專利名稱：診斷人類乳頭狀病毒感染的基因型試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種診斷人類乳頭狀病毒(HPV)感染的基因型試劑盒，尤其涉及一種利用DNA芯片檢測被感染患者臨床樣品中人類乳頭狀病毒的基因型試劑盒，以及制備所述DNA芯片的方法和利用所述基因型試劑盒診斷HPV感染的方法。
背景技術：
子宮癌包括子宮頸癌，子宮內膜癌，子宮肉瘤等。對于子宮頸癌來說，全球每年約有450000起新病例發(fā)生，其中大約有6000起在韓國。由于子宮頸癌(包括子宮頸內上皮瘤形成)占據韓國婦女總癌癥發(fā)生率的22.1％，其發(fā)生率占第一位，死亡率占第二位，所以，預防、診斷和治療子宮頸癌就成為維護婦女健康最重要的問題。
子宮頸癌經歷一個癌癥前期，子宮頸內上皮瘤形成(CIN)被認為主要由人類乳頭狀病毒(HPV)感染引起，特別是特定類型的HPV感染能提高侵染性疾病的發(fā)生機率。自從認識到HPV是子宮頸癌的主要病原學因素以來，70多種HPV基因型已被鑒定出。在特殊位置或時期的病灶中選擇性的發(fā)現了特定的HPV基因型，這些基因型是導致已知HPV感染生物多樣性的原因。在肛殖區(qū)檢測到的HPV基因型中，已有10多種基因型被歸類為高風險類，該類基因型是與提高子宮頸癌發(fā)展風險聯(lián)系的?；谝陨涎芯?，HPV感染的生物學特征對于診斷和預防子宮頸癌是非常有意義的。
為在子宮頸癌的早期階段診斷該病，應用最廣泛的是Pap涂片測試，該測試是一種細胞學測試，按如下步驟進行子宮頸表面的最外層細胞經過收集，染色，檢測包括中空細胞，上皮細胞內核周孔環(huán)的形成在內的組織病理學特征。但是，由于Pap測試的低診斷率(1-15％)和其他限制，額外的更可靠診斷方法如陰道鏡檢查是很必要的。陰道鏡檢查對HPV感染的檢出率高達70％，但是缺點是設備消費高，需要技術熟練的操作人員，并且不能識別高風險和低風險的HPV感染基因型。所以一直在努力發(fā)展一種技術可以檢出HPV并且鑒定HPV基因型來補充傳統(tǒng)的子宮頸癌檢測方法及包括Pap測試在內本方法前身的不足。
檢測HPV和鑒定HPV基因型的方法可以歸納為兩類，即直接檢測HPV DNA和檢測擴增DNA。直接檢測HPV DNA的方法包括液體雜交(Hybrid Capture kit Digene Diagnostics，silver Spring，MD，USA，www.digene.com)，具有HPV類型特異性探針的Sourthern印跡和點印跡，原位雜交過濾(FISH)等，而檢測擴增DNA的方法包括類型特異性PCR(聚合酶鏈式反應)和普通引物PCR。特別是普通引物組進行的擴增HPV DNA基因型分析通常是采用點印跡雜交，微量滴定板雜交或者線性探針測定。在上述方法中，利用Hybrid Capture的液體雜交和普通引物PCR之后線性探針測試被認為是針對于診斷目的最合適的方法。線性探針測定可以通過硝化纖維素膜上固定化寡核苷酸探針檢測出大約20種不同的HPV基因型，但是由于該方法的低靈敏度以及實驗數據難以解釋，使得該方法的可信度低。商業(yè)化的HybridCapture試劑盒無須PCR擴增即可檢出臨床樣品中的HPV DNA，并且可區(qū)別出高風險類和低風險類。但是Hybrid Capture試劑盒無法鑒定出感染HPV基因型，由于在高風險類HPV中風險因素是不相同的，換言之，中度風險類是包括在高風險類中的，所以限制了精確確定風險類型。并且，使用RNA探針可能會影響試劑盒的穩(wěn)定性，并且也不能排除感染的可能。
基于以上所述，開發(fā)研制一種簡單、精確的用于檢出HPV感染且鑒定感染HPV基因型的方法是非常必要的。
發(fā)明簡述本發(fā)明者嘗試去檢測HPV感染和通過鑒定臨床樣品中的HPV基因型鑒定HPV類型，以及制備一種基因型試劑盒，該試劑盒包括一個帶有互補于HPV DNA的核苷酸序列的探針的DNA芯片，通過PCR擴增臨床樣品中的DNA時所用的引物，和標記與所述DNA芯片上探針雜交的擴增DNA的物質(means)，通過該基因型試劑盒即可簡便，準確的檢測HPV感染和鑒定感染HPV的基因型。
本發(fā)明的主要目的是提供一種診斷HPV感染的基因型試劑盒。
本發(fā)明還提供一種HPV基因型試劑盒內的DNA芯片的制備方法。
本發(fā)明還提供一種利用HPV基因型試劑盒診斷HPV感染的方法。


以下是附圖的相應說明，有助于清楚理解上述目的和本發(fā)明的特征。
圖1是代表DNA芯片上探針類型和位置的圖解圖2a是顯示HPV 16 DNA分析結果的照片圖2b是顯示HPV 18 DNA分析結果的照片圖2c是顯示HPV 31 DNA分析結果的照片圖2d是顯示HPV 33 DNA分析結果的照片圖2e是顯示HPV 35 DNA分析結果的照片圖2f是顯示HPV 39DNA分析結果的照片圖2g是顯示HPV 45 DNA分析結果的照片圖2h是顯示HPV 51 DNA分析結果的照片圖2i是顯示HPV 52 DNA分析結果的照片圖2j是顯示HPV 56 DNA分析結果的照片圖2k是顯示HPV 58 DNA分析結果的照片圖2l是顯示HPV 59 DNA分析結果的照片圖2m是顯示HPV 66 DNA分析結果的照片圖3a是顯示HPV 6 DNA分析結果的照片圖3b是顯示HPV 11 DNA分析結果的照片圖3c是顯示HPV 34 DNA分析結果的照片圖3d是顯示HPV 40 DNA分析結果的照片圖3e是顯示HPV 42 DNA分析結果的照片圖3f是顯示HPV 44 DNA分析結果的照片圖4a是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的46號樣品DNA分析結果的照片圖4c是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的47號樣品DNA分析結果的照片圖4d是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的51號樣品DNA分析結果的照片圖4e是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的52號樣品DNA分析結果的照片圖4f是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的53號樣品DNA分析結果的照片圖4g是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的54號樣品DNA分析結果的照片圖4h是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的57號樣品DNA分析結果的照片圖4i是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的95號樣品DNA分析結果的照片圖4j是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的107號樣品DNA分析結果的照片圖4k是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的115號樣品DNA分析結果的照片圖4l是顯示使用本發(fā)明DNA芯片進行的124號樣品DNA分析結果的照片發(fā)明詳述本發(fā)明用于診斷人類乳頭狀病毒(HPV)感染的基因型試劑盒包括一個帶有與HPV DNA互補的核苷酸序列探針的DNA芯片；PCR擴增臨床樣品DNA所用引物；以及標記與所述DNA芯片上探針雜交的擴增DNA的物質。DNA芯片可以進一步包括位置標記以定位探針，通過標記物質，優(yōu)選生物素結合的物質，最優(yōu)選的是鏈親合素-R-藻紅素(是一種熒光基團和帶有生物素結合位點的蛋白質的結合物)進行染色和標記。
所述HPV基因型試劑盒中DNA芯片的制備方法包括如下步驟制備5′末端胺連接的DNA探針，該探針含有與HPV DNA互補的核苷酸序列；將由此制備的DNA探針固定到乙醛衍生物的固體表面；最后還原未與胺反應的過量乙醛。
制備本發(fā)明的DNA芯片的過程在下述步驟中詳細描述。
第一步探針的制備帶有與HPV DNA互補核苷酸序列的5′末端胺連接的DNA探針是這樣制備的設計并合成探針的核苷酸序列，使其帶有與HPV DNA互補的核苷酸序列，優(yōu)選HPV DNA的L1區(qū)，通過將胺基連接到核苷酸序列5′末端來制備探針，這樣胺基可使探針結合到乙醛衍生物固體表面上。
第二步固定探針將第一步中制得的探針固定在固體支持物的乙醛衍生物表面，優(yōu)選玻璃。通過固體支持物表面的乙醛基團與探針5′末端胺基之間的西夫氏堿反應將探針固定在固體支持物表面。該反應溫度為30-40℃，濕度70-100％，同時控制探針濃度在優(yōu)選100-300pmol/μl，最優(yōu)選濃度為200pmol/μl。
第三步制備DNA芯片固體支持物表面的未與胺反應的過量乙醛通過NaBH(硼氫化鈉)還原劑去除，最終制得DNA芯片。
利用本發(fā)明HPV基因型試劑盒診斷HPV感染的方法包括如下步驟利用HPV基因型試劑盒中的引物，PCR擴增臨床樣品中的DNA；將擴增得到的DNA應用于DNA芯片，使擴增DNA與DNA芯片上DNA探針雜交；并且在標記雜交DNA之后測定DNA芯片表面上結合的DNA。
利用本發(fā)明HPV基因型試劑盒診斷HPV感染的方法進一步在如下步驟中說明。
第一步擴增樣品DNA臨床樣品中得到的DNA通過HPV基因型試劑盒中引物擴增，其中聚合酶鏈式反應(PCR)中利用生物素-16-dUTP來得到含有生物素的擴增DNA。
第二步雜交如上所述的擴增DNA應用于HPV基因型試劑盒DNA芯片，與DNA芯片上的探針雜交。
第三步檢測與探針雜交的擴增樣品DNA通過標記物質被標記，并且利用聚焦激光掃描儀檢測鏈親合素-R-藻紅素作為優(yōu)選的標記物質，因為它可將具有高消光系數的熒光團與帶有四個生物素結合位點的蛋白質連接起來，因而保證聚焦激光掃描儀對于DNA芯片上的雜交點的高檢出率。
本發(fā)明所述HPV基因型試劑盒是一種能夠簡便，準確檢測HPV感染以及鑒定HPV感染類型的工具，所以對于子宮頸癌的早期診斷，預防和治療是很有作用的。
本發(fā)明在以下實施例中作了進一步說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。特別是盡管實施例中制備的DNA芯片帶有19個探針，但并不能理解為本發(fā)明就局限于探針的類型和數量，凡是使用HPV DNA衍生核苷酸序列的生物芯片以及任何使用所述DNA芯片檢測試劑盒的變異均屬于本發(fā)明保護范圍。
實施例1DNA芯片的制備選擇出流行的HPV型，包括13中高風險型(HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66)以及6種低風險型(HPV型6、11、34、40、42、44)，針對于每一種HPV型，制備序列的5′末端帶有胺基的特異基因型探針，用來檢測HPV基因型。每一種探針的核苷酸序列如下所述HPV165′-gtcattatgtgctgccatatctacttcaga-3′(SEQ ID NO1)，HPV185′-tgcttctacacagtctcctgtacctgggca-3′(SEQ ID NO2)，HPV315′-tgtttgtgctgcaattgcaaacagtgatac-3′(SEQ ID NO3)，HPV335′-tttatgcacacaagtaactagtgacagtac-3′(SEQ ID NO4)，HPV355′-gtctgtgtgttctgctgtgtcttctagtga-3′(SEQ ID NO5)，HPV395′-tctacctctatagagtcttccataccttct-3′(SEQ ID NO6)，HPV455′-acacaaaatcctgtgccaagtacatatgac-3′(SEQ ID NO7)，HPV515′-agcactgccactgctgcggtttccccaaca-3′(SEQ ID NO8)，HPV525′-tgctgaggttaaaaaggaaagcacatataa-3′(SEQ ID NO9)，HPV565′-gtactgctacagaacagttaagtaaatatg-3′(SEQ ID NO10)，HPV585′-attatgcactgaagtaactaaggaacgtac-3′(SEQ ID NO11)，HPV595′-ctgtgtgtgcttctactactgcttctattc-3′(SEQ ID NO12)，HPV665′-ctattaatgcagctaaaagcacattaacta-3′(SEQ ID NO13)，HPV65′-atccgtaactacatcttccacatacaccaa-3′(SEQ ID NO14)，HPV115′-atctgtgtctaaatctgctacatacactaa-3′(SEQ ID NO15)，HPV345′-tacacaatccacaagtacaaatgcaccata-3′(SEQ ID NO16)，HPV405′-gctgccacacagtcccccacaccaacccca-3′(SEQ ID NO17)，HPV425′-ctgcaacatctggtgatacatatacagctg-3′(SEQ ID NO18)，HPV445′-gccactacacagtcccctccgtctacatat-3′(SEQ ID NO19)，DNA芯片按如下步驟制備上述制備的每種探針以200pmol/μl的濃度溶解于3×SSC(45mM檸檬酸鈉，0.45M氯化鈉pH7.0)，通過微陣列儀(GMS 417 Arrayer，TaKaRa，Japan)在乙醛衍生物硅烷基化的載玻片(CSS-100，CEL，Houston，TX，USA)表面點出點陣列，陣列中點大小為150μm，兩點之間間距300μm，然后在37℃且濕度大于70％條件下進行西夫氏堿反應4小時，再用0.2％(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)以及三蒸水洗滌載玻片，然后用NaBH溶液(0.1gNaBH4，30ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，10ml乙醇)處理載玻片5分鐘，以去除未與胺反應的過量乙醛，再用三重蒸水洗滌載玻片，自然干燥。
實施例2樣品制備為檢測人類子宮頸化驗標本的HPV感染，從所述樣品中提取出DNA，并純化。為測試樣品DNA量是否足夠，所述的純化DNA通過利用β-珠蛋白引物——PC03(5′-acacaactgtgttcactagc-3′，SEQ IDNO20)和5′-生物素連接的PC04(5′caacttcatccacgttcacc-3′，SEQ IDNO21)進行PCR擴增。選出那些顯示β-珠蛋白DNA擴增的DNA樣品，用于下一步HPV DNA的分析。
至于HPV DNA標準，使用含有從下列捐獻者獲得的HPV序列的質粒DNAHPV型6，11，40，45，51來源于Dr.Ethel-Michele de Villiers，Angewandte Tumorvirologie，Deutsches Krebsforschungszentrum，Im Neuenheimer Feld 242，69009 Heidelerg，Germany；HPV型35，44和56來源于Dr.Attila Lorincz，Vice President，R&D andScientific Director，Digene Diagnostics，Inc.，2301-BBroadbirch Drive，Silver Spring，MD20904，USA；HPV型42，58和59來源于Dr.Toshihiko Matsukura，Department of Pathology andLaboratory of Pathology，AIDS Reserch Center，National Institueof Infectious Disease，TOKYO 162，Japan；HPV型33，34，39，52，和66來源于Dr.Gérard Orth，Unité Mixte InstitutPasteur/INSERM(U.190)，Institut Pasteur，25rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15.France.
另外，從下列細胞系分離純化的DNA作為陽性對照SiHa cellline(HPV 16，KCLB 30035，Human squamous carcinoma，cervix)和Hila cell line(HPV 18，KCLB 10002，Human epithelial carcinoma，cervix)購于Korean Cell Line Bank(Seoul National University，College of Medicine，Seoul，Korea)。
上述的選擇出的樣品DNA使用如下引物組進行PCR擴增GP5+(5′-tttgttactgtggtagatactac-3′，SEQ ID NO22)和生物素結合的GP6+，Bio-GP6+(5′-Biotin-gaaaaataaactgtaaatcatattc-3′，SEQ IDNO23)，以及GP5d+(5′-tttkttachgtkgtdgatacyac-3′，SEQ ID NO24)和GP6d+(5′-gaaahataaaytgyaadtcataytc-3′，SEQ ID NO25)。修飾過的引物組GP5d+/GP6d+促進臨床樣品HPV DNA的PCR擴增。在對核苷酸序列的描述中，‘k’表示‘g’或‘t’，‘h’表示‘t’、‘a’或‘c’，‘d’表示‘a’、‘t’或‘g’，‘y’表示‘t’或‘c’。
實施例2-1制備陽性對照組樣品為得到生物素標記的擴增DNA樣品，上述純化HPV16和HPV18DNA用GP5+和Bio-GP6+作為引物進行PCR擴增。PCR在50μl的反應混合液中進行，該反應混合液含有PCR緩沖液(50mM氯化鉀，4mM氯化鎂，10mM tris-HCl，pH8.3)，0.1μg DNA，4.5mM氯化鎂，50pmol每種引物，40μM每種dATP，dCTP，dGTP(Pharmacia)，30μM dTTP(Pharmacia)，10μM生物素-16-dUTP(Boehringer Manheim，Germany)和1u Taq聚合酶(TaKaRa，Japan)，PCR過程為94℃變性1分鐘，40℃引物退火兩分鐘，72℃進行1.5分鐘的延長反應，該過程循環(huán)40次。
實施例2-2HPV標準的制備同實施例2-1相似步驟制備生物素結合的擴增HPV DNA樣品，不同之處在于利用上述各種HPV質粒作為模板。
實施例2-3制備臨床樣品中DNA樣品同實施例2-1相似步驟獲得生物素結合的擴增HPV DNA樣品，不同之處在于所用模板為子宮頸化驗標本獲得的DNA，引物為GP5+和GP6+，并且PCR過程為94℃變性1分鐘，55℃引物退火兩分鐘，72℃進行1.5分鐘的延長反應，該過程循環(huán)40次。
實施例3使用DNA芯片檢測HPV感染實施例2中得到的擴增DNA樣品應用于實施例1中制得的DNA芯片，雜交過程在Cover slip(GRACE Bio-Labs，USA，PC4L-1.0)制成的100μl容積的雜交反應箱中進行。
為保證雜交反應樣品的數量，10μl每種擴增產物被用做陽性對照和質粒DNA，10μl的HPV擴增產物和5μl β-珠蛋白擴增產物混合液用做子宮頸化驗標本得到的DNA。加入3N NaOH溶液(10％v/v)變性所述的反應樣品，室溫靜置5分鐘，再加入1M Tris-HCl(Ph7.2，5％v/v)中和，然后加入3N HCl(10％v/v)，冰水中冷卻5分鐘。再將樣品與6×SSPE(磷酸鈉鹽-EDTA緩沖液，Sigma Chemical Co.，St。Louis，MO，USA)和0.2％SDS(十二烷基硫酸鈉)組成的雜交液混合，應用于DNA芯片，40℃條件下雜交2小時，然后用3×SSPE洗滌2分鐘，1×SSPE洗滌2分鐘，再于室溫自然干燥。與樣品DNA雜交的DNA芯片用含有5μl鏈親和素-R-藻紅素偶聯(lián)物(50μg/ml)和95μl 3×SSPE的混合液染色25分鐘，然后用1×SSPE洗滌，再用聚焦激光掃描儀(GMS 418 ArrayScanner，TaKaRa，Japan)分析熒光信號(吸收波長480nm，激發(fā)波長＞520nm)(見圖1，圖2a-2m，3a-3f，4a-4l)。圖1是DNA芯片上代表探針類型和位置的圖解數字代表每種HPV探針，‘bg’表示用于檢測合適雜交結果的β-珠蛋白探針，‘M’代表用于定位探針的位置標記，空心圓(○)代表HPV和β-珠蛋白探針固定的位置，實心圓(●)代表‘M’位置。圖2a-2m是顯示使用HPV質粒和子宮頸癌細胞系對于高風險型HPV DNA的分析結果圖2a是HPV16 DNA分析結果的照片，圖2b是HPV 18 DNA分析結果的照片，圖2c是HPV 31 DNA分析結果的照片，圖2d是HPV 33 DNA分析結果的照片，圖2e是HPV 35DNA分析結果的照片，圖2f是HPV 39 DNA分析結果的照片，圖2g是HPV 45 DNA分析結果的照片，圖2h是HPV 51 DNA分析結果的照片，圖2i是HPV 52 DNA分析結果的照片，圖2j是HPV 56 DNA分析結果的照片，圖2k是HPV 58 DNA分析結果的照片，圖2l是HPV 59 DNA分析結果的照片，圖2m是HPV 66 DNA分析結果的照片，圖3a-3f是顯示使用HPV質粒分析低風險類HPV DNA的結果照片圖3a是顯示HPV 6DNA分析結果，圖3b是顯示HPV 11 DNA分析結果，圖3c是顯示HPV34 DNA分析結果，圖3d是顯示HPV 40 DNA分析結果，圖3e是顯示HPV 42 DNA分析結果，圖3f是顯示HPV 44 DNA分析結果。如在圖2a-2m和圖3a-3f所示，無須顯著交差雜交即可在相應探針上清楚地觀察到HPV質粒標準對照和HPV陽性對照(子宮頸癌細胞系)的擴增DNA產生的雜交信號。
實施例4使用DNA芯片檢測臨床樣品中HPV感染為檢測本發(fā)明DNA芯片診斷的準確性和有效性，臨床樣品進行PCR擴增，所用引物含有SEQ ID NO20-25的核苷酸序列，然后針對合適樣品，利用DNA芯片進行診斷以檢出HPV感染以及確定感染類型。
124例在子宮頸部獲得的樣品被分離，然后通過實施例2-3中所述方法擴增，再用實施例3中所述的本發(fā)明DNA芯片分析HPV感染，上述124例分離出的DNA進行PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)鑒定，該PCR-RFLP鑒定中，DNA擴增后用限制性酶AvaII，AfaI、BglII、AccI或AvaI處理，然后分析限制性酶作用后得到的片段模式，以確定HPV感染的6種類型(HPV16、18、31、33、52和58)。PCR-RFLP的結果通過類型特異性PCR技術確定(見Hwang，T.，J.Kor.Med.Sci.，15593-599，1999；Fujinaga，Y.etal.，J.General Virology，721039-1044，1991)。對比兩種方法——本分明中的DNA芯片和PCR-RFLP及其隨后的類型特異性PCR——的結果，以鑒定DNA芯片方法診斷的有效性(見圖4a-4l，表1)。圖4a-4l是顯示子宮頸化驗標本樣品中HPV感染的DNA芯片分析結果的照片，如圖4a-4l所示，使用本發(fā)明的DNA芯片，可準確檢測和鑒定HPV感染基因型以實現臨床樣品中HPV感染的詳細診斷。上述124例臨床樣品通過這兩種方法測定，統(tǒng)計其結果的一致程度(見表1)。
表1.采用本發(fā)明的試劑盒和較早技術的PCR-RFLP測試方法獲得的檢測/鑒定基因型結果比較。



表1中，“無型”代表特異性方法未確定出HPV型的情況下，PCR擴增后HPV DNA的存在，“-”代表PCR擴增后HPV DNA不存在。如表1所示，兩種方法得到結果對比的良好一致性顯示出DNA芯片分析的高可信度?？紤]到過程的簡單、快速，加之能夠方便地檢測出基因型多樣性和多種感染，DNA芯片分析方法被認為是比PCR-RFLP及其隨后的類型特異性PCR和其它相關方法有利得多?；谏鲜?24例樣品的結果計算本發(fā)明DNA芯片診斷的準確率為96.5％，其重復率為95％，這被認為是完善更大規(guī)模病例研究的原因。FDA(Food and DrugAdministration)證實用于快速診斷HPV感染的Hybrid Capture試劑盒近來使用率上升。據報道對于檢測和區(qū)分高或低風險HPV感染。其準確率為98％，DNA芯片分析與Hybrid Capture試劑盒相比具有競爭性的效率及額外鑒定基因型的優(yōu)點。以上所述顯示使用本發(fā)明基因型試劑盒診斷HPV感染方法在許多方面優(yōu)于傳統(tǒng)用于診斷HPV感染的方法。
以上已清楚解釋說明本發(fā)明提供一種用于鑒定感染患者臨床樣品HPV基因型的基因型試劑盒，以及一種利用該基因型試劑盒鑒定感染病毒基因型的HPV感染診斷方法。本發(fā)明所述HPV基因型試劑盒包括一個帶有與HPV DNA互補的核苷酸序列探針的DNA芯片；PCR擴增臨床樣品DNA所用的引物；以及標記與所述DNA芯片上探針雜交DNA的標記物質。使用本發(fā)明所述基因型試劑盒診斷HPV感染的方法包括以下步驟利用該試劑盒中引物PCR擴增臨床樣品中的DNA，將擴增DNA應用于DNA芯片，使擴增DNA與DNA芯片上探針雜交；采用基因型試劑盒中標記物質標記與DNA芯片上探針雜交的DNA，之后檢測出DNA芯片表面上結合的DNA。本發(fā)明所述HPV基因型試劑盒是一種能夠簡便，準確檢測HPV感染以及鑒定HPV感染類型的工具，所以對于子宮頸癌的早期診斷，預防和治療很有作用。
除以上所示實施例外，本發(fā)明還可有各種不同的修改，這些修改對于本領域技術人員來說是顯而易見的，這些修改也屬本發(fā)明的保護范圍。
序列表<110>生物醫(yī)學實驗室有限公司<120>診斷人類乳頭狀病毒感染的基因型試劑盒<130>P0066/BML/PCT<150>KR 10-2000-0013161<151>2000-03-15<160>25<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV16<400>1gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV18<400>2tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca30<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV31<400>3tgtttgtgct gcaattgcaa acagtgatac30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV33<400>4tttatgcaca caagtaacta gtgacagtac30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV35<400>5gtctgtgtgt tctgctgtgt cttctagtga30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV39<400>6tctacctcta tagagtcttc cataccttct30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV45<400>7acacaaaatc ctgtgccaag tacatatgac30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV51<400>8agcactgcca ctgctgcggt ttccccaaca30<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV52<400>9tgctgaggtt aaaaaggaaa gcacatataa30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV56<400>10gtactgctac agaacagtta agtaaatatg30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV58<400>11attatgcact gaagtaacta aggaaggtac30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV59<400>12ctgtgtgtgc ttctactact gcttctattc30<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV66<400>13ctattaatgc agctaaaagc acattaacta30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV6<400>14atccgtaact acatcttcca catacaccaa30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV11<400>15atctgtgtct aaatctgcta catacactaa30<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV34<400>16tacacaatcc acaagtacaa atgcaccata30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV40<400>17gctgccacac agtcccccac accaacccca30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV42<400>18ctgcaacatc tggtgataca tatacagctg30<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HPV44<400>19gccactacac agtcccctcc gtctacatat30<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物PC03<400>20acacaactgt gttcactagc 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物PC04<400>21caacttcatc cacgttcacc 20<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GP5+<400>22tttgttactg tggtagatac tac 23<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GP6+<400>23gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GP5d+<400>24tttkttachg tkgtdgatac yac 23<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GP6d+<400>25gaaahataaa ytgyaadtca taytc 2權利要求
1.一種人類乳頭狀病毒(HPV)基因型試劑盒，包括(i)一個DNA芯片，其上帶有探針，該探針含有與HPV DNA互補的核苷酸序列；(ii)用于PCR擴增臨床樣品中獲得DNA的引物；以及(iii)標記物質，用于標記與所述DNA芯片上探針雜交的擴增DNA。
2.如權利要求1所述HPV基因型試劑盒，其中DNA芯片進一步包括用于定位探針的位置標記。
3.如權利要求1所述HPV基因型試劑盒，其中引物選自序列為SEQ ID No.22的GP5+，序列為SEQ ID No.23的GP6+，序列為SEQ ID No.24的GP5d+，序列為SEQ ID No.25的GP6d+。
4.如權利要求1所述HPV基因型試劑盒，其中標記物質是一種生物素結合的物質。
5.如權利要求4所述HPV基因型試劑盒，其中生物素結合物質是鏈親和素-R-藻紅素。
6.一種DNA芯片的制備方法，包括如下步驟(i)制備5′末端連接胺的DNA探針，該探針帶有與HPV DNA互補的核苷酸序列；(ii)將制得的DNA固定于固體支持物的乙醛衍生物表面；以及(iii)還原未與胺反應的過量乙醛。
7.如權利要求6所述DNA芯片的制備方法，其中與乙醛衍生的固體表面反應的探針濃度范圍為100-300pmol/μl。
8.如權利要求6所述DNA芯片的制備方法，其中將DNA探針固定于乙醛衍生的固體表面是通過胺與乙醛基團之間的西夫氏堿反應進行，該反應環(huán)境為溫度30-40℃，濕度70-100％。
9.如權利要求6所述DNA芯片的制備方法，其中乙醛的還原是通過還原劑NaBH4進行。
10.一種利用HPV基因型試劑盒診斷HPV感染的方法，包括如下步驟(i)PCR擴增臨床樣品DNA，所用引物為權利要求1中HPV基因型試劑盒中的引物，以獲得含有生物素的擴增DNA；(ii)將得到的擴增DNA應用于HPV基因型試劑盒中DNA芯片，使擴增DNA與DNA芯片上的DNA探針雜交；以及(iii)用HPV基因型試劑盒中標記物質標記與探針雜交的擴增DNA后，檢測結合在DNA芯片表面上的DNA。
11.用權利要求10的HPV基因型試劑盒診斷HPV感染的方法，其中PCR擴增臨床樣品中DNA使用了生物素-16-dUTP。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷人類乳頭狀病毒(HIV)感染的基因型試劑盒,以及利用該試劑盒測定患者體內分離出DNA樣品的基因型以診斷HPV感染的方法。本發(fā)明的基因型試劑盒包括一個帶有與HPV DNA互補的核苷酸序列的探針的DNA芯片,用于PCR擴增樣品DNA的引物,以及用于標記與DNA芯片雜交DNA樣品的物質。診斷HPV感染的方法包括使用試劑盒中引物擴增樣品得到的DNA,將擴增得到的DNA應用于DNA芯片,使擴增DNA與DNA芯片上的探針雜交,通過標記雜交DNA檢測結合在DNA芯片表面的DNA。由于本發(fā)明的試劑盒可以簡便地診斷HPV感染,準確地測定HPV的基因型,所以本發(fā)明的基因型試劑盒可應用于子宮頸癌的早期診斷、預防和治療。
文檔編號G01N37/00GK1350593SQ00807629
公開日2002年5月22日 申請日期2000年10月26日 優(yōu)先權日2000年3月15日
發(fā)明者樸泰信, 樸美宣, 金禎美 申請人:百奧麥雷公司