專利名稱：用于Western印跡的納米纖維膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于Western印跡的膜及其制備方法，所述膜所具有的三維開放式孔結(jié)構(gòu)的平均孔徑為0. 1 μ m至1. 0 μ m以及其厚度為30 μ m至200 μ m,其中該用于^festern 印跡的膜通過使由電紡絲而獲得的平均纖維直徑為50nm至IOOOnm的納米纖維經(jīng)過熱板壓延過程而制備。
背景技術(shù)：
目前常用的用于Western印跡的膜包括由硝化纖維(NC)、尼龍或聚偏1，1_二氟乙烯(下文稱為“PVdF”)聚合物制成的多孔膜。特別地，基于PVdF的膜主要用作Western印跡用膜，因?yàn)樗鼈兣c基于硝化纖維或基于尼龍的膜相比具有優(yōu)異的蛋白結(jié)合靈敏性、膜強(qiáng)度和操作性質(zhì)。Western印跡是用于檢測(cè)組織均漿或提取物的給定樣品中特異性蛋白的技術(shù)。其為用于從各種蛋白混合物中檢測(cè)任何特異性蛋白的技術(shù)，并且是通過使用抗待檢測(cè)蛋白的抗體來(lái)引起抗原-抗體反應(yīng)從而檢測(cè)蛋白存在的方法。Western印跡還用于通過多肽或蛋白三維結(jié)構(gòu)的尺寸來(lái)分離天然凝膠或變性蛋白。在Western印跡中，將從細(xì)胞或組織中提取的蛋白與樣品緩沖液混合，并放置在由丙烯酰胺制成的分子篩上，然后進(jìn)行電泳。然后，在樣品緩沖液中包含的十二烷基硫酸鈉 (SDS)使蛋白攜帶負(fù)㈠電荷，以便蛋白被吸引至正⑴電荷。同時(shí)，SDS分子篩干涉蛋白移動(dòng)，從而小分子快速移動(dòng)并且大分子慢速移動(dòng)，因此形成各種尺寸的帶。當(dāng)將膜放置在根據(jù)尺寸而分離的凝膠上并在其上施加電流時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)移至膜?？勾龣z測(cè)的特異性蛋白的抗體與膜結(jié)合，然后對(duì)該抗體特異性的第二抗體與該膜結(jié)合，并且通過X射線將生成的顯色反應(yīng)成像。用于該目的的膜為多孔膜，其由能與蛋白疏水作用的聚合物(例如，PVdF)制成并具有0. 2 μ m至0. 45 μ m的平均孔徑。該多孔膜由諸如通過相分離的濕法、干法或干-濕法澆鑄的方法而制備，其中將溶劑和聚合物引入諸如水的納米溶劑中。然而，多孔膜制備的成本高并且難于大量制備。此外，若多孔膜通過相分離而制備，則缺點(diǎn)在于孔結(jié)構(gòu)分布不均勻。例如，PVdF膜需要在使用前通過將其浸入甲醇中來(lái)進(jìn)行使膜部分親水化的過程，由此使膜與緩沖溶液的相容性最大化。若不進(jìn)行該親水化過程，則由于蛋白未充分地吸收在膜上而降低膜的靈敏性。該甲醇預(yù)處理過程能顯著降低膜的強(qiáng)度而導(dǎo)致裂縫并形成導(dǎo)致背景的氣泡，因此使其難于準(zhǔn)確地檢測(cè)期望的蛋白。因此，本發(fā)明人已使用電紡絲過程來(lái)以簡(jiǎn)單且便捷的方式制備昂貴的納米纖維膜，其為具有人工可控的孔結(jié)構(gòu)，并由具有最大表面積的納米纖維制成且甚至在其未經(jīng)過甲醇預(yù)處理過程時(shí)與現(xiàn)有膜相比具有優(yōu)異的靈敏性，由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明概述技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的是提供用于Western印跡的膜及其制備方法，所述膜使用電紡絲過程而制備、由具有最大表面積的納米纖維網(wǎng)組成以消除對(duì)甲醇預(yù)處理過程的需求， 并由此具有無(wú)背景的優(yōu)異靈敏性。本發(fā)明的另一目的是提供用于Western印跡的膜及其制備方法，所述膜由于通過進(jìn)行等離子表面改性來(lái)使膜親水化而具有更優(yōu)異的靈敏性。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了制備用于Western印跡的膜的方法，所述方法包括如下步驟將疏水性聚合物材料溶解在溶劑中以制備紡絲溶液；使紡絲溶液經(jīng)歷紡絲過程以獲得疏水性聚合物納米纖維網(wǎng)；以及將納米纖維網(wǎng)壓延以獲得用于 Western印跡的膜。本發(fā)明的方法還包括進(jìn)行表面改性以賦予壓延的納米纖維網(wǎng)親水性的步驟。用于本發(fā)明的疏水性聚合物材料可以為例如選自聚偏1，1_ 二氟乙烯(PVdF)、尼龍、硝化纖維素、聚氨基甲酸酯(Pu)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚乳酸(PLA)、聚丙烯腈(PAN)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚甲基吖丙啶(PPI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯乙酸酯(PVAc)和聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物中的一種或者兩種或多種的混合物。用于本發(fā)明的溶劑可以為選自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAc)、四氫呋喃(THF)、丙酮、乙醇、氯仿、二甲基亞砜(DMSO)、二氯甲烷、乙酸、甲酸、N-甲基吡咯烷酮 (NMP)、氟代醇和水中的一種或多種。形成納米纖維網(wǎng)的納米纖維的直徑優(yōu)選為50nm至lOOOnm。紡絲過程可以選自電紡絲、電霧化、電吹制紡絲、離心電紡絲、快速電紡絲、氣泡電紡絲、熔融電紡絲和非針電紡絲中的任一種。壓延通過選自壓縮、加壓、熱板壓延(hot-plate calendering)、滾壓、熱粘合、超聲波粘合、縫口密封帶法和層壓中的任一過程而進(jìn)行。相對(duì)于紡絲溶液的總重量，紡絲溶液優(yōu)選包含5%重量比至90%重量比的疏水性聚合物材料。當(dāng)在60°C至200°C下進(jìn)行熱處理時(shí)完成壓延步驟。優(yōu)選通過等離子處理進(jìn)行表面改性。使用氧氣或氬氣進(jìn)行等離子處理。優(yōu)選使等離子處理進(jìn)行30秒至300秒。優(yōu)選地，膜的平均孔徑為0. 1 μ m至1. 0 μ m、厚度為30 μ m至200 μ m以及孔隙率為大于等于60%。根據(jù)另一方面，提供了根據(jù)所述方法制備的用于Western印跡的膜。技術(shù)效果因此，本發(fā)明的用于制備Western印跡的膜的制備工藝簡(jiǎn)單，這樣能以低成本大批量生產(chǎn)，相比傳統(tǒng)的采用膜分離和分析的蛋白質(zhì)或多種應(yīng)用，本發(fā)明提供出色的靈敏度， 可用于檢測(cè)的用途。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制備的PVdF膜的一組掃描電子顯微圖。(a) IKX放大率；以及(b)10kx放大率。圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4制備的等離子-處理的PVdF膜的一組掃描電子顯微圖。(a)使用等離子處理30秒；(b)使用等離子處理60秒；(c)使用等離子處理150秒；以及(d)使用等離子處理300秒。圖3和圖4為示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4制備的等離子-處理的PVdF膜的接觸角和抗張強(qiáng)度的圖。圖5為示出在本發(fā)明實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例中制備的各個(gè)膜的尺寸的一組圖。(a) 對(duì)比實(shí)施例；以及(b)實(shí)施例1。圖6為在本發(fā)明實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例中制備的各個(gè)膜的橫截面的一組掃描電子顯微圖。(a)對(duì)比實(shí)施例；以及(b)實(shí)施例1。圖7示出在本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例中制備的膜的空氣中TGA分析的結(jié)果。 (a)對(duì)比實(shí)施例；(b)實(shí)施例1 (PVdF HSV 900) ； (c)實(shí)施例2 (PVdF 761)；以及(d)實(shí)施例 3 (PVdF 761/2801) 圖8示出使用在本發(fā)明實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例中制備的各個(gè)膜而進(jìn)行的Western 印跡的結(jié)果。圖9和圖10示出使用本發(fā)明實(shí)施例1至4中制備的各個(gè)膜而進(jìn)行的Western印跡的結(jié)果。圖11為示出在Western印跡后膜脫色的照片。發(fā)明詳述為了制備本發(fā)明的用于Western印跡的納米纖維膜，將諸如PVdF聚合物的疏水性聚合物以其能紡絲的濃度而溶解在溶劑中，由此制備紡絲溶液。將紡絲溶液傳送至噴絲頭噴嘴，然后通過向噴嘴施加高電壓而對(duì)紡絲溶液進(jìn)行電紡絲。使由電紡絲制備的納米纖維網(wǎng)經(jīng)過壓延過程，由此制備平均孔徑為0. 1 μ m至1. 0 μ m、平均纖維直徑為50nm至IOOOnm 且厚度為30 μ m至200 μ m的膜。該納米纖維膜甚至在其未經(jīng)過甲醇預(yù)處理的情況具有優(yōu)異的靈敏性，并因此其能用于蛋白的分離和檢測(cè)。其還可以在使用前經(jīng)過包括等離子處理的各種表面改性過程以使其表面親水化。在下文中，將詳細(xì)地描述本發(fā)明的制備納米纖維膜的方法的各個(gè)步驟。制備含疏水性聚合物的紡絲溶液的步驟將疏水聚合物(例如PVdF)以其能紡絲的濃度而溶解在適合的溶劑中，由此制備紡絲溶液。在紡絲溶液中的聚合物材料(PVdF)含量?jī)?yōu)選為5%重量比至90%重量比。若在紡絲溶液中聚合物材料的含量小于5%重量比，則當(dāng)對(duì)紡絲溶液進(jìn)行電紡絲時(shí)，其將形成小珠而非形成納米纖維，因此使其難于制備膜。在另一方面，若聚合物材料的含量大于90%， 則其將因?yàn)榧徑z溶液粘度高而難以形成纖維。因此，盡管紡絲溶液的制備不受特別地限制， 但其優(yōu)選將紡絲溶液中聚合物濃度設(shè)定在能夠易于形成纖維結(jié)構(gòu)的濃度，由此控制纖維形態(tài)。形成聚合物納米纖維網(wǎng)的步驟
使用計(jì)量泵將上述制備的紡絲溶液轉(zhuǎn)移至紡絲袋，然后使用高壓控制器通過向紡絲袋施加高壓來(lái)進(jìn)行電紡絲。因此，使用的電壓可調(diào)節(jié)在0. 5kV至IOOkV之間，并且作為集電板，可以將電導(dǎo)金屬或離型紙(release paper)，并且其可以在使用前接地或帶負(fù)電荷。 集電板優(yōu)選和與其連接的吸入式收集器一起使用，從而在紡絲期間有助于捆扎纖維。在靜電霧化中，紡絲袋和集電板之間的間隔優(yōu)選控制為5cm至50cm，并且使用計(jì)量泵以0. OOOlcc/洞·分鐘至5cc/洞·分鐘的速率排放紡絲溶液。此外，在能控制溫度和濕度的室中，優(yōu)選在為30%至80%的相對(duì)濕度下進(jìn)行電紡絲。按照上述進(jìn)行紡絲的納米纖維網(wǎng)的平均纖維直徑為50nm至lOOOnm。除了電紡絲，能使用電霧化、電吹制紡絲、離心電紡絲、快速電紡絲、氣泡電紡絲、 熔融電紡絲或非針電紡絲進(jìn)行紡絲過程。壓延聚合物納米纖維網(wǎng)的步驟上述紡絲的聚合物納米纖維網(wǎng)通過包括加壓、壓縮、滾壓、熱板壓延、熱粘合、超聲波粘合、縫口密封帶法和層壓在內(nèi)的各種方法進(jìn)行壓延，由此獲得壓延的膜。因?yàn)楂@得的聚合物納米纖維網(wǎng)具有三維開放式孔結(jié)構(gòu)，所以其甚至在未經(jīng)過甲醇預(yù)處理過程的情況下仍能夠提供具有超高靈敏性的膜。因此，膜的厚度為30μπι至200μπι且平均孔徑為0. ΙΟμπι至Ι.Ομπι。若膜的
厚度小于30 μ m,則其由于在Western印跡期間硬度低而難于操作，并且若其的厚度大于 200 μ m，則將增加制備成本。此外，若膜具有小于0. Iym的平均孔徑，則后處理過程成本將提高，并且將會(huì)延遲轉(zhuǎn)移時(shí)間，并且若其平均孔徑大于1. 0 μ m，則能轉(zhuǎn)移濃度降低，從而不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確地蛋白分析。特別地，當(dāng)進(jìn)行壓延時(shí)，還可以與壓延同時(shí)進(jìn)行熱處理。壓延中的熱處理溫度優(yōu)選為60°C至200°C，在該溫度范圍下聚合物不會(huì)熔融。若壓延中的熱處理溫度低于60°C， 則納米纖維間的粘合將不牢固，從而將發(fā)生納米纖維間的分離，由此使其以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行Western印跡，以及若熱處理溫度高于200°C，則通過將組成納米纖維的聚合物(例如， PVdF)熔融而使孔結(jié)構(gòu)封閉，從而蛋白不能從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至膜，由此使其不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的分析。修飾納米纖維表面的步驟使用各種方法能夠修飾納米纖維的表面結(jié)構(gòu)，所述方法包括包括使用溶劑除去 WBL(弱邊界層)、然后溶脹和表面蝕刻的化學(xué)方法；通過諸如X射線、Y射線或電子束的電離輻射來(lái)誘發(fā)表面反應(yīng)的光化學(xué)修飾方法；在真空下使用電暈放電或諸如等離子、電子束或粒子束的高能原子或分子離子來(lái)誘發(fā)表面氧化反應(yīng)的物理修飾方法；以及使用火焰或臭氧的方法。在本發(fā)明中，在這類表面改性方法之間，將當(dāng)具有低環(huán)境負(fù)載和優(yōu)異表面改性作用時(shí)為最簡(jiǎn)單的等離子處理用于使納米纖維表面親水化，由此提供用于超高靈敏性 Western印跡的膜。在等離子處理中的變量可包括所用的氣體的類型和流速、處理壓力、處理時(shí)間、電功率等。優(yōu)選地，確定適于納米纖維表面改性的條件。S卩，在等離子處理過程中可將氧氣(O2)或氬氣(Ar)用作處理氣體。在本發(fā)明中， 優(yōu)選使用具有蝕刻和交聯(lián)作用的氬氣。
等離子處理優(yōu)選在400W的功率下進(jìn)行30秒至300秒。若等離子處理時(shí)間短于30 秒，則膜的親水化程度將不充分，因此當(dāng)進(jìn)行Western印跡時(shí)，膜將具有與緩沖溶液的較差相容性，并且出現(xiàn)背景的幾率將非常高。若等離子處理時(shí)間長(zhǎng)于300秒，則膜將長(zhǎng)期暴露于等離子，將會(huì)使膜的物理性質(zhì)變差，而非改善，并且將增加過程成本。功率和處理時(shí)間彼此成反比，并且因此，當(dāng)功率增加時(shí)能縮短等離子處理時(shí)間。在下文中，將進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅為示例性目的， 并不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1相對(duì)于溶液的總質(zhì)量，以20%重量比來(lái)將疏水性均聚物PVdF (HSV 900)溶解在溶劑DMAc中，由此制備紡絲溶液。使用計(jì)量泵將紡絲溶液轉(zhuǎn)移至噴絲頭噴嘴，然后在下列條件下進(jìn)行電紡絲，由此獲得PVdF納米纖維網(wǎng)施加的電壓25kV ；噴絲頭和集電器之間的間隔20cm ；每分鐘放電量0. 005cc/g ·洞/分鐘；室溫和大氣壓。圖1為紡絲的PVdF納米纖維網(wǎng)的掃描電子顯微圖。如圖1所示，紡絲的納米纖維的平均纖維直徑為約300nm至400nm。此外，納米纖維具有相對(duì)均勻的孔徑和三維開放式孔結(jié)構(gòu)。將紡絲的PVdF納米纖維網(wǎng)通過使其經(jīng)過加熱至140°C的熱板軋輥而壓延，由此制備PVdF納米纖維膜。由壓延產(chǎn)生的膜具有約80 μ m的厚度。實(shí)施例2和3在實(shí)施例2和3中，以與實(shí)施例1中相同的方法，單獨(dú)將疏水性均聚物PVdF (761) (實(shí)施例2)或電紡絲均聚物PVdF (761)和共聚物PVdF (2801)的50 50 (w/w)混合物(實(shí)施例3)進(jìn)行電紡絲，然后壓延，由此獲得納米纖維膜。將實(shí)施例2和3中制備的膜經(jīng)過TGA、 XRD、SEM和DSC分析以與對(duì)比實(shí)施例中制備的膜進(jìn)行對(duì)比。在熱重量分析(TGA)的結(jié)果中，對(duì)比實(shí)施例和實(shí)施例中制備的樣品表現(xiàn)出基本相同的結(jié)果，并且表現(xiàn)出PVdF聚合物的典型特性。這些結(jié)果在下面“膜的結(jié)構(gòu)分析”部分描述。實(shí)施例4在實(shí)施例4中，使用等離子清潔器系統(tǒng)，使實(shí)施例1中制備的PVdF納米纖維膜經(jīng)過表面改性。當(dāng)供給IOOsccm的氬氣時(shí)，在400W下分別進(jìn)行30秒、60秒、150秒和300秒的表面改性。圖2為示出根據(jù)等離子處理時(shí)間而等離子處理的實(shí)施例4的PVdF膜的表面結(jié)構(gòu)的一組掃描電子顯微圖。如在圖2中所示，隨著等離子處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在PVdF納米纖維表面上出現(xiàn)的裂縫尺寸增加。這認(rèn)為是由于納米纖維表面因等離子處理而蝕刻。圖3示出根據(jù)等離子處理時(shí)間而進(jìn)行等離子處理的PVdF膜的水接觸角。如圖3 所示，PVdF膜的水接觸角由于等離子處理而降低。即，膜由于等離子處理而表現(xiàn)出親水性質(zhì)。隨等離子處理時(shí)間的延長(zhǎng)，膜的親水性質(zhì)提高。當(dāng)將膜等進(jìn)行離子處理30秒時(shí)，膜的親水性質(zhì)變化最大。圖4示出根據(jù)等離子處理時(shí)間而進(jìn)行等離子處理的實(shí)施例4的PVdF膜的抗張強(qiáng)度。如圖4中所示，隨著等離子處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抗張強(qiáng)度表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。這說(shuō)明隨著等離子處理時(shí)間延長(zhǎng)，膜的物理性能由于等離子處理而變差。(對(duì)比實(shí)施例)
為了對(duì)比，使用通過相分離而制備的商購(gòu)PVdF膜(PALL CO.，LTD.，BioTrace PVdF)。采用的PVdF膜的厚度為150 μ m且平均孔徑為0. 45 μ m。圖5示出實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例中制備的各個(gè)膜的平均孔徑，其中使用PMI毛細(xì)流孔隙率儀來(lái)測(cè)量平均孔隙直徑。如圖5中所示，實(shí)施例1的納米纖維膜表現(xiàn)出非常均勻的平均孔徑(圖恥)，而對(duì)比實(shí)施例的商購(gòu)膜表現(xiàn)出非常不均勻的平均孔隙直徑(圖fe)。圖6示出對(duì)比實(shí)施例(a)和實(shí)施例1 (b)中各個(gè)膜的橫截面的掃描電子顯微圖。如對(duì)比實(shí)施例的圖6(a)所示，商購(gòu)膜具有二維封閉的孔結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠錇槭褂孟喾蛛x而制備的。然而，如實(shí)施例1的圖6(b)所示，納米纖維膜當(dāng)其制備出時(shí)表現(xiàn)出三維開放式孔結(jié)構(gòu)。(膜結(jié)構(gòu)的分析)通過DSC、XRD、TGA和SEM進(jìn)行實(shí)施例1至3制備的各個(gè)膜和對(duì)比實(shí)施例中制備的商用膜的結(jié)構(gòu)分析。如在圖6a中所示，掃描電子顯微照相技術(shù)(SEM)的結(jié)果說(shuō)明對(duì)比實(shí)施例的膜具有非均勻的孔徑和閉合的孔結(jié)構(gòu)。圖7示出各個(gè)膜的熱重量分析(TGA)的結(jié)果。如圖7所示，對(duì)比實(shí)施例1的商用膜和實(shí)施例1至3的膜在約500°C或更低的溫度下在空氣中未分解。然而，觀察到實(shí)施例1 至3的膜比對(duì)比實(shí)施例的膜更熱穩(wěn)定。同時(shí)，為了測(cè)定實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例的各個(gè)膜的孔隙率，從各個(gè)膜中采集 Icm(寬)Xlcm(長(zhǎng))的樣品，并且根據(jù)下列方程⑴測(cè)量各個(gè)樣品的孔隙率
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孔隙率X誦(％}
I A) I..........(!)其中P C1為PVdF的密度(1. 76g/cm3)，并且P為測(cè)量的密度值。根據(jù)上述方程獲得的孔隙率對(duì)于實(shí)施例1為73.3%，且對(duì)于對(duì)比實(shí)施例為約 67%，說(shuō)明根據(jù)實(shí)施例1的方法制備的膜的孔隙率比對(duì)比實(shí)施例的膜高約10%。(測(cè)試實(shí)施例1:Western印跡)通常，在進(jìn)行Western印跡之前，膜需要通過使用100%甲醇對(duì)其進(jìn)行處理而部分地親水化。該過程增加了膜與Western緩沖液的相容性，從而在凝膠中易于發(fā)生膜與蛋白的相互作用。在該測(cè)試實(shí)施例中，在未進(jìn)行膜的部分親水化處理的狀態(tài)下使用實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例的膜進(jìn)行Western印跡。首先，將在實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例中制備的各個(gè)膜切割為6cm(寬)XScm(長(zhǎng))的尺寸，然后使用切割后的膜進(jìn)行Western印跡而不用甲醇處理該膜。為此，將各個(gè)切割的膜轉(zhuǎn)移至IX轉(zhuǎn)移緩沖液，然后靜置10分鐘。此時(shí)，轉(zhuǎn)移緩沖液包含3.03g/L Trisma-堿、 14. 4g/L甘氨酸和20%的甲醇(200ml/L)。將待轉(zhuǎn)移的凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，持續(xù)短暫的時(shí)間，并且放置在各個(gè)膜上，同時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡。使凝膠開始與膜接觸，將已由轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤(rùn)的3M紙涂覆于生成的膜的兩側(cè)，然后將膜放置在轉(zhuǎn)移試劑盒中。使用Mini-gel轉(zhuǎn)移試劑盒，在100V下，進(jìn)行蛋白向膜的轉(zhuǎn)移，持續(xù)1小時(shí)。同時(shí)， 為了減少熱量的產(chǎn)生，在將轉(zhuǎn)移試劑盒放置在冰上的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)移。在完成轉(zhuǎn)移之后，將膜從試劑盒中分離并使用1 X TBST (具有0. 05%吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖的鹽水) 洗滌。此時(shí)，TBST包含0. 2M的pH為8的三羥甲基氨基甲烷2g Trisma堿)和1. 37M NaCl (80g NaCl)，通過濃 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 7. 6。由此，在20μ g、10y g、5y g、2. 5μ g和Iyg的濃度下使用純化的蛋白抗體，并且使用10%的SDS-PAGE凝膠?？傓D(zhuǎn)移時(shí)間為約100分鐘，并且滯留時(shí)間(blocking time)為 90分鐘。作為第一抗體，使β -肌動(dòng)蛋白(Santa cruz, sc-47778)進(jìn)行5000倍稀釋，并使其在-4°C與轉(zhuǎn)移膜反應(yīng)約一天( 小時(shí))。使用X射線膠片來(lái)觀察轉(zhuǎn)移至膜的蛋白的表達(dá)。圖8示出使用實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例中制備的膜進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。如圖 8所示，在商購(gòu)膜的情況下，當(dāng)未使用甲醇對(duì)膜進(jìn)行處理時(shí)，不能觀察到蛋白的表達(dá)。然而， 在實(shí)施例1的膜(等經(jīng)離子未處理的)的情況下，清晰地觀察到蛋白的表達(dá)。這是由于實(shí)施例1的膜表現(xiàn)出毛細(xì)現(xiàn)象，因?yàn)槠渚哂腥S開放式孔結(jié)構(gòu)，其中孔由于電紡絲而從膜的一個(gè)表面延伸至其它表面。此外，認(rèn)為與對(duì)比實(shí)施例的膜相比，實(shí)施例1的膜孔徑均勻且由于孔隙率高因而產(chǎn)生的比表面積大，因此表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏性。特別地，因?yàn)槭褂孟喾蛛x制備對(duì)比實(shí)施例的商購(gòu)膜，所以認(rèn)為商購(gòu)膜將必然具有二維封閉開口結(jié)構(gòu)，因此與實(shí)施例1的納米纖維膜相比靈敏性低。(測(cè)試實(shí)施例2=Western印跡)使用在實(shí)施例1和4中制備的PVdF納米纖維膜，以與測(cè)試實(shí)施例1相同方式進(jìn)行 Western印跡。在進(jìn)行Wfestern印跡之前，使用100%甲醇對(duì)各個(gè)膜處理1分鐘，并且用等離子處理30秒、60秒、180秒或300秒或者不用等離子處理(等離子處理時(shí)間0秒)。圖9示出使用實(shí)施例1和4中制備的各個(gè)膜進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。如圖9所示，在未用等離子處理(等離子處理時(shí)間0秒)的實(shí)施例1的膜的情況下，使用甲醇(MeOH) 處理的膜與未用甲醇處理的膜相比表現(xiàn)出的蛋白表達(dá)高。然而，當(dāng)使用等離子分別處理實(shí)施例4的膜30秒、60秒、180秒和300秒的情況下，未用甲醇處理的膜與用甲醇處理的膜相比表現(xiàn)出的蛋白表達(dá)高。這認(rèn)為是因?yàn)楫?dāng)已經(jīng)通過等離子處理而表面-親水化的膜由甲醇進(jìn)行處理時(shí)，表面親水性變得過度，因此干擾了在膜和蛋白間的疏水相互作用。(測(cè)試實(shí)施例3=Western印跡)為了觀察等離子處理的膜隨時(shí)間的變化，使實(shí)施例1和4中制備的PVdF納米纖維膜在室溫下靜置3個(gè)月，然后以與測(cè)試實(shí)施例1和2相同的方式使用膜進(jìn)行Western印跡。 在圖10中示出Western印跡的結(jié)果。如圖10所示，即使在用等離子處理膜之后的3個(gè)月，所獲得到與測(cè)試實(shí)施例2的結(jié)果仍相同。這說(shuō)明用氬等離子處理的納米纖維的表面結(jié)構(gòu)未隨時(shí)間顯著改變。在測(cè)試實(shí)施例2和3的情況下，當(dāng)?shù)入x子處理時(shí)間為30秒時(shí)，更清楚地觀察到蛋白表達(dá)。如圖11所示，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)入x子處理時(shí)間大于60秒時(shí)，膜的表面親水化變得過度， 因此當(dāng)進(jìn)行Wfestern印跡時(shí)，膜變?yōu)辄S色。這歸因于膜和Western印跡緩沖液中包含的材料之間的相互作用，但在進(jìn)行Western印跡時(shí)未造成顯著問題。此外，如在圖9和10的結(jié)果所示，與用甲醇處理的樣品的情況相比，用等離子處理的樣品的情況中，蛋白表達(dá)更明顯。這說(shuō)明與甲醇處理相比，等離子處理更均勻地修飾納米纖維的表面結(jié)構(gòu)。特別地，本發(fā)明的納米纖維膜與現(xiàn)有商購(gòu)膜相比更有效地吸收蛋白。這認(rèn)為是由于納米纖維的比表面積大和由于其三維開放式孔結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的毛細(xì)效應(yīng)。此外，如圖6所示，這是因?yàn)榧{米纖維膜與現(xiàn)有的商購(gòu)膜相比具有均勻的孔結(jié)構(gòu)。因此，在本發(fā)明的納米纖維膜中，即使在未通過甲醇處理而親水化時(shí)仍發(fā)生蛋白表達(dá)。此外，當(dāng)其通過等離子處理而親水化并用作Western印跡用的膜時(shí)，其具有優(yōu)異的靈敏性，而且不具有背景。如上所述，本發(fā)明的膜尤其能用作Western印跡用的膜。此外，其能用作包括蛋白分離、分析、檢測(cè)和診斷在內(nèi)的各種領(lǐng)域中的膜。因此，本發(fā)明的用于Western印跡的膜通過簡(jiǎn)單方法而制備，因此能以低成本大量制備。此外，其與現(xiàn)有的膜相比提供了優(yōu)異的靈敏性，因此能用于包括蛋白分離、分析和檢測(cè)在內(nèi)的各種應(yīng)用。盡管為了示例性目的而描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種改進(jìn)、增加和替換是可能的，這不背離隨附的權(quán)利要求中所公開的本發(fā)明的范圍和主旨。
權(quán)利要求
1.制備用于Western印跡的膜的方法，所述方法包括如下步驟將疏水性聚合物溶解于溶劑中以制備紡絲溶液；使所述紡絲溶液經(jīng)過紡絲過程以獲得疏水性聚合物納米纖維網(wǎng)；以及將獲得的所述納米纖維網(wǎng)壓延以獲得用于Western印跡的膜。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括進(jìn)行表面改性以賦予經(jīng)壓延的納米纖維網(wǎng)親水性的步驟。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疏水性聚合物材料為選自聚偏1，1_二氟乙烯(PVdF)、尼龍、硝化纖維素、聚氨基甲酸酯(PU)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚乳酸 (PLA)、聚丙烯腈(PAN)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚甲基吖丙啶 (PPI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯乙酸酯(PVAc)和聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物中的一種或者兩種或多種的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑選自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺 (DMAc)、四氫呋喃(THF)、丙酮、乙醇、氯仿、二甲基亞砜(DMSO)、二氯甲烷、乙酸、甲酸、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、氟代醇和水中的一種或多種。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中形成所述納米纖維網(wǎng)的納米纖維的直徑為50nm至 IOOOnm0
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述紡絲過程選自電紡絲、電霧化、電吹制紡絲、離心電紡絲、快速電紡絲、氣泡電紡絲、熔融電紡絲和非針電紡絲中的任一種。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述壓延通過選自壓縮、加壓、熱板壓延、滾壓、熱粘合、超聲波粘合、縫口密封帶法和層壓中的任一過程而進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中基于所述紡絲溶液的總重量，所述疏水性聚合物材料的量為5%重量比至90%重量比。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行所述壓延步驟時(shí)在60°C至200°C下進(jìn)行熱處理。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其中通過等離子處理進(jìn)行所述表面改性。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中使用氧氣或氬氣進(jìn)行所述等離子處理。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中將所述等離子處理進(jìn)行30秒至300秒。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述膜的平均孔徑為0.1 μ m至1. 0 μ m、厚度為 30 μ m至200 μ m以及孔隙率大于等于60 %。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求制備的用于Wfestern印跡的膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于Western印跡的納米纖維膜及其制備方法，例如，該用于Western印跡的納米纖維膜的三維開放式孔通道結(jié)構(gòu)的平均孔徑為0.1μm至1.0μm且厚度為30μm至200μm，該用于Western印跡的膜通過使由電紡絲獲得的平均纖維直徑為50nm至1000nm的納米纖維經(jīng)過熱板壓延過程而制備。所述方法包括如下步驟將疏水性材料溶解于溶劑中以制備紡絲溶液；使該紡絲溶液經(jīng)過紡絲過程以獲得疏水性聚合物納米纖維網(wǎng)；以及壓延獲得的納米纖維網(wǎng)以獲得用于Western印跡的膜。
文檔編號(hào)B01D71/00GK102574067SQ201080043816
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者徐寅踴, 徐尚哲, 樸奏映, 李承勳, 趙紀(jì)云, 金允譓, 金哲賢, 金燦, 鞠重基 申請(qǐng)人:阿莫綠色技術(shù)有限公司, 阿莫麥迪有限公司