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用于測定具有生物來源和復(fù)雜組成的樣品中一種或多種分析物的方法及其用途的制作方法

文檔序號:5029972閱讀:1333來源:國知局
專利名稱:用于測定具有生物來源和復(fù)雜組成的樣品中一種或多種分析物的方法及其用途的制作方法
用于測定具有生物來源和復(fù)雜組成的樣品中
一種或多種分析物的方法及其用途
本發(fā)明涉及用于檢測一個或多個生物來源和復(fù)雜組成的樣品中一種或多種分析物的方法。
背景技術(shù)
許多應(yīng)用領(lǐng)域都需要通過外部作用,例如通過提供生物活性化合物的方式來確定復(fù)雜樣品中的多種生物相關(guān)分析物,例如在用于確定個體健康狀況或治療效果的診斷過程中,或者在用于確定生物系統(tǒng)影響,如有機體及其復(fù)雜的作用模式的 藥物研究開發(fā)過程中。
盡管已知的分析分離方法通常進行了優(yōu)化以根據(jù)預(yù)定義的理化參數(shù),例如分子量或分子的荷質(zhì)比來在盡可能短的時間內(nèi)分離存在于給定樣品中的盡可能大量化合物,但生物親和性檢測方法是基于在各種情況下利用一種盡可能高特異性的生 物或生化或合成的識別部件,以便以高度選擇性的方式來識別和結(jié)合復(fù)雜組成樣品中相應(yīng)的(單個)分析物。因而檢測大量不同化合物需要采用相應(yīng)數(shù)量的不同 特異性識別部件。
基于生物親和性反應(yīng)的任何檢測方法既可以在均勻溶液中進行也可以在固體載體的表面進行。根據(jù)所述方法的特殊設(shè)計,其需要在分析物與相應(yīng)的識別部件結(jié)合之后并且任選地在進一步與檢測物質(zhì)結(jié)合后,并同樣任選地,在各方法步驟之間的各種情況下進行洗滌步驟,以分離產(chǎn)生的所述識別部件與待測分析物的復(fù)合物,同樣任選地從剩余樣品中分離其它檢測物質(zhì)以及任選采用的附力口試劑。
現(xiàn)在較為廣泛使用的是,利用固定于固體載體上的不連續(xù)的、空間分隔的測量區(qū)域中作為識別部件的相應(yīng)互補核酸來同時檢測樣品中大量不同核酸的方法。例如,已經(jīng)公開了基于簡單玻璃載玻片或顯微鏡載玻片的并具有非常高特征密度(共 同固體載體上的測量區(qū)域的密度)的作為識別部件的寡核苷酸陣列。例如,美國專利No, 54459(AflfymaxTechnologies)描述并要求保護一種密度大于每平方厘米1000 個特征的寡核苷酸陣列。
近年來,更常見的記載用于同時測定大量蛋白質(zhì)的陣列以及利用其實施的類 似種類的檢測方法,例如美國專利No.6365418Bl,特別利用固定抗體作為待測分析物的識別部件的陣列。
涉及檢測核酸和其它生物高分子如蛋白質(zhì)的這種“微陣列”的專利文件中記載了在M情況下,將多種不同的特異性識別部件固定在不連續(xù)的測量區(qū)域中以形 賴于分析物識別的陣列,然后#^有分析物(任選地在復(fù)雜的混合物中)的待研究樣品與該"捕獲陣列"相接觸。根據(jù)所公開的說明書,紐不同的特異性識別部 件在各種情況下都以最高可能性的純度存在于不同的不連續(xù)測量區(qū)域中,這樣通常樣品中的不同分析物就結(jié)合到具有不同識別部件的測量區(qū)域。
已知的陣列類型需要通過有時非常復(fù)雜的加工步驟來以盡可能高純的形式純化和濃縮所述待固定的特異性識別部件。由于不同的識別部件多多少少在理化性 質(zhì)上有所不同(例如癡歐性),故用于在共同的固定載體上的不連續(xù)測量區(qū)域中, 任選地在施加于其中的促粘附層上,用于優(yōu)化固定所述識別部件也有相應(yīng)的不同,例如通過吸附或共價結(jié)合的方式。因此,選擇固定多種不同識別部件的 固定條件(例如,促粘附層的種類)很難同時針對所有的識別部件優(yōu)化,而僅在不同的識別部件的固定特性之間進行折中。另一缺點是在各種情況下每個陣列僅有一個施加的樣品可以用于在這種捕獲陣列中存在的分析物的研究。
因而需要一種改良的陣列設(shè)計,其能夠針對存在于所述樣品中的分析物進行大量樣品品的分析,可以在一個陣列上或者在共同載體上的多個陣列上同時進行,或者在多個載體上的多個陣列上順序進行。為此,可以很方便地將被研究的樣品本身而不是不同的特異性識別部件施加到一個或多個載體上的一個或多個陣列的不 連續(xù)測量區(qū)域中,這是以直接的方式,即未處理的形式,或者在盡可能少的一些制備步驟之后進行的。這種陣列設(shè)計在下文中將稱為"反式測試架構(gòu)"。
為了滿足這種種需要,例如,最近Paweletz等人在Oncogene 2001, Vol. 20,1981 — 1989中基于反式測試構(gòu)架構(gòu)提出了這種用于蛋白質(zhì)檢測的陣列,命名為"反相蛋白質(zhì) 微車列"。
這種分析物檢測則方法,利用微陣列以及甚至更通用的在表面上進行的檢測方法,其基于結(jié)合試劑作為祠側(cè)分析物的特異性結(jié)合配對物的特異性結(jié)合,的一個 常見的問題非特異性結(jié)合事件的發(fā)生,其并非基于分析物和用于檢測分析物的結(jié)合試劑之間、以及任選的進一步的檢測試劑之間的特異f封目互作用。
美國專利No.5726064記載了修正背景信號對測試信號干擾的多種方法,例如 背景熒光,其尤其可能由非特異性的結(jié)合割牛產(chǎn)生,以及溫度或pH值的變化,其 可能削弱觀察到的測試信號。這些方法基本上是根據(jù)在共同的固體載體上,除了 指定為產(chǎn)生測試信號的區(qū)域之外提供為此修正目的而指定的附加區(qū)域。
美國專利申請2004/0043508Al 記載了與不同表面的特異和非特異性結(jié)合的程度,所述表面用于制備"捕獲陣列",該捕獲陣列用不同的材料進行了處理以最小化非特異性的結(jié)合。在該文中,據(jù)說有靜電作用的涂層有利于減少非特異 性的結(jié)合。
美國專利No.5677196也記載了用于最小化非特異性結(jié)合的不同表面涂層,特
別是包括緣乙烯醇的那些,以及對于非特異性結(jié)合的絕對和相對比例測量,但同樣
是以對應(yīng)于捕獲陣列的(傳感器)形式。
所述用于最小化測試結(jié)盟果的非特異性結(jié)合的方法具有共同的特征,即它們 基于改變所述載體表面的性質(zhì)以賄或者最小化在固定有分析物特異性識別部件
的測試區(qū)域中本身不會發(fā)生非特異魁吉合,、因為這些效應(yīng)在所描:的方法中
不能加以考慮。此外在捕獲P車列的情況下,利用施加到測量區(qū)域中的化合物精確 限定的組成,即通常稱為測量區(qū)域內(nèi)識別部件的一致形式,通過認真選擇所述識 別部件以及測試中使用的結(jié)合和檢測試劑可以基本上滿足上述需要。
在用于具有反式測試架構(gòu)的測試陣列的情況下,即利用固定在測量區(qū)域中的生 物來源和復(fù)雜組成的樣品,要滿;Ui述前提是困難而不可靠的,因為所施加的樣 品具有生物樣品基質(zhì)的多種不同化合物的未知組成。因而預(yù)計結(jié)合式劑和任選使 用的檢測試劑的非特異性學(xué)結(jié)合會在明顯程度上發(fā)生,甚至在測量區(qū)域內(nèi)也如此。
本發(fā)明的一個目的是為這種種測試提供測量區(qū)域的陣列,其中固定有含有待測分 析物的生物來源和復(fù)雜組成的樣品, 一種能夠確定測量區(qū)域中發(fā)出的、由力加入的結(jié)合試劑以及任選加入的檢測試劑的非特異性互相作用產(chǎn)生的光學(xué)信號的比例的方法。
而且,本發(fā)明實現(xiàn)了甚至更通用問題,即測定生物來源和復(fù)雜組成的固定樣品 中一種或多種分析物的絕對含量,并校正由于結(jié)合到棒則分析物上的結(jié)合試劑所 產(chǎn)生的信號。通過添加適當(dāng)數(shù)量的含有適當(dāng)濃度的相應(yīng)分析物的校正溶液,以對 存在于所提供樣品中的、結(jié)合于其固定在"捕獲陣列"中的識別部件上的分一斤物 所產(chǎn)生的信號生M正曲線是爿W口的。不利的是,該方法需要添加多種溶船)J相 應(yīng)的多個扭Dl匕同種類型的測量區(qū)域陣列中。國際申請WO01/092870和 WO 02/40998中提出,在各種情況下在一個或多個陣列中,提供多個測量區(qū)域,其 中以不同的可控密度固定有生物或生4線合成的識別部件,以檢測對所述測量區(qū)域很常見的分析物。特別優(yōu)選的是,利用已知的分析物與其生物或生化合成的 識別部件之間的結(jié)合信號的濃度依賴性,以及以不同的可控密度固定在一個P車列 的多個測量區(qū)域中的所述識別部件的足夠大"變化",已經(jīng)可以通過向所述陣列中添 力口單個校正溶液來生成所述分析物的校正曲線。然而,用于"捕獲陣列"的這些
不同的校正方法總是用于校正由于存在于溶液中的未知濃度分析物與陣列的固定識別部件相結(jié)合而產(chǎn)生的信號。相比之下,對于含固定在不連續(xù)測量區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成的樣品陣列而言,目的在于對以未知濃度存在于固定基質(zhì)中的分析物的校正。根據(jù)本發(fā)明的測量區(qū)域的陣列以及發(fā)明基于此的定量測方法解決了該任務(wù)。通過與本發(fā)明的用于區(qū)分特異性和非特異性結(jié)合所產(chǎn)生信號比例的上述方法相結(jié)合,使得能夠以可靠的方式確定分析物的絕對含量和濃度。
令人驚訝的是,本發(fā)明還可以對本文所使用的陣列種類高精確度地得到存在于復(fù)雜組成的固定樣品中的分析物的相對和/或絕對含量或者相對和/或絕對濃度。
附圖簡要說明
圖l:用于本發(fā)明方法的具有6個測量區(qū)域陣列的載體。在該陣列的左右表示了用于耦合光進出的光柵結(jié)構(gòu)。放大的細節(jié)圖描繪了單個陣列中測量區(qū)域的幾何設(shè)置。——測量區(qū)域內(nèi)容的附圖標記參見表l。
圖2:來自測量區(qū)域的參比熒光強度(RFI),其中所述測量區(qū)域具有施加于其中的純化Akt,并且固定溶液中另外存在有0.1 mg/mlBSA或0.1 mg/ml的鼠血清,作為固定溶液的Akt濃度的函數(shù)。實心標記結(jié)合試劑溶液中無竟?fàn)巹┧傻暮苏€("抗Akt"抗體,5nM)。空心標記結(jié)合試劑溶液中具有100nM 的Akt作為竟?fàn)巹┧傻臏y量曲線。
圖3:來自測量區(qū)域的參比焚光強度(RFI),其中所述測量區(qū)域具有施加于 其中的純化Akt,并且固定溶液中另外存在有0.1 mg/ml BSA或0.1 mg/ml的鼠血清,作為固定溶液的Akt濃度的函數(shù)。實心標記結(jié)合試劑溶液中無竟?fàn)巹┧傻男U€("抗Akt"抗體,5nM)??招臉擞浗Y(jié)合試劑溶液中具有0.1 mg/ml 的EA清作為非特異性結(jié)合竟?fàn)巹┧傻臏y量曲線。
圖4:用于檢測由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性Akt的參比焚光強度, 具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000ng/ml),作為固定溶液的總蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(上橫坐標)。還癥會制了圖2的用于沖&則Akt的校正 曲線,由另外含有0.1mg/mlBSA的測量區(qū)生成(作為AktM的函數(shù),下橫坐標)。
圖5:用于檢測由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性Akt的參比熒光強度, 具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000ng/ml),作為固定溶液的總蛋白質(zhì);級(上橫坐標)的函數(shù)。實心標記結(jié)合試劑劑溶液中無竟?fàn)巹┑臏y量過程獲得的測量值("抗Akt"抗體,5nM);空心標記,試劑溶液中具有100nM的純化Akt作為竟?fàn)巹┑臏y量過程獲得的測量值("抗Akt"抗體,
5nM)。 還繪制了圖2的用于檢測則Akt的校正曲線,由另夕卜含有0.1 mg/mlBSA的 測量區(qū)域生成(實心標記;作為AktM的函數(shù),下橫坐標)以^目應(yīng)的校正曲 線,由接合試劑溶液中含有100nMAkt作為竟?fàn)巹┧?空心標記;作為Akt 濃度的函數(shù),下橫坐標)。
圖6:通過比較溶液中存在和不存在在竟?fàn)巹r的數(shù)據(jù),確定在0.1mg/ml的蛋 白質(zhì)濃度下圖5中由特異性結(jié)合形成的信號比例(圖6a),以及通過比較由特異 性結(jié)合("SB")形成的信號比例與校正曲線,確定內(nèi)源性Akt的含量(圖6b)。
圖7:用于4&則由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性Akt的參比焚光強度, 具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000ng/ml),作為固 定溶液的總蛋白質(zhì)濃度(上橫坐標)的函數(shù)。實心標記從結(jié)合試劑溶液中無竟 爭劑的測量過程獲得的測量值("抗Akt"抗體,5nM);空心標記從結(jié)合試劑溶溶 液中具有0.1 mg/ml的ajk清作為非異魁吉合的竟?fàn)巹┑臏y量過程獲得的測量值 ("抗Akt"^^, 5nM) 。 還繪制了圖2用于檢測Akt的校正曲線,由另夕卜含有 0.1mg/mlBSA的測量區(qū)域生成(實心標記;作為AktM的函數(shù),下橫坐標)以及相應(yīng)的校正曲線,由結(jié)合試劑溶液中含有0.1 mg/ml的鼠血清作為非特異結(jié)合 的竟?fàn)巹┧?空心標記;作為AktM的函數(shù),下橫坐標)。
圖8:來自測量區(qū)域的參比熒光強度(RFI),其中所述測量區(qū)域具有勵口于 其中的純化Akt,并且固定溶液中另外存在O.l mg/mlBSA或0.1 mg/ml的鼠血 清,作為固定溶液的P-Akt (Ser473)濃度的函數(shù)。實心標記結(jié)合試劑劑溶液中無 竟?fàn)巹┧傻男U€("抗P-Akt (Ser473),,抗體,5nM)??招臉擞浗Y(jié)合 試劑溶液中具有l(wèi)OOnMAkt作為竟?fàn)巹┧傻臏y量曲線。
圖9:來自測量區(qū)域的參比狄強度(RFI),其中所述測量區(qū)域具有施加于 其中的純化Akt,并且固定溶液中另外存在0.1 mg/ml BSA或0.1 mg/ml的E> 清,作為固定溶液的P-Akt (Ser473)濃度的函數(shù)。實心標記結(jié)合試劑溶液中無 竟?fàn)巹┧傻男U€("抗P-Akt (Ser473)"她,5nM)??招臉擞浗Y(jié)合 試劑溶液中具有0.1 mg/ml的鼠血清作為非特異f生結(jié)合竟?fàn)巹┧傻臏y量曲線。


圖10:用于檢測由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Ser473)的參 比熒光強度,具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000 n^ml), 作為固定溶液的總蛋白質(zhì)M (Ji^黃坐標)的函數(shù)。了圖7用于檢測P-Akt (Ser473)的才^jE曲線,由另夕卜含有0.1 m^ml BSA的測量區(qū)i勝成(作為P-Akt (Ser473)濃度的函數(shù),下橫坐標)。
圖11:用于檢測由鼠心臟組織織中制備的樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Ser473)的參
比熒光強度,具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000 ng/ml), 作為固定溶液的總蛋白質(zhì)濃度(上橫坐標)的函數(shù)。實心標記Akt式劑溶液 中無竟?fàn)巹┑臏y量過程得的測量值("抗P-Akt (Ser473),,抗體,5nM);空心 標記從結(jié)合式劑溶液中具有100nM的純化Akt作為竟?fàn)巹┑臏y量過程獲得的測 量值("抗P-Akt (Ser473) 1脈,5 nM) 。 還繪制了圖7的用于檢測P-Akt (Ser473 ) 的校正曲線,由另夕卜含有0.1 mg/ml BSA的測量區(qū)Jt勝成(實心標"i己;作為P-Akt (Ser473)濃度的函數(shù),下橫坐標)以^i目應(yīng)的校正曲線,由結(jié)^^式劑溶液中含有 100nMAkt作為竟?fàn)巹┧?空心標記;作為Akt濃度的函數(shù),下橫坐標)。
圖12:通過比較溶液中存在竟?fàn)巹r的測量值,確定在0.1mg/ml的 蛋白質(zhì)濃度下圖11中由特異性結(jié)合成的信號比例(圖12a),以及通過比較由 特異性吉合("SB")形成的信號比例與校正曲線,確定內(nèi)源性Akt的含量(圖12b)。
圖13:用于檢測由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性P-Kat(Ser473)的參比熒光強度,具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt(1000ng/ml),作為固定溶液的蛋白質(zhì)濃度(上橫坐標)的函數(shù)。實心標記從結(jié)合試劑溶液中無競爭劑的測量過程獲得的測量值(”抗P-Akt(Ser473)“抗體,5nM);空心標記;從結(jié)合試劑溶液中具有0.1mg/ml的鼠血清作為非異性結(jié)合的競爭劑的測量過程獲得的測量值。還繪制了圖8用于檢測)P-Kat(Ser473的校正曲線,由另外含有0.1mg/mlBSA的測量區(qū)域生成(實心標記;作為P-Kat(Ser473)濃度的函數(shù),下橫坐標)以及相應(yīng)的校正曲線,由結(jié)合試劑溶液中含有0.1mg/ml的鼠血清作為非特異性結(jié)合的競爭劑鎖生成(空心標記);作為P-Kat(Ser473濃度的函數(shù),下橫坐標)
圖14:來自測量區(qū)域的參比熒光強度(RFT),其中所述測量區(qū)域具有施加于 其中的純化Akt,并且固定溶液中另外存有O.l mg/mlBSA或0.1 mg/ml的1血 清,作為固定溶液的P-Akt (Thr308) 的函數(shù)。實心標記結(jié)^^式劑溶液中無 竟?fàn)巹┧傻男U€("抗P-Akt (Thr308)"抗體,5nM)??招臉薸己結(jié)合 試劑溶液中具有l(wèi)OOnMAkt作為竟?fàn)巹┧傻臏y量曲線。
圖15:來自測量區(qū)域的參比熒光強度(RFT),其中所述測量區(qū)域具有編口于 其中的純化Akt,并且固定溶液中另外存在有O.l mg/mlBSA或0.1 mg/ml的鼠血清,作為固定溶液的P-Akt (Thr308)濃度的函數(shù)。實心標記結(jié)合試劑溶液中無 竟?fàn)巹┧傻男U€("抗P-Akt (Thr308)"抗體,5nM)??招臉擞浗Y(jié)合 試劑溶液中具有O.l mg/ml EA清作為非特異彪吉合的竟?fàn)巹┧傻臏y量曲線。
圖16:用于檢測由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Thr308)的參比焚光強度,具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt( 1000n^ml), 作為固定溶液的總蛋白質(zhì)^1(J^黃坐標)的函數(shù)。還繪制了圖12用于檢測P-Akt(Thr308)的才^jE曲線,由另外含有0.1 mg/ml BSA的測量區(qū)生成(作為假定的 P-Akt (Thr308) 濃度的函數(shù),下橫坐標)。
圖17:用于沖&則由鼠心I^且織中制備的樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Thr308)的參 比焚光強度,具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000 ng/ml), 作為固定溶液的總蛋白質(zhì)M (J^f黃坐標)的函數(shù)。實心標記/A^^式劑溶液 中無竟?fàn)巹┑臏y量過程得的測量值("抗P-Akt (Thr308) 1脈,5nM);空心 標記從結(jié)合試劑溶液中具有100nM的純化Akt作為竟?fàn)巹┑臏y量過獲得的測 量值("抗P-Akt(Thr308),,抗體, 5nM)。還繪制了圖14用于才^則P-Akt(Thr308) 的沖li曲線,由另夕卜含有0.1mg/mlBSA的測量區(qū)生成(實心標記;作為P-Akt(Thr308)濃度的函數(shù),下橫坐標)以^i目應(yīng)的校正曲線,由結(jié)^i式劑溶液中含有 100nMAkt作為竟?fàn)巹┧?空心才朽己;作為假定的P-Akt (Thr308) M的函 數(shù),下橫坐標)。
圖18:通過比較溶液中存在和不存在竟?fàn)巹r的測量值,確定在0.1mg/ml的 蛋白質(zhì)濃度下圖17中由特異魁吉合形成的信號比例。
圖19:用于檢測由鼠心臟組織中制備的樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Thr308)的參 比^強度,具有(上曲線)或不具有(中曲線)另外添加的純化Akt (1000 n^ml), 作為固定溶液的總蛋白質(zhì)濃度(J^f黃坐標)的函數(shù)。實心標記:結(jié)合試劑溶液 中無竟?fàn)巹┑臏y量過程得的測量值("抗P-Akt (Thr308)"抗體,5nM);空心 標記結(jié)合試劑劑溶液中具有0.1 mg/ml的IA清作為非異魁吉合的竟?fàn)巹┑臏y量 過牙1^得的測量值("抗P-Akt (Thr308) tl脈,5nM) 。 還繪制圖12用于檢 測P-Akt (Thr308)的才itiE曲線,由另外含有O.lmg/mlBSA的測量區(qū)生成(實 心標記;作為,汰的P-Akt (Thr308) M的函數(shù),下一黃坐標)以;相應(yīng)的校正曲 線,由結(jié)^i式劑溶液中含有0.1 mg/ml的IA清作為非特異,吉合的竟?fàn)巹┧?(空心標記;作為假定的P-Akt (Thr308)濃度的函數(shù),下橫坐標)。
發(fā)明詳細說明
根據(jù)本發(fā)明,固體載體上空間分隔或不ili賣的測量區(qū);i^當(dāng)由封閉的區(qū)iV斤限 定,其被施加于上面的生物來源和復(fù)雜組成的樣品或者施加的參比試劑(例如,熒iiy示記的白蛋白)或教正試劑或者施加的其混合物所占據(jù)。所述區(qū)域可具有任 何幾何形狀,例如可以是圓形、矩形、三角形、橢圓性等等。
本發(fā)明的第一主題是用于檢測一種或多種生物來源和復(fù)雜組成的樣品中的一種或多種分析物的方法,包括以下步驟
(1) 提供一種或多種生物來源和復(fù)雜組成的樣品,
(2) 提供至少一個固體載體,
(3) 將少量所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀釋的形式直接施加到所述固體載體上的不連續(xù)的位點上,或者在預(yù)先施加促粘附層之后施加到固體載體上的所述促粘附層上,從而在所趕少一個固體載體上形成一個或多個不連 續(xù)測量區(qū)域的陣列,
(4)使至少一個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列與第一溶液接觸,所述第一溶液含有一種或二種或多種待測分析物特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑和如果需要的話任選地含有一種或多種檢測試劑,所述分析物存在于所述不連續(xù)測量區(qū)域中施加的生 物來源和復(fù)雜組成的樣品中,并且,所述結(jié)合試劑和檢測試劑可以同時或者順序施加,
(5) 以空間分辨的方式測量從已在步驟(4)中與第一溶液接觸后的一個或多個陣列的不連續(xù)測量區(qū)域發(fā)出的第一光學(xué)信號,
(6)記錄所述第一光學(xué)信號,基特征在于,通過進一步進行以下步驟測定肺則得的第一光學(xué)信號的比例,所述第一光學(xué)信號是由于與加入的結(jié)合試劑和任選加入的檢測試劑發(fā)生非特異性相互作用而產(chǎn)生的;
(7a)在步驟(4)中力口入的第一溶液的一種或多種結(jié)合試劑和任選的一種或 多種檢測試劑之外施加笫二溶液,其含有已知高濃度的化合物,其與待測的并存 在于生物來源和復(fù)雜組成的樣品中的分析iNt類相同,該樣品已施加到不連續(xù)的 測量區(qū)域中,作為所述彬則的并存在于生物來源和復(fù)雜組成的樣品中分析物的竟?fàn)?劑,該樣品已施加到不連續(xù)的測量區(qū)域中,以使所述結(jié)合試劑和任選另外添加的檢測試劑特異魁吉合到步驟(3)中生成的一個或多個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列上,和/或
(7b) 施加笫三溶液,所述第三溶液除了在步驟(4)中力口入的第一溶液的一 種或多種結(jié)合試劑和任逸的一種或多種沖檢測試劑外,還含有已知高濃度的物質(zhì),該物質(zhì)與步驟(3)中施加樣品的樣品基質(zhì)中存在的物質(zhì)種類類似,以便與樣品基質(zhì)中的所述物質(zhì)竟?fàn)?,所述物質(zhì)存在于已施加到不連續(xù)的測量區(qū)域中的生物來源 和復(fù)雜Mi^羊品中,以使所述試劑和任選另外添加的檢測試劑非特異性結(jié)合到步驟(3)中生成的一個或多個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列上,
(8) 以空間分辨的方式測量從已在步驟(7a)中與第二溶液和/或在步驟(7b) 中與笫三溶液接觸后的一個或多個陣列的不彭賣測量區(qū)域發(fā)出的第二和/或第三光 學(xué)信號,
(9) 記錄所述笫二和/或笫三光學(xué)信號,以及
(10 ) 比較所述第一和第二和/或第三光學(xué)信號。
在步驟(7a)和(7b)中,所述結(jié)合劑和加入用于竟?fàn)幍奈镔|(zhì)還有任選的檢 測試劑在各種情況下可以以這三組成分的單獨溶液的形式添加。然而,在另外添 力口檢測試劑的情況下,優(yōu)選首先施加結(jié)合劑和用于竟?fàn)幍奈镔|(zhì)的混合物第二或 第三溶液,隨后任選地進行一個或多個洗滌步驟添加所述檢測試劑的后續(xù)分離 的子步驟。
術(shù)語"所述固體載體的"或"固體載體的"在下文中意扭包括"所紅少一個固 體載體的"或"至少一個固體載體的"的含義。
術(shù)語"第一溶液"、"第二溶液"、"第^#液"意^£分別包括"多個笫一溶液"、"多 個第二溶液"和"多個第^液"的含義,其中所聰液以這種多幹溶液形式時在各 種情況下可以具有相同或不同的組成。
除非另有說明,下文中使用的術(shù)語"樣品"也與"生物來源和復(fù)雜組成的樣品"有 相同含義。除非另有說明,單數(shù)形式的術(shù)語"樣品"也包括術(shù)語"多個樣品"。
所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品可以選自由以下樣品構(gòu)成的組細胞群、細胞取物、體液及體液組分例如,血液,血清、血漿、滑液、淚液、尿、 唾液、組織液和淋巴,所述樣品是分餾或未分餾的樣品。
所述樣品可以從健康和/或患病和/或受到刺激和/或未至處理的細胞中獲得,所 述細月包來自包括人、動物、細菌和植物細胞的組。更M來說,所述生物來源和 復(fù)雜組成的樣品可以從動物或人的組織如器官、力夫、M、肌肉、脂肪或骨組 織中獲得。
不同的樣品可以從相同的生物體或相同的細月魄養(yǎng)物中獲得。然后,例如可以 通過分析含有來自相同(或同種類型)生物體或相同細胞培養(yǎng)物(或同種類型的 細月媳養(yǎng)物)的多個測量區(qū)域來獲得在所述測量區(qū)域中測定的、所施加的樣品的 相對分子組成再現(xiàn)性的數(shù)據(jù)言息。
不同的樣品特別是可以從相同生物體的不同部位獲得。然后,可以由相應(yīng)不連 續(xù)測量區(qū)域上的分析物獲得列如,有關(guān)在獲得所述樣品的所述生物體中待測分析 物相對襯組成非同源性的信息。該步驟例如對于檢查患癌癥的生物體來說非常 重要。
然而,不同的樣品還可以從不同的生物體或不同的細胞培養(yǎng)物中獲得。其可以 是例如,來自未經(jīng)處理的生物體或者經(jīng)藥物活性成分處理后的生物體的樣品。然
后,可以以類似于核酸分析中表達分析的方式來研究特定活性成分對樣品相對分
子組成的影響,即特別是通過其來自的細胞群體所表達的多種化合物的組合物。
如果細胞是所述樣品的起始材料,那么所述細胞通常在第一個制備步驟中進行裂解。自物可以溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校缇彌_液,并包括已知的添加混合物,
例如急定劑如蛋白酶抑制劑,以防止存在的生物高分子降解。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選方案案,所述,物以這樣的方式制備和處理 使從中獲得的樣品(即生 物來源和復(fù)雜組成的樣品)包括細胞系、細胞培養(yǎng)物或細胞組織的整個蛋白質(zhì)組。
本發(fā)明方法的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域研究包含細胞裂解物的、或由用于不同條件下分析物細胞表達(即特別是蛋白質(zhì)表達)的細胞辦物所制備的樣品。才M居特 殊的研究目的,可以以不同的方式選擇施加到測量區(qū)域中的樣品。
一種可能的變形方式是基于采用來自彼此獨立的細胞群體(即細胞系或細胞培養(yǎng)物)的裂解物。在本文中,經(jīng)彼此獨立生長或者彼此獨立培養(yǎng)的那些細胞群體(例如"體外細胞培養(yǎng)物")應(yīng)當(dāng)稱為"彼此獨立的"。因此,該術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括例
如,源自各種人、動物、植物或微生物和來自各種器官的細胞群體,還有從 有機體或器官內(nèi)的不同部位獲得的細胞群體,例如來自同一個器官的癌癥和健康組織。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)包括從相同有機體或器官的不同時間點獲得的細胞群體,和/或在取出后經(jīng)受不同處理,刺激或其它不同影響的體外培養(yǎng)方法的細胞群體。然后可以利用本發(fā)明方法并利用從這種彼此獨立的細胞群體中獲得的樣品,來產(chǎn)生例如差異表達圖,以便檢測細胞表達和/或細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)活化中的差異,例如在不同有機體之間,在相同種類的健康和患病有機體之間,在各種器官之間等。這里特別引人關(guān)注的是對所述細胞群體的處理或刺激對細胞表達的影響。在本文中,術(shù)語處理或刺激意思是向目的細胞群體添加化學(xué)或生化化合物(試劑或藥物),以及不同外部物理條件的影響,例如以紫外到紅外光譜中的光輻射形式,熱影響,電磁場影響等等。
由于本發(fā)明的方法可以獲得高精度的測量結(jié)果,其尤其也適用于研究在上述條 件下,在一段時期內(nèi),如數(shù)分鐘,數(shù)小時,數(shù)天,數(shù)周,數(shù)月或數(shù)年,細胞表達和/或活性(見下文)隨時間流逝而發(fā)展。
另一種可能的變形方式是基于采用由各種細胞亞群產(chǎn)生的不同細胞裂解物,該細胞亞群又是從普通細胞群體中獲得的??梢酝ㄟ^例如,在不同時間點從普通細胞群體去除來產(chǎn)生各種細胞亞群。各種細胞群體也可以通過從普通群體中去除以及后續(xù)的通過不同試劑處理或吃雞和/或在不同外部條件下培養(yǎng)(例如,用于研究UV光輻射,熱激等的影響)來產(chǎn)生。
用于應(yīng)用本發(fā)明方法的上述其它可能的變形方式的處理細胞群體所用的典
型試劑包括藥物活性化合物、細胞因子、針對細胞刺激的抗原、引起細胞死亡的 刺激物、激素等等。
優(yōu)選在各種情況下將從細胞群體(其表達將利用本發(fā)明的方法進行比較)獲得的復(fù)雜組成的樣品施加到共同的測量區(qū)域陣列中,以便能夠隨后在盡可能一致的條件下針對待測分析物研究所述樣品。
樣品可包括已知濃度的與待測分析物相同種類的化合物添加劑(如標準物),
其在色譜分析中的“峰值"與樣品的可相比較。這種添加劑可以用于例如校正的目
的。而且,所述樣品可包括與樣品基質(zhì)類似但不同于待測分析物的化合物添加劑,
例如白蛋白(如牛血清白蛋白(BSA))、免疫球蛋白或稀釋血清,其中化合物
可用于例如以可控的方式調(diào)節(jié)測量區(qū)域內(nèi)固定分析物分子的表面密度。存在于樣 品或其部分中的或者所述樣品或其部分的稀釋液中的分析物,即特別是生物高分
子例如核酸或蛋白質(zhì),可以以天然形式或變性形式在,例如經(jīng)尿素或表面活 性劑(如SDS)處理后。如果需要的話,可以通過適當(dāng)?shù)拇胧?,例如在裂解物?為中間材料的情況下通過離心的方式,在提供生物來源和復(fù)雜組成的樣品之前的 多個制備步驟中去除原始材料或中間材料中特別是不溶的成分。伏選地,用于制 備"生物來源和復(fù)雜組成樣品"的起始材料不經(jīng)過一步預(yù)處理步驟,除了過濾和/或餾分和/或稀釋之外。
存在于樣品或其部分或者所述樣品或其部分的稀釋液中的分析物,即特別是生物高分子例如核酸或蛋白質(zhì),優(yōu)選以變性形式在,例如經(jīng)尿素處理,所述分 析物的抗原決定簇能盡可能自由地結(jié)合其特定的待測物質(zhì),例如抗體。這可以通 過例如,用尿素處J1^破壞三級或四級結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)。而且,變性樣品具有這樣的 優(yōu)點,即由它形成的陣列非常穩(wěn)定,并且可以在較長的時間內(nèi)(長達數(shù)年)對延
遲分析的分析物進行儲存并存檔。
分餾的樣品可以利用分離方法獲得,例如選自包括以下分離方法構(gòu)成的組沉 淀、過濾、離心、通過正相色譜法、反相色譜、離子交換色譜和疏水作用色譜(HIC) 的HPLC和微HPLC ("高壓液相色譜")、排阻色譜、凝膠色譜、電泳、毛細管電 泳、電色譜以及自由流動電泳。
更具體來說,所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品可包括去血清(abgereichertes Serum)。"去血清"是指城過例如親和層析法高度去除掉諸如白蛋白、免疫球蛋白和載脂蛋白等成分的血清中獲得的那些樣品。
生物來源和復(fù)雜組成的待分4射羊品中的物質(zhì)可以通過例如以下去除方法獲銀組織切片、活組織檢查和激光捕獲顯微分離。
本發(fā)明的方法甚至能夠高精度地分析僅僅小體積和少量的樣品。樣品的量這里是指施加到不連續(xù)測量區(qū)域中的總量。例如,要施加到測量區(qū)域中的樣品物質(zhì)可相當(dāng)于100個細胞以下的物質(zhì)。其甚至相當(dāng)于10個細胞以下的物質(zhì)。此外還可以施加到測量區(qū)域中的、生物來源和復(fù)雜組成的待分##品物質(zhì)的體積小于100 nl,優(yōu)選小于lnl。
施加到不連績測量區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成祥品中的被測分析物可以是來自以下組的化合物:蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾蛋白形式,如磷酸化、糖基化、甲基化和口乙?;问降牡鞍?,特別是涉及并參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白,例如激酶、激酶底物、受體以及針對肽、激素、輔助因子、膜受體、通道受體、T細胞受體和酶的結(jié)合蛋白,還有來自不同細胞區(qū)室的蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾蛋白形式, 例如胞漿蛋白、核內(nèi)蛋白、膜蛋白、線粒蛋白以及胞外蛋白,如分泌到體液中的蛋白、特別還有在細胞處理或刺激影響下過表達或表達不足的蛋白,還有人工修飾或表達的蛋白,如具有附加結(jié)合位點的功能化蛋白(標簽蛋白,如組胺酸標簽蛋白)、單或多克隆抗體以及抗體片段、肽、來自完整蛋白質(zhì)的肽片段、糖肽、 外源凝集素、熒光蛋白(如綠色熒光蛋白質(zhì)、GFP等等)、親和素、鏈親和素、 生物素、生物素化蛋白以及不同綴合的蛋白寡糖以及核酸(例如DNA、 RNA)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的"分析物"是指這樣一種分子物質(zhì),其區(qū)別于被分析樣品中存在的其他化合物并結(jié)合于為此作為特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑以及任選地額外使用的檢測試劑。例如,如果適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合試劑僅結(jié)合磷酸化形式而不結(jié)合非磷酸化形式的待測化合物或物質(zhì)的話,則根據(jù)該定義,所述化合物或物質(zhì)的兩種形式表示兩種不同的分析物。如果適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合試劑并結(jié)合任何磷酸化的化合物或物質(zhì),則因此在該條件下相應(yīng)的磷酸化化合物或物質(zhì)在一起表示一種分析物。根據(jù)例如其僅識別并結(jié)合磷酸化形式或糖基化形式(或相應(yīng)的非磷酸化形式或糖基化形式)的待測化合物。細胞或機體中的生物信號通道活性可以與控制所述信號通道的磷酸化、甲基化、乙酰化或糖基化化合物的比例相關(guān)(取決于信號通道的性質(zhì))。樣品中磷酸化、甲基化、乙?;蛱腔问降目倢δ繉Ρ壤?,即化合物以其磷酸化、曱基化、乙酰化或糖基化形式的量與所述化合物以磷酸化形式或非磷酸化或甲基化和非甲基化形式或乙?;头且阴;问交蛱腔头翘腔问降目偭恐?,下文中稱為所述樣品中所述化合物的磷酸化或甲基化或乙?;蛱腔潭取A姿峄潭?、甲基化程度、乙?;潭群吞腔潭瓤梢越M合成上位概念化合物的活性程度。然而,化合物的活性程度??梢陨婕盎衔锏钠渌瘜W(xué)修飾形式。本發(fā)明的方法還特別使用于測定表達蛋白的活性程度。
作為特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑還可以這樣選擇,即使其只有在待測化合物具有特定的三維結(jié)構(gòu)時才于該待測化合物結(jié)合。例如,許多抗體只識別和結(jié)合具有特殊三維結(jié)構(gòu)的待測物質(zhì)的特定亞區(qū)域(抗原決定簇)。根據(jù)相應(yīng)的待測化合物的構(gòu)象狀態(tài),所述亞區(qū)域(抗原決定簇)可以易于或不易結(jié)合相應(yīng)的結(jié)合試劑。然而,所述結(jié)合試劑還可以這樣選擇,使其結(jié)合于可結(jié)合性獨立于待測化合物的三維結(jié)構(gòu)的所述化合物區(qū)域。因而利用適當(dāng)選擇的結(jié)合試劑能夠獲得樣品中待測化合物總量相對比例,所述化合物具有待測的特定構(gòu)象狀態(tài)。
在選擇了所使用的結(jié)合試劑以及任選額外的檢測試劑之后,本發(fā)明的方法可以使待測蛋白作為被施加到不連續(xù)的待測區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的分析物,根據(jù)其在所述施加的生物來源和復(fù)雜組成樣品中存在的磷酸化和/或糖基化和/或甲基化和/或乙?;问絹磉M行區(qū)分,這種區(qū)分是在如權(quán)利要求1所述的步驟(4)中進行的,即在結(jié)合與其接觸的作為特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑、以及任選的另外的檢測試劑之后,并且在權(quán)利要求1所述的檢測步驟(5)中不作為不同的分析物分別檢測,而是作為單個分析物一同檢測。
本發(fā)明的方法能夠獲得存在于施加生物來源和復(fù)雜組成待測樣品中的一種或多種分析物(即,特別是存在的蛋白質(zhì))的活性程度(根據(jù)上述定義)。更具體來說,所述方法可用于存在于所施加樣品中的一種或多種分析物(特別是蛋白質(zhì))的磷酸化程度和/或甲基化程度和/或乙?;潭群?或糖基化程度。
用作待測并存在于所施加生物來源和復(fù)雜組成樣品的不連續(xù)測量區(qū)域的分析物的特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑可以選自,例如下組的化合物蛋白質(zhì),如單或多克隆抗體以及抗體片段,肽、酶、酶抑制劑、激酶底物、適配體、合成 肽結(jié)構(gòu)、糖肽、激素、輔助因子、#^糖、外源凝集素、針對M或T細胞受體 的抗原、生物素、親和素、鏈親和素、具有附加結(jié)合位點的官能化蛋白質(zhì)(標簽蛋白,如組氨酸標簽蛋白)以及其復(fù)合結(jié)合配對物,以及核酸(例如DNA、 RNA、 寡核苷酸)以及核酸類似物(例如PNA)及具有人工堿基的衍生物。
使用]的檢測試劑可以選自包括以下物質(zhì)的第一組多克隆或單克隆抗體以及抗 體片段、核酸和核酸衍生物及其具有人工堿基的衍生物、生物素、親和素、鏈親 和素和中性親和素。所述檢測試劑還可以選自包括以下物質(zhì)的第二組質(zhì)量標記,例如納米顆粒、小球或叫膠體形式的,以及發(fā)光標記,如發(fā)光染料或發(fā)光納米顆粒形式的,如激發(fā)和發(fā)射波長在200nm到1000nm之間的量子點,從而形成了所述 質(zhì)量發(fā)光標記結(jié)合在結(jié)合試劑上,或者附著或連接于其上,或者結(jié)合在上述第 一組檢測試劑中的檢測試劑上,或者以特殊的方式結(jié)合或附著在第一組檢測試劑 中的所述檢測試劑上,或者連接或附著在檢測分析物和作為特異性結(jié)合配對物與 其連接的結(jié)合試劑之間,其中所述檢測分析物存在于働口到不連續(xù)測量區(qū)域中的 生物來源和復(fù)雜組成的樣品中。所結(jié)合試劑還可以包括檢測試劑的功能。
本申請中的術(shù)語"發(fā)光;,是指在光學(xué)或非光學(xué)的,如電子或化學(xué)或生化或熱的激 發(fā)之后,在紫外到紅外范圍內(nèi)光子的自發(fā)發(fā)射。該“發(fā)光”術(shù)語的實例包括化學(xué)發(fā)光、 生物發(fā)光、電致發(fā)光,特別是熒光和磷光。
本發(fā)明方法的伏選變形方式中,作為特異性結(jié)合配對物的所結(jié)合試劑以及 第一溶液中任選的檢測試劑,和/或
作為特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑,也即與待測的和存在于生物來源和復(fù)雜組 成樣品中的分析物相同種類的化合物,其中所述樣品翻口到不連續(xù)的測量區(qū)域, 以及第二溶液中任選的檢測試劑,和/或
作為特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑,也即與存在于生物來源和復(fù)雜組成并在步 驟(3)中施加到不連續(xù)測量區(qū)域中的樣品的樣品基質(zhì)種類類似的物質(zhì),以及包括 第三溶液中的任選的檢測試劑,
在各種情況下預(yù)先相互溫浴,然后將所述第一、笫二或第三溶液一個添加步 驟中與所述測量區(qū)域陣列相接觸。
本發(fā)明方法的一種可能的變形方式特征在于,通過向所述陣列添加可區(qū)分的檢 測試劑而在共同的測量區(qū)域陣列中檢測不同的分析物。這里優(yōu)選不同的待測分析 物數(shù)量等于所使用的可區(qū)分檢測試劑的數(shù)量。尤其優(yōu)選可區(qū)分的檢測試劑在發(fā)光 性的激發(fā)波長和/或發(fā)射波長方面有所不同。
本發(fā)明方法的另一種變形方式特征在于,通過添加用于確定各不連續(xù)測量區(qū)域陣列上的不同分析物的、作為特異性結(jié)合配對物的不同結(jié)合式劑,和/或向所述測 量區(qū)域陣列添加可區(qū)分的檢測試劑,來檢測在多個不連續(xù)測量區(qū)域P車列中的多種 不同分析物。
另一種可能的變形方式特征在于,不同的結(jié)合試劑作為針對不同分析物的特異性結(jié)合配對物被施加到用于各不同待測分析物的補陣列中。
有利的是,含有施加到其中的生物來源和復(fù)雜組成樣品的測量區(qū)域陣列包括, 與待測分析物相同種類的已知濃度化合物的測量區(qū)域,該化合物作為所施加物質(zhì)的標準品而添加。這里特別伊述測量區(qū)域陣列包括一些這樣的測量區(qū)域,其中添加了與待測分析物相同種類的不同的已知濃度作為所施加物質(zhì)的標準品, 這種測量區(qū)域的數(shù)量和所述不同的已知濃度水平足以產(chǎn)生用于確定所迷陣列中未 知濃度的所述述待測分析物的校正曲線,其中所述校正曲線是通過根據(jù)本發(fā)明方法權(quán)利要求1所述的步驟(4)添加含有作為特異性配對物的結(jié)合試劑和還任 選含有的的檢測試劑的第一溶液,以及如權(quán)利要求1所述的后續(xù)步驟(5)和(6) 而形成的。同樣,這里根據(jù)本發(fā)明方法步驟(4)的結(jié)合試劑和任選區(qū)的檢測試劑可 以在單個添加步驟中力口入,或者在單獨的子步驟中力口入,在適當(dāng)?shù)那闆r下子步驟 之間進行先滌步驟。這里添加了用于分析物測定的標準品的所述物質(zhì)可以包括例 如,僅有所使用的緩液成分,添加的類似于樣品基質(zhì)的化合物,如白蛋白(特 別是牛血清白蛋白),免疫球蛋白或稀釋血清。
優(yōu)選的是,在固體載體上設(shè)置多個相同種類的測量區(qū)域陣列,其中,名陣列中 相同的測量區(qū)域位點表示就和列的排列而言相同種類的樣品施加于此。
有多種將各溶液施加到設(shè)置在共同固體載體上的測量區(qū)域中的可能的實施方案,即含有結(jié)合試劑和任選的另外的檢測試劑的第一溶液,含有與待測分析樹類相同的另外化合物作為竟?fàn)巹┑牡诙芤海约昂写嬖谟谑┘拥綔y量區(qū)域的樣品的樣品基質(zhì)中的添加化合物的第三溶液。
第一種優(yōu)選的可行實施方案特牲在于,根據(jù)步驟(4)加入第一溶液,并根據(jù)如權(quán)利要求1所述的步驟(5)和(6)測量和記錄來自該陣列的測量區(qū)域的第一 光學(xué)信號,根據(jù)步驟(7a)和(7b)加入第二和/或第三液,接著根據(jù)如權(quán)利要求l所述的步驟(8)和(9)測量并記錄目標陣列測量區(qū)域中發(fā)出的信號,其中, 在各陣列中相同的測量區(qū)域位點表示就行和列的排列而言相同種類的樣品施加于此。
然而,也可以順序?qū)⒌谝弧⒌诙偷谌芤菏┘拥綔y量區(qū)域的相同陣列中(或
射目同的多個測量區(qū)域中),^t情況下其是在實施了足夠數(shù)量的再生和洗、紗
驟^進#^。"再生"M是指這樣一種中間步驟,其中4^口Af—溶液、和分別 的笫二或第三溶液之后,在分析物及其結(jié)^^式劑、以及任選的另外添加的檢測試 劑之間形成的復(fù)^f勿通ii^口入適當(dāng)?shù)膹?fù)^^破壞試劑而解離,所ii^^f勿破壞試
劑例如,用于解離^f4琳復(fù)^t勿的具有高鹽^i:/高離子強度和/或強酸性的"離 液"試劑,或者用于解離雜交核酸鏈的尿素溶液,從而所述固定的分析物襯在分 別添加第二、第三溶液之前,在各種情況下再次可以與結(jié)^i式劑、以及4右4的另 外的^;則試劑相結(jié)合。然而,本發(fā)明方法的變形方式伊CiiLx有在確^f林高度再生 性(例如,高于80%,優(yōu)選高于90%)時才實施。
在待^i。的第二溶液中使用的所述^^物的優(yōu)選^1:^夬,期在測量區(qū)域 中的所述分析物的表面濃度,和所述分析物及其結(jié)合和^;則試劑之間分別的結(jié)合
^平^f數(shù),其中所述"^^物與待測的和存在于^o到不連續(xù)測量區(qū)域中生物
來源和復(fù)雜組成樣品中的分析4樹類相同,并用作待測的和存在于翻口到不連續(xù) 測量區(qū)域中生物來源和復(fù)雜組成樣品中的分析物的竟?fàn)巹?,以便特異^i吉合所述 結(jié)合試劑和任選的另外添加的才S則試劑。所iii吉^^式劑通常^lf從供應(yīng)商處獲得 的原溶液稀釋成百倍到上千倍。在^^的情況下,這種原溶液的^i:通常為
0.5-1 m^ml,相當(dāng)于1-10一范圍的M。所述^^則試劑以與結(jié)^i式劑可比較的濃 度范圍^ffi,即通常為l國10nM。在竟^^^"々情況下,竟?fàn)巹?例^^^化肽的 抗原決^)以超iii吉^i式劑濃度的至少十倍、最好百4^f吏用。用作非特異〖生結(jié) 合的竟?fàn)巹┑奈镔|(zhì)通常以這些第3^i^液(4財居本發(fā)明方法的步驟(7b))的10pg/ml 到500 pg/ml的總蛋白質(zhì)^ir^J^,其中所述物質(zhì)與存在于生物來源和復(fù)雜組^i羊 品M中的物質(zhì)種類相同(例如白蛋白、免疫球蛋白或稀釋血清)。
本發(fā)明的方法能夠以兩種方式測定通過非特異^目互作用或者非特異,吉合 得到的信號占在測量區(qū)域效'將的基于特異彪吉合和其它的非特異^i吉^^成的總 信號的比例。
在第一種可4t^案中,通過與添加的結(jié)^S式劑和《右4的與添加的^^則試劑的非 特異對目互作用產(chǎn)生的光學(xué)信號占根據(jù)^U'虔求1測得的第一光學(xué)信號的比例以 如下方^^角定在添加根據(jù)步驟(7a)的笫二溶液^根據(jù)步驟(8)測得的光學(xué) 信號和在添加步驟(4)的笫一溶液^才財居步驟(5)測得的光學(xué)信號的差異。
第^t可行方案的特征在于,通過與添加的結(jié)^i式劑和^^的與添加的檢測試
劑的非特異〖封目互作用產(chǎn)生的光學(xué)信號占才N^U'決求1測得的第一光學(xué)信號的 比例以如下方^/角定在添加才財居步驟(7b)的第^i^液^才財居步驟(8)測得
的光學(xué)信號和在添加步驟(4)的第一溶液^根據(jù)步驟(5)測得的光學(xué)信號的 差異。
結(jié)合上述發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案,根梧測量區(qū)域陣列包括lt個這樣的測量區(qū)域,其中與待測分許物相同種類的不同的已知濃度化合物作為標準品加入到所施加物質(zhì)中,這種測量區(qū)域的數(shù)量和所述不同的已知濃1水平足以行程用于確定所述陣列中未知濃度的所述待測則分析物的校正曲線,其中所述校正正曲線通過根據(jù)如本發(fā)明方法權(quán)利要求1所述的步驟(4)添加含有作為特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑的第一溶液和同樣任選的檢測試劑,以及如權(quán)利要求1所述的后續(xù) 步驟(5)和(6)而形成的,本發(fā)明的方法可以測得生物來源和復(fù)雜組成樣品分析物的(相對和/或絕對)濃度或(相對和/或絕對)量,其中所述樣品被施加到測量區(qū)域中,這是通過所述測量區(qū)域測得的光學(xué)信號(即測得的第一光學(xué)信號) 與由于與添加的結(jié)合式劑和任選添加的檢測試劑的非特異性封相目互作用產(chǎn)生的光學(xué) 信號比例之間的差異,并將所述差異與目標分析物的校正曲線相比較而實現(xiàn)的。
所述方法步驟將在示例性的實施方案中更為詳細地的說明。
由于高靈敏度、高精確度和再現(xiàn)性,特別是由于可以同時或交替使用多個彼此相獨立的參比和校正方法,本發(fā)明的方法還具有這樣的特征能夠確定施加到各測量區(qū)域的各生物來源和復(fù)雜組成樣品中分析物的(相對和/或絕對)濃度或(相 對和/或絕對)量的差異,優(yōu)選小于20%,更優(yōu)選小于10%。
由于得到的測量結(jié)果僅有細微變化,本發(fā)明的方法還是適用于研究在生物有機體或細胞培養(yǎng)物的疾病影響和/或?qū)τ袡C體或細胞培養(yǎng)的外部影響下,(生物來源和 復(fù)雜組成樣品中待測的)分析物量或(即變化),其中所述外部影響例如由于用生物活性化合物(藥物)處理或刺激產(chǎn)生,或由于外部物理作用產(chǎn)生,例如紫外到紅外光譜波長的光照輻射,放射性影響或由于熱效應(yīng)產(chǎn)生。
因而本發(fā)明方法的另 一種可能的實效案特在于,從相同來源位點在不同時 間點獲得樣品和一個或多個比較樣品,以及測定所述樣品中存在的一種或多種分析物量或濃度隨時間的變化。"相同來源位點"處這里是指相同的有機體或者相同種類有機體,或者相同的細胞培養(yǎng)物或相同種類的細胞培養(yǎng)物(在各種情況下,在 不同時間的同種類型疾病或者影響作用之后)。優(yōu)選地,本發(fā)明的方法能夠檢測到所述分析物濃度和量隨時間小于20%,優(yōu)選小于10%的變化。
固定載體上被研究的生物來源和復(fù)雜組成樣品的最簡單固定形是物理吸附,例如由于與所述固體載體表面的疏水相互作用形成。然而,這些相互作用的程度在很大程度上可以根據(jù)所述法進一步的過程中所施加的溶液的成分及其理化性質(zhì)而改變,所述理化性質(zhì)如極性和離子強度。特別是在多步測定中順序添加各種試劑的情況下,在純粹的吸附固定之后,復(fù)雜組成的樣品或其組分與所述表面的粘附性可能不足。因而優(yōu)選向所述固體載體施加促粘附層以便提高將施加到不連續(xù)測量區(qū)域的樣品的粘附性,然后將樣品施加到該促粘附層上。
所述促粘附層的厚度優(yōu)選小于200 nm,特別優(yōu)選小于20nm。
多種材料用于制備所述促粘附層。例如,所述促粘附層可包括以下組的化合物硅烷、官能化硅烷、環(huán)氧化物、功能化帶電或極性聚合物以及"自組裝鈍化或功能化單層和多層"、硫醇、磷酸烷基酯和膦酸烷基酯、以及多官能嵌段共聚物,例 如聚(L)賴氨酸/聚乙二醇。
有利的是,使不連續(xù)測量區(qū)域之間的區(qū)域"鈍化"以最小結(jié)合或檢測試劑的非 特異結(jié)合,即,將對所述結(jié)合試劑和/或檢測試劑"化學(xué)中性"的那些成分,即不 與其結(jié)合的成分,翻口到空間分隔的測量區(qū)域之間。
對結(jié)合試劑和/或檢測試劑"化學(xué)中性",即不與其結(jié)合的所述成分可以選自如 下組白蛋白,特別是牛血清白蛋白和人血清白蛋白,酪蛋白,非特異性的、多克隆和單克隆的外源性抗體,以及經(jīng)驗上對待測(特別是免疫測定的)分析物非特異)"生的抗體,清潔劑例如Tween20-、不與被分析的多聚核苷發(fā)生雜交的天然 和合成DNA片段,例如鯡魚或魚精子提取物(特別是用于多聚核普酸雜交測定的),還有不帶電但親水性的聚合物,例如聚乙二醇或葡聚糖。
多種已知的方法適用于將生物來源和復(fù)雜組成的樣品直接施加到固體載體上或者施加到預(yù)先施加到所述載體上的促粘附層上,所述方法可以選自例如以下方法的組噴墨點樣法,通過針尖、筆或毛細管的枳械存、樣,微接觸印刷,通過將樣品加到平行或交叉的微通道中使流體接觸測量區(qū)域,使其暴露于壓力差或電勢差或電磁勢差,以光化學(xué)和光固固方法。
所述測量區(qū)域陣列是一維的或二維的不連續(xù)測量區(qū)域設(shè)置。在測量區(qū)域陣列內(nèi)可達到的測量區(qū)域密度以及在共同固體載體上的測量區(qū)域數(shù)量基本上取決于所 采用的施加方法的空間分辨率。 一個陣列通常包括50個以上、優(yōu)選500個以上、 特別優(yōu)選5000個以上的測量區(qū)域。這里各個測量區(qū)域可以含有與其它測量區(qū)域相同或不同的固定樣品。陣列的測量區(qū)域設(shè)置密度為每平方厘米10個以上、優(yōu)選100個以上、特別優(yōu)選1000個以上的測量區(qū)域。
本發(fā)明方法的有利實施方案特征在于,多個測量區(qū)域的陣列設(shè)置在固體載體上。更具體來說,所述在體上可以設(shè)置至少5個,優(yōu)選至少50個測量區(qū)域的陣列。 特別有利的是,不同的測量區(qū)域陣列設(shè)置在不同的樣品容器中。例如,國際專利
申請WO01/13096和WO01/43875中記載了這樣一種方式設(shè)計成漸逝場傳感器平臺形式的固體載體作為基板可以與適當(dāng)?shù)纳喜拷M合形成合適的樣品容器陣列, 在各種情況下用于接收測量區(qū)域的陣列。
所述共同的連固體載體上優(yōu)選設(shè)置2-2000個、優(yōu)選2400個、特別優(yōu)選2-100個樣品容器。
特別優(yōu)選所述樣品容器設(shè)置成格柵形式,即一連串的行和/或列,這與標準微滴定板格柵相適應(yīng)。這里建立的工業(yè)標準為8xl2孔的設(shè)置,其中心間隔大約9 mm。與其相適應(yīng)的較小陣列包括例如,3、 6、 12、 24和48個樣品容器,其具體有相同的間距。還可這樣組合多個這種較小樣品容器陣列在其組合之后, 上以大約9 mm的多個所述間隔相隔開。
一段時間以來,還曾經(jīng)使用過具有384和1536個孔的板,作為整體的多個96孔,在相同的基本區(qū)域具有相應(yīng)減少的孔間距(分別大約4.5mm和2.25mm), 其同樣應(yīng)當(dāng)稱為標準微滴定板。作為本發(fā)明試劑盒一部分的樣品容器設(shè)置也適用于所述幾何形狀。
通過使所述樣品容器適合于這些標準,可以采用多種市場上獲得和存在的實驗室移液管和實驗室點樣機器人添加所述第一、第二或第三液。
用于本發(fā)明方法的固體載體的這種實船案可以使稱為"多維"的實驗概念成為可能例如,可將多種樣品,如來自不同有機體(例如對應(yīng)于列)以不同的稀釋度(例如對應(yīng)于行)施加到陣列的行和列中。然后可以使在不同容器中的含有固定樣品的不同測量區(qū)域陣列與不同的第一和/或第二或第三溶液相接觸,所述溶液中含有用于確定不同陣列中不同固定分析物的結(jié)合試劑和任選的檢測試劑.顯然這種載體的變形方式可以用于實施幾乎無限種不同的實驗。
多種固體載體的實施方案適用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選上面生成有不連續(xù)測量區(qū)域陣列的固體載體為基本上平面的。"基本上平面的"是指除了例如,可能形成于面對測量區(qū)域的表面上的結(jié)構(gòu)之外,如用于形成樣品容器的裝置的凹陷或突起,所述表面的顯微不平整度為沿其表面平面任何可軸向上小于100微米每厘米長度。
對于許多應(yīng)用而言,還非常有利的是所述固體載體為非多孔性的。"非多孔性的"這里是指所述載體不具有連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu),并且其(顯微)表面的粗糙度小于lμm。所述固體載體的表面粗糙度優(yōu)選小于20nm,特別優(yōu)選小于2nm。
對許多應(yīng)用來還希望所述光學(xué)載體在至少激發(fā)光或測量光的波長下是基本上光學(xué)透明的,所述光在本發(fā)明方法的檢測步驟中被導(dǎo)向測量區(qū)域的方向。
入射的“激發(fā)光”這里是指所述用作二次發(fā)射的能量源(通常稱為"發(fā)射光"),例如熒M"fit^^拉曼輻射,或者例如,用于金屬層中表面細,基因組的
^t^t,其可以利用適當(dāng)?shù)牟?amp;則器測得。A4t的"測量光"是指同樣為了分析物斥&則
如,所述測i^二ii射中沒有4^到光"ii變化, ;而例如,測量了'所i光的' 沖^i錄(例如,扭it^y鵬吉構(gòu)M^到薄膜波導(dǎo)中的共振角中,見下)或傳播
桐改的變化(例如,通過不同光學(xué)通路i什涉計測量通路和參考通路的光部分之
間的相差,不與樣品相互作用)。
在特定波長下一種材料、層或固體載體"J4Ui光學(xué)透明"是指,在所ii^料或
在所ii^或在所ii^體或在作為光學(xué)波導(dǎo)的載體(高折射率)波導(dǎo)層中傳導(dǎo)的光
傳#5^圣在目的波長下大于2 mm,如^^斤述傳#^^1^^皮結(jié)構(gòu)所限制而改變 所述光的傳l番方向的話。例如,當(dāng)所述ib^A^斤述材4牛中時,所述傳#^4圣長度, 例如光學(xué)可見光的傳播^4圣長度,即所i^^目應(yīng)材料中的通路上的距離,可以 從/U^米(例如薄膜波導(dǎo)中) 一直到lfc^ML數(shù)公里(在用于光信號傳輸?shù)墓鈱?dǎo)的 情況下)的數(shù)量級,直到該光強減小到原始光強的1/e。在基于薄膜波導(dǎo)的光柵波 導(dǎo)結(jié)構(gòu)的情況下,通必Ml^^折射光柵(設(shè)計成波導(dǎo)層形式,見下),在波導(dǎo) 層內(nèi)傳導(dǎo)的光的傳播矢量長度可以限制在數(shù)樣沐內(nèi)。然而,傳^4至M的這種 限制是由于結(jié)構(gòu)而非所i^吉構(gòu)的材料^t狄的。才財居本發(fā)明,如絲i^形吉構(gòu) 區(qū)域W卜的光的傳^4圣狄大于2 mm,則這種^y冊波導(dǎo)結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)稱為"J4Ui 光學(xué)透明的"。
伊Ci4i也,^^,o到所述固體載體上的促粘附層的材料至少在A^^t^^
測量光的波長下Ai4Ui光學(xué)透明的。
所述固體載體的材料伊逃包括以下組的材料^^:,如3皮璃或石英,陶瓷, 金屬氧^^,塑料,特別是熱塑料,如聚碳酸酯,丙烯酸酯,聚丙烯酸酯,特別 錄曱基丙烯酸曱酯,聚苯乙烯,環(huán)烯聚^ ,以及環(huán)烯共聚物及其組合( 物和/或?qū)觀RM構(gòu))。伊Ci4^斤ii塑泮牛^^可才莫制的,可壓紋的、;封莫的和/或可軋制的 以及~~用于輛J^^則的應(yīng)用——^r有非常低的棘焚光。伊Ci^斤述材料滿 U少在A^lt^或測量光波長下為J本上光學(xué)透明的要求。
本發(fā)明方法的^t應(yīng)用需要所述固體載體實M案的特征在于,所ii^l體包括 多個具有不同光學(xué)棒性的層。
一種特別的實施方案的特征在于,所述固體載^^有薄金屬層,優(yōu)選包括金、
4賤鋁。通常,iUii伊逸的是,所ii^體^i舌另外的不與所述金屬層^a^觸的
中間層,^4斤射率為<1.5,例如二氧4t^氟4b4美。對該載體的實;^案而言,還優(yōu)選這樣選擇所述金屬層和可能的中間層的厚度,即在入射的波長下和/ 或產(chǎn)生的發(fā)光的波長下可以邀發(fā)表面細^^基因組。所述金屬層的厚度伊述在10 nm到1000 nm之間,特別伊Ci4在30 nm到200 nm之間。
本發(fā)明方法的大多數(shù)應(yīng)用需要至少所述固體載體層至少在入射或測量光波長下為基本上光學(xué)透明的,其中所述固體載體層與測量區(qū)域直接接觸或通過促粘附層接觸。
所述固體載體可包括以下組的元件顯微載波片、微滴定板、納米滴定板、過 濾器(如包括濾紙)、薄膜(如硝酸纖維素膜)以及微結(jié)構(gòu)載體(如硅制蜂窩結(jié) 構(gòu)或穿孔)。在類似于所建立的微滴定板(通常含有96、 384或1536個樣品 容器)的方式中,具有類似的構(gòu)造設(shè)計、但具有較小尺寸(通常在微升的數(shù)量級 而不是毫升^:量級)的開放樣品容器這里被稱為納米滴定板。
用于本發(fā)明方法的所述固體載體的特別伊逸的實施方案特征于,所述固體載 體包括光學(xué)波導(dǎo),其為連續(xù)的或者劃分成不連續(xù)的波導(dǎo)區(qū)域并包括一層或多層。
對于本發(fā)明方法的一個或多個檢測步驟而言,優(yōu)選激發(fā)或測量從一個或多 個多色或單色光源傳導(dǎo)到一個或多個測量區(qū)域陣列的一個或多個測量區(qū)域中,并 且以空間分辨的方式測量并記錄來自所述測量區(qū)域的光學(xué)信號和從所述測量區(qū)發(fā)出的光學(xué)信號的變化或差異。
所述激發(fā)光或測量光優(yōu)選波長在200 nm到1200nm之間。
優(yōu)選采用具有窄發(fā)射光i普的光源。特別伏選的光源為激光二極管和激光。
優(yōu)選采用用于空間分辨信號檢測的空間分爭辨全測器,其可以選自例如以下組 CCD照相機、CCD芯片、光電^^4及管陣列、雪崩^f及管P車列、多通道板和多通道 光電倍增管。適用于本發(fā)明方法的才S則步驟的光學(xué)系統(tǒng)及其元件以及光學(xué)檢測方法記載于例如,國際申請W095/33197,、 WO95/33198和WO96/35940中,這里全文引入其內(nèi)容作為本發(fā)明的一部分。
根據(jù)所述固體載體的物理設(shè)計,有多種產(chǎn)生用于分析物檢測的測量信號的選 擇??赡艿淖冃畏绞降奶卣髟谟冢钥臻g分辨方式測量的光學(xué)信號的變化或線差異建立在所述固體載體表面有效折射率的局部差異基礎(chǔ)上的,其中所述載體 面對測量區(qū)域,或者離所述固體載體的所表面在小于lum距離內(nèi),該局部差異是由于與分析物相結(jié)合的結(jié)合試試劑造成的,其中所述分析物存在 于施加于其中的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的不連續(xù)測量區(qū)域中。
本發(fā)明方法的這種實施方案的子變形方式特征在于,以空間^#岸方式測量的光 學(xué)信號中的變化或差異嫂立在共振條件下的局部差異基礎(chǔ)之上的,所述共振條件用于在作為所述固體載體一部分的薄金屬層上產(chǎn)生表面細胞質(zhì)基因組。
用于產(chǎn)生表面細胞質(zhì)基因組共振和用于與發(fā)光測量還有波導(dǎo)結(jié)構(gòu)相結(jié)合的條件已多次記載于文獻中,例如美國專利US-P5478755、 US-P5841143、 US-P 5006716和US-P 4649280中。
可以測量共振角(具有在入射光光恒定波長下的入射角變化)和共振波長(具有恒定入射角和入射激發(fā)波長的變化)以便確定共振條件的變化。因此,利用恒定波長的入射光,所述共振條件中的變化可以為,在用于在固體載體的薄金屬層中產(chǎn)生表面細胞質(zhì)基因組的入射激發(fā)光的共振角中可測量的變化。相應(yīng)的,所述共振條件中的變化也可以是存在于在作為固體載體一部分的薄金屬層中產(chǎn)生表面細胞質(zhì)基因組的入射激發(fā)光的共振波長變化,其中在這種情況下入射角(其應(yīng)當(dāng)?shù)扔谥辽僭谏湓谳d體上的光譜變化入射光的波長下的共振角)優(yōu)選保持恒定。
特別優(yōu)選本發(fā)明方法的那些變形方式,其特征在于,所述固體載體包括光學(xué)層波導(dǎo),其具有第一基本上光學(xué)透明的層(a),該層(a)位于第二基本上光學(xué)透明的層(b)之上,其中層(a)比層(b)具有更高的折射率并與測量區(qū)域直接接觸或者通過促粘附層介導(dǎo)接觸。
這里第二基本上光學(xué)透明的層(b)可包括以下組的材料硅酸鹽,如玻璃或石英,陶資,金屬氧化物,塑料,特別是熱塑料,如聚碳酸酯,丙烯酸酯,聚丙 烯酸酯,特別戰(zhàn)曱基丙烯酸曱酯,聚苯乙烯,環(huán)烯聚合物,以及環(huán)烯共聚物及其組合(混合物和/或?qū)訝罱Y(jié)構(gòu))。同樣優(yōu)選所述塑料是可模制的,可壓紋的、可注模的和/或可軋制的以及--用于采用發(fā)光檢測的應(yīng)用——具有非常低的本征熒光。而且,優(yōu)選所述材料滿足至少在入射激發(fā)光或測量光波長下為基本上光學(xué)透明的要求。
優(yōu)選所述第一光學(xué)透明層(a)的折射率大于1.8。還優(yōu)選所述第一光學(xué)透明(a) 包括以下組的材料氮化硅、Ti02、 ZnO、Nb2O5,, Ta205 、 HfO2 、和ZrO2,特別優(yōu)選Ti02、 Ta205或Nb2O5。
適于用作本發(fā)明方法的固體載體的(薄)層波導(dǎo)實施方案記載于例如,國際專 利申請W0 95/33197、 WO95/33198和W096/35940中。
對于包括光學(xué)波導(dǎo)的固體載體的本發(fā)明方法實施方案來說,優(yōu)選通過一個或多個光耦合元件將來自一個或多個光源的激發(fā)光或測量光耦合到所述固體載體的波導(dǎo)層內(nèi),所述光耦合元件選自以下組棱鏡耦合器、具有相互接觸的光學(xué)波導(dǎo)并具有相重疊的漸逝場的漸逝場耦合器、具有設(shè)置在所述波導(dǎo)層的末端前面的聚焦透鏡,優(yōu)選柱面透鏡的端面耦合器、以及光柵耦合器。 特別伊速利用 一個或多個光柵結(jié)構(gòu)將所述激發(fā)光或測量光耦合到固體載體的波導(dǎo)層中,所述光柵結(jié)構(gòu)設(shè)置在所述波導(dǎo)層中作為具有特定光柵周期和光柵深度的表面趙挑冊。還有利的是,在所述固體載體的波導(dǎo)層中傳導(dǎo)的光利用一個或多個光柵結(jié)構(gòu) (c,)井給出去,其中所述光柵結(jié)構(gòu)(c,)設(shè)計在所述波導(dǎo)層中并具有與光柵結(jié)構(gòu) (c)相同或不同的周期和光柵結(jié)a。本發(fā)明方法的另一種變形方錄于折浙則量方法,其特征在于,以空間分辨的方式測量的光學(xué)信號中的變化和差異是建立在共振條件的局部差異勤出之上的, 所述共振條件是用于通過設(shè)置在所述波導(dǎo)層中的光柵結(jié)構(gòu)將一個或多個光源的激發(fā)光或測量光耦合到所述固體載體的波導(dǎo)層中的。
在一種類似于確定產(chǎn)生表面細胞質(zhì)基因組共振的共振角變化的方式中,可以射角和入射激發(fā)波長的變化)以確定通過設(shè)計在其中的光柵將光耦合到波導(dǎo):中 的共振條件的變化。因此,在趟光的恒定波長下,共振條件的所述變化為,在 用于將光耦合到所述固體載體的波導(dǎo)層中的可測量的變化。相應(yīng)的,所述共振條
件中的變化也可以是用于將光耦合到所述固體載體的波導(dǎo)層中的入射激發(fā)光的共板皮長變化,其中在這種情況下入射角(其應(yīng)當(dāng)?shù)扔谥辽僭谏湓谳d體上的光譜變化入射光的波長下的共振角)優(yōu)選保持恒定。國際專利申請WO01/885U詳細記載了各種光柵波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的實施方案,其適 于用作固體載與本發(fā)明的方法相結(jié)合。其中記載的檢測方法還適用于本發(fā)明方 法上述利用折射測量方法的變形方式的檢測步驟。因此,這里引入WO 01/88511 的全文作為本說明書的一部分。
至于產(chǎn)生信號的技術(shù),本發(fā)明方法伊逃實施方案的特征在于,以空間分辨方式 測量的光學(xué)信號中的變化或差異M立在一個或多個發(fā)光事件的局部差異或變化基礎(chǔ)之的,所述發(fā)光事件是由與存在于施加在上面的生物來源和復(fù)雜組成樣品 的不連續(xù)測量區(qū)域中的分析物相結(jié)合的結(jié)合試劑和檢測試劑引起的。特別有利的采用兩種或多種具有不同發(fā)射波長和/或不同激發(fā)光譜發(fā)光標 記,優(yōu)選對于分析物檢測來說具有不同的發(fā)射波絲湘同的激發(fā)波長。如果具有 不同光譜性質(zhì)、特別是不同發(fā)射波長的多個發(fā)光標記結(jié)合于不同的與測量區(qū)域相 接觸的結(jié)合和/檢測試劑,則可以例如,在一個檢測步驟中確定單個測量區(qū)域中的不同分析物,即使所述測量區(qū)域接觸所結(jié)合/或檢測試劑并同步或順序檢測所 發(fā)生的發(fā)光事件。例如,本發(fā)明方法的這種變形方式優(yōu)選用于利用兩種相應(yīng)的不同結(jié)合試劑, 例如直接才封己的結(jié)合試劑(如具有綠色或紅色發(fā)光標記的)作為特異行結(jié)合配物,至少同時地檢測例如,磷酸化或非磷酸化形式的化合物,特別是在單個(共同的)測量區(qū)域內(nèi)。
在類似的方式中,還可以同時檢測單個測量區(qū)域內(nèi)兩種或多種不同的分析物,如果將具有不同發(fā)射衰減時間的兩種或多種發(fā)光標記用于所述分析物檢測,并利用適當(dāng)?shù)募す鈼l件(即脈沖或調(diào)制光激發(fā)的話,可以時間分辨方式檢測所 成的發(fā)光時間,這使得可以區(qū)分所述具有不同衰減速度的發(fā)光事件。
有利的是,式激發(fā)光在持續(xù)在lfsec到10分鐘之間的脈沖內(nèi)發(fā)光,并以時間分辨的方式測量從所述測量區(qū)域發(fā)出的光。
本發(fā)明方法的一個十分特別優(yōu)選的實施方案特征在于,
所述固體載體包括光學(xué)層波導(dǎo),其具有至少在入射激發(fā)光波長下基本上光學(xué)透明的第一層(a),所述第一層(a)位于至少在入射激發(fā)光波長基本上光學(xué)透明的第二層(b)所述第二層(b)的折射剩氐于層(a),
-通過設(shè)置在所述層(a)中的光柵結(jié)構(gòu)(c)將光源的激發(fā)光耦合到層(a)中,
-所述激發(fā)光作為導(dǎo)波被傳導(dǎo)到測量區(qū)域上,所述測量區(qū)域直接位于所述層(a)之上或者通過促粘附層介導(dǎo)在所述層(a)之上,以及
-以空間分辨的方式測量化合物的發(fā)光事件,其中所述化合物能夠發(fā)光并在所述層(a)中傳導(dǎo)的光的漸逝場內(nèi)稱被激發(fā)發(fā)光.
這里一種特別的變形方式包括,除了確定一種或多個發(fā)光時間之外,還確定所述測量區(qū)域上有效折射率的變化。
為了進一步提高靈敏度,這里可能有利的是,以偏振選擇性的方式來實現(xiàn)一個或多個發(fā)光事件和/或確定激發(fā)波長下的光信號.這里優(yōu)選利用不同于激發(fā)光的偏振性來測量一種或多個發(fā)光事件.
本發(fā)明的另一個主題是一種用于定量測定一種或多種生物來源和復(fù)雜組成樣品中的一種或多種分析物的味陣列,該微陣列包括:
-固體載體
-第一多個不連續(xù)測量區(qū)域,其中在各種情況下將少量的生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀釋形式直接固定或通過促粘附介導(dǎo)固定,
其特征在于,
在固體載體上的所述陣列中具有至少第二多個測量區(qū)域,該測量區(qū)域中以不同的濃度固定有與祠側(cè)分析物相同種類的物質(zhì),其適合于針對被定量檢測在于固定的復(fù)雜組成樣品中的所述分析物生成校正曲線,所述校正曲線的形成是通過使所述微陣列與第一溶液相接觸,該第一溶液包括一種或多種結(jié)合試劑,作為存 在于所施加的生物來源和復(fù)雜組成樣品的第一多個不連續(xù)測量區(qū)域中的待測則分析物的特異性結(jié)合配對物,并作為與存在于所述笫二多個不連續(xù)測量區(qū)域中的所述待測分析物相同種類的物質(zhì)的特異性結(jié)合配對物,以及如果需要的話任逸的一種 或多種檢測試劑,所述結(jié)合試劑和檢測試劑可以同時或者順序施加,之后以空間 分辨的方式測量從與所述第一溶液接觸后的一個或多個陣列的不連續(xù)測量區(qū)域發(fā)出的第一光學(xué)信號,并記錄所述第一光學(xué)信號。
有利的是,在所述固體載體的所述陣列上具有第三多個測量區(qū)域,其中在樹 情況下將少量的生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀釋形式固定,此外, 還固定有添加于其中的與待測分析物相同種類的已知的物質(zhì)。所述第三多個測 量區(qū)域可用于,例如,確定“復(fù)原”程度的控制功能,也正如以下示例性實施方案中 那樣。
本發(fā)明進一步開發(fā)的微陣列中,所述固體載體上的所述陣列中具有第四多個 測量區(qū)域,其中固定有與施加到第一多個測量區(qū)域的樣品基質(zhì)中存在的物質(zhì)類似 種類的物質(zhì)。
優(yōu)選所述第二多個測量區(qū)域的測量區(qū)域還包括與施加到第一多個測量區(qū)域的 樣品M中存在的物質(zhì)種類相似的物質(zhì)。
與施加到第一多個測量區(qū)域的樣品基質(zhì)中存在的物質(zhì)種類射以的物質(zhì)可以從 以下組的物質(zhì)中獲得白蛋白,特別是牛血清蛋白,免疫球蛋白,4封失蛋白和纖 維蛋白原。
更為優(yōu)選所述的是,所述固體載體上的所述陣列中具有用于參比目的的第五多個測 量區(qū)域。還優(yōu)選所述第五多個測量區(qū)域的測量區(qū)域中包含選自以下組的物質(zhì)質(zhì)量標記,例如納米顆粒、小球或膠體形成的、以及發(fā)光標記,如發(fā)光染料或發(fā)光納米顆粒形成。如激發(fā)和發(fā)射波長在200nm到1000nm之間的量子點。
任何固體載體及改良形式的實施方案(例如通過施加促粘附層)都適用于本發(fā)明的微陣列,如上述的本發(fā)明的方法(用于區(qū)分觀察到信號的特異性和非特異性的結(jié)合部分)。同樣可以采用所述與本發(fā)明的微陣列結(jié)合用于本發(fā)明方法的任何復(fù)雜組成的樣品、結(jié)合試劑、檢測試劑和測量區(qū)域。
本發(fā)明還涉及一種用于定量測定生物來源和復(fù)雜組成樣品中一種或多種分析物的方法,包括以下步驟
-提供一種或多種生物來源和復(fù)雜組成的樣品,
-提供多種不同濃度的物質(zhì)溶液,所述物質(zhì)與復(fù)雜組成樣品中的幹測分析物 種類相同,
-提供至少一個固體載體,
-通過將少量生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀釋的形式施加到不連 續(xù)的位點從而形成第一多個不連續(xù)測量區(qū)域怍為微陣列的一部分,其直接位于所 述固體載體上或者在先施加促粘附層之后,位于所述固體載體上的所述促粘附層 上,
-在各種情況下通過施加少量的多種不同濃度物質(zhì)溶液從而形成第二多個不 連續(xù)測量區(qū)域作為所述微陣列的一部分,其中所述物質(zhì)與復(fù)雜組成樣品中的待鍘 分析樹類相同,
使所述微陣列與以下物質(zhì)接觸第一溶液,該第一溶液包括一種或多種結(jié)合試劑作為存在于所施加的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的第一多個不連續(xù)測量區(qū) 域中的待測分析物的特異性結(jié)合配對物,以及與待測分析物相同種類的物質(zhì),所 述物質(zhì)存在于第二多個不連續(xù)測量區(qū)域中,如果需要的話任選的, 一種或多種檢
測試劑,其可以結(jié)合同時或順序施加的結(jié)合試劑和檢測試劑,
-以空間分辨的方式測量從微陣列的所述第一和第二多個不連續(xù)測量區(qū)域發(fā) 出的第一光學(xué)信號,記錄來自所述第一多個不連續(xù)測量區(qū)域的所述第一光學(xué)信號 作為其接觸第一溶液的特征信號,記錄來自第二多個不連續(xù)測量區(qū)域的所述第一 光學(xué)信號作為其接觸笫一溶液的特征信號,所述信號作為與存在于復(fù)雜組成樣品
中的分析樹類相同的物質(zhì)齢的函數(shù),所述物質(zhì)存在于所述測量區(qū)域中,
-由來自第二多個不連續(xù)測量區(qū)域的所述的光學(xué)信號生成復(fù)雜組成樣品中待測分析物的校正曲線,如果需要的話在先去掉背景信號和進行適當(dāng)?shù)膮⒈戎笊桑?br> 通過比較所記錄的來自第一多個不連續(xù)測量區(qū)域的第一光學(xué)信號與所述特定
分析物的校正曲線,如果需要的話在先減去背景信號和進行適當(dāng)?shù)膮⒈戎螅繙y定存在于復(fù)雜組成樣品中的待測分析物。
用于定量測定生物來源和復(fù)雜組成樣品中一種或多種分析物的本發(fā)明方法可 以與上述苯發(fā)明方法的實施方案相結(jié)合,如權(quán)利要求1及其從屬權(quán)利要求中所述。 所述結(jié)合同樣是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還包括本發(fā)明微陣列的應(yīng)用和/或本發(fā)明用于定量測定生物來源和復(fù)雜 組成樣品中一種或多種分析物的方法,用于在藥物庫篩選過程中定量和/或定性分析確定化學(xué)、生化或生物分析物,用于在藥物研究、組合f匕學(xué)、臨#臨床前開發(fā)之前有效地確定,用于識別、證實和監(jiān)測生物或化學(xué)標記物質(zhì)("生物標記物"), 用于在蛋白質(zhì)組學(xué)研究和系統(tǒng)生物技術(shù)中識別禾w正實信號傳導(dǎo)通道,用于親和性篩選,特別是用于抗體篩選,用于實時結(jié)合研究和確定親和f生篩選和研究中的動力學(xué)參數(shù),用于定量和定性分析物測定,特別是DNA和RNA分析和在基因組或 蛋白質(zhì)組中測M因M^蛋白質(zhì)組差異,例如單核苷酸多態(tài)性,用于測量蛋白質(zhì) -DNA相互作用,用于確定mRNA表達和蛋白質(zhì)(生物)合成控制機制,用于產(chǎn)生毒性研究和用于確定表達圖譜,特別用于形成再有或無外部刺激時患病和健康細胞群體地細胞表達圖譜并進行比較,用于研究這種表達圖譜隨著分、小時、 天、周、月或年時間周期的發(fā)展變化,用于確定生物和化學(xué)標記物,如mRNA、 蛋白質(zhì)、肽、或低分子量有機(信使)物質(zhì),還用于在藥物產(chǎn)品研發(fā)、人類和動物珍斷、農(nóng)用化學(xué)產(chǎn)品研發(fā)、癥狀和癥狀前植診斷、藥物產(chǎn)品開發(fā)中的患者分類和治療藥物選棒中抬側(cè)抗體、抗原、病原體或細菌,用以檢測病原體、有害物 質(zhì)和病原微生物,特別是沙門氏菌、朊病毒、病毒和細菌,特別是在食品分析和環(huán)境分析中。
由于可以擬目同條件下在共同的載體上同時實施大量的研究,本發(fā)明的方法特別適用于親和性篩選,即用于比較交針對共同特異性結(jié)合配對物的各種結(jié)合部分的親和性,特別是針對共同抗原的各種抗體。
還特別優(yōu)選利用本發(fā)明的方法來產(chǎn)生細胞表達圖譜并進行比較. 這特別涉及有或沒有刺激的情況下對比患病和健康細胞群體的表達圖譜。"刺激"這里指像所述細胞群體中添加化學(xué)或生化化合物以及用不同物理務(wù)降,例如, 輻射,熱效應(yīng)等等處理它們。由于本發(fā)明的方法可獲得高精確度的測量結(jié)果,故該方法也特別別適用于研究在上述條件下經(jīng)時間段,例如數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù) 年,細胞表達的隨時間變化。
本發(fā)明的方法還特別適用于發(fā)發(fā)現(xiàn)上述種類的"生物獲生化標記物質(zhì)", 其通過與健康細胞群體相比較、比較突變或改良細胞群體與野生型細胞群體,適合于提供關(guān)于患病細胞群體的信息,或者通幼于其刺激或處理提供關(guān)于影響細胞群體的信息.
本發(fā)明的微陣列和本發(fā)明的方法通過以下實施例來說明。
實施例
1. 分析物和樣品
在以下示例性的實施方案中,#^則分析物^&內(nèi)Akt信號通道的標i淺白 "Akt"以及兩種不同活化(磷酸化)形式的這種蛋白質(zhì)。Akt是一種蛋白激酶,在 多種生理過程中M關(guān)鍵的作用,例如在葡萄糖代謝、細胞生長、細胞分化和程序性細胞死亡(細胞凋亡)過程中。Akt通過不同氨基酸側(cè)鏈的磷酸化活化,尤其 是絲氨酸473和蘇氨酸308。其導(dǎo)致的所述Akt信號通道的錯誤調(diào)控以及程序性細 胞死亡的抑制在癌癥發(fā)病中起著決定性的作用,因此該表敫蛋白在治療中受到極 大的關(guān)注。
分析檢測Akt及磷酸化形式P-Akt(Ser473)和P-Akt (Thr308)可通過不同的 特異性抗體實現(xiàn),所述抗體要么獨立于其磷酸化程度地結(jié)合所述蛋白質(zhì),要么僅 結(jié)合于特別的磷酸化形式,例如僅結(jié)合于(Ser473)或結(jié)合于P-Akt(Thr308)。因 此可以通施加三種不同的抗體的方式來測量樣品,以檢測所有的Akt含量以及其特定修飾形式的含量。在本示例性實施方案中在未過濾的鼠心臟組織裂解物中 進行了 Akt及其磷酸化化形式的檢測,該樣品是在含有尿素和清潔劑的高度變性裂 解緩沖液中制備的,氣含有存在于其中的細胞的整個蛋白質(zhì)組。此外,在裂解緩 沖液中制備不含Akt的鼠血清。
2. 本發(fā)明方法中使用的載體
用于本發(fā)明方法的固體載體,在各種情況下尺寸為14 mm寬x 57 mm h 0.7腿厚,設(shè)計成薄膜波導(dǎo)的形式,在各種情況下包括玻璃基板(AF45)作為 基本光學(xué)透明的層(b),將厚度150nm的五氧化鉭高折射率層施加于其中作 為差本上光學(xué)透明的層(a)。在所述玻璃基板上與其長度平行方向上,模制兩 個表面起伏光柵(光柵周期318nm, 光柵深度(12+/-2)ran),間隔9mm。在隨后施加的所述高折射率層過程中,這些將用作衍射光柵以將光耦合到高衍射層(a)中的結(jié)構(gòu)將轉(zhuǎn)移到所述五氧化二鉭層的表面。
這種薄膜波特別適用于本發(fā)明的方法,因為其能夠高測量信號與背景信號比與背景信號檢測所述表面附近的結(jié)合事件,使其可以達到很深的檢測極限。然而,理論上任何其它實施方案的固體載體,如上所述,例如顯微載玻片或微滴定板,也適用于本發(fā)明的方法。
在小心純化了所述載體后,通過從水溶液(0.5mMDDP)中沉淀的方式自 發(fā)地自組裝成促粘附層,在所述金屬氧化物層表面上形成單十二烷基磷酸脂 (DDP)的單層。之前親水性的金屬氧化物表面的所述表面修飾形成了疏水性的表面(水的接觸角為大約100。),含有分析物作為特異結(jié)合配對物的生物來源 和復(fù)雜組成的樣品將施加到上面用于特異性結(jié)合反應(yīng)中進行分析物檢測。
3.試劑和測量區(qū)域陣列的形成
對于測定由非特異性結(jié)合分析物形成的信號比例的竟?fàn)幮詫嵲囼?見下文)來說, 用純化的Akt (Pharmacia Italia SPa,Milan, Italy)作為存在于生物來源和復(fù)雜組成的 固定樣品中作為分析物的待測Akt("內(nèi)源性Akt")溶液中的竟?fàn)巹?。通過加入不 同成分的不同固定溶液(見下文),所述純化的Akt還用于生成校正曲線。
利用改良Bradford測定(PIERCE Coomassie Plus Kit (PIERCE # 23238)確定用 于樣品(裂解緩沖液中的鼠心臟組織裂解物)的原溶液的總蛋白質(zhì)濃度以及作為 介質(zhì)的鼠血清分別為17.3 mg/ml和54.0 mg/ml,其中由所述樣品原溶液制備要施加到固體載體上的生物來源和復(fù)雜組成的樣品,所述鼠血清具有與從鼠心臟組織裂 解物中制備的樣品基質(zhì)相比較的組份。
用同樣有尿素但不含清潔劑("點樣緩沖液")的第二緩沖液進一步稀釋得到 具有不同總蛋白質(zhì)含量的鼠心臟組織裂解物溶液(0.025 m/ml, 0.050 m/ml, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml),以編口到單個測量區(qū)域中, 而不改變與原溶液相比稀釋溶液的蛋白質(zhì)組合物。所獲得的不同總蛋白質(zhì)濃度的
溶液代表要研究的生物來源和復(fù)雜組成的樣品(未加入其它添加劑)。
此外,制備鼠心臟組織裂解物的溶液,其具有相同的總蛋白質(zhì)濃度(0.025 mg/ml, 0.050 mgtel, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml), 但在各種情況下 另夕卜含有1000ng/ml的Akt。由這些溶液形成的測量區(qū)域用于檢測,無論分析物檢 測(Akt或磷酸化形式)是否獨立于特定測量區(qū)域中的總蛋白質(zhì)濃度。
而且,為了生成Akt及磷酸化形式的4tjt曲線,在點樣緩沖液中制備純化 Akt (0 ng/ml, 1 ng/nl, 3 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml, 1000 ng/ml, 3000ng/ml),在糾情況下添加O.l mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。這里BSA用作 均勻的無Akt的樣品基質(zhì),其中Akt將根據(jù)所述不同濃度的固定溶液固定在不連續(xù) 測量區(qū)域的載體上。
同樣為了生成所述Akt及磷酸化形式的校正曲線,雖然在不同的樣品基質(zhì)中,在存、樣緩沖液中制備具有同樣純化的Akt成分的溶液0 ng/ml, 1 ng/nl, 3 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml,1000ng/ml, 3000 ng/ml),但在各種清況下添 力口O.l mg/ml 鼠血清來替代0.1 mg/ml的BSA。 這里鼠血清用作非均勻的樣品M, 其類似于鼠心臟組織但無Akt,并且其中Akt將根據(jù)所述不同濃度的固定溶液固 定在不連續(xù)測量區(qū)域的載體上。
40在各種情況下,利用噴墨點樣機(GeSIH Grofierkmannsdorf, Germany)將6個相 同的224個測量區(qū)域(點)的微陣列(各種情況下依次設(shè)置為14行和16列) 到具有疏水性促粘附層的載體上。每個點是在所述載體表面上施加體積大約400 pl的單個液滴而形成的。在各種情況下,每個溶液形成兩個相同的測量區(qū)域(兩個
相同的點)。此外,對于陰性對照來說,還形成了含有點樣緩沖液但沒有任何蛋白質(zhì)成分的測量區(qū)域。
除了上述"樣品點",在樹情況下所述微陣列還包括"參考點"在每個微陣列 內(nèi),用Cy5(Amersham)標記的牛血清白蛋白熒光標記(Cy5-BSA標記率每個BSA 分子 3個Cy5 固定在各224個測量區(qū)域中的一部分中。這些測量區(qū)域中的一部分中,這些測量區(qū)域用于 比單個陣列內(nèi)還有不同陣列之間("參考點")及發(fā)光強度的局部差異。在各種情況 下將含尿素點樣緩沖液中的0.5 nM 的Cy5-BSA過口到所述測量區(qū)域中。
在各種情況下相同陣列中的測量區(qū)域幾何形狀設(shè)置描繪于圖1中并Ml中詳述。
在完成制備測量區(qū)域陣列之后,通過填充牛血清白蛋白(BSA)來封閉所述 載體上空余的,未覆蓋蛋白質(zhì)的疏水表面區(qū)域,通過用含BSA的緩沖溶影溫育所述表面30分鐘 ,作為對使用的結(jié)合試劑和/或檢測試劑"化學(xué)中性",即不與之結(jié)合 的元件。用7K(18Macm)洗滌上面形成有測量區(qū)域的載體,最后在氮氣流中干燥 并存放于4°C下直到實施本發(fā)明的檢測方法。
4.實施本發(fā)明方法的陣列設(shè)計
為了進一步實施本發(fā)明的方法,在各種情況下將具有測量區(qū)域陣列的載體與上部件連接以形成6個測量區(qū)域陣列設(shè)于其中的樣品容器設(shè)置(各種情況下內(nèi)部體積15ul)。這種樣品容器設(shè)置記載于國際申請WO01/43875和WO02/103331 中,處引入其4^內(nèi)容作為本申請的一部分。
(根據(jù)本發(fā)明方法步驟(4)的)分析物檢測步驟分兩行步驟進行,其中每 付步驟中檢測,海個測量區(qū)域陣列中的一種分析物。
4.1 使用不添加競爭劑的結(jié)合試劑
在第一付步驟中,用初級抗體作為結(jié)合試劑("抗Akt" (# 9272)在樣品容器中 溫育測量區(qū)域P車列以檢測總Akt(磷酸化合非磷酸化形式之間無區(qū)分),用"抗P-Akt (Ser473) “ (#9271) 檢測磷酸化P-Akt(Thr308)" (Ser473),(所有抗體Cell Ssinaling Technologies, Beverly,USA),在各種情況下用測試援沖:液稀釋到原溶液的500倍(對應(yīng)于大約5 nM), 室溫下過夜。
41
在各種情況下,用200 μl測緩沖液進洗滌以去除結(jié)合的結(jié)合試機,在各種情況下將在第二子步驟中的測量區(qū)域陣列用檢測試劑溫育,即熒光標記 的AlexaFluor647抗兔Fab片段(MolecularProbes;Eugene,USA),同樣用測試緩沖液稀釋到原溶液的500倍,在暗處室溫下六十分鐘。然后在各種情況下將測量區(qū)域陣列再次用各200μl的測試緩沖液洗涂以去除未結(jié)合的檢測試劑。然后,將 經(jīng)過這些處理步驟的載體,其與上部件相連并以這種方式形填充有緩沖液的樣 品容器,存放直到檢測步驟,該檢測步驟是通過ZeptoREADERTM中對所得到的熒光信號進行激發(fā)和檢測進行的 (見下文)。
4.2.使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合劑
相應(yīng)地,在與分析物相同種類的竟?fàn)巹┐嬖诘那闆r下進行分析物檢測,以特異 性結(jié)合所使用的結(jié)合試劑以及,任選另外的檢測試劑,同樣分成兩付步驟添加 到上面具有測量區(qū)域陣列的固體載體上首先,在各種情況下用大約20倍過量的 Akt(5 μml相當(dāng)于100nM)預(yù)先溫育結(jié)合試劑溶液("抗Akt","抗P-Akt(Ser473)"或 "抗P-Akt(Thr308)", 各種情況下大約為5nM)。 這里分析物特異性抗體的所有抗 原結(jié)合位點被相應(yīng)的竟?fàn)巹┧紦?jù),結(jié)果不再有可用的結(jié)合試劑的特異性結(jié)合位點用于與測量區(qū)域中分析物分子的反應(yīng)。然后在各種情況下將這樣制備的含Akt 的溶液以類似于4.1中的第一0步驟的方式引入另一樣品容器中,其中具有另一 種與4.1中使用的測量區(qū)域陣列相同的測量區(qū)域陣列,并使其溫育過夜,之后洗滌, 之后添加檢測試劑的子步#進一步的子步驟如4.1中所迷。根據(jù)該4,2節(jié)的步驟 對應(yīng)于本發(fā)明方法的子步驟(7a)。
43. 使用添加有樣品基質(zhì)作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
在類似于4.1和4.2的方式中,M在另外添加到結(jié)合試劑中的物質(zhì)情況下進行分析物檢測,所述物質(zhì)與存在于樣品基質(zhì)中的物質(zhì)相同或盡可能相似并用作固 定在測量區(qū)域中的樣品基質(zhì)成分的竟?fàn)巹┮苑翘禺愋越Y(jié)合結(jié)合試劑。為此,在各 種情況下將結(jié)合試劑溶液("抗Akt"、"抗P-Akt(Ser473 ),,或"抗P-Akt(Thr308)", 在各種情況下大約5 nM)與0.1 mg/ml的鼠血清進預(yù)先溫育。然后在各種情況下將 這樣制備的含血清的溶液以類似于4.1中的第一付步驟的方式引入另 一樣品容 器中,其中具有另一種與4.1中使用的測量區(qū)域陣列相同的測量區(qū)域P車列,并使其 溫育過夜,之后洗滌,之后添加檢測試劑的子步和進—步的子步驟如4.1中所述。 根據(jù)該4.3節(jié)的步驟于應(yīng)于本發(fā)明方法的子步驟(7b)。
5.激發(fā)和檢測來自測量區(qū)域陣列的熒光信號
利用ZeptoREADERTM(ZeptosensAG,CH"4108Witterswi1,瑞士)順序自動測量來自測量區(qū)域不同陣列的熒光信號。所述光學(xué)系統(tǒng)更詳細地J戰(zhàn)于國際專利申請PCT/EP 01/10012中,這里引入其全文作為本申請的一部分。
6. 圖像分析和參比
利用圖像分析軟"ft(ZeptoVIEWTM,Pro 2.0 Release 2.0, Zeptosens AG, CH4108 Witterswil)確定來自測量區(qū)域(點)的熒光信號。從而在其臨近環(huán)嫂中確定每個點 的平均信號強度和平均局部背景信號強度。通過從目標點的平均測得總信號強度 中減去平均局部背景信號可確定每個點的背景校正的平均凈信號強度。
在各種情況下利用Cy5-BSA參比點對所有點進行4#號強度的參比。為此, 將"樣品點"的凈信號強度除以一排中兩個最相鄰“參比點"的平均信號強度,該信號 強度外外推到特定"樣品點"的位置。所述參比方式彌補了每個測量陣列內(nèi)以及不同陣 列之間存在的激發(fā)光強度差異。
最后計算所述點副本(各種情況下兩個相同的測量區(qū)域)的參比凈信號強度平均值并描繪于相應(yīng)的圖像中作為“RFT”數(shù)據(jù)點(參比熒光強度),其中表示的誤差 線條對應(yīng)于特定的標準偏差。
7. 本發(fā)明方法的實施及結(jié)果
7.1 確定總Akt含量
7.1.1.用于檢測Akt的校正曲線
a)使用不添加竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
在各種情況下,擬目同的測量區(qū)域陣列中設(shè)置兩個測量區(qū)域片段用于形成激酶 Akt的校正曲線(參見圖1):
片段l:陣列的行I和II,具有項目編號l-9的測量區(qū)域,其中施加了在點樣 緩沖液中的不同濃度(在0ng/ml到3000ng/ml之間)的純化Akt,其另外含有O.l mg/ml的BSA,
片段2:陣列的行III和IV,具有項目編號13-21的測量區(qū)域,其中施加了在 點樣緩沖液中的不同濃度(在0ng/ml到3000ng/ml之間)的純化Akt,其另外含 有0.1 mg/ml的鼠血清。
將抗Akt (5nM)溶液添加到包含第一測量區(qū)域陣列的第一樣品容器中。進一 步方法的子步驟之前已記載于4.1中。圖2中描繪了測量區(qū)域片段1 (由加入點樣緩沖液中的含有不同濃度Akt和0.1 mg/ml BSA的溶液生成)(表示為實心方塊) 和測量區(qū)域片段2的校正曲線(由加入點樣緩沖液中的含有不同MAkt和O.l mg/ml 鼠血清的溶液生成)(表示為實心圓)。
在30nng/ml以上的Akt濃度下,同時固定有BSA的和同時固定有鼠血清的測
43量區(qū)域的校正曲線是相同的;在30ng/ml以下的Akt濃度下,同時固定有鼠血清的測量區(qū)域的校正曲線比同時固定有BSA的信號值高。信號差異被認為應(yīng)歸因于 結(jié)合試劑與固定的鼠血清成分的非特異性結(jié)合。當(dāng)向固定溶液中添加甚至更高濃度的IA清時,僅添加了 BSA來形成固定溶液的測量區(qū)域的信號差異甚至更顯著。
為了確定從鼠心臟組織制備的樣品中未知的Akt濃度,可以利用由但添加了 BSA的固定溶液生成的校正曲線,因為所述曲線可以在甚至很低的Akt濃度下, 低于30ng/ml, 測定濃度。
b) 使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了測試非特異性結(jié)合于校正曲線的信號比例,其中所述校正曲線是利用不同樣品基質(zhì)的固定溶液建立的,將作為為結(jié)合試劑的"抗Akt"抗體與過量Akt (5pg/ml 相當(dāng)于100nM濃度)的溶液混合物引入另一陣列上的第二樣品容器中,所述陣列與最初研究的陣列的測量區(qū)域設(shè)置相同,并與所述測量區(qū)域溫育過夜,如4.2中所述。在這些條件下,預(yù)計由抗體特異性結(jié)合到固定Akt上形成的信號比例將完全消失,而由非特異性形成的信號比例仍然存在。
如預(yù)期那樣,在用于確定內(nèi)源性Akt的相關(guān)濃度范圍內(nèi),即100ng/ml以下(圖 2中表示為空心標記),在測量準確度內(nèi)觀察到完全被抑制的信號(由特異性結(jié)合引起的)。根據(jù)預(yù)期的與樣品基質(zhì)成份的非特異結(jié)合的不同比例,固定溶液中含有IA清的測量區(qū)域信號(表示為空心圓)高于固定溶液中除限定的Akt濃度之外僅含有BSA的測量區(qū)域信號(表示為空心方塊)。觀察到的具有最高Akt濃度(固定溶液中1000ng/ml到3000ng/ml)的信號增幅歸因于這些條件下溶液中竟 爭劑濃度明顯不足以完全防止結(jié)合試劑與固定Akt的特異性結(jié)合。
c) 使用添加有樣品基質(zhì)的結(jié)合試劑作為竟?fàn)巹?br> 為了查看由結(jié)合試劑結(jié)合樣品基質(zhì)成分形成的非特異性結(jié)合的比例,將總蛋白質(zhì)濃度為0.1mg/ml的鼠血清加入抗體溶液中。然后根據(jù)4,3節(jié)的步驟,將該溶液引入具有第三陣列的第三樣品容器,所述陣列同樣與上述第一和第二陣列測量區(qū) 域設(shè)置相同。在這些條件下,預(yù)計由特異性結(jié)合于固定Akt所生成的信號比例會保持不變,同時預(yù)計由非特異性結(jié)合于樣品基質(zhì)所生成的信號比例會大部分消失。
圖3同樣用實心標記描繪了 7.1.l.a)節(jié)中所述的校正曲線,其中采用沒有添加結(jié)合試劑竟?fàn)巹┑牡谝魂嚵猩?。通過膠加入作為結(jié)合試劑的抗體的含鼠血清溶液 (由空心方表示),從這些校正曲線中不能測得利用第三陣列獲得的信號偏差。
這表明,在存在"抗總Akt"脈的情況下,生成的校正曲線高精確度地對應(yīng)于應(yīng)于特異性結(jié)合事件,而與樣品基質(zhì)非特異性結(jié)合僅在很少的程度上發(fā)生。
7.1.2.由鼠心臟組織制備的樣品中總AKT含量測定
a) 使用不添加竟?fàn)巹┑慕Y(jié)試劑
在標有測量區(qū)域項目編號25到31的測量區(qū)域片段上進行由鼠心臟組織中制備 的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的總Akt含量檢測。用于形成所述測量區(qū)域的固定溶液自相同的原溶液,并通過稀釋(參見第3節(jié))到不同的總蛋白質(zhì)濃度(0.025 mg/ml到0.5 mg/ml之間)進傷周節(jié)。
在測量區(qū)域項目標號為37到43的測量區(qū)域片段中;^o與鼠心MI且織賄物原 溶液具有相同系列稀釋度的固定樣品,只不ii在各種情況下將M為1000ng/ml 的純化Akt加入該固定樣品中。通過>4交#^則^it信號與具有相同總蛋白質(zhì)濃度 (0.1mg/ml)的校正曲線(利用具有同時固定有BSA的測量區(qū)域建立),利用該 片段測得的信號將用于控制是否再次建立所采用的這種高Akt濃度(其大大高于 預(yù)期的天然內(nèi)源性Akt含量)。
結(jié)合本發(fā)明方法的一部分分,如7.1.1a所述,通過向含有第一測量區(qū)域陣列的第 一樣品容器中加入"抗Akt" (5nM)的方式來進行則量。進一步的方法子步驟已在前面記載4.1中。
圖4描繪了所述結(jié)果(參比熒光強度)。來自測量區(qū)域的熒光信號表示成總蛋 蛋白質(zhì)的函數(shù)(圖4, 上橫坐標),其中所述測量區(qū)域口有由鼠心臟組織制備的固定溶液,具有共同固定的BSA (蛋白質(zhì)濃度0,1mg/ml)的校正測量參比熒 光信號值表示成用于這些測量區(qū)域的固定溶液Akt濃度的函數(shù)(圖4,下橫坐標)。
來自未添加AKt的測量區(qū)域(即,具有天然存在于固定樣品中的內(nèi)源性Akt) 的信號最初如所預(yù)計那樣隨蛋白質(zhì)齢的增加而增加,并必0最大值,從0.2 mg/ml 的蛋白質(zhì)濃度增加到當(dāng)進一步增加蛋白質(zhì)濃度時不會觀察到近一步的信號增加, 類似于飽和效應(yīng)。
來自含1000ng/ml添加的Akt (即,具有天然存在于固定樣品中的內(nèi)源性Akt 和另外的1000n^ml的純化Akt)的測量區(qū)域的信號相應(yīng)地達到非常高得值。通過 將所述信號值與同時生成的具有可比較的總蛋白質(zhì)濃度的校正曲對目tb4交(0.1 mg/ml,在0.1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度時表示為虛線,并表示為在校正曲線方向上從該線條與來自含1000 ng/ml添加的Akt的測量區(qū)域信號的測量曲線的充吾、的虛 線),可以回收加入樣品的1000ng/mlM的Akt并確定為(840 士70)n^ml。所達 到的84%的回收率或8%的精度通常允許的限度范圍內(nèi),即在測定中80%"120% 回收率或高于20%的精度。因而該實施例表明,可以以良好的測試準確度^4奇度 進行分析物的測定。所述高回收率值同樣證實了在固定溶液(作為蛋白質(zhì)M) 中添加有0.1 mg/mlBSA的測量區(qū)&Ui生成的測量曲線很適合于校正由含鼠心臟組織裂解物的溶液制備的點樣數(shù)據(jù)。
針對由鼠心臟組織制備的樣品測定(20士2)ng/ml內(nèi)源性Akt含量:,其中通過與 校正曲線(在0.1m、ml的蛋白質(zhì)濃度時表示為虛線,并表示為在校正曲線方向上 從該線條與來自僅舍內(nèi)源性Akt的測量區(qū)域信號的測量曲線的交泉的虛線)相比 專支蛋白質(zhì)*為0.1 mg/ml。
b) 使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了確定由于非特異性與測量曲線結(jié)合的信號比例,其中所述校正曲線來自利
用基于鼠心中2組織作為樣品基質(zhì)的固定溶液的測量區(qū)域,將作為結(jié)合式劑的"抗
Akt":與過量Akt (5ug/ml相當(dāng)于100riM)的溶液"給物引入另一陣列上的第 二樣品容器中,所述陣列與最初研究的P車列的測量區(qū)域設(shè)置相同,并與所述測量 區(qū)域J顯育過夜,如4,2中所述。在這些條件下,預(yù)計由抗體特異性結(jié)合到固定Akt 上形成的信號比例將完全消失,而由非特異結(jié)合形成的信號比例仍然存在。
圖5描繪了溶液中具有鼠血清的竟?fàn)幮栽囼灲Y(jié)果,以及相應(yīng)的在結(jié)合式劑溶 液中不存在竟?fàn)巹┑臏y量結(jié)果,如上面7丄2a)節(jié)所述。實心才斜汰示在各種情況 下*在竟?fàn)巹┑慕Y(jié)果(在第一陣列上測得),空心才朽汰示在竟?fàn)巹┐嬖谙聹y 得的信號(在第二陣列上測得)。來自測量區(qū)域的焚光信號被繪制成固定溶液的 蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(圖5,上橫坐標),其中測量區(qū)域的固定溶液由鼠心臟組織裂 解物制備(按照圖l,既用于確定沒有另外添加Akt時天然存在的內(nèi)源性Akt,其 測量區(qū)域的項目編號為25到31,也用于確定另外添加有1000ng/ml的純化Akt, 其測量區(qū)域的項目編號為37到43 )。用于檢測Akt(固定溶液中具有0.1 m^ml的 BSA)的校正曲線,如7丄1所述,繪制成Akt濃度的函數(shù)(圖5,下橫坐標)。
在竟?fàn)巹┐嬖诘那闆r下,用于確定內(nèi)源性Akt的來自測量區(qū)域的信號顯著降 低。在存在和不存在竟?fàn)巹┑那闆r下測量曲軟間的差異表示了由特異魁吉合引 起的信號比例。
在固定溶液另外含有過量Akt (1000ng/ml)的測量區(qū)域,觀察到參比熒光信號甚至更為顯著的降低。在溶液中存在100nMAkt作為竟?fàn)巹r,兩個測量區(qū)域
的測量曲線非常一致。升高到0.3m/ml并保持亙定的蛋白質(zhì)濃度的剩余信號(空 心標記)對應(yīng)于由于非特異結(jié)合(與樣品M的蛋白質(zhì))引起的信號增加,這 種增加崎蛋白質(zhì)表面濃度的增加而增加,直到測量區(qū)域的表面完全;RM。
圖6表示通過比較溶液中存在和不存在在竟?fàn)巹r的數(shù)據(jù),確定在0.1 m^ml的
蛋白質(zhì)濃度下由于特異,吉合引起的信號比例(圖6a),以絲過tb4交由特異性結(jié)合("SB")形成的信號比例與^it曲線,確定內(nèi)源性Akt的含量 (圖6b)。在 測量精度范圍內(nèi),由非特異結(jié)合("NSB")引起的信號比例(0.20RFI)等與來自僅含內(nèi)源性Akt (0.373 RFI)的測量區(qū)域含另外添加的1000 ng/ml純化Akt (大 約20RFI)的信號。通過比較總信號與非特異法引起信號和M曲線(圖6b)之間的差異,可確定內(nèi)源性Akt的含量為(8.8士1.3)ng/ml。與7.1.2.a)節(jié)中測定的Akt值相比較,其中由非特異性結(jié)吉合產(chǎn)生的信號比例不顯著,表明其中暫時測定的大約56%的Akt含量必然為非特異性結(jié)合所貢獻。
c) 使用添加有類以于樣品基質(zhì)的物質(zhì)作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合劑 為了查看由結(jié)合試劑結(jié)合樣品M成分形成的非特異性結(jié)合的部分,將總蛋白 質(zhì)M為0.1mg/ml的鼠血清加入抗體溶液中。然后根據(jù)4.3節(jié)的步驟,將該溶液引入具有第三陣列的第三樣品容器,所述陣列同樣與上述第一和第二陣列測量區(qū) 域設(shè)置相同。在這些條件下,預(yù)計由特異性結(jié)合于固定Akt所生成的信號比例會保持不變,同時預(yù)計由非特異性結(jié)合于樣品M所生成的信號比例會大部分消失。 圖7描繪了溶液中具有鼠血清的竟?fàn)幮詼y量結(jié)果,以及相應(yīng)的在結(jié)合試劑溶液中不存在在竟?fàn)巹┑臏y量結(jié)果,如上面7.12.a)節(jié)所述。實心才標記表示在各種情況 下不在竟?fàn)巹┑慕Y(jié)果(在第一陣列上測得),空心標i汰示在竟?fàn)巹┐嬖谙聹y 得的信號(在第二陣列上測得)。來自測量區(qū)域的熒光信號被繪制成固定溶液的 蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(圖7,上橫坐標),其中測量區(qū)域的固定溶液由鼠心臟組織裂 解物制備(按照圖l,既用于確定沒有另外添加Akt時天然存在的內(nèi)源性Akt,其 測量區(qū)域的項目編號為25到31,也用于確定另外添加有1000ng/ml的純化Akt, 其測量區(qū)域的項目編號為37到43 )。用于抬溯Akt(固定溶液中具有0.1 mg/ml的 BSA)的校正曲線,如7.1.1所述,繪制成Akt紋的函數(shù)(圖7,下橫坐標)。
溶液中存在IA清作為非特異魁吉合的竟?fàn)巹┎⒉粫鹚鰷y量曲絲任何明顯的改變;在測量精度范圍內(nèi),在鼠血清存在或不存在時測得的參比焚光信號在各種情況下是相同的。
這表明在具有“抗總Akt”抗體的情況下,沒有明顯的與樣品基質(zhì)的非特異性結(jié)合。
7.2.測定P-Akt(Ser473)含量
7.2.1用于測定P-Akt(Ser473)的校正曲線
a) 使用不添加竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
采用與上述測定Akt中相同的測量區(qū)域片段來建立用于測定磷酸化形式的
P-Akt (Ser473)的校正曲線。
片段l:陣列的行I和II,具有項目編號l-9的測量區(qū)域,其中施加了在點樣緩沖液中的不同濃度(在0ng/ml到3000ng/ml之間)的純化Akt,其另外含有O.l mg/ml的BSA,
片段2:陣列的行IE和IV,具有項目編號13-21的測量區(qū)域,其中施加了在點樣緩沖液中的不同濃度(在0ng/ml到3000ng/ml之間)的純化Akt,其另外含有0.1 mg/ml的EA清。
所述純化Akt假設(shè)為完全磷酸化的,即在Ser473和Thr308處磷酸化。
將抗P-Akt(Ser473) (5nM)溶液添加到包含第四測量區(qū)域陣列的第四樣品容器中。其它的方法子步驟之前已記載于4.1中。圖8中描繪了測量區(qū)域片段1 (由加入點樣緩沖液中的含有不同濃度Akt和0.1 mg/mlBSA的溶液生成)和測量區(qū)域片段2的校正曲線(由加入點樣緩沖液中的含有不同濃度Akt和O.l mg/ml 鼠血清的溶液生成)(實心標記)。
在10ng/ml以上的Akt濃度下,同時固定有BSA的和同時固定有EA清的測量區(qū)域的校正曲線是相同的;在10ng/ml以下的AktM下,同時固定有EA清的測量區(qū)域的校正曲線比同時固定有BSA的信號值高。信號差異被認為應(yīng)歸因于結(jié)合試劑與固定的鼠血清成分的非特異性結(jié)合。當(dāng)向固定溶液中添加甚至更高濃度的鼠血清時,僅添加了BSA來形成固定溶液的測量區(qū)域的信號差異甚至更顯著。
為了確定從鼠心臟組織制備的樣品中未知的P-Akt(Ser473)濃復(fù),可以利用由僅添加了BSA的固定溶液生成的校正曲線,因為所述曲線可以在甚至很低的Akt 紋下,低于10ng/ml,測定濃度。
b) 使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了測試非特異性結(jié)合于校正曲線的信號比例,其中所述校正曲線利用不同樣品基質(zhì)的固定溶鍵立的,將作為結(jié)合試劑的"抗P-Akt (Ser473)"抗體與過量Akt(5 μgv/ml相當(dāng)于100nM)的溶液混合物引入另一陣列上的第五樣品容器中,所述陣列與前面研究的陣列的測量區(qū)域設(shè)置相同,并與所述測量區(qū)域溫育過夜,如4.2中所述。在這些條件下,預(yù)計由抗體特異結(jié)合到固定P-Akt(Ser473)上形成的信號比例將完全消失,而由非特異性結(jié)合形成的信號比例仍然存在。
如預(yù)期那樣,在用于確定內(nèi)源性P-Akt(Ser473)的相關(guān)濃度范圍內(nèi),即100ngv/ml 以下(圖8中表示為空心標記),在測量準確度內(nèi)觀蕃到完全被抑制的信號(由 特異性結(jié)合引起的)。根據(jù)預(yù)期的與樣品濃度成分的非特異性結(jié)合的不同比例, 固定溶液中含有鼠血清的測量區(qū)域信號高于固定溶液中除限定的Akt 濃度之外僅含有BSA的測量區(qū)域信號。
觀察到的具有最高P-Akt(Ser473)濃度(固定溶液中1000ng/ml到3000ng/ml)的信號增幅歸因于這些條件下溶液中競爭劑嘗試明顯不足以完全防止結(jié)合試劑與固定P-Akt (Ser473)的特異性結(jié)合。
c)使用添加有樣品基質(zhì)樣的物質(zhì)作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了查看由結(jié)合試劑結(jié)合樣品基質(zhì)成分形成的非特異性結(jié)合的部分,將總蛋白 質(zhì)濃度為0.1mg/ml的鼠血清加入抗體溶液中。然后才根據(jù)4.3節(jié)的步驟,將該溶液 引入具有第六陣列的第六樣品容器,所述陣列同樣與上述陣列的測量區(qū)域設(shè)置相同。在這些條件下,預(yù)計由特異性結(jié)合于固定P-Akt(Ser473)所生成的信號比例會保持不變,同時預(yù)計由非特異性結(jié)合于樣品基質(zhì)所生成的信號比例會大部分消失。
圖9同樣用實心標記描繪了 7.2丄a)節(jié)中所述的校正曲線,其中采用沒有添加 結(jié)合試劑竟?fàn)巹┑牡谒年嚵猩?。通過加入作為結(jié)合試劑的抗體的含鼠血清溶液, 從這些校正曲線中不能測得利用第六陣列獲得的信號偏差。
這表明,在存在"抗P-Akt(Ser473)1琳的情況下,生成的校正曲線高精確度地對應(yīng)于特異性結(jié)合事件,而與樣品基質(zhì)非特異性結(jié)合僅在很少的程度上發(fā)生。
7.2.2.由鼠心臟組織制備的樣品中P-Akt(Ser473)含量測定
a)使用不添加競爭劑的結(jié)合試劑
在標有測量區(qū)域項目編號25到31的測量區(qū)域片段上進行由鼠心臟組織中制備 的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的P-Akt(Ser473)含量檢測。用于形成所述測量區(qū)域 的固定溶液來自相同的原溶液,并通過稀釋(參見第3節(jié))到不同的總蛋白質(zhì)濃 度(0.025 mg/ml到0.5 mg/ml之間)進行調(diào)節(jié)。
在測量區(qū)域項目標號為37到43的測量區(qū)域片段中施加與鼠心臟組織死角物原溶液具有相同系列稀釋度的固定樣品,只不過在各種情況下將濃度為1000ng/ml 的純化Akt加入該固定樣品中。通過比較待測熒光信號與具有相同總蛋白質(zhì)濃度 (0.1 mg/ml)的P-Akt (Ser473)校正曲線(利用具有同時固定有BSA的測量區(qū)域 建立),利用該片段測得的信號將用于控制是否再次建立所采用的對應(yīng)于高"總 Akt"濃度的高P-Akt(Ser473)含量:(其大大高于預(yù)期的天然內(nèi)源性Akt含量)。
結(jié)合本發(fā)明方法的一部分,如7,2.1a所述,通過向含有第四測量區(qū)域P車列的第 四樣品容器中力口入'T-Akt(Ser473)" (5nM)的方式來進行測量。進一步的方法子步驟已在前面記載于4.1中。
圖10描繪了所述結(jié)果(參比熒光強度)。來自測量區(qū)域的熒光信號表示成總蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(圖10,上橫坐標),其中所述測量區(qū)域施加有由鼠心臟組織制備的固定溶液,具有共同固定的BSA (蛋白質(zhì)M: O.lmg/ml)的^jt測量參 比熒光信號^4示成用于這些測量區(qū)域的固定溶液P-Akt(Ser473)^l的函數(shù)(圖 10,下纟黃坐標)。
來自未添加Akt的測量區(qū)域(即,具有天然存在于固定樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Ser473))的P-Akt(Ser473yf言號最初如所預(yù)計那樣隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增力口,并 ii5ij最大值,從0.2 m^ml的蛋白質(zhì)^1增加到當(dāng)進一步增加蛋白質(zhì)紋時不會觀 察到近一步的信號增加,類似于^^^t^。
來自含1000ng/ml添加的P-Akt(Ser473)(即,具有天然存在于固定樣品中的 內(nèi)源性P-Akt(Ser473)和另外的1000ng/ml的純化P-Akt(Ser473))的測量區(qū)域的信 號相應(yīng)i4i^ij非常高得值。這需要用來生^i交正曲線的純化Akt完全^^化,即 在Ser473和Thr308處;#^化。通過將所述信號值與同時生成的具有可tb4交的總蛋 白質(zhì)濃度的^曲對目tb4交(0.1 mg/ml,在O.l mg/ml的蛋白質(zhì)^1時表示為虛線, 并表示為在校正曲線方向上從該線條與來自含1000 ng/ml添加的P-Akt (Ser473)的 測量區(qū)域信號的測量曲線的充泉的虛線)(參見虛線),可以回4t^入樣品的1000 ng/ml濃度的P畫Akt(Ser473)并測定為(870 ± 100) n^ml。
92%的回收率。所述 高回收爭f直同樣證實了在固定溶液(作為蛋白質(zhì)基質(zhì))中添加有0.1 m^mlBSA的 測量區(qū)域Ji生成的測量曲賴^t合于校正由含鼠心臟^UKfj^物的溶液制備的點 微據(jù)。
針對由鼠心lM0i只制備的樣品測定(12 ± 2) ng/ml內(nèi)源性P-Akt(Ser473)^J:, 其中通過與^jE曲線(在0.1mg/ml的蛋白質(zhì)M時表示為虛線,并表示為^RjE 曲線方向上從該線條與來自僅含內(nèi)源性P-Akt (Ser473)的測量區(qū)域信號的測量曲線 的充泉的虛線)相J^支蛋白質(zhì)襯為0.1mg/ml。這需要用來生^liE曲線的純化 Akt完4>#^化,即在Ser473和Thr308處^^化。如f^斤i^i屯化Akt的P-Akt (Ser473) 比例小于100%,則由鼠心^MHi只制備的樣品中的測量值相應(yīng)減小。
b) 使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了確定由于非特異性于測量曲線結(jié)合的信號比例,其中所述校正曲線來自利 用基于鼠心臟組織作為樣品基質(zhì)的固定溶液的測量區(qū)域,將作為結(jié)合試劑的"抗 P-Akt(Ser473)" (5nM)抗M過量Akt (5 ng/ml相當(dāng)于100nM)的溶液混合物引入另一陣列上的第五樣品容器中,所i^P車列與最初研究的陣列的測量區(qū)域iU 相同,并與所述測量區(qū)域溫育過夜,如4.2中所述。在這些條件下,預(yù)計由抗## 異性結(jié)合到固定P-Akt(Ser473)上形成的信號比例將完全消失,而由非特異I4i吉合 形成的信號比例仍然存在。
圖11描繪了竟?fàn)幮栽囼灥慕Y(jié)果,以相應(yīng)的在結(jié)合試劑溶液中不存在在竟?fàn)巹┑臏y量結(jié)果,如上面7.2.2.a)節(jié)所述。實心標記表示在各種情況下不存在竟?fàn)巹┑?結(jié)果(在第四陣列上測得),空心標記表示在竟?fàn)巹┐嬖谙聹y得的信號(在第二 陣列上測得)。來自測量區(qū)域的熒光信號被繪制成固定溶液的蛋白質(zhì)濃度的函數(shù) (圖ll, 上橫坐標),其中測量區(qū)域的固定溶液由鼠心臟組織裂解物制備(按照 圖l,既用于確定沒有另外添加Akt時天然存在的內(nèi)源性P-Akt (Ser473),其測 量區(qū)域的項目編號為25到31,也用于確定另外添加有1000ng/ml的純化Akt,其 測量區(qū)域的項目編號為37到43 )。用于檢測P-Akt (Ser473)(固定溶液中具有 0.1mg/ml的BSA)的校正曲線,如7.2.1所述,繪制成P-Akt (Ser473)濃度的函 數(shù)(圖11,下橫坐標)。
在竟?fàn)巹┐嬖诘那闆r下,用于確定內(nèi)源性p473-Akt的來自測量區(qū)域的信號顯 著降低。在存在和不存在竟?fàn)巹┑那闆r下測量曲線之間的差異表示了由特異性結(jié) 合引起的信號比例。
在固定溶液另外含有過量Akt U000ng/ml)的測量區(qū)域,觀察到參比熒光信 號甚至更為顯著的降低在溶液中存在100nMAkt作為竟?fàn)巹r,兩個測量區(qū)域 片段(用于確定內(nèi)源性Akt和在固定溶液中有1000ng/mlAkt用于對照測量)生成 的測量曲線同樣基本上—致。明顯升高到0.3 mg/ml并誠過它后進有微量增加的 蛋白質(zhì)濃度的剩信號對應(yīng)于由于非特異性結(jié)合(與樣品基質(zhì)的蛋白質(zhì))引起的 信號增加,這種增加隨著蛋白質(zhì)表面濃度的增加而自然增加,直到測量區(qū)域的表 面完全被覆蓋。
圖12表示通過比較溶液中存在和不存在竟?fàn)巹r的數(shù)據(jù),確定在0.1mg/ml 的蛋白質(zhì)濃度下由于特異性結(jié)合引起的信號比例(圖12a),以及通過比較特異 性結(jié)合("SB")形成的信號比例與校正曲線,確定內(nèi)源性Akt的含量(圖12b)。 在測量精度范圍內(nèi),由非特異性結(jié)合("NSB")引起的信號比例(0.037RFI)等與 來自僅含內(nèi)源性Akt (0.073RFI)的測量區(qū)域和含另外添加的1000ng/ml純化Akt (大約10RFT)的信號。通過比較總信號與非特異性引起信號和校正曲線(圖12b) 之間的差異,可確定內(nèi)源性P-Akt (Ser473)的含量為(5.3土0.5)ng/ml。與7.1.2.a) 節(jié)中測定的Akt值相比較,其中由非特異性結(jié)合產(chǎn)生的信號比例不顯著,表明其 中暫時測定的大約57Q/o的P-Akt (Ser473)含量必然為非特異性結(jié)合所貢獻。
c) 使用添加有類似于樣品基質(zhì)的物質(zhì)作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了查看由結(jié)合試劑結(jié)合樣品基質(zhì)形成的非特異性結(jié)合的比例,將總蛋白 質(zhì)濃度為0.1mg/ml的鼠血清加入抗體溶液中。然后根據(jù)4.3節(jié)的步驟,將該溶液
引入具有第六陣列的第六樣品絲,所iiP車列同樣與上述第—第二陣列測量區(qū)
域設(shè)置相同。在這些條件下,預(yù)計由特異性結(jié)合于固定P-Akt (Ser473)所生成的 信號比例會保持不變,同時預(yù)計由非特異性結(jié)合于樣品艦所生成的信號比例會 大部分消失。
圖13描繪了溶液中具有aiL清的竟?fàn)幮栽囼灲Y(jié)果,以及相應(yīng)的在結(jié)^i式劑 溶液中林在竟?fàn)巹┑臏y量結(jié)果,如上面7.22a)節(jié)所述。實心標記表示在各種情 況下不存在竟?fàn)巹┑慕Y(jié)果(在笫四陣列上測得),空心標記表示在竟?fàn)巹┐嬖谙?測得的信號(在第六陣列上測得)。來自測量區(qū)域的熒光信號成固定溶液 的蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(圖13,上橫坐標),其中測量區(qū)域的固定溶液由鼠心臟組 織賄物制備(按照圖1,既用于確定沒有另外添加Akt時天然存在的內(nèi)源性P-Akt (Ser473),其測量區(qū)域的項目編號為25到31,也用于確定另外添加有1000nng/ml 的純化Akt,其測量區(qū)域的項目編號為37到43 )。用于抬嘲P-Akt(Ser473)(固 定溶液中具有0.1m^ml的BSA)的沖吏正曲線,如7.21.a)所述,繪制成P-Akt (Ser473)濃度的函數(shù)(圖13,下橫坐標)。
溶液中存在鼠血清作為非特異魁吉合的竟?fàn)巹┎⒉粫鹚鰷y量曲有任 何明顯的改變;在測量準確度范圍內(nèi),在鼠血清存或不存在時測得的參比焚光 信號在樹情況下是相同的。
這表明在具有"抗P-Akt (Ser473)"抗體的情況下,沒有明顯的與樣品基質(zhì)的 非特異性結(jié)合。
7.3測定P-Akt(Thr308)含量
7.3.1用于測定P-Akt(Thr308))的校正曲線
a)朋不添加竟?fàn)巹┑慕Y(jié)賴劑
采用與上迷測定Akt和P-Akt (Ser473)中相同的測量區(qū)域片段來建立用于測量區(qū)域化形式的P-Akt(Thr308)的校正曲線。
片段l:陣列的行I和n,具有項目編號l-9的測量區(qū)域,其中翻。了在泉樣 緩沖液中的不同就(在0ng/ml到3000ng/ml之間)的純化Akt,其另外含有O.l mg/ml的BSA,
片段2:陣列的行m和IV,具有項目編號13-21的測量區(qū)域,其中施加了在 點樣緩沖液中的不同濃度(在0ng/ml到3000ng/ml之間)的純化Akt,其另外含 有O.lmgtol的IA清。所述純化Akt假設(shè)為完全磷酸化的,即在Ser473和Thr308
處磷酸化。
將抗P-Akt(Thr308) (5nM)溶液添加到包含第七樣品區(qū)域陣列的第七樣品容
器中。其它的方法子步驟之前已i戰(zhàn)于4.1中。圖14中描繪了測量區(qū)域片段l (由 力口入泉樣緩沖液中的含有不同MAkt和O.l mg/mlBSA的溶液生成)和測量區(qū)域 片段2的爭^iE曲線(由加入樣緩沖液中的含有不同濃度Akt和0.1 mg/ml 鼠清 的溶液生成)(實心標記)。
在100ng/ml以上的Akt M下,同時固定有BSA的和同時固定有鼠血清的測 量區(qū)域的校正曲弦相同的;在100ng/ml以下的Akt濃度下,同時固定有鼠血清 的測量區(qū)域的校正曲線比同時固定有BSA的信號值高;信號差異被認為應(yīng)歸因于 結(jié)合試劑與固定的鼠血清成分的非特特異性結(jié)合。然而,與針對Akt和P-Akt(Ser473) 建立校正曲線時測得的熒光信號相比,從所述兩種測量區(qū)域測得的信號值相對較 低。
為了確定從鼠心臟組織制備的樣品中未知的P-Akt (Thr308)濃度,可以利用由僅添加了 BSA的固定溶液生成的校正曲線。
b) 使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)合試劑
為了測試非特異性結(jié)合曲線的信號比例,其中所述正曲線是利用不同
樣品基質(zhì)的固定溶鍵立的,將作為結(jié)合試劑的"抗P-Akt (Thr308)"抗體與過量Akt (5 μ/ml相當(dāng)于100nM)的溶液混合物引入另一P車列上的第八樣品容器中,所述 陣列與前面研究的陣列的測量區(qū)域設(shè)置相同,并與所述測量區(qū)域溫育過夜,如4.2 中所述。在這些條件下,預(yù)計由抗體特異性結(jié)合到固定P-Akt(Thr308)上形成的信 號比例將完全消失,而由非特異性結(jié)合形成的信號比例仍然存在。
僅在高M (高于30ng/ml)的固定溶液中,測定到了信號下降(圖14中為 空心標記),其中來自固定溶液中含鼠血清的測量區(qū)域的測量信號高于來自固定 溶液中除了P艮定的Akt濃度"卜僅含BSA的測量區(qū)域的信號。只有在濃度范圍高 于大約30ng/ml時,由于結(jié)合實際溶液中存在作為竟?fàn)巹┑腜-Akt(Thr308),信號 下降程度超過了實驗引起的信號變化。
這樣可以推斷,抗P-AktCThr308)抗體既非特異地結(jié)合于具有同時固定的 BSA的測量區(qū)域,并且在相當(dāng)程上也結(jié)合于具有同時固定的血清成分的測量區(qū) 域。
c)使用添加有樣品基質(zhì)樣的物質(zhì)作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)和試劑
為了查看由結(jié)合試劑結(jié)合樣品基質(zhì)成分形成的非特異性結(jié)合于熒光信號的比 例,將總蛋白質(zhì)M為0.1mg/ml的鼠血清加入M溶液中。然后根據(jù)4,3節(jié)的步 驟,將該溶液引入具有笫九陣列的第九樣品容器,所述陣列同樣與上述陣列的測 量區(qū)域設(shè)置相同。在這些條件下,預(yù)計由特異性結(jié)合于固定P-Akt(Thr308)所生成
53的信號比例會保持不變,同時預(yù)計由非特異性結(jié)合于樣品基質(zhì)所生成的信號比例 會大部分消失。
圖15同樣用實心標記苗繪了 7.3.1a)節(jié)中所述的校正曲線,其中采用沒有添 加結(jié)合試劑竟?fàn)巹┑牡谄哧嚵猩?。通過加入作為結(jié)合試劑的抗體的含鼠血清溶 液,從這些校正曲線中不能測得利用第九陣列獲得的信號偏差。僅在高于30ng/ml 的濃度下發(fā)現(xiàn)固定溶液中明顯依賴于假定的P-Akt(Thr308)濃度。這與在低濃度下測的熒光信號可有利于非特異性結(jié)合的事實一致。
7.3.2.由鼠心臟組織制備的樣品中P-AKt(Thr308)含量測定
a)使用不添加競爭劑的結(jié)合試劑
在標有測量區(qū)域項目編號25到31的測量區(qū)域片段上進行由鼠心臟組織中制備 的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的P-Akt(Thr308)含量檢測。用于形成所述測量區(qū)域 的固定溶液來自相同的原溶液,并且通過稀釋(參見第3節(jié))到不同的總蛋白質(zhì)濃 度(0.025 mg/ml到0.5 mg/ml之間)進行調(diào)節(jié)。
在測量區(qū)域項目標號為37到43的測量區(qū)域片段中施加與鼠心臟組織裂解物原溶液具有相同系列稀釋度的固定樣品,只不過在各種情況下將濃度為1000ng/ml 的純化Akt加入該固定樣品中。通過比較待測熒光信號與具有相同總蛋白質(zhì)濃度 (0.1 mg/ml)的P-Akt(Thr308)校正曲線(利用具有同時固定有BSA的測量區(qū)域建 立),利用該片段測得的信號將用于控制是否再次建立所采用的對應(yīng)于高"總Akt" 濃度的高P-Akt(Thr308)含量(其大大高于預(yù)期的天然內(nèi)源性Akt含量)。
結(jié)合本發(fā)明方法的一部分,如7.3.1a所述,通過向含有第七測量區(qū)域陣列的第 七樣品容器中加入"抗P-Akt(Thr308)" (5nM)的方式來進行測量。進一步的方法 子步驟已在前面記載于4.1中。
圖16描繪了所述結(jié)果(參比熒光強度)。來自測量區(qū)域的熒光信號表示成總 蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(圖16,上橫坐標),其中所述測量區(qū)域施加有由鼠心臟組織 制備的固定溶液,具有共同固定的BSA (蛋白質(zhì)濃度O.lnVml)的校正測量參 比焚光信號表示成用于這些測量區(qū)域的固定溶液的假定 P-Akt (Thr308)M的函 數(shù)(圖16,下橫坐標)。
來自未添加Akt的測量區(qū)域(即,具有天然存在于固定樣品中的內(nèi)源性P-Akt (Thr308))的P-Akt(Thr308)信號隨蛋白質(zhì)齢的增加而增加到0.4 mg/ml,并達到最大值,此時在0.5 mg/ml的蛋白質(zhì)濃度下基本上不會改變。
通過與校正曲線相比較(在0.1 mg/ml的蛋白質(zhì)濃度時表示為虛線,并表示為 在校正曲線方向上從該線條與來自僅含內(nèi)源性P-Akt (Thr308)的測量區(qū)域信號的測量曲線的交泉的虛線),可測定(暫時地)從鼠心臟組織制備的樣品在0.1mg/ml 蛋白好時內(nèi)源性P-Akt(Thr308)的錄為(130士15)ng/ml。然而,該值必須從一 開始就視為不現(xiàn)實的,因為擬目同條件下(不考慮非特異彪吉合效應(yīng)),之前測 定的20ng/ml濃度的"總Akt"具有相同的總蛋白質(zhì)濃度。測得的曲線與來自測量區(qū) 域的信號相比較(在0.1 mg/ml的蛋白質(zhì)濃度時表示為虛線,并表示為^jt曲線 方向上從該線條與來自含有1000 ng/ml添加的Akt的測量區(qū)域信號的測量曲線的 交泉的虛線)測得了 (51Otl0)ng/ml的回收剩直,其中該測量區(qū)域的固定溶液中 力口入了 1000ng/ml的純化Akt。
b) 使用添加有Akt作為竟?fàn)巹┑慕Y(jié)試劑
為了確定由于非特異r生于測量曲線結(jié)合的信號比例,其中所述校正曲線來自利用基于鼠心組織作為樣品M的固定溶液的測量區(qū)域,將作為結(jié)合式劑的"抗 P-Akt(Thr308)" (5nM) 與過量Akt (5 μg/ml相當(dāng)于lOOnM)的溶液混合物引入另一陣列上的第八樣品容器中,所述陣列與最初研究的陣列的測量區(qū)域相同,并與所述測量區(qū)域顯育過夜,如4.3中所述。^it些條(牛下,預(yù)計由抗4M寺 異f4i吉合到固定P-Akt(Thr308)上形成的信號比例將完全消失,而由非特異性結(jié)合 形成的信號比例仍然存在。
圖17描繪了竟?fàn)幮証^^/結(jié)果,以W目應(yīng)的在結(jié)^i式劑溶液中絲在竟?fàn)巹?的測量結(jié)果,如上面7.3,2.a)節(jié)所述。實心標i汰示在樹情況下騎在竟?fàn)巹┑?結(jié)果(在第一陣列上測得),空心標ie^示在竟?fàn)巹┐嬖谙聹y得的信號。來自測 量區(qū)域的熒光信"fi^賴'J成固定溶液的蛋白質(zhì)^l的函數(shù)(圖15,上橫坐標), 其中測量區(qū)域的固定溶液由鼠心^l且織賄物制備(按照圖1,既用于確定沒有另 外添加Akt時天然存在的內(nèi)源性P-Akt (Thr308),其測量區(qū)域的項目編號為25到 31,也用于確定另外添加有1000ng/ml的純化Akt,其測量區(qū)域的項目編號為37 到43 )。用于枱溯P-Akt(Thr308)(固定溶液中具有0.1 m^ml的BSA)的4^it 曲線,如7,3.1所述,繪制成P-Akt(Thr308)紋的函數(shù)(圖17,下橫坐標)。
在竟?fàn)巹┐嬖诘那闆r下,用于確定內(nèi)源性P-Akt (Thr308)的來自測量區(qū)域的信 號無論怎樣殳有出現(xiàn)見P射氐。在測量準確度范圍內(nèi),4^由特異^i吉合引起的 信號比例的存不存在竟?fàn)巹┑那闆r下測量曲線之間的差異為零。
對于固定溶液另夕卜含有過量Akt (lOOOngtol)的測量區(qū)域而言,在參比焚光
信號中;C^到了較微弱的斷氐,尤其是在低蛋白質(zhì)紋范圍內(nèi)。
圖18表示通過比^^液中存#不存在竟?fàn)巹r的數(shù)據(jù),確定在0.1mg/ml 的蛋白質(zhì)^1下由于特異性結(jié)合引起的信號比例。測定由鼠心^l且織辦物形成的測量區(qū)域,無競爭劑時的測量信號為0.068 RFI,具有100 nM競爭劑時的測量信號為O.073RFI,其中預(yù)計存在最多程度的內(nèi)源性P-Akt0~308)。這兩個值之間的差異大致對應(yīng)于實驗引起的信號變化。這證實了在該條件下沒有測得由特異}生結(jié)合引起的信號,從而可以推斷P-Akt(Thr308)-g"-~零。
D使用添加有類似于樣品基質(zhì)的物質(zhì)作為競爭劑的結(jié)合試劑
為了查看由結(jié)-'b4L~'J結(jié)合樣品基質(zhì)成分形成的非特畀}生結(jié)合的比例,將總蛋白質(zhì)濃度為O.1 m魴“的鼠血清加入抗林溶液中。然后根據(jù)4-3節(jié)的步驟,將該溶液引入具有第九陣列的第九樣品容器,所述陣列同樣與上述陣列測量區(qū)域設(shè)置相同。在這些條件下,預(yù)計由特異牲結(jié)合于固定P-Akt(Thr308)所生成的信號比例會保持不變,同時預(yù)計由非特異性結(jié)合于樣品基質(zhì)所生成的信號比例會大郭分消失。
圖19描繪了溶液中具有鼠血清的競爭陛試驗的結(jié)果,以及相應(yīng)的在結(jié)合試劑溶液中不存在競爭劑的測量結(jié)果,如上面7.3.2.a(chǎn))節(jié)所述。實心標’汜表示在各種情況下不存在競爭劑的結(jié)果(在第七陣列上測得),空心標記表示在競爭劑存在下測得的信號。來自測量區(qū)域的熒光信號被繪制成固定溶液的蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)(圖19,上橫坐標),其中測量區(qū)域的固定溶液由鼠心臟組織裂篇I.井勿制備(搖照圖1,既用于確定沒有另外??贏kt時天然存在的內(nèi)源·t~P-Akt(Thr308),其測量區(qū)域的項目編號為25到31,也用于確定另外添加有1000 ng/ml的純化魅)。用瑚4P-Akt(Thr308)(固定溶液中具有O.1 mg/ml的BSA)的校正曲線,如7_3.1.a(chǎn))所述,繪制成P-Akt(Vnr308)濃度的函數(shù)(圖19,下橫坐標)。
溶液中存在鼠血清作為非特異陛結(jié)合的競爭劑導(dǎo)致熒光信號具有可壩滑的下降,再次證實了非特異性結(jié)合的來源。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測一種或多種生物來源和復(fù)雜組成的樣品中的一種或多種分析物的方法,包括以下步驟(1)提供一種或多種生物來源和復(fù)雜組成的樣品,(2)提供至少一個固體載體,(3)將少量所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀釋的形式直接施加到所述固體載體上的不連續(xù)的位點上,或者在預(yù)先施加促粘附層之后施加到固體載體上的所述促粘附層上,從而在所述至少一個固體載體上形成一個或多個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列,(4)使至少一個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列與第一溶液相接觸,所述第一溶液含有一種或多種作為待測分析物特異性結(jié)合配對物的結(jié)合試劑和如果需要的話任選地含有一種或多種檢測試劑,所述分析物存在于所述不連續(xù)測量區(qū)域中施加的生物來源和復(fù)雜組成的樣品中,并且,所述結(jié)合試劑和檢測試劑可以同時或者順序施加,(5)以空間分辨的方式測量從已在步驟(4)中與第一溶液接觸后的一個或多個陣列的不連續(xù)測量區(qū)域發(fā)出的第一光學(xué)信號,(6)記錄所述第一光學(xué)信號,其特征在于,通過進一步進行以下步驟來測定所測得的第一光學(xué)信號的比例,所述第一光學(xué)信號是由于與加入的結(jié)合試劑和任選加入的檢測試劑發(fā)生非特異性相互作用而產(chǎn)生的(7a)施加第二溶液,所述第二溶液除了在步驟(4)中加入的第一溶液的一種或多種結(jié)合試劑和任選的一種或多種檢測試劑之外,還含有已知高濃度的化合物,其與待測的并存在于已施加到不連續(xù)的測量區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成的樣品中的分析物種類相同,作為所述待測的并存在于生物來源和復(fù)雜組成樣品中的分析物的競爭劑,該樣品已施加到不連續(xù)的測量區(qū)域中,以使所述結(jié)合試劑和任選另外添加的檢測試劑特異性結(jié)合到步驟(3)中生成的一個或多個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列上,和/或(7b)施加第三溶液,所述第三溶液除了在步驟(4)中加入的第一溶液的所述一種或多種結(jié)合試劑和任選的一種或多種檢測試劑之外,還含有已知高濃度的物質(zhì),該物質(zhì)與步驟(3)中施加樣品的樣品基質(zhì)中存在的物質(zhì)種類類似,以便與樣品基質(zhì)中的所述物質(zhì)競爭,所述物質(zhì)存在于已施加到不連續(xù)的測量區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成樣品中,以使所述結(jié)合試劑和任選另外添加的檢測試劑非特異性結(jié)合到步驟(3)中生成的一個或多個不連續(xù)測量區(qū)域的陣列上,(8)以空間分辨的方式測量從已在步驟(7a)中與第二溶液和/或在步驟(7b)中與第三溶液接觸后的一個或多個陣列的不連續(xù)測量區(qū)域發(fā)出的第二和/或第三光學(xué)信號,(9)記錄所述第二和/或第三光學(xué)信號,以及(10)比較所述第一和第二和/或第三光學(xué)信號。
2. 權(quán)矛溪求1所述的方法,其特征在于,所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品可 以選自由以下才羊品構(gòu)成的《且細^#^,物、細l&^取物、體^^體^i且分, 其中(1) 所述樣品可以是^^溜或未分餾的樣品,(2) 所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品從^i^和/或患病和/或受到刺激和/或^i至處理的細胞中獲得,所述細胞來自包括人、動物、細菌和植物細胞的組,(3) 所述生物來源和復(fù)雜組成的樣品從動物ilA的組織如器官、皮膚、毛發(fā)、 肌肉、月旨肪或骨組織中獲得。
3. ^5U,J^求1或2所述的方法,^#4碌于,;^。到測量區(qū)域的生物來源和 復(fù)雜組成的待分片辨羊品中的物質(zhì)相當(dāng)于少于100個細胞的物質(zhì),優(yōu)選相當(dāng)于少于 IO個細胞的物質(zhì),和/或表示體積小于100nl,伏選小于lnl。
4. 權(quán)矛虔求1-3 ^-項所迷的方法,^NNiL^于, 口到不連續(xù)測量區(qū)域中 的生物來源和復(fù)雜組成樣品中的待測分析物是蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾的蛋白形 式,還有人工#^或表達的蛋白,單或多克隆^^以及4脈片段、肽、來自完整 蛋白質(zhì)的肽片段、糖肽、外源凝集素、熒光蛋白、親和素、鏈親和素、生物素、 生物素化蛋白以及不同綴合的蛋白、S^唐以及核酸。
5. ^U'虔求4所述的方法,^#棘于,4^又矛決求1的步驟(4)中,在結(jié) 合與絲觸的作為特異性結(jié)合SW于物的結(jié)^i式劑、以及^^的另外的才&則試劑之 后,被測蛋白質(zhì),作為被施加到不連續(xù)的測量區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成樣品 中的分析物,根據(jù)其在所ii^口的生物來源和復(fù)雜^L^樣品中存在的石#@^^口/或 糖J^^口/或甲^^^^/或乙?;问絕ii行區(qū)分,并JL^如權(quán)矛j^求l中所述的檢 測步驟(5)中^^'J;f^則。
6. 權(quán)矛J^求4所述的方法,^#棘于,^^U'J^"求1的步驟(4)中,在結(jié) 合與^^觸的作為特異性結(jié)合SW]"物的結(jié)^S式劑、以及任選的另外的^^則試劑之 后,被測蛋白質(zhì)作為被i^口到不連續(xù)的測量區(qū)域中的生物來源和復(fù)雜組成樣品中 的分析物,不根據(jù)其在所g加的生物來源和復(fù)雜組成樣品中存在的石il^f^V或沖唐J^^口/或曱J^^V或乙酰^:形式^^f亍區(qū)分,并JM^又矛J^求l中所述的^r測 步驟(5)中不i^f亍^^別才&則。
7. ^U'J^求1-6 項所述的方法,^NM碌于,所^i^^式劑,作為4彰則的并存在于不連續(xù)測量區(qū)域中所施加的生物來源和復(fù)雜組^i羊品中的分析物的特異性結(jié)合SW于物,可以選自以下組的^^:蛋白質(zhì)、肽、酶、酶抑制劑、激酶 底物、適酉沐、合成肽結(jié)構(gòu)、糖肽、激素、輔助因子、^^糖、外源凝集素、針 對^^或T細胞受體的抗原、生物素、親和素、鏈親和素、具有附加結(jié)^i立點的 官能化蛋白質(zhì)和/或其復(fù)合結(jié)^SW于物,以及核酸類似物及W"有人J^^的衍生物。
8. 4又矛J^"求l-7任一項所述的方法,其特征在于,所述沖&則試劑選自第^i且,包拾多克隆或單克隆4脈以及^^片段、核酸和核酸衍生物 及^r有人X4tt的書f生物、生物素、親和素、鏈親和素和中性親和素,或者第二組,包括質(zhì)量標"i^^/isl^^i己,所ii^量il^NHei吉合在結(jié)^i式劑上,或者附著或連接于其上,或者結(jié)合在才財居(1)的第一組^^則試劑的檢測試劑上,或者以特殊的方式結(jié)合或附著在才財居(1)的第-^lb^則試劑的所述檢 測試劑上,或者結(jié)合或附著在待測分析物和作為特異性結(jié)^S^t物與其連接的結(jié) ^i式劑之間形成的^^上,其中所述待測分析物存在于^>到不連續(xù)測量區(qū)域 中的生物來源和復(fù)雜組成的樣品中。
9. 外5U'j^求l-8^—項所述的方法,^##于, 第一溶液中作為特異魁吉^Se^物的所i^吉^^式劑以及^f鏈的檢測試劑,和/或第二溶液中作為特異魁吉^SWt物的結(jié)^i式劑、與;^>到不連續(xù)測量區(qū)域的存 在于生物來源和復(fù)雜組成樣品中的徐測分析物相同種類的化合物、以及4i^的檢 測試劑,和/或第三溶液中的作為特異性結(jié)^s^j"物的結(jié)^^式劑、與存在于^MM,]^求i所述的步驟(3)中編口的樣品的樣品M中物質(zhì)種類類似的物質(zhì)、和^^的^^則試劑, 在各種情況下預(yù)^目互溫浴,然后將所述第一、第二或第三溶^一個添加步 驟中與所迷測量區(qū)域陣列坤U^觸。
10. 權(quán)矛虔求1-9^"~項所述的方法,^#4^于,通過向所述P車列添加可 區(qū)分的才^則試劑而在共同的測量區(qū)域P車列中檢測不同的分析物。
11. 4又矛J^求10所述的方法,其特征在于,不同的待測分析物數(shù)量等于可 區(qū)分的才&則試劑的數(shù)量。
12. ^^要求iO-lH—項所述的方法,^NN4于,可區(qū)分的才&則試劑在 a的^t^波^f口/il^射波長方面有所不同。
13. 權(quán)矛溪求1-12 項所述的方法,其特征在于,通it^^力o用于確^^ 不連續(xù)測量區(qū)域陣列上的不同分析物的、作為特異性結(jié)^S^J"物的不同結(jié)^"i式劑, 和/或向所述測量區(qū)域陣列添加可區(qū)分的才&則試劑,來檢測在多個不連續(xù)測量區(qū)域 陣列中的多種不同》—斤物。
14. 權(quán)矛J^求1-13 項所述的方法,^#站于,不同的結(jié)^^式劑作為 針對不同分析物的特異性結(jié)合酉Wt^^皮⑩口到用于各不同#^則分析物的樸陣列 中。
15. 權(quán)矛J^求1-14 ^—項所述的方法,^4爭4iE^于,含有謝。到其中的生 物來源和復(fù)雜組^i羊品的測量區(qū)域陣列包括,添加有與待測分析物相同種類的已 知濃度"^^物的測量區(qū)域,所述^^^作為所^i。物質(zhì)的標準品。
16. 權(quán)矛J^求15所述的方法,^#4£^于,測量區(qū)域P車列包括一些這樣的 測量區(qū)域,其中添加了與待測分析物相同種類的不同的已知^l^^f勿作為所施 加物質(zhì)的標準品,這種測量區(qū)域的數(shù)量和所述不同的已知j^l水平足以產(chǎn)生用于 確定所述陣列中所述未知濃度的#^則分析物的校]£曲線,其中所述^jE曲線^Jt 過才財居權(quán)矛J^求1所述的步驟(4)、以;Si又矛J^求1所述的后續(xù)步驟(5)和(6),添加含有作為特異性結(jié)合ge^物的結(jié)^^式劑以及還^i4含有的才&則試劑的第一溶液的一個步驟而形成的。
17. 4M']^求1-16 ^-項所述的方法,^NN雄于,在固體載體上iU多 個相同種類的測量區(qū)域陣列,其中,各陣列中就4沐列的排列而言相同的測量區(qū) 域位;束示相同種類的樣品施加于此。
18. ^U'J^求1-17 ^-項所述的方法,^NN棘于,在各種相同類型的測 量區(qū)域陣列上,才財居權(quán)矛J^求1所述的步驟(4)力口7vf—溶液,并根據(jù)步驟(5) 和(6)測量^錄來自該陣列的測量區(qū)域的第一光學(xué)信號,才財居權(quán)矛談求l所述 的步驟(7a)和(7b)力口7v^二和/或第^液,接著才財居步驟(8)和(9)測量 射己錄目標陣列測量區(qū)域中發(fā)出的信號,其中,在各陣列中^f沐列的4賴'J而言 相同的測量區(qū)域位點表示相同種類的樣品淑。于此。
19. 45U'J^求1-18 ^-項所述的方法,^NN4于,由于與力口入的結(jié)^^式 劑和《,。入的;^則試劑的非特異'f封目互作用產(chǎn)生的光學(xué)信號占才M居權(quán)矛J^求1 所測得的第一光學(xué)信號的比例是通it^根據(jù)步驟(7a)力口4二溶液^才財居步驟(8)測得的光學(xué)信號與才財居步驟(4)加Af—溶液^根據(jù)步驟(5)測得的光學(xué)信號的差異確定的。
20. 4WJ^求i-i9 <—項所述的方法,^Nr棘于,由于與力口入的結(jié)^^式劑和^^口入的;^則試劑的非特異4封目互作用產(chǎn)生的光學(xué)信號占才財居權(quán)矛J^求1 所測得的笫一光學(xué)信號的比例是通it^根據(jù)步驟(7b)力口A^三溶液^才財居步 驟(8)測得的光學(xué)信號與才財居步驟(4)力口4一溶液^根據(jù)步驟(5)測得的 光學(xué)信號的差異確定的。
21. 45U'J^求l-2(HP項所述的方法,^4村雄于,通ii/斤述測量區(qū)域測 得的光學(xué)信號與由于與添加的結(jié)^^式劑和^i^添加的抬鄰J試劑的非特異^N)互作 用產(chǎn)生的光學(xué)信號比例之間的差異,并將所述差異與目標分析物的to曲對目比 較,來測定;^口到測量區(qū)域中的、生物來源和復(fù)雜組成樣品中分析物的濃度或量。
22. 柏為J^求1-21任一項所述的方法,期爭征在于,確定;^口到各測量區(qū) 域的各生物來源和復(fù)雜組成樣品中分析物的濃度或量的差異,優(yōu)選小于20%,更 伊Ci^小于10%。
23. 4WJ^求1-22 ^fi-"項所述的方法,^##于,才財居^U'J^求1所述 的步驟(7b) ;^>到一個或多個測量區(qū)域陣列的第三溶液包4鏈自白蛋白,特別 是牛血清白蛋白(BSA),免疫球蛋白^#釋血清的物質(zhì)。
24. 柏j'j^求1-23 ^-項所述的方法,其特征在于,向所述固體載^^i口 的^^占附層包括以下組的4^^: ^t克、官能4^t克、環(huán)氧^4勿、官能化、帶電 或極性聚^;以及"自ia^鈍^^功能4傳和多層"、碌撙、^W^JJ旨和膦S^錄 酯、以及多官能嵌段共聚物,例如聚(L)賴械聚乙二醇。
25. 權(quán)矛J^求1-24 項所述的方法,其特征在于,使不連續(xù)測量區(qū)域之 間的區(qū)坎'鈍化"以最小4,o到空間分隔的測量區(qū)域之間的結(jié)合iU&則試劑,即, 將對所iii吉^i式劑和/i^^則試劑呈"化學(xué)中性"的那些成分,即不與其結(jié)合的成分, 的非特異^i吉合。
26. 權(quán)矛虔求1-25 ^""項所述的方法,^#棘于,所述固體載體AJ^ 上平面的和/或非多孔性的和/或至少在A^HIL^^測量光的波長下J^Ui光學(xué) 透明的。
27. ^U'J^求1-26 項所述的方法,^4衫iE^于,所述固體載體包括多 個不同光學(xué)4 的層。
28. 權(quán)矛J^求1-27 ^""項所述的方法,^4衫iE^于,所述固體載體包括金 屬層,艦包括金、絲鉆。
29. ^U'J^求1-28 ^-項所述的方法,^NN4于,至少所述固體載體層至少在A^ilt^^測量光波長下為J4Ui光學(xué)透明的,其中所述固體載體層與 測量區(qū)域直4I^觸或通過促粘附層接觸。
30. 權(quán)矛J^求1-29 ^-項所述的方法,^##于,所述固體載體包4舌以 下組的元件顯微載波片、微滴定板、納米滴定板、過濾器、薄膜以及微結(jié)構(gòu)載體。
31. ;K^'J^求l-3(HP項所述的方法,^4村i^于,所述固體載體包括光 學(xué)波導(dǎo),其為連續(xù)的或者劃分成不連續(xù)的波導(dǎo)區(qū)域并包括一層或多層。
32. ^U'J^"求1-31 ^-項所述的方法,^#棘于,^b^t^測量it/人一 個或多個多色或單色光源傳導(dǎo)到一個或多個測量區(qū)域陣列的一個或多個測量區(qū)域 中,并且以空間分辨的方式測量^fi錄來自所述測量區(qū)域的光學(xué)信號和/isU^斤述 測量區(qū);拔出的光學(xué)信號的變^^差異。
33. ;fcf'談求32所述的方法,^#棘于,以空間^f方式測量的光學(xué)信 號的變化或差異是建立在所述固體栽體表面上有效折射率的局部差異J^出之上 的,其中所述固體載體表面面對測量區(qū)域,或者離所述固體載體的所ii^面在小 于1 pm的距離內(nèi),該局部差異是由于與分析物相結(jié)合的結(jié)^^式劑和/iU&則試劑造 成的,其中所述分析物存在于施加于其中的生物來源和復(fù)雜組^#品中的不連續(xù) 測量區(qū)域中。
34. 權(quán)矛溪求33所述的方法,其特^E^于,以空間^^岸方式測量的光學(xué)信 號中的變化或差異^Jt立在共振條件下的局部差異J^出之上的,所述共振條件用 于在作為所述固體載體""^^^薄金屬層上產(chǎn)^^面細M基因組。
35. 權(quán)矛J^求31-34^—項所述的方法,^#44于,所述固體載體^i舌光 學(xué)層波導(dǎo),其具有第一J4Ui光學(xué)透明的層(a),該層(a)位于第二J4Ui光學(xué) 透明的層(b)之上,其中層(a)比層(b)具有更高的折射率并與測量區(qū)域直接 接觸或者通過鄉(xiāng)附絲導(dǎo)接觸。
36. 權(quán)矛J^求31-3"i-"項所述的方法,^4爭4^于,通過一個或多個ibl禺合元件將來自 一個或多個光源的激發(fā)光或測量^y^^到所述固體載體的波導(dǎo)層內(nèi),所述^y^^元件選自以下組棱衞給器、具有相互接觸的光學(xué)波導(dǎo)并具有相重疊的漸逝場的漸逝^^^器、具有iU在所述波導(dǎo)層的末端前面的聚禁透鏡,伊ci4柱面透鏡的端面^^器、以^y冊井給器,伊逸利用一個或多個iy形吉構(gòu)(c) 將所必lt^或測量^^、到固體載體的波導(dǎo)層中,所述i^鵬吉構(gòu)"&^在所述波 導(dǎo)層中作為具有特^y冊周期和iy冊^l的表面起^iy冊。
37. 權(quán)矛J^求34-364—項所述的方法,其特征在于,以空間分辨的方式測量的光學(xué)信號中的變化和差異是建立在共振條件的局部差異i^^上的,所述共 振^f牛是用于通過形^所述波導(dǎo)層中的光柵結(jié)構(gòu)將一個或多個光源的^ ^ 測量^^^到所述固體載體的波導(dǎo)層中的。
38. 權(quán)矛J^求1-37 ^"-項所述的方法,^#44于,以空間^#岸方式測量 的光學(xué)信號中的變化或差異是建立在一次或多次發(fā)光的局部差異或變^^^i^Ji 的,所ii^是由與存在于施加在其中的生物來源和復(fù)雜組成樣品的不連續(xù)測量 區(qū)域中的分析物相結(jié)合的結(jié)^i式劑和/i^&則試劑引起的。
39. ;^U'虔求32-38 ^""項所述的方法,^4爭4iE^于,-所述固體載體包括光學(xué)層波導(dǎo),Wr有至少^A^IL^b皮長下J^上光 學(xué)透明的第一層(a),所述第一層(a)位于至少在A^lt^b皮長下J4Ui光學(xué) 透明的第二層(b)之上,所迷第二層(b)的折射4M氐于層(a),-通過形絲所述層(a)中的光柵結(jié)構(gòu)(c)將光源的^t^^^到層(a)中,-所必H^^作為導(dǎo)波故傳導(dǎo)到測量區(qū)域上,所述測量區(qū)域直接位于所i^ (a) ^Ji或者通iii^占附;^h導(dǎo)位于所ii^ (a) 以及_以空間^#的方式測量^^物的 >,其中所述^^物能夠;^并在所述 層(a)中傳導(dǎo)的光的漸逝場內(nèi)^IL^^。
40. —種用于定量測定一種或多種生物來源和復(fù)雜組成樣品中的一種或多 種分析物的微陣列,該微陣列^i舌_固體載體,-第一多個不連續(xù)測量區(qū)域,其中在各種情況下將少量的生物來源和復(fù)雜組 成的樣品以稀釋或未稀釋的形id接固定或通過^^占附^^導(dǎo)固定, 期爭棘于,在固體載體上的所述陣列中具有至少第二多個測量區(qū)域,該測量區(qū)域中以不同 的濃度固定有與祠側(cè)分析物相同種類的物質(zhì),該物質(zhì)適合于#^^^*^則并存 在于固定的復(fù)雜組成樣品中的所述分析物生成校正曲線,所述校正曲線的形^U: 通過^^斤述微陣列與第一溶液#^觸,該第一溶液包括一種或多種結(jié)^^式劑以及 如果需要的話佑逸的一種或多種才&則試劑,該結(jié)合試劑作為存在于所^^的生物 來源和復(fù)雜組^#品的笫一多個不連續(xù)測量區(qū)域中的4彰則分析物的特異性結(jié)^S己 對物,并作為與存在于所述第二多個不連續(xù)測量區(qū)域中的所述4彰則分析物相同種 類的物質(zhì)的特異l^i吉^SW于物;所i^i吉^^式劑和4^則試劑可以同時或者順序;^口, 之后以空間》—岸的方式測量從與所述第一溶液接觸后的一個或多個P車列的不連續(xù)測量區(qū)Jt拔出的笫一光學(xué)信號,射e^^斤述第一光學(xué)信號。
41. 積為溪求40所述的微陣列,其特征在于,在所述固體載體上的所述陣列中具有第三多個測量區(qū)域,其中在各種情況下將少量的生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀釋的形式固定,jH^卜,還固定有添加于其中的與待測分析物相同種類的已知量的物質(zhì)。
42. 權(quán)矛決求40或41所迷的微陣列,其特征在于,所迷固體載體上的所述 陣列中具有第四多個測量區(qū)域,其中固定有與編q到第一多個測量區(qū)域的樣品基 質(zhì)中存在的物質(zhì)相同種類的物質(zhì)。
43. ^U'J^求4042中^"項所述的微陣列,^#棘于,所述第二多個測 量區(qū)域的測量區(qū)域包括與;^口到第一多個測量區(qū)域的樣品基質(zhì)中存在的物質(zhì)種類 相似的物質(zhì)。
44. 柏力]^求42或43所述的樣tP車列,其特征在于,與;^口到第一多個測量 區(qū)域的樣品M中存在的物質(zhì)種類相似的物質(zhì)可以從以下組的物質(zhì)中獲得白蛋 白,特別是牛血清蛋白,免疫球蛋白,或稀釋血清。
45. ;M^'J^求4044中^"項所述的樣tf車列,^#棘于,所述固體載體上 的所述陣列中具有用于參比目的的第五多個測量區(qū)域。
46. 權(quán)矛決求45所述的微陣列,^##于,所述第五多個測量區(qū)域的測 量區(qū)域中包舍逸自以下組的物質(zhì)質(zhì)量標ie^口^jy示記。
47. —種用于定量測定生物來源和復(fù)雜組成樣品中 一種或多種分析物的方 法,包4舌以下步驟-提#-種或多種生物來源和復(fù)雜《誠的樣品,-提供多種不同濃度的物質(zhì)溶液,所述物質(zhì)與復(fù)雜組成樣品中的幹測分析物 種類相同,-^R4^至少一個固體載體,-通過將少量生物來源和復(fù)雜組成的樣品以稀釋或未稀#^形^>到不連 續(xù)的位點從而形成第一多個不連續(xù)測量區(qū)域作為微陣列的-~^分,所述不連續(xù)的 位點直^f立于所述固體載體上或者在^Vfef'占附層^,位于所述固體載體上 的所述^*占附層上,-在各種情況下通it^加少量的多種不同濃度物質(zhì)溶液從而形成第二多個不 連續(xù)測量區(qū)域作為所述樣釷車列的~~^分,其中所述物質(zhì)與復(fù)雜組^f羊品中的《彰則 分析樹類相同,國使所述mF車列與以下物質(zhì)接觸第一溶液,該第一溶液^i舌一種或多種結(jié)^^式劑和如果需要的話<鏈的一種或多種才&則試劑,該結(jié)^i式劑作為存在于所施加的生物來源和復(fù)雜組^#品中的第一多個不連續(xù)測量區(qū)域中的祠側(cè)分析物的特 異l"生結(jié)^Se^物,和作為存在于第二多個不連續(xù)效'J量區(qū)域中的與所述4彰則分析物 相同種類的物質(zhì)的特異^i吉^i"于物,其中所必吉^i式劑和^^則試劑可以同時或 順序湖口,-以空間《9岸的方式測量從微陣列的所i4^i第二多個不連續(xù)測量區(qū)域發(fā) 出的第一光學(xué)信號,i諒來自所述第一多個不連續(xù)測量區(qū)域的所述第一光學(xué)信號 作為其接觸第一溶液的特征信號,"^4:來自第二多個不連續(xù)測量區(qū)域的所述第一 光學(xué)信號作為其接觸第一溶液的特征信號,該信號作為與存在于復(fù)雜組免f羊品中的分析旨類相同的物質(zhì)濃度的函數(shù),所述物質(zhì)存在于所述測量區(qū)域中,國由來自第二多個不連續(xù)測量區(qū)域的所《錄的光學(xué)信號生成復(fù)雜組^#品中 棒則分析物的feiE曲線,如果需要的話在先去掉背景信號和進4諒當(dāng)?shù)膮⒈萟 生成,通過比較所記錄的來自第一多個不連續(xù)測量區(qū)域的第一光學(xué)信號與 各種分析物的校正曲線,如果需要的話在先減去背景信號和進行適當(dāng)?shù)?參比之后,定量測定存在于復(fù)雜組成樣品中的待測分析物。
48.權(quán)利要求1-39中任一項所述的方法和/或權(quán)利要求40-46中任一 項所述的微陣列和/或權(quán)利要求47所述的方法的用途,用于在藥物庫篩 選過程中定量和/或定性分析測定化學(xué)、生化或生物分析物,以便在藥物 研究、組合化學(xué)、臨床和臨床前開發(fā)中確定效力,用于識別、證實和監(jiān) 測生物或化學(xué)標記物質(zhì)("生物標記物"),用于在蛋白質(zhì)組學(xué)研究和系 統(tǒng)生物技術(shù)中識別和證實信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道,用于親和性篩選,特別是用于 抗體篩選,用于實時結(jié)合研究和確定親和性篩選和研究中的動力學(xué)參 數(shù),用于定量和定性分析物測定,特別是DNA和RNA分析和在基因組 或蛋白質(zhì)組中測定基因組或蛋白質(zhì)組差異,例如單核普酸多態(tài)性,用于 測量蛋白質(zhì)-DNA相互作用,用于確定mRNA表達和蛋白質(zhì)(生物)合 成控制機制,用于產(chǎn)生毒性研究和用于確定表達圖譜,特別是用于形成 在有或無外部刺激時患病和健康細胞群體的細胞表達圖譜并進行比較, 用于研究這種表達圖譜隨著時間段分、小時、天、周、月或年的隨時間 流逝的發(fā)展變化,用于確定生物和化學(xué)標記物質(zhì),如mRNA、蛋白質(zhì)、 肽或低分子量有機(信使)物質(zhì),還用于在藥物產(chǎn)品研發(fā)、人類和動物 診斷、農(nóng)用化學(xué)產(chǎn)品研發(fā)、癥狀和癥狀前植物診斷中檢測抗體、抗原、病原體或細菌,用以藥物產(chǎn)品開發(fā)中的患者分類和治療藥物選擇,用以 檢測病原體、有害物質(zhì)和病原微生物,特別是沙門氏菌、朊病毒、病毒 和細菌,特別是在食品分析和環(huán)境分析中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測或多個生物來源和復(fù)雜組成的樣品中一種或多種分析物的方法。本發(fā)明還涉及一種用于定量測定生物來源和復(fù)雜組成的樣品中一種或多種分析物的微陣列,所述樣品固定于微陣列的測量區(qū)域中,還涉及一種基于其的定量檢測方法。
文檔編號B01J19/00GK101346626SQ200580052434
公開日2009年1月14日 申請日期2005年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月29日
發(fā)明者E·??? M·埃拉特, M·文圖里, M·波拉克 申請人:拜爾技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司
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