譯成蛋白序列或肽，然后與細(xì)胞結(jié)構(gòu)或蛋白相互作用，從而可以導(dǎo)致癌癥?？赡軐?dǎo)致腫瘤或癌癥的基因產(chǎn)物通常被稱作致癌蛋白或癌蛋白。
在宿主細(xì)胞中，E6和E7基因產(chǎn)物與細(xì)胞p53和調(diào)控細(xì)胞分裂的眼癌腫瘤抑制蛋白形成復(fù)合物。通過功能性地中和或滅活這些蛋白，細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期。E7癌蛋白進(jìn)一步通過與依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶抑制劑蛋白p21的相互作用破壞細(xì)胞控制的穩(wěn)定性。這些相互作用為控制宿主細(xì)胞增殖和分化(即轉(zhuǎn)化)創(chuàng)造了條件，這是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤發(fā)生前(即癌前期)細(xì)胞，并最終轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤或癌癥的完全表達(dá)中的第一個步驟。
E6和E7癌蛋白在腫瘤細(xì)胞中被組成型地表達(dá)，使這些基因沉默可以使惡性表現(xiàn)型逆轉(zhuǎn)。因此，E6和E7基因產(chǎn)物似乎是腫瘤特異性抗原，并且在免疫學(xué)的癌癥檢測中是抗體的可能靶標(biāo)或探針，還可以在控制HPV誘導(dǎo)型腫瘤的疫苗中用作抗原。
事實上，E6和E7癌蛋白似乎是抗體產(chǎn)生的天然靶標(biāo)，這是由于它們在子宮頸癌細(xì)胞中的一致表達(dá)。在早期研究中針對E7癌蛋白的響應(yīng)僅僅具有適度的疾病特異性，但現(xiàn)在E7IgG和IgA已經(jīng)被檢驗為具有很強的疾病相關(guān)性。與非癌癥對照組的抗體相比，針對E6和E7癌蛋白的抗體在子宮頸癌病人血清中的水平較高。而且，甚至當(dāng)以較低量存在時，這樣的抗體似乎也可以通過免疫學(xué)方法檢測。多種病毒蛋白的血清實驗的組合可以增加鑒別HPV感染和可能的癌癥的靈敏度。因此，對于來自子宮頸癌病人的樣品，應(yīng)用兩種癌蛋白，產(chǎn)生了陽性的免疫學(xué)結(jié)果。
除了本發(fā)明的方法，應(yīng)用利用了來自HPV E2、E6和E7早期編碼區(qū)中的兩個或多個的基因產(chǎn)物、蛋白序列或肽的組合的檢測或診斷方法，也是有益的。來自HPV E2以及HPV E6或E7的分離出的蛋白序列或肽的組合可以允許更靈敏和/或更特異的用于檢測或診斷HPV病毒整合(即感染)到宿主細(xì)胞中，以及檢測或診斷與HPV相關(guān)的細(xì)胞異常的方法。作為選擇，來自HPV E6和E7的分離出的蛋白序列或肽的組合可以允許更靈敏和/或更特異的用于檢測或診斷某些細(xì)胞異常的方法。
針對E2的抗體也可能與惡化前狀況和癌癥有關(guān)(Stevenson等人，“Inverse relationship between the expression ofthe human papillomavirustype 16 transcription factor E2 and virus DNA copy number during theprogression of cervical intraepithelial neoplasias，”Journal of GeneralVirology，811825-1832，2001；Tonon等人，“Physical status of the E2human papilloma virus 16 viral gene in cervical preneoplastic andneoplastic lesions，”Journal of Clinical Virology，21129-134，2001；Lindel等人，“Human papillomavirus positive squamous cell carcinoma of theoropharynxa radiosensitive subgroup of head and neck carcinoma，”Cancer，92805-813，2001；Rosales等人，“Antibodies against humanpapillomavirus(HPV)type 16 and 18 E2，E6 and E7 proteins in seracorrelation with presence of papillomavirus DNA，”Journal of MedicalVirology，65736-744，2001；Sheets等人，“Immunotherapy of humancervical high-grade cervical intraepithelial neoplasia withmicroparticle-delivered human papillomavirus 16 E7 plasmid DNA，”American Journal of Obstetrics and Gynecology，188916-926，2003)，但關(guān)于HPV E2蛋白如何有助于瘤形成的具體細(xì)節(jié)仍然不清楚(Dong等人，“Human papillomavirus type 11 E2 proteins repress the homologous E6promoter by interfering with the binding of host transcription factors toadjacent elements，”Journal of Virology，681115-1127，1994)。
本發(fā)明的蛋白序列或肽可以分離、純化或衍生于HPV 16和18的E2，E6和E7癌蛋白的早期編碼區(qū)。本發(fā)明的肽的分離可以基于其與致癌性HPV感染的宿主中形成的抗體反應(yīng)的能力。在選擇過程中所用的特定因素包括在水溶液中的溶解性或親水性質(zhì)?？梢栽O(shè)想到，在自然或天然條件下，癌基因產(chǎn)物蛋白的親水區(qū)域更可能定向于該完整蛋白的表面，并且這樣的區(qū)域包括抗體反應(yīng)性將最可能針對其發(fā)生的抗原區(qū)域。
抗原性描述的是一種被人體視作外源的或潛在危險的物質(zhì)，人體會針對這樣的物質(zhì)產(chǎn)生抗體。抗原通常包括蛋白或肽?？贵w是在對特定抗原的存在作出響應(yīng)的過程中在淋巴組織中產(chǎn)生的一種特異性蛋白。抗體將攻擊抗原，使其變?yōu)闊o害?？贵w的攻擊通常導(dǎo)致形成抗原-抗體復(fù)合物，該術(shù)語經(jīng)常與如下術(shù)語互換使用抗體-肽復(fù)合物，或肽-抗體復(fù)合物，抗體-表位復(fù)合物。
另一個因素是要使氨基酸序列中的半胱氨酸殘基在總體上維持在相對缺乏的水平。在氨基端殘基處多于一個半胱氨酸被認(rèn)為是不可接受的。由于多個半胱氨酸將預(yù)示著該肽不能在免疫測定中使用的情形，所以也做了一些嘗試來限制沿著肽鏈的其它位置的半胱氨酸。具有半胱氨酸的肽在中性pH下更易于氧化，并且半胱氨酸易于形成巰基的這一傾向可能導(dǎo)致二聚化作用，這會阻礙抗體的結(jié)合。
另外，由于色氨酸的高的氧化勢(oxidative potential)，所以希望該氨基酸在總體上表現(xiàn)為較為缺乏。缺乏的意思是盡可能少的出現(xiàn)，豐富的意思是對在序列出現(xiàn)的數(shù)量沒有限制。肽物質(zhì)的一個更優(yōu)選的實施方案包括將多達(dá)8個的其它氨基酸殘基附著在羧基末端殘基上，在羧基末端殘基上的那些殘基是甘氨酸和天冬酰胺的任何組合。額外的甘氨酸和天冬酰胺氨基酸殘基可以有助于使肽適應(yīng)水介質(zhì)，從而可以增強與抗體的結(jié)合。
正如下面所描述的，8個特異性蛋白序列或肽可以從HPV 16和HPV 18的E2、E6和E7癌蛋白中分離、純化或衍生出來，這8個特異性蛋白序列或肽的長度范圍在17到23個氨基酸殘基之間。序列標(biāo)識編號(SEQ.ID.NO.)為1的序列來源于HPV 18的E2區(qū)。序列1如下，包括22個殘基，由HPV 18 E2癌蛋白的氨基酸219到240構(gòu)成，該序列被譯碼并且使用標(biāo)準(zhǔn)的三個字母縮略詞表示，所表示的序列從氨基末端殘基開始，在羧基末端殘基結(jié)束Lys Gln Leu Gln His Thr Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val1 5 10 15Gly Thr Ala Lys Thr Tyr(SEQ.ID.NO.1)20序列2和3來源于HPV 16的E2早期編碼區(qū)。使用標(biāo)準(zhǔn)的三個字母縮略詞來譯碼，序列號2和3如下，序列2包括17個殘基，由HPV16 E2癌蛋白的氨基酸112到131構(gòu)成，序列3包括23個殘基，由HPV16 E2癌蛋白的氨基酸187到209構(gòu)成，序列在氨基末端殘基端開始Lys His Gly Tyr Thr Val Gln Phe Asp Gly Ile Cys Asn Thr Met His15 10 15Tyr(SEQ.ID.NO.2)His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser15 10 15Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu(SEQ.ID.NO.3)20序列4來源于HPV 16的E6早期編碼區(qū)。使用標(biāo)準(zhǔn)的三個字母縮略詞來譯碼，序列號4如下，該序列號包括22個殘基，由HPV 16 E6癌蛋白的氨基酸62到83構(gòu)成，序列在氨基末端殘基端開始Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe1 5 10 15Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr(SEQ.ID.NO.4)20序列5來源于HPV 18的E6早期編碼區(qū)。使用標(biāo)準(zhǔn)的三個字母縮略詞來譯碼，序列號5如下，該序列號包括22個殘基，由HPV 18 E6癌蛋白的氨基酸67到88構(gòu)成，序列在氨基末端殘基端開始Lys Cys Ile Asp Phe Gly Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser1 5 10 15Asp Ser Val Tyr Gly Asp(SEQ.ID.NO.5)20序列6和7來源于HPV 16的E7早期編碼區(qū)。使用標(biāo)準(zhǔn)的三個字母縮略詞來譯碼，序列6和7如下，其中序列6包括21個殘基，由HPV 16 E7癌蛋白的氨基酸26到46構(gòu)成，序列7包括21個殘基，由HPV 16 E7癌蛋白的氨基酸67到88構(gòu)成，序列在氨基末端殘基端開始Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly1 5 10 15Pro Ala Gly Gln Ala Glu(SEQ.ID.NO.6)20Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser1 5 10 15Ser Glu Asp Glu Ile Asp(SEQ.ID.NO.7)20序列8來源于HPV 18的E7早期編碼區(qū)。使用標(biāo)準(zhǔn)的三個字母縮略詞來譯碼，序列號8如下，該序列號包括22個殘基，由HPV 18 E7癌蛋白的氨基酸14到35構(gòu)成，序列在氨基末端殘基端開始His Leu Gln Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His1 5 10 15Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu(SEQ.ID.NO.8)20
這些肽在診斷方法中的應(yīng)用是基于如下事實，即針對HPV16和18的E2、E6和E7癌蛋白的天然表位的抗體被發(fā)現(xiàn)存在于那些遭受了各種與HPV相關(guān)的細(xì)胞異常的個體中，所述與HPV相關(guān)的細(xì)胞異常是存在于贅生物中的細(xì)胞異常，包括從癌前期狀況到惡性腫瘤。更具體地，這樣的與HPV相關(guān)的細(xì)胞異?；虬l(fā)育異?？梢园ǖ幌抻冢?xì)胞中空；過度角化；癌前期狀況，包括上皮內(nèi)瘤形成或上皮內(nèi)損害；高度發(fā)育異常；和侵入性或惡性癌癥。發(fā)育異常是一般性地意指異常的、惡化前的或癌前期細(xì)胞的存在或發(fā)展。上面討論了與HPV相關(guān)的惡性腫瘤。
診斷方法包括獲取可能含有抗體的體液或組織的樣品。該樣品優(yōu)選為易于獲得的樣品，可以是來源于靜脈血樣品的血清或血漿，或甚至來源于指尖刺傷。然而，子宮頸分泌物、子宮頸組織、來自人體其它部分的組織、或其它的體液被已知含有抗體，它們就可以被用作樣品的來源。一旦肽抗原和樣品抗體被允許在合適的介質(zhì)中反應(yīng)，那么就可以進(jìn)行測定來確定是否存在抗體-肽反應(yīng)。
下述實施例將進(jìn)一步詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明的實施。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該能容易地理解到，正如此處在實施例中所描述和闡明的，下述方法、配方以及來自本發(fā)明的HPV 16和18的E2、E6和E7早期編碼區(qū)的新穎肽的組合物被看作是本發(fā)明的原理的例證，本發(fā)明并不限于實施那些原理的特定結(jié)構(gòu)或過程。因此，下面在實施例1中所表達(dá)的對本發(fā)明的方法、配方和組合物的優(yōu)選實施方案的更詳細(xì)的描述的目的不在于限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍，它們僅僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的代表。
實施例11.氨基酸序列或肽的合成盡管本發(fā)明的肽可以通過多種現(xiàn)有方法獲得，這些現(xiàn)有方法包括但不限于重組技術(shù)和其它生物技術(shù)來源，但目前化學(xué)合成是優(yōu)選的方法，這是由于其有助于積累可觀數(shù)量的基本上純化的形式，在本例中肽的重量占95％到99％之間。肽的合成可以在0.25scale上實現(xiàn)，使用(9-芴基)甲氧基羰基(FMOC)保護(hù)的L-氨基酸，用高級的酸不穩(wěn)定的2-氯三苯甲基樹脂(Novabiochem，Nottingham，UK)作為固體支持物。樹脂可以被預(yù)先加入到反應(yīng)容器中，用二甲基甲酰胺洗滌，然后將液體徹底排空。可以將10ml的含有20％哌啶的二甲基甲酰胺加入到該樹脂中。然后將該混合物振蕩5分鐘，將液體排空?？梢栽俅渭尤?0ml的含有20％哌啶的二甲基甲酰胺，將混合物振蕩30分鐘。在排空液體后，用二甲基甲酰胺將樹脂洗滌四次，然后用二氯甲烷洗滌一次。如果應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的水合茚三酮測試發(fā)現(xiàn)樹脂珠變?yōu)樗{(lán)色，那么可以認(rèn)為樹脂珠被恰當(dāng)?shù)刂苽涑鰜怼?br> 對于各種氨基酸，可以如下制備偶聯(lián)溶液選擇1mmol Fmoc氨基酸；2.1mL 0.45M 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium-六氟-磷酸/氫化苯并三唑[1mmol]；348μL的N，N-二異丙基乙胺[2mmol]。將該混合物振蕩30分鐘。可以將反應(yīng)容器中液體徹底排空，用二甲基甲酰胺將樹脂洗滌四次，最后用二氯甲烷洗滌一次。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的水合茚三酮測試來確定氨基酸的偶聯(lián)。對于每一個氨基酸，可以將偶聯(lián)溶液以適當(dāng)?shù)拇涡蚣尤氲綐渲?，重?fù)偶聯(lián)反應(yīng)，直到所有氨基酸被置于沿著肽鏈的適當(dāng)位置。
通過用如下成分的溶液反應(yīng)兩個小時，可以從樹脂上切割出完整的肽5％H2O，5％苯酚，3％茴香硫醚，3％乙二硫醇，3％三異丙基硅烷，81％三氟乙酸。在切割后，樹脂混合物可以被過濾到冷的甲基-叔丁基-醚中。然后可以用冷的甲基-叔丁基-醚將沉淀的肽洗滌兩次，在氣態(tài)氮下干燥?？梢酝ㄟ^基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜來檢驗肽的分子量，通過高效液相色譜檢驗純度，使用的是C18399A 5μ柱。合成的肽序列的純度水平可以是大約95-99％，但需要強調(diào)的是，對于測定目的來說，較低的水平也可以被認(rèn)為是合適的。
2.氨基酸序列的存儲制備出的氨基酸序列可以懸浮于PBS中，大約7.0的pH值，濃度為大約1mg/mL，可以在大約-20℃的溫度保存在密封小瓶中。
3.氨基酸序列通過順丁烯二酐結(jié)合到滴定板上可以應(yīng)用REACTI-BINDTM順丁烯二酐活化的聚苯乙烯平板(Pierce，Rockford，IL)?？梢杂冒痪彌_液(100mM碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.4)將各氨基酸序列稀釋到12.5μg/mL?？梢詫?00μL(1.25μg)稀釋的序列溶液加入到各滴定孔中。然后可以將平板在室溫下振蕩溫育1小時。可以將平板中液體倒空，將殘余液體吸到清潔紙巾中?？梢杂?00μL洗滌緩沖液(含有0.1％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的磷酸緩沖鹽溶液，pH7.0)洗滌各個孔。可以將這一步驟總共重復(fù)三次。每一次都可以倒空平板并將殘余液體吸到清潔紙巾中。在各個孔中可以加入200μL封閉溶液(含有3％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的磷酸緩沖鹽溶液，pH7.0)。
可以將封閉溶液在各孔中保留1分鐘。然后可以通過倒置倒空滴定板。添加封閉溶液和倒空可以進(jìn)行三次?？梢栽谑覝叵赂稍锿瓿傻牡味ò澹梢杂?℃保存4個月。
4.樣品收集所有樣品由醫(yī)生或醫(yī)生助理在婦產(chǎn)科檢查過程中取自女性對象?？梢杂盟幱妹藓瀬硎占訉m頸內(nèi)細(xì)胞?？梢詫⒂糜赥hinPrep Pap涂片(Cytyc Corporation Stamford，CT)的細(xì)胞分散在ThinPrep防腐溶液中?？梢詫⒂糜贖PV DNA雜交捕獲分析(DNA Hybrid Capture assay)的細(xì)胞懸浮在相同介質(zhì)中。下面對ThinPrep Pap涂片和HPV DNA雜交捕獲分析做進(jìn)一步的說明。
通過規(guī)定的靜脈切開放血術(shù)方法獲得靜脈血液，將21或22號雙向針頭插入到“紅色端(red top)”管子中?？梢詮母鱾€對象獲取總共7-9mL血液。允許其在室溫下保持15-20分鐘以形成血液凝塊，可以于2500g將血液離心15分鐘?？梢允褂靡淮涡晕?，通過抽吸從凝結(jié)的細(xì)胞中分離出血清，以0.25ml的等分量分配到微量離心管中，于-80℃儲存。
5.免疫測定對于陰性樣品，可以從年齡在14-15之間的處女獲得，也可以從年齡大于25歲、性生活活躍、單配偶的成年婦女獲得，這些對象沒有Pap涂片異常歷史并且通過DNA驗證不存在HPV。陽性樣品包括從診斷出子宮頸癌或癌前期疾病的婦女獲得的血清?？梢詫⒛繕?biāo)和對照組血清用洗滌緩沖液(含有0.1％牛血清清蛋白和0.5％Tween-20的磷酸緩沖鹽溶液，pH7.0)以1∶25稀釋?？梢詫?00μL稀釋的血清加入到各個孔中，將測定板在室溫下振蕩溫育1小時。然后可以將各個孔潤洗三次，每一次使用200μL洗滌緩沖液。每次潤洗可以持續(xù)5分鐘。每次都可以通過將殘余液體吸到清潔紙巾上來倒空平板。
可以在各個孔中加入100μL辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鼠抗人IgG，其已經(jīng)用洗滌緩沖液以1∶12000稀釋。然后可以在室溫下將測定板溫育1小時?？梢允褂枚嗟牢浩?，用200μL洗滌緩沖液將每個孔潤洗四次。每次潤洗持續(xù)5分鐘。在每次潤洗之前，可以倒空平板，并且將殘余液體吸到紙巾上。
可以在每一個孔中加入100μL 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，用作辣根過氧化物酶的底物?？梢詫⑵湓谑覝叵聹赜?，直到可以通過視覺觀察到明顯的竹綠色顯色，這通常是在10-15分鐘內(nèi)發(fā)生，然后通過將150μL1.5M硫酸(H2SO4)放入到各孔中來終止反應(yīng)。
6.對比測試——ThinPrep Pap測試和HPV DNA雜交捕獲ThinPrep Pap測試——ThinPrep Pap測試Pap涂片可以被用于指示癌癥或癌前期的細(xì)胞異常是否存在的細(xì)胞學(xué)檢驗。ThinPrep Pap測試經(jīng)由美國食品與藥品管理局許可，可以作為傳統(tǒng)Pap涂片的一種替代，其克服了傳統(tǒng)方法的局限性。通過改進(jìn)樣品載片的制備方法，ThinPrepPap測試可以有效地提高測試的質(zhì)量。在臨床試驗中，ThinPrep Pap測試提高了低級和更嚴(yán)重病變的檢測，在篩選人群中提高了65％，在高風(fēng)險人群中提高了6％。它的使用也將不太適合的樣本的數(shù)量降低了不止50％。
不同于傳統(tǒng)Pap涂片中將子宮頸樣品涂到載片上的做法，子宮頸藥簽可以在盛有防腐溶液的小瓶中被潤洗。樣本可以被送到合格的臨床實驗室，在該實驗室可以使用ThinPrep 2000處理器設(shè)備來分散和過濾內(nèi)容物，從而減少血液、粘液和炎癥。然后薄的平整的子宮頸細(xì)胞層可以用機(jī)械沉積到載片上，結(jié)果得到良好防腐處理的細(xì)胞的均勻制備物，其可準(zhǔn)備用于精確的顯微鏡檢驗。由有資格的婦產(chǎn)科細(xì)胞學(xué)家對載片進(jìn)行顯微鏡檢驗和解釋。
雜交捕獲II HPV DNA測試——雜交捕獲II HPV DNA測試(Digene Corporation，Silver Springs，MD)被用來與使用了本發(fā)明所述肽的ELISA測試作比較。由美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)對致癌HPVDNA進(jìn)行測試，作為不典型鱗狀細(xì)胞性質(zhì)未定(Atypical SquamousCells of Undetermined Significance，ASCUS)或其它異常Pap結(jié)果的自身的進(jìn)一步測試。事實上，雜交捕獲II HPV DNA測試辨認(rèn)的是病毒DNA而不是子宮頸疾病，但所有癌前期和癌癥狀況都涉及HPV DNA的存在。雜交捕獲涉及分子雜交，其中使用了非放射性探針，并對雜交分子的化學(xué)發(fā)光檢測進(jìn)行擴(kuò)增。可以將分析的材料變性，并與特異性基因探針反應(yīng)，形成雜交RNA/DNA，雜交RNA/DNA被覆蓋于管壁上的抗體捕獲。為了進(jìn)行固定化的雜交，可以與堿性磷酸酶偶聯(lián)的RNA/DNA的特異性抗體反應(yīng)。形成穩(wěn)定的基層物質(zhì)(substratum)后，核酸雜交可以通過光譜測定法利用化學(xué)發(fā)光來檢測。
所述測試可以根據(jù)制造商的實施方案來進(jìn)行，其中使用了基于微量滴定板的型式以及用于“高致癌風(fēng)險”或“致癌”HPV型的探針。人類乳頭瘤病毒的測定可以是定量的，其中樣本所產(chǎn)生的讀數(shù)是被認(rèn)為含有病毒DNA的陽性對照的讀數(shù)的一倍或者多倍(每次測試使用1pg/mL HPV DNA或5000個HPV基因組拷貝)。
7.完整ELISA測試的可視化/解釋抗體-肽復(fù)合物的存在可以通過將抗體-肽復(fù)合物的形成所帶來的物理化學(xué)變化可視化來轉(zhuǎn)化為信號。物理化學(xué)變化的發(fā)生可能與氧化反應(yīng)和其它化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。物理化學(xué)反應(yīng)可以使用分光光度計或類似儀器來檢測。
可以用70％乙醇清潔滴定板的底部，將滴定板裝載到分光光度計中?？梢栽?50nm處讀取吸光度，用100mL TMB溶液與100mL 2N HCl作為空白對照。
8.結(jié)果將Pap涂片細(xì)胞學(xué)、Digene HPV DNA測試和根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的免疫測定進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1和2所示?，F(xiàn)在參考圖1和2，對16個女性對象進(jìn)行了測試。在實際上進(jìn)行的所有測試的所有樣品中，來自于藉由性生活史和/或Pap涂片史判斷為具有低的測試前概率(pre-testprobability)的女性的樣品都是陰性的，證據(jù)是吸光度的平均值為0.19，而與之相比，具有不同疾病狀況的對象的平均值為0.42，一個異常例外在下面被討論。這表明假陽性和高的陰性預(yù)測值的比例很低。
如上所述，來自于藉由性生活史和/或Pap涂片史判斷為具有低的測試前概率的對象的樣品大部分具有較低的吸光度。然而，對象6例外，其HPV E2抗體-抗原復(fù)合物具有較高值，平均值為0.42，其中SEQID NO 1為0.44，SEQ ID NO 2為0.32，SEQ ID NO 3為0.49。而對象6的其它抗體-抗原復(fù)合物產(chǎn)生的吸光度平均值為0.21。這些數(shù)據(jù)不是感染或發(fā)育異常的指示。在對象6中沒有檢測到HPV DNA，這些高的HPV E2吸光度非?？赡苁窍惹按嬖诘牡F(xiàn)在已經(jīng)清除的HPV感染的證據(jù)。
來自于藉由已證實的臨床/病理史判斷為具有高的測試前概率的女性的樣品大部分在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的免疫測定中顯示為陽性，這由較高的吸光度值來指示。對于來自患病對象8-16的血清，平均吸光度值為0.42，僅僅考慮那些源自E6和E7癌蛋白的肽的話，平均吸光度值為0.47。而且，這些值平均起來顯著高于來自未患病或健康對象的吸光度值(p＜0.001)。這些結(jié)果指示了高的陽性預(yù)測值。由于在一些情況下，有一次或多次測定會產(chǎn)生稍微低一些的吸光度值，這證明了應(yīng)用肽的組合的優(yōu)點。低的假陽性和高的真陽性表明這是一種用于癌前期疾病和癌癥的高靈敏度的和高特異性的測試。
非常重要的是，對象15和16具有在病理學(xué)上已經(jīng)證實的子宮頸腺癌，對象13和14具有在病理學(xué)上已經(jīng)證實的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，來自這些對象的血清的一個特征是具有較高的吸光度值。同樣重要的是，雖然患有嚴(yán)重的子宮頸疾病，但對象15的Pap涂片檢查的結(jié)果卻沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常。Pap涂片細(xì)胞學(xué)可能對腺癌產(chǎn)生錯誤判斷，這凸現(xiàn)了本發(fā)明的肽的有用性。
同樣顯著地，當(dāng)與對象8-16的結(jié)果相比較時，來自對象7的血清對于實際上本發(fā)明的所有肽均顯示出較低的吸光度。盡管對象6伴隨有證實為診斷出細(xì)胞異常的病理學(xué)，但是使用本發(fā)明所述肽的免疫測定與陰性DNA結(jié)果更一致。認(rèn)為這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞異常與致癌病毒無關(guān)，并且由此導(dǎo)致的疾病進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的發(fā)育不良或癌癥的可能性較小。正如此處所描述的，這些結(jié)果指出了本發(fā)明的進(jìn)一步的實用性。
從上述討論應(yīng)該意識到，本發(fā)明提供了從HPV 16和18 E2、E6和E7早期編碼區(qū)分離出的新穎的能夠與抗體反應(yīng)的蛋白序列或肽。在優(yōu)選的設(shè)計中，新穎的蛋白序列或肽提供了一種用于簡單、快捷、低成本、更靈敏和更特異的測試的標(biāo)識物，其不僅用于檢測或診斷HPV感染，而且用于檢測或診斷大部分——即使不是所有的——與HPV相關(guān)的細(xì)胞異常、癌前期細(xì)胞、癌癥和贅生物。
與現(xiàn)有技術(shù)不同，本發(fā)明提供了這樣的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，即獲得人體組織樣品，使該樣品與從HPV 16和18 E2、E6和E7早期編碼區(qū)分離出的新穎的蛋白序列或肽反應(yīng)，以形成抗體-肽復(fù)合物；檢測所述抗體-肽復(fù)合物。
本發(fā)明可以以不背離本發(fā)明精神或必要特征的其它特定形式來實施。所描述的實施方案在所有方面都僅僅被視作例證，而不是限制。因此，本發(fā)明的范圍是由所附的權(quán)利要求來指明，而不是由前述描述來限定。在權(quán)利要求的等同意義和范圍內(nèi)發(fā)生的所有變化都包括在本序列表<110>Y·X·胡<120>用于檢測和/或診斷宮頸癌和其它癌癥的來自人乳頭瘤病毒16和18的E2、E6和E7蛋白的肽<130>CPUSZ42759<150>US 60/394,172<151>2002-07-02<150>US 10/612,818<151>2003-07-01<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV 18的E2區(qū)<400>1Lys Gln Leu Gln His Thr Pro ser Pro Tyr Ser ser Thr Val Ser Val1 5 10 15Gly Thr Ala Lys Thr Tyr20<210>2<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV 16的E2早期編碼區(qū)<400>2Lys His Gly Tyr Thr Val Gln Phe Asp Gly Ile Cys Asn Thr Met His1 5 10 15Tyr<210>3<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV 16的E2早期編碼區(qū)<400>3His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser1 5 10 15
Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu20<210>4<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV 16的E6早期編碼區(qū)<400>4Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr1 5 10 15Ser Lys Ile Ser Glu Tyr20<210>5<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV18的E6早期編碼區(qū)<400>5Lys Cys Ile Asp Phe Gly Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser1 510 15Asp Ser Val Tyr Gly Asp20<210>6<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV16的E7早期編碼區(qū)<400>6Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro1 510 15Ala Gly Gln Ala Glu20<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV 16的E7早期編碼區(qū)<400>7
Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Ser1 5 10 15Glu Asp Glu Ile Asp20<210>8<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>源自HPV 18的E7早期編碼區(qū)<400>8His Leu Gln Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu1 5 10 15Gln Leu Ser Asp Ser Glu20
權(quán)利要求
1.來自人乳頭瘤病毒(HPV)的E2、E6或E7早期編碼區(qū)的可溶于水介質(zhì)中的分離出的蛋白序列或肽，其特征在于色氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸殘基的相對缺乏，以及甘氨酸和天冬酰胺殘基的相對豐富。
2.如權(quán)利要求1的分離出的蛋白序列或肽，其中所述HPV選自16、18、31、33、35、45、51、52、56和58。
3.如權(quán)利要求1的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
4.來自HPV的分離出的蛋白序列或肽，其可用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常，所述分離出的蛋白序列或肽選自如SEQ.ID.NO.1中所闡述的HPV 18的E2早期編碼區(qū)；如SEQ.ID.NO.2中所闡述的HPV 16的E2早期編碼區(qū)；如SEQ.ID.NO.3中所闡述的HPV 16的E2早期編碼區(qū)；如SEQ.ID.NO.4中所闡述的HPV 16的E6早期編碼區(qū)；如SEQ.ID.NO.5中所闡述的HPV 18的E6早期編碼區(qū)；如SEQ.ID.NO.6中所闡述的HPV 16的E7早期編碼區(qū)；如SEQ.ID.NO.7中所闡述的HPV 16的E7早期編碼區(qū)；和如SEQ.ID.NO.8中所闡述的HPV 18的E7早期編碼區(qū)。
5.如權(quán)利要求4的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
6.如權(quán)利要求4的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
7.如權(quán)利要求4的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
8.如權(quán)利要求4的分離出的蛋白序列或肽，其中HPV選自31、33、35、45、51、52、56和58。
9.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.1中所闡述的HPV 18的E2早期編碼區(qū)。
10.如權(quán)利要求9的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
11.如權(quán)利要求9的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
12.如權(quán)利要求9的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
13.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.2中所闡述的HPV16的E2早期編碼區(qū)。
14.如權(quán)利要求13的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
15.如權(quán)利要求13的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
16.如權(quán)利要求13的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
17.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.3中所闡述的HPV16的E2早期編碼區(qū)。
18.如權(quán)利要求17的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
19.如權(quán)利要求17的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
20.如權(quán)利要求17的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
21.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.4中所闡述的HPV16的E6早期編碼區(qū)。
22.如權(quán)利要求21的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
23.如權(quán)利要求21的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
24.如權(quán)利要求21的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
25.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.5中所闡述的HPV18的E6早期編碼區(qū)。
26.如權(quán)利要求25的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
27.如權(quán)利要求25的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
28.如權(quán)利要求25的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
29.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.6中所闡述的HPV16的E7早期編碼區(qū)。
30.如權(quán)利要求29的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
31.如權(quán)利要求29的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
32.如權(quán)利要求29的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
33.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.7中所闡述的HPV16的E7早期編碼區(qū)。
34.如權(quán)利要求33的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
35.如權(quán)利要求33的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
36.如權(quán)利要求33的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
37.分離出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.8中所闡述的HPV18的E7早期編碼區(qū)。
38.如權(quán)利要求37的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
39.如權(quán)利要求37的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
40.如權(quán)利要求37的分離出的蛋白序列或肽，進(jìn)一步包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
41.用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，所述方法包括如下步驟使可能含有抗體的體液或組織樣品與來自人乳頭瘤病毒(HPV)的E2、E6和E7早期編碼區(qū)的分離出的一種或多種蛋白序列或肽反應(yīng)，其中所述早期編碼區(qū)選自如SEQ.ID.NO.1中所闡述的HPV 18的E2早期編碼區(qū)、如SEQ.ID.NO.2中所闡述的HPV 16的E2早期編碼區(qū)、如SEQ.ID.NO.3中所闡述的HPV 16的E2早期編碼區(qū)、如SEQ.ID.NO.4中所闡述的HPV 16的E6早期編碼區(qū)、如SEQ.ID.NO.5中所闡述的HPV 18的E6早期編碼區(qū)、如SEQ.ID.NO.6中所闡述的HPV16的E7早期編碼區(qū)、如SEQ.ID.NO.7中所闡述的HPV 16的E7早期編碼區(qū)，和如SEQ.ID.NO.8中所闡述的HPV 18的E7早期編碼區(qū)；形成抗體-肽復(fù)合物，其包括所述分離出的蛋白序列或肽的至少一種和所述的樣品抗體；和檢測所述抗體-肽復(fù)合物。
42.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中HPV選自31、33、35、45、51、52、56和58。
43.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述分離出的蛋白序列或肽包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的甘氨酸殘基。
44.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述分離出的蛋白序列或肽包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的一個或多個額外的天冬酰胺殘基。
45.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述分離出的蛋白序列或肽包括在所述分離出的蛋白序列或肽的羧基末端殘基處添加的甘氨酸和天冬酰胺殘基的組合。
46.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述分離出的蛋白序列或肽的所述半胱氨酸殘基被羧甲基半胱氨酸殘基取代。
47.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷HPV表位。
48.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述HPV表位是抗體反應(yīng)性將針對其發(fā)生的抗原性區(qū)域。
49.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷與HPV相關(guān)的細(xì)胞異常。
50.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷與HPV相關(guān)的癌前期或惡化前狀況。
51.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷與HPV相關(guān)的癌癥。
52.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷子宮頸發(fā)育異常。
53.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷子宮頸癌。
54.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷選自細(xì)胞中空、過度角化、包括上皮內(nèi)損害在內(nèi)的癌前期狀況、高度發(fā)育異常、侵入性癌癥和惡性癌癥的子宮頸細(xì)胞異常。
55.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述診斷方法是涉及檢測或診斷子宮頸的腺癌。
56.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中從所述HPV E2編碼區(qū)分離出的所述蛋白序列或肽包括檢測或診斷來自HPV的癌蛋白表位。
57.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中從所述HPV E2編碼區(qū)分離出的所述蛋白序列或肽包括檢測或診斷惡化前細(xì)胞轉(zhuǎn)化、癌前期狀況或癌癥。
58.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中從所述HPV E6編碼區(qū)分離出的所述蛋白序列或肽包括檢測或診斷惡化前細(xì)胞轉(zhuǎn)化、癌前期狀況或癌癥。
59.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中從所述HPV E7編碼區(qū)分離出的所述蛋白序列或肽包括檢測或診斷惡化前細(xì)胞轉(zhuǎn)化、癌前期狀況或癌癥。
60.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述檢測步驟進(jìn)一步包括在視覺上檢查所述抗體-肽復(fù)合物的顏色變化的步驟。
61.如權(quán)利要求41的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述檢測步驟進(jìn)一步包括檢查所述抗體-肽復(fù)合物的物理化學(xué)變化。
62.如權(quán)利要求61的用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法，其中所述檢查步驟進(jìn)一步包括使用分光光度計檢查所述抗體-肽復(fù)合物。
全文摘要
來自人乳頭瘤病毒(HPV)的E2、E6或E7早期編碼區(qū)的可溶于水介質(zhì)中的分離的蛋白序列或肽，其特征包括色氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸殘基的相對缺乏，以及甘氨酸和天冬酰胺殘基的相對豐富。也公開了來自HPV 16和18的E2、E6或E7早期編碼區(qū)的分離的蛋白序列或肽，以及用于檢測或診斷癌癥或細(xì)胞異常的方法。檢測和/或診斷癌癥或細(xì)胞異?？梢园z測和/或診斷癌前期或惡化前狀況、子宮頸發(fā)育異常、子宮頸癌、細(xì)胞中空、過度角化、上皮內(nèi)損害和其它癌癥。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于檢測和/或診斷癌癥或細(xì)胞異常的新穎方法包括步驟(1)將體液或組織樣品與分離的蛋白序列或肽反應(yīng)；(2)形成抗體－肽復(fù)合物；和(3)檢測抗體－肽復(fù)合物。
文檔編號G01N33/569GK1662550SQ03815024
公開日2005年8月31日 申請日期2003年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月2日
發(fā)明者Y·X·胡, M·J·羅森菲爾德 申請人:Y·X·胡