專利名稱：含有結(jié)合雌激素的提取物及其提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有結(jié)合雌激素的提取物及其提取純化方法，特別是涉及一種從孕驢尿中提取的含有結(jié)合雌激素的提取物及提取純化方法。
背景技術(shù)：
結(jié)合雌激素類藥物主要用于激素替代療法(Hormone Replacement Therapy,HRT)，用于緩解任何雌激素不足的臨床癥狀，治療和預(yù)防女性生理或人工絕經(jīng)后出現(xiàn)的更年期綜合癥，能夠預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥和冠心病。許多婦女把結(jié)合雌激素看作是一種能延緩衰老，留住青春的“靈丹妙藥”，美國惠氏公司也因此開始了在世界范圍內(nèi)對雌激素產(chǎn)品長達(dá)65年的壟斷。早期結(jié)合態(tài)雌激素提取研究中主要采用有機(jī)溶劑萃取方法，如低碳醇、酯、鹵代烴等，有美國專利US2834712、US2429398、US2711988、US2519516，但該方法易產(chǎn)生乳化、沉淀現(xiàn)象，導(dǎo)致萃取效率低，雌激素?fù)p失過多等問題。上世紀(jì)60年代，美國專利US2551205開始采用活性炭提取結(jié)合雌激素混合物，之后相繼出現(xiàn)了離子交換樹脂、聚丙烯酸酯吸附樹脂、反相硅膠進(jìn)行提取的案例。但這些方法普遍存在再生困難，吸附效率低，工業(yè)成本高等特點(diǎn)。在近幾年關(guān)于結(jié)合態(tài)雌激素的提取研究中，應(yīng)用新型的大孔吸附樹脂從孕馬尿中提取雌激素的方法逐漸顯露出前所未有的優(yōu)勢。該方法成本低、樹脂可再生、吸附效率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。孕馬尿中富含雌激素，每升孕馬尿中雌激素的平均含量為7(Tl30mg，每匹孕馬在孕期內(nèi)可形成雌激素50 100g。目前市售的結(jié)合雌激素藥物多為從孕馬尿中提取的天然雌激素。驢和馬同屬馬屬，有著共同的起源，有不少共同特征。但從驢尿中提取含有結(jié)合態(tài)雌激素的提取物還未見有報(bào)道。本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，采用苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂對孕驢尿中結(jié)合態(tài)雌激素進(jìn)行吸附分離，并開創(chuàng)性的結(jié)合反相柱純化工藝，成功從孕驢尿中提取 到結(jié)合態(tài)雌激素混合物，填補(bǔ)了孕驢尿應(yīng)用的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從孕驢尿中提取純化結(jié)合態(tài)雌激素的方法及由此方法得到的含有結(jié)合雌激素的提取物。為達(dá)上述目的，本發(fā)明一種從孕驢尿中提取純化結(jié)合雌激素的方法，包括以下步驟(I)將采集的孕驢尿樣品經(jīng)過大孔樹脂吸附柱分離，采用水混溶性溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到含有結(jié)合態(tài)雌激素的濃縮液；(2)將提取的結(jié)合態(tài)雌激素濃縮液，經(jīng)反相C18柱富集純化，進(jìn)行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物；(3)將純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物，加水和醋酸緩沖液，震蕩，然后加酶進(jìn)行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。
本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟(I)所用的大孔吸附樹脂為苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂，市場有售。本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟(2)所用純化方法為反相C18柱分離純化，且上樣前，C18反相柱經(jīng)洗脫溶劑沖洗，預(yù)先平衡直到獲得穩(wěn)定的基線。本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟(3)醋酸緩沖液濃度為O. 2M，pH=5. 2。本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟(3)中所用酶為硫酸酯酶。本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述水混溶性洗脫溶劑選自低級鏈烷醇，更優(yōu)選為甲醇或乙醇。本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟(I)中的孕驢尿?yàn)樵衅谠?個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿液。本發(fā)明還涉及由上述方法得到的含有結(jié)合雌激素的提取物。進(jìn)一步地，本發(fā)明含有結(jié)合雌激素的提取物中三種主要結(jié)合態(tài)雌激素為雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于，相比之前結(jié)合態(tài)雌激素多從孕馬尿中提取，本發(fā)明首次從孕驢尿中提取結(jié)合態(tài)雌激素，得到了含有雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結(jié)合態(tài)雌激素的混合物。本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，采用市售苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，再經(jīng)C18反相柱純化、進(jìn)行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫，從孕驢尿中得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物，由于常規(guī)使用的液-液和固-液提取方法中出現(xiàn)的諸多問題，如乳化層形成、沉淀、再生困難等現(xiàn)象，導(dǎo)致提取過程損失嚴(yán)重、成本增加、效率低。本發(fā)明克服了上述方法所產(chǎn)生的弊端，采用大孔吸附樹脂方法實(shí)現(xiàn)了快速、簡便地從孕驢尿中 獲得富集的結(jié)合雌激素混合物成分，并開創(chuàng)性的結(jié)合反相柱分離對富集的結(jié)合雌激素混合物進(jìn)行了純化，得到的提取產(chǎn)品中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉成分含量高。本發(fā)明工藝簡單，樹脂可再生，節(jié)約成本，產(chǎn)品收率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說明。本發(fā)明具體實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料來源1、孕驢尿液采自新疆喀什岳普湖。2、洗脫及萃取溶劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。3、硫酸酯酶購自上海西格瑪奧德里奇有限公司。4、液相檢測所用標(biāo)準(zhǔn)品雌酮、馬烯雌酮、17 α -雌二醇購自上海西格瑪奧德里奇有限公司。實(shí)施例1將IL采集的孕期在3個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿樣品經(jīng)過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用O %，15 %，60%, 100%乙醇洗脫3個(gè)柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經(jīng)C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分并分別濃縮至IOOmL,得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP O. 2M、pH5. 2的醋酸緩沖液IOOmL,震蕩30min，然后加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時(shí)，溫度40°C。水解后，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合并濃縮至幾乎干，加入5mL甲醇，得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物。經(jīng)高效液相檢測(檢測過程請參見試驗(yàn)例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結(jié)合態(tài)雌激素，含量分別為2. 9Img/L、2. 14mg/L、20. 45mg/L。實(shí)施例2將IL采集的孕期在3個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿樣品經(jīng)過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用10%，30%, 50%, 100%乙醇洗脫3個(gè)柱體積，取50%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經(jīng)C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分并分別濃縮至IOOmL,得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、pH5. 2的醋酸緩沖液IOOmL,震蕩30min，然后加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時(shí)，溫度400C。水解后，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合并濃縮至幾乎干，加入5mL甲醇，得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物。經(jīng)高效液相檢測(檢測過程請參見試驗(yàn)例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉含量分別為3. llmg/L、4. 2mg/L、18. 58mg/L0實(shí)施例3將IL采集的孕期在3個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿樣品經(jīng)過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用0%，15%，60%, 100%乙醇洗脫3個(gè)柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經(jīng)C18反相柱純化，依次用20%，50%, 80%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分并分別濃縮至IOOmL,得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物。取100%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、pH5. 2的醋酸緩沖液IOOmL,震蕩30mi n，然后加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時(shí)，溫度400C。水解后，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合并濃縮至幾乎干，加入5mL甲醇，得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物。經(jīng)高效液相檢測(檢測過程請參見試驗(yàn)例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結(jié)合態(tài)雌激素，含量分別為2. 91mg/L、2. 14mg/L、20. 45mg/L。實(shí)施例4將IL采集的孕期在3個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿樣品經(jīng)過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用0%，15%，60%, 100%乙醇洗脫3個(gè)柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經(jīng)C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分并分別濃縮至IOOmL,得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、pH5. 2的醋酸緩沖液IOOmL,震蕩30min，然后加硫酸酯酶約50mg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時(shí)，溫度400C。水解后，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合并濃縮至幾乎干，加入5mL甲醇，得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物。經(jīng)高效液相檢測(檢測過程請參見試驗(yàn)例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結(jié)合態(tài)雌激素，含量分別為1. 87mg/L、0. 95mg/L、ll. 23mg/L。
實(shí)施例5將IL采集的孕期在3個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿樣品經(jīng)過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用0%，15%，60%, 100%乙醇洗脫3個(gè)柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經(jīng)C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分并分別濃縮至IOOmL,得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP O. 2M、pH5. 2的醋酸緩沖液IOOmL,震蕩30min，然后加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱2小時(shí)，溫度400C。水解后，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合并濃縮至幾乎干，加入5mL甲醇，得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物。經(jīng)高效液相檢測(檢測過程請參見試驗(yàn)例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結(jié)合態(tài)雌激素，含量分別為3. 5Img/L、4. 51mg/L>17. 59mg/L。實(shí)施例6將IL采集的孕期在3個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿樣品經(jīng)過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用10%，20%, 50%, 70%, 80%, 100%甲醇洗脫3個(gè)柱體積，取50%和70%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經(jīng)C18反相柱純化，依次用20%，50%，80%，100%乙醇各IOOOmL洗脫，收集餾分并分別濃縮至IOOmL,得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物。取100%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、PH5. 2的醋酸緩沖液IOOmL,震蕩30min，然后加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時(shí)，溫度40°C。水解后，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合并濃縮至幾乎干，加入5mL甲醇，得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物。經(jīng)高效液相檢測(檢測過程請參見試驗(yàn)例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結(jié)合態(tài)雌激素，含量分別為 5. 21mg/L、2. 67mg/L、21. 33mg/L。

將上述實(shí)施例1-6提取純化得到的結(jié)合態(tài)雌激素混合物進(jìn)行含量檢測如下試驗(yàn)例I孕驢尿雌激素提取物高效液相色譜檢測測試儀器高效液相色譜儀(Agi lent 1100)色譜柱C185 μ m, 250 X 4. 6nm流動(dòng)相A相為0. 3%乙酸，B相為純乙腈；洗脫條件0 10min，80% 60%A;10 20min，60% 30%A ;20 30min，30%-5%A ;3(T35min，59T0%A。檢測條件柱溫為28°C，流速，lml/min,檢測波長270nm，進(jìn)樣體積20 μ I。測試步驟取Iml上述實(shí)施例得到的結(jié)合態(tài)雌激素提取物，通過0. 22 μ m—次性過濾器過濾，濾液加入進(jìn)樣瓶中經(jīng)液相檢測。樣品測定采用色譜峰的保留時(shí)間定性，采用外標(biāo)法以峰面積定量，測量結(jié)果如上述實(shí)施例中所述。以上所述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從孕驢尿中提取純化結(jié)合雌激素的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將采集的孕驢尿樣品經(jīng)過大孔樹脂吸附柱分離，采用水混溶性溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到含有結(jié)合態(tài)雌激素的濃縮液； (2)將提取的結(jié)合態(tài)雌激素濃縮液，經(jīng)反相C18柱富集純化，進(jìn)行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物； (3)將純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物，加水和醋酸緩沖液，震蕩，然后加酶進(jìn)行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(I)所用的大孔吸附樹脂為苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)所用純化方法為反相C18柱分離純化，且上樣前，C18反相柱經(jīng)洗脫溶劑預(yù)先平衡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)醋酸緩沖液濃度為O.2M，ρΗ=5· 2ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中所用酶為硫酸酯酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述水混溶性洗脫溶劑選自低級鏈烷醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述洗脫溶劑為甲醇或乙醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中的孕驢尿?yàn)樵衅谠?個(gè)月到10個(gè)月之間的孕驢尿液。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法得到的含有結(jié)合雌激素的提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的提取物，其特征在于所述的提取物混合物中三種主要結(jié)合態(tài)雌激素為雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有結(jié)合雌激素的提取物及其提取純化方法，包括以下步驟將采集的孕驢尿樣品經(jīng)過大孔樹脂吸附柱分離，采用水混溶性溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到含有結(jié)合態(tài)雌激素的濃縮液；將提取的結(jié)合態(tài)雌激素濃縮液，經(jīng)反相C18柱富集純化，進(jìn)行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物；將純化的結(jié)合態(tài)雌激素混合物，加水和醋酸緩沖液，震蕩，然后加酶進(jìn)行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。本發(fā)明采用苯乙烯型非極性共聚體D101大孔吸附樹脂，再經(jīng)C18反相柱純化，首次從孕驢尿中得到結(jié)合態(tài)雌激素提取物，工藝簡單，樹脂可再生，節(jié)約成本，同時(shí)避免了常規(guī)使用的液-液和固-液提取法所產(chǎn)生的弊端。
文檔編號B01D15/10GK103040866SQ20121056268
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者孟彩云, 秦玉峰, 尤金花, 周祥山 申請人:山東東阿阿膠股份有限公司