專利名稱：瘋牛病病原檢測壓電生物芯片及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物檢驗檢疫裝備及制備方法，特別適用于瘋牛病病原體檢測。
背景技術：
瘋牛病是由非常規(guī)致病因子朊蛋白引起的一種亞急性海綿狀腦病。如Prusiner在Ann.Rev.Microbiol.，43，pp345-374(1989)上發(fā)表的文章“Scrapie Prions”所述，瘋牛病病原羊癢病相關纖維是由變異的抗蛋白酶朊蛋白組成。由于該朊蛋白對一些理化因素的抵抗力很強，大大高于已知的各類微生物和寄生蟲，其傳染性強、危害性大的特性極不利于人類和動物的保健，越來越引起人類的恐慌和關注。因此對作為瘋牛病病原的朊蛋白的檢測具有重要意義。
對各種蛋白的檢測主要有免疫學檢測，即用待測蛋白作為抗原制備出對應的抗體，根據(jù)抗原抗體進行免疫化學反應形成免疫復合物的性狀與活性特點，對該蛋白進行定性、定位或定量的檢測。現(xiàn)有對瘋牛病病原變異朊蛋白的檢測，也主要是基于免疫學檢測包括免疫電泳、放射免疫分析、熒光免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等各種技術。如Schmerr等在Journal ofChromatography A，853，207-14(1999)上發(fā)表的文章“Use of CapillaryElectro-phoresis and Fluorescent Labeled Peptides to Detect theAbnormal Prion Protein in the Blood of Animals that are Infected with aTransmissible Spongiform Encephalopathy”，以及Bieschke等在Proceed-ings of the National Academy of Science(USA)，97(10)，5468-73A(2000)發(fā)表的文章“Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggre-gates by dual-color scanning for intensely fluorescent targets”所述，分別采用熒光標記的毛細管免疫電泳和共聚焦雙色熒光光譜技術，檢測出瘋牛病變異朊蛋白。這些檢測裝置在使用時都需采用同位素、熒光素或酶等標記朊蛋白或朊蛋白的抗體，因此，對檢測條件有極其嚴格的要求，檢測設備復雜、成本高，而且操作冗繁，難以實現(xiàn)自動化。
生物芯片是近年來發(fā)展十分迅速的一種生化分析裝置。壓電生物芯片，如重慶大學向國家知識產權局申請的發(fā)明專利，其申請?zhí)?91174402，發(fā)明名稱“微型壓電諧振式傳感器陣列芯片”，和莫志宏等申請的發(fā)明專利，其申請?zhí)?01131109，發(fā)明名稱“原位生物芯片及其制備方法”，它們將多個壓電生物傳感器集成在一個芯片上，當將芯片上的各電極與配套使用的振蕩電路聯(lián)接時形成獨立的諧振檢測單元。測量各檢測單元的響應信號如器件的諧振頻率、聲電阻抗譜、頻譜或相位等，可獲取有關目標組分或多元組分體系的成分、性狀的一維或多維信息，得到目標的全面、動態(tài)、實時或在位描述。但已公開的這種壓電生物芯片不能提供檢測瘋牛病病原的信息。目前，國內、外還沒有關于采用生物芯片檢測瘋牛病病原的報導。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種瘋牛病病原檢測壓電生物芯片及其制備方法，該芯片能實時檢測瘋牛病病原的信息。
為實現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明包括壓電片、固定在壓電片下面的共用電極及固定在壓電片上面的微型電極陣列、在微型電極陣列各電極上一一對應地固定有不同的瘋牛病朊蛋白抗體，形成其抗體陣列，來構成瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
本發(fā)明的瘋牛病病原檢測壓電生物芯片(參見附圖1、附圖2)，包含壓電材料的壓電片(1)、共用電極(2)、微型電極陣列(3)、微型電極上的瘋牛病朊蛋白抗體陣列(4)。上述壓電片的表面是光整表面，電極有分別在壓電片的下、上兩面的共用電極(2)和由至少兩個相互隔離的微型電極構成的微型電極陣列(3)，朊蛋白抗體是與各種朊蛋白相對應的抗體，各種朊蛋白抗體一一對應地固定在微型電極陣列的各個電極上，構成有至少一種朊蛋白抗體的朊蛋白抗體陣列(4)。
上述的瘋牛病朊蛋白抗體陣列(4)，可以是各種N端氨基酸序列的朊蛋白及其正常或變異構型的抗體，從而使壓電生物芯片成為瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
上述的瘋牛病朊蛋白抗體，可以采用吸附、或鍵合、或交聯(lián)、或包埋、或自組裝方法固定于微型電極上。固定抗體與電極的結合強度和與待測蛋白的反應活性與所采用的固定方法、固定劑的組成及pH值、固定溫度與時間等因素有關。特別是采用交聯(lián)法或自組裝法、固定劑pH值為4～10、固定抗體的環(huán)境溫度為大于零而小于70℃，固定時間0.1-24小時，使朊蛋白抗體的構型在固定前后保持不變，可使固定抗體具有較強的結合強度和反應活性。
本發(fā)明所采用的瘋牛病朊蛋白抗體陣列與壓電諧振陣列結合，是將朊蛋白抗體陣列的各種抗體分子一一對應固定在壓電諧振陣列的各個微型電極上，形成瘋牛病各種朊蛋白的檢測位點。各種朊蛋白的檢測位點組成朊蛋白檢測陣列，其整體構成瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
本發(fā)明的瘋牛病病原檢測壓電生物芯片與檢測儀配套使用，配裝時將共用電極和微型電極陣列與檢測儀的壓電諧振檢測電路接口一一對應聯(lián)接，從而構成壓電生物芯片檢測系統(tǒng)。進行瘋牛病病原檢測時，將樣品置于芯片上，當抗體與瘋牛病朊蛋白進行免疫化學反應時，利用各檢測位點的諧振頻率與該位點的表面質量成反比，通過測量各檢測位點的諧振頻率可實時或在位檢測相應各位點免疫反應的動態(tài)進程，從而對瘋牛病相應各種朊蛋白進行定性和定量分析。
本發(fā)明與已有技術比較，具有如下的優(yōu)點和效果。
首先，本發(fā)明所采用的瘋牛病朊蛋白抗體陣列可以是根據(jù)診斷的對象或需要設計組合而成，即將多種朊蛋白的抗體組合成一組瘋牛病朊蛋白抗體陣列，使本瘋牛病病原檢測壓電生物芯片可同時對多種朊蛋白進行檢測，達到對瘋牛病病原進行準確、快速檢測的目的，并具有無須標記、使用簡便、高特異性、高檢測效率的優(yōu)點。
其次，本發(fā)明與檢測儀配套采用頻率測量，能對本芯片上各檢測位點同時進行高靈敏度、高精度地實時、在位檢測；且能使檢測設備簡化、易于小型化。
再者，本發(fā)明的芯片結構簡單，制作方法簡便、易于大批量制備、成本低廉。
本發(fā)明的瘋牛病病原檢測壓電生物芯片與檢測儀配套使用，適用于瘋牛病的早期、高效和快速診斷。


圖1是圖2中的A-A剖面圖。
圖2是圖1的俯視圖。
圖3是本發(fā)明的對應一種朊蛋白抗體陣列的四種朊蛋白(I～IV)的N端氨基酸序列。
圖4是本發(fā)明的一種自組裝抗體及其與朊蛋白結合的結構圖。
圖1、2中，1為壓電片，2為共用電極，3為微型電極陣列，4為瘋牛病朊蛋白抗體陣列，5為通電導線，6為芯片支撐體。
圖3中，N端氨基酸序列根據(jù)國際理論與應用化學聯(lián)合會IUPAC標準給出，字母分別代表下列氨基酸A-丙氨酸、C-半胱氨酸、D-天冬氨酸、E-谷氨酸、F-苯丙氨酸、G-甘氨酸、H-組氨酸、I-異亮氨酸、K-賴氨酸、L-亮氨酸、M-蛋氨酸、N-天冬酰胺、P-脯氨酸、O-谷酰胺、R-精氨酸、S-絲氨酸、T-蘇氨酸、V-纈氨酸、W-色氨酸、Y-酪氨酸。
圖4中，7為生物素，8為親合素，9為朊蛋白。
具體實施例方式本發(fā)明的瘋牛病病原檢測壓電生物芯片，如附圖1、2所示，由壓電片、共用電極、微型電極陣列、瘋牛病朊蛋白抗體陣列、芯片支撐體構成。
上述壓電片1選用石英晶體，也可以選用壓電陶瓷、或壓電聚偏氟乙烯薄膜等壓電材料。采用通常方法制成表面光整的平片形，其片面呈為n邊型，且n≥3，即可以是三邊形、四邊形、五邊形等多邊形。
上述共用電極2、微型電極陣列3分別被覆在壓電片1下、上兩面上。采用通常的金、銀、鋁等導電材料。用真空蒸鍍法將導電材料鍍覆在壓電片的兩側片面上形成導電膜，在壓電片的一側片面上的導電膜成為共用電極2；用光刻法或化學腐蝕法按設計的陣列圖形，將壓電片1的另一側的片面上導電膜制成由多個相互隔離呈均勻分布的陣列形的微型電極組成的微型電極陣列3。
上述瘋牛病朊蛋白抗體陣列4是由各種N端氨基酸序列朊蛋白的抗體、包括正常或變異兩種構型的朊蛋白的抗體構成，瘋牛病朊蛋白抗體陣列是在微型電極陣列的各電極上固定1-1000納米厚的朊蛋白的抗體組成。
上述瘋牛病朊蛋白抗體的固定，是利用電極金屬與抗體分子間的范得華力、靜電力、親和力的物理性質，使朊蛋白抗體物理吸附固定在電極表面；或是利用抗體分子一端含有的反應性游離基，如羥基、羧基、氨基，與電極表面經(jīng)預處理具有的對應官能基發(fā)生共價鍵合，使朊蛋白抗體化學鍵合固定在電極表面；或是采用具有反應性多官能性基的固定劑，例如戊二醛，使抗體分子之間產生交聯(lián)的結構，從而使朊蛋白抗體交聯(lián)固定在電極表面；或是將朊蛋白抗體包埋在電極表面的多孔性聚合物中；或是利用生物素化蛋白質與親合素的親和力將朊蛋白抗體自組裝在電極上。
上述瘋牛病朊蛋白抗體的固定化方法，特別是交聯(lián)法和自組裝法，通過選擇適當?shù)墓潭▌⒖刂乒潭囟葹榇笥诹愣∮诨虻扔?0℃、固定劑的pH值為4～10，使固定抗體具有較大的結合強度和反應活性。
瘋牛病朊蛋白抗體的交聯(lián)固定方法，可采用包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等的醛類固定劑、或包括碳化二亞胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亞胺等的非醛類固定劑、或醛類與非醛類混合的固定劑。固定劑中還包含調節(jié)pH值的緩沖劑，如常用的磷酸鹽、醋酸鹽等。
瘋牛病朊蛋白抗體的自組裝固定方法，如附圖4所示，電極(3)表面自組裝一層生物素(7)，再在上面自組裝一層親合素(8)，生物素化的朊蛋白抗體(4)與其結合，從而自組裝固定在電極表面。該生物素化的朊蛋白抗體(4)捕獲結合待測的朊蛋白(9)，此法由于電極表面抗體排列有序，具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。
上述芯片支撐體6選用陶瓷，也可以選用塑料、或玻璃等絕緣材料。壓電片1的邊緣通過熱壓或用膠粘劑，固定于支撐體6的周邊的上部。支撐體6的作用是支撐壓電片，組裝時要求微型電極及其上的朊蛋白抗體不與支撐體6相接觸。從而制成本發(fā)明的瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
實施例1本發(fā)明的一種瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
本實施例的壓電片1為100μm厚的石英晶體片，微型電極膜3及其引腳5為200nm厚的金膜，壓電片1與微型電極3形狀均為四邊形，抗體陣列4由N端氨基酸序列分別為前述I和II、正常和變異的朊蛋白抗體，共4種朊蛋白抗體組成，支撐體6為陶瓷?？贵w4用固定劑且采用交聯(lián)法固定于微型電極3上，朊蛋白抗體的厚度為100-150納米，固定劑為多聚甲醛4％、戊二醛25％、pH為6～8的磷酸緩沖液10％、余量為水。固定溫度為4℃，固定時間為8小時。本實施例可用于N端氨基酸序列為I和II變異朊蛋白瘋牛病病原的同時定性檢出和定量分析。
實施例2本發(fā)明的一種瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
本實施例的壓電片1為80μm厚的石英晶體片，微型電極膜3及其引腳5為150nm厚的銀膜，壓電片1與微型電極形3狀均為圓形，抗體陣列4由N端氨基酸序列分別為前述I、II和III、正常和變異的朊蛋白抗體，共6種朊蛋白抗體組成，支撐體6為塑料。抗體4采用交聯(lián)法固定于微型電極3上，抗體厚度為100-150納米，固定劑為乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽2％、戊二醛25％、pH為6～8的磷酸緩沖液10％、余量為水。固定溫度為15℃，固定時間為4小時。本實施例可用于N端氨基酸序列為I、II和III變異朊蛋白瘋牛病病原的同時定性檢出和定量分析。
實施例3本發(fā)明的一種瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。
本實施例的壓電片1為200μm厚的壓電聚偏氟乙烯片，微型電極膜3及其引腳5為100nm厚的金膜，壓電片1和微型電極3形狀均為四邊型，抗體陣列4由N端氨基酸序列分別為前述I、II、III和IV、正常和變異的朊蛋白抗體，共8種朊蛋白抗體組成，支撐體6為塑料?？贵w4通過生物素和親合素自組裝固定于微型電極3上，抗體厚度為100-500納米，固定溫度為25℃，固定時間為2小時。本實施例可用于N端氨基酸序列為I、II、III和IV變異朊蛋白瘋牛病病原的同時定性檢出和定量分析。
上述實施例瘋牛病病原檢測壓電生物芯片的最低檢出量為1-10ng/mL，可在10分鐘內一次完成對多種朊蛋白的同時測定。
權利要求
1.一種瘋牛病病原檢測壓電生物芯片，包括壓電片(1)及分別固定在壓電片下、上面上的共用電極(2)和微型電極陣列(3)，其特征在于在微型電極陣列(3)的各電極上一一對應地固定有不同的瘋牛病朊蛋白抗體，構成瘋牛病朊蛋白的抗體陣列(4)。
2.根據(jù)權利要求1所述的瘋牛病病原檢測壓電生物芯片，其特征在于瘋牛病朊蛋白抗體陣列(4)是在微型電極陣列的各電極上固定1-1000納米厚的朊蛋白的抗體組成，抗體陣列是由各種N端氨基酸序列及其正常或變異兩種構型的朊蛋白的抗體構成。
3.根據(jù)權利要求2所述的瘋牛病病原體檢測壓電生物芯片，其特征在于瘋牛病朊蛋白抗體陣列由N端氨基酸序列I、II、正常的和變異的朊蛋白抗體組成，朊蛋白抗體的厚度為100-150納米。
4.根據(jù)權利要求2所述的瘋牛病病原體檢測壓電生物芯片，其特征在于瘋牛病朊蛋白抗體陣列由N端氨基酸序列I、II、III、正常的和變異的朊蛋白抗體共6種組成，抗體的厚度為100-150納米。
5.根據(jù)權利要求2所述的瘋牛病病原體檢測壓電生物芯片，其特征在于瘋牛病朊蛋白抗體陣列由N端氨基酸序列I、II、III、IV、正常的和變異的朊蛋白抗體共8種組成，抗體的厚度為100-500納米。
6.一種瘋牛病病原檢測壓電生物芯片的制備方法，其特征在于(1)、制作微型電極陣列；(2)、采用物理吸附、或化學鍵合、或交聯(lián)、或包埋、或自組裝方法將朊蛋白抗體固定在微型電極陣列(3)的電極上，固定抗體的環(huán)境溫度為大于零而小于或等于70℃、固定時間為0.1-24小時，使朊蛋白抗體的構型在固定前后保持不變。
7.根據(jù)權利要求6所述的瘋牛病病原體檢測壓電生物芯的制備方法，其特征在于由多聚甲醛4％、戊二醛25％、pH為6～8的磷酸緩沖液10％、余量為水組成的固定劑，用固定劑且采用交聯(lián)法將抗體固定在微型電極陣列的電極上，固定溫度為4℃，固定時間為8小時。
8.根據(jù)權利要求6所述的瘋牛病病原體檢測壓電生物芯的制備方法，其特征在于由乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽2％，戊二醛25％，pH為6～8的磷酸緩沖液10％、余量為水組成的固定劑，用固定劑且采用交聯(lián)法將抗體固定在微型電極陣列的電極上，固定溫度為15℃，固定時間為4小時。
9.根據(jù)權利要求6所述的瘋牛病病原體檢測壓電生物芯的制備方法，其特征在于抗體通過生物素和親合素自組裝固定在微型電極陣列的電極上，固定溫度為25℃，固定時間為2小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物檢驗檢疫裝置及其制備方法，特別適用于瘋牛病病原體的檢測。本發(fā)明采用壓電片、分別固定在壓電片上、下兩面的微型電極陣列和共用電極、瘋牛病朊蛋白抗體陣列，來構成瘋牛病病原檢測壓電生物芯片。瘋牛病朊蛋白抗體通過吸附、鍵合、交聯(lián)、包埋、或自組裝方法，一一對應地固定在微型電極陣列的各電極上。本芯片與檢測儀配套使用，構成瘋牛病病原壓電生物芯片檢測系統(tǒng)，當各抗體與對應朊蛋白進行免疫化學反應時，通過測量諧振頻率可實時檢測相應各種朊蛋白的信息，對其進行定性和定量分析。適用于瘋牛病病原的早期、高效和快速診斷。
文檔編號G01N33/68GK1395103SQ0213356
公開日2003年2月5日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權日2002年7月31日
發(fā)明者魏傳忠, 莫志宏, 馬貴平, 靳萍, 李冰玲, 田學隆, 田海燕, 郭鋼 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局, 重慶大學