一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法；本發(fā)明首先將含有cyp2e1基因的質粒載體轉入發(fā)根農(nóng)桿菌，利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉基因法在活體植株上獲得轉cyp2e1基因的毛狀不定根，進而獲得含有cyp2e1基因毛狀根的復合型轉基因水蕹菜，利用這種復合型轉基因植株對水體有機污染物進行吸收。
【專利說明】一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方 法 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水體有機污染物的去除方法，特別涉及一種清除水體有機污染物 的轉基因復合型水蕹菜的培育方法。 (二）

【背景技術】
[0002] 水蕹菜（Ipomoea aquatica Forsk)屬旋花科草本植物，俗稱竹葉菜，有水生和旱 生兩種生態(tài)類型。水蕹菜可以一次栽種、多次收割，從而把營養(yǎng)物質直接從污染水體中去除 而不產(chǎn)生二次污染。
[0003] 有學者研究了水蕹菜在水體凈化方面的功能。李欲如等在蘇州重污染河道上種 植水蕹菜以控制水體水質污染。不僅進行了靜態(tài)試驗，而且在重污染河道苗家河上作了 示范應用。靜態(tài)試驗結果表明在氣溫35°C、水溫30°C以上的條件下，水蕹菜對重污染水體 中利用高錳酸鹽指數(shù)法測定的化學需養(yǎng)量濃度（COD sfa)、總氮濃度（TN)、NH4+-N、總磷濃度 (TP)的去除率分別為37. 0%、92. 9%、93. 9%、94. 3% ;苗家河示范工程水域中水質有明顯 改善，透明度可達90-130cm，認為水蕹菜是對蘇州重污染河道凈化處理的優(yōu)良生物材料之 一（李欲如，操家順，徐峰，周金余.水蕹菜對蘇州重污染水體凈化功能的研究.環(huán)境 污染與防治，2006, 28(1) :69-71)。操家順等報道了水蕹菜對重污染河道凈化及克藻功能， 結果與李欲如等的報道相似（操家順，李欲如，陳娟.水蕹菜對重污染河道凈化及克藻 功能.水資源保護，2006, 22 (2): 36-41)。顧國平等采用浮床種植水蕹菜等6種陸生植物， 初步研究了浮床種植植物對景觀水體中主要養(yǎng)分氮、磷的去除動態(tài)及效率，結果表明，以水 蕹菜去除效果最佳。水蕹菜能夠大量吸收N、P營養(yǎng)提供自身生長所需，在試驗進行的第6d 及第IOd可分別使試驗水體的TN、TP去除率達到100%，對改善水質、修復水體具有重要 作用（顧國平，周麗燕，王森.空心菜對景觀水中氮磷的去除效果研究初報.安徽農(nóng)學 通報，2008, 14(19) : 111-112)。黃婧等研究了浮床水培水蕹菜的生物學特性及水質凈化效 果，結果顯示，水蕹菜以總氮計，Im2的水蕹菜可以把73. 06m3的水由V類凈化到III類；以總 磷計，則可凈化134. 73m3的水，因此，水蕹菜與其他水培植物相比具有較強的N、P吸收力， 是一種可用于富營養(yǎng)化水體水質凈化的優(yōu)良植物（黃婧，林惠鳳，朱聯(lián)東，李兆華.浮 床水培蕹菜的生物學特征及水質凈化效果.環(huán)境科學與管理，2008, 33(12) :92-94)。宋超 等利用PVC管構建浮床，研究了浮床栽培水蕹菜對羅非魚養(yǎng)殖池塘水體中N和P的控制效 果。數(shù)據(jù)表明，在試驗后期，池塘水體中總氮水平降至淡水養(yǎng)殖池塘廢水排放二級標準，而 總磷水平達到地表水環(huán)境質量二類標準，氨氮的水平控制在lmg/L以下，而亞硝酸鹽氮水 平則控制在0. lmg/L以下。從各處理組對污染物的去除情況來看，水蕹菜種植時間與種植 面積均與N、P的去除效果呈現(xiàn)較好的正相關關系，種植時間越長（>60天），種植面積與去 除效果的正相關性越明顯。結果表明，在集約化養(yǎng)殖池塘中采用浮床栽培水蕹菜能夠對氮 和磷實現(xiàn)有效的控制，并且，水蕹菜浮床覆蓋率為20%時比10%和15%處理組更具有經(jīng)濟 效益（宋超，陳家長，戈賢平，吳偉，范立民，孟順龍，胡庚東.浮床栽培空心菜對羅非 魚養(yǎng)殖池塘水體中氮和磷的控制.中國農(nóng)學通報，2011，27 (23): 70-75)。唐瑩瑩等報道在 塑料水箱中水培水蕹菜，研究浮床水蕹菜對氮循環(huán)細菌數(shù)量、分布和氮素凈化效果的影響。 研究結果表明，浮床水蕹菜氮循環(huán)細菌總數(shù)、氨化菌、亞硝化菌、硝化菌數(shù)量極顯著高于空 白對照；而浮床水蕹菜反硝化菌數(shù)量與空白對照差異不顯著；氨化菌在根內(nèi)、根面、水體中 的分布差異不大，亞硝化菌主要分布在根內(nèi)和根面，硝化菌主要分布在根面，反硝化菌主要 分布在水體中。試驗結束時，浮床水蕹菜系統(tǒng)和空白對照對氨氮的去除率分別為91. 8%和 88. 5%。浮床水蕹菜系統(tǒng)中氮素的去除是植物吸收、根系表面的氨化作用、以及水體中硝化 和反硝化共同作用的結果，而空白對照系統(tǒng)中氮素的主要去除途徑是微生物的硝化和反硝 化作用以及氨揮發(fā)（唐瑩瑩，李秀珍，周元清，賈悅，辛在軍，孫永光.浮床空心菜對 氮循環(huán)細菌數(shù)量與分布和氮素凈化效果的影響.生態(tài)學報，2012, 32(9) :2837-284)。楊文 婕和劉更另分析了磷和硫對水蕹菜吸收砷的影響，結果顯示，微量的砷有利于水蕹菜生長， 而過量的磷和硫阻抑砷這種有益效應的發(fā)揮（楊文婕，劉更另.磷和硫對空心菜吸收砷 的影響.環(huán)境化學，1995, 15(4) :374-379)。此外，任朋娟等研究兩性表面活性劑BS-12和 Cd2+共存對水蕹菜種子萌發(fā)、葉綠素含量及MDA含量等的影響。結果表明，BS-12為50mg/ L時，能降低Cd2+對水蕹菜種子萌發(fā)的毒害作用（任朋娟，孟昭福，馬云飛，袁進，郭彩 虹，樊利，趙賢.BS-12與Cd 2+復合污染對空心菜種子萌發(fā)及生長的影響.西北農(nóng)業(yè)學 報，2011，20(4) :129-133)。
[0004] 上述有關水蕹菜的修復作用僅限于對N、P和重金屬的污染修復，未見其具有修復 有機污染物的研究報道。
[0005] 細胞色素 P450酶是一類與重金屬結合的血紅蛋白，在代謝異源有機物方 面起著重要作用；其中，P450酶家族成員之一 P4502E1(CYP2E1，其編碼基因簡稱為 cyp2el)，主要分布在哺乳動物肝細胞中，對有機污染物具有非常重要的解毒功能（Lee SSj Buters JTj Pineau Tj Fernandez-Salguero Pj Gonzalez FJ. Role of CYP2Elin the hepatotoxicity of acetaminophen. J Biol Chem，1996,271 (20):12063-12067)。
[0006] 為此，本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉基因技術將cyp2el基因轉入水蕹菜中，有效提高 水蕹菜對有機污染的修復能力，進一步提高水蕹菜對水體復合污染的綜合修復能力。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方法。
[0008] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方法，所述方 法包括：（1)無菌苗的培養(yǎng)：將水蕹菜種子消毒后接種在1/2MS(0)培養(yǎng)基上，22±2°C，光 照培養(yǎng)至萌發(fā)小苗，剪取靠頂端的帶葉莖段作為外植體，然后將外植體轉入含〇. 5-2. Omg/ L 6-BA+O. 25mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，22±2°C，光照培養(yǎng)，獲得無菌苗；（2)侵染菌液：將 含有核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示cyp2el基因的質粒導入發(fā)根農(nóng)桿菌，篩選得到抗性菌 落；將抗性菌落活化后接種至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，200r/ min培養(yǎng)至0D_為0. 4-0. 6,離心，沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮清洗3次，離心去除清洗液， 沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心去除清洗液（重復清洗3次）后，沉淀再用MS液體培養(yǎng)基 懸浮，制成光密度OD值為0. 1-0. 2菌懸液，作為侵染菌液；(3)轉基因植株的獲?。簩⒉襟E (1)培育的無菌苗轉入1/2MS(0)培養(yǎng)基上，22±2°C，光照培養(yǎng)至株高5. 5-6cm時在植株的 莖上刺出傷口，然后將步驟（2)制備的侵染菌液滴加在植株的傷口處，22±2°C，光照培養(yǎng)， 獲得轉基因毛狀不定根；(4)轉基因植株：當步驟（3)獲得的毛狀不定根長達5-6cm時，將 著生有毛狀不定根的莖與原植株分離剪斷并保留完整的毛狀不定根的莖（即將原始的野 生根系剪掉），將著生有毛狀不定根的莖（即將毛狀不定根作為根系進行栽培）直接插入含 瓊脂0.6wt%的1/2MS(0)的培養(yǎng)基中，22±2°C，光照繼續(xù)培養(yǎng)10-15天，然后打開瓶蓋練 苗2-3天，取出洗去根部的瓊脂，轉移至1/2MS液體培養(yǎng)基中生長，即獲得轉基因復合型水 蕹菜（所述轉基因復合型水蕹菜是指植株的毛狀根含有cyp2el基因，莖葉為侵染前的原始 結構）。
[0010] 進一步，步驟（1)所述水蕹菜種子消毒方法為：將水蕹菜種子進入體積濃度〇. 1% 氯化汞水溶液中，消毒7. 5min。
[0011] 進一步，步驟（1)所述無菌苗培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為含〇.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA 的MS培養(yǎng)基。
[0012] 進一步，本發(fā)明所述含有核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示cyp2el基因的質?？勺?行構建，本發(fā)明優(yōu)選步驟（2)所述質粒為pSLD50-6。
[0013] 進一步，步驟（2)所述發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌K599。發(fā)根農(nóng)桿菌是一種革蘭氏 陰性菌，能侵染大多數(shù)的雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物及個別的裸子植物，誘發(fā)被感染植物 的受傷部位長出毛狀根。
[0014] 進一步，步驟（2)抗性菌落按如下方法制備：在發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細胞中加 入含cyp2el基因的質粒，混勻后冰上放置IOmin,置于液氮速凍5min，28°C水浴熱激5min， 加入LB液體培養(yǎng)基于28°C振蕩培養(yǎng)2h后，取菌液涂布于含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB 液體培養(yǎng)基中，28°C，200r/min培養(yǎng)至0D_為0. 4-0. 6,離心，取濕菌體即獲得重組發(fā)根農(nóng) 桿菌 K599/pSLD50-6。
[0015] 進一步，步驟（3)所述帶有傷口的植株按如下步驟獲?。涸跓o菌苗莖高l-3cm處用 無菌針尖刺入，形成傷口。
[0016] 進一步，所述水體有機污染物為苯或三氯乙烯。
[0017] 本發(fā)明所述水蕹菜為各種基因型的水蕹菜,優(yōu)選農(nóng)家水蕹菜、柳葉水蕹菜、寬葉水 蕹菜、泰國水蕹菜，更優(yōu)選柳葉水蕹菜。
[0018] 本發(fā)明所用培養(yǎng)基的組成為：所述1/2MS(0)培養(yǎng)基組成為：即MS培養(yǎng)基不添加 任何植物激素、且營養(yǎng)成分減半。所述MS培養(yǎng)基組成為：參見文獻：Murashige T，Skoog F A.revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue culture. Physiol Plant，1962，18:100-127。所述LB液體培養(yǎng)基組成為：5g/L酵母膏，lOg/L蛋白 胨，10g/L NaCl，溶劑為蒸餾水，pH值為7. 5。所述1/2MS液體培養(yǎng)基組成為：MS液體培養(yǎng) 基不添加任何植物激素、且營養(yǎng)成分減半的液體培養(yǎng)基。
[0019] 本發(fā)明首先將含有cyp2el基因的質粒轉入發(fā)根農(nóng)桿菌K599,利用農(nóng)桿菌轉基因 法獲得轉cyp2el基因毛狀根的復合型轉基因植株。當轉基因毛狀根長達5-6cm時，將著生 有毛狀根的莖的下部剪去，將著生有毛狀根的莖直接插入含瓊脂〇.6wt%的1/2MS(0)的培 養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)10-15天，然后打開瓶蓋練苗2-3天，取出洗去根部的瓊脂，轉移至1/2MS 液體培養(yǎng)基中生長，即獲得含轉cyp2el基因毛狀根的復合型水蕹菜植株。經(jīng)PCI^PqRT-PCR 進行cyp2el基因表達分析，毛狀根中cyp2el基因能夠繼續(xù)正常的表達。測定轉基因再生 植株對水體有機污染物的吸收情況，將轉基因再生植株置于含有苯或三氯乙酸的1/2MS培 養(yǎng)基中，水培7天后培養(yǎng)液中剩余的苯和三氯乙烯的含量均近0,而對照水培非轉基因植株 的培養(yǎng)液中，苯和三氯乙烯的含量分別為6. 20 ±0. 015 μ g/mL和11. 31 ±0. 037 μ g/mL，表 明含cyp2el基因的水蕹菜提高了對水體有機污染物的抗性，并且能高效吸收水體中的有 機污染物。
[0020] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明方法獲得的水蕹菜可有效清除水體中有機 污染物，尤其是苯和二氣乙稀，有效提1?水雍菜對有機污染的修復能力，進一步提1?水雍菜 對水體復合污染的綜合修復能力。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為柳葉水蕹菜外植體組培苗發(fā)育情況。
[0022] 圖2為組培苗轉基因毛狀根的誘導情況。
[0023] 圖3為毛狀根進行PCR擴增鑒定的凝膠電泳圖，泳道1為DNA標準分子量 (DS2000)，泳道2為-泳道6為毛狀根根系平行實驗，泳道7為野生型水蕹菜根系，泳道8 為質粒PSLD50-6。
[0024] 圖4為普通根（非轉基因根）和轉基因毛狀根中cyp2el基因表達情況。
[0025] 圖5為轉基因水蕹菜吸收水體有機污染物的情況，A為在含苯的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，B 為在含三氯乙烯的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 (五）

【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0027] 實施例1水蕹菜組織培養(yǎng)快速繁殖無菌苗
[0028] (1)選擇農(nóng)家水蕹菜、柳葉水蕹菜、寬葉水蕹菜、泰國水蕹菜等不同的基因型的種 子作為實驗起始材料。
[0029] (2)選擇不同的消毒方法對種子進行消毒，消毒后種子污染情況見表1，0. 1%氯 化汞是指質量濃度〇. 1 %氯化汞水溶液，75 %酒精為體積濃度75 %乙醇水溶液，20 %次氯 酸鈉為質量濃度20%次氯酸鈉水溶液，結果表明：利用0. 1 %氯化汞消毒7. 5min對種子的 消毒效果最佳，無污染，而且柳葉水蕹菜的發(fā)芽率最高。
[0030] 表1種子消毒
[0031]

【權利要求】
1. 一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方法，其特征在于所述方法 包括：⑴無菌苗的培養(yǎng):將水蕹菜種子消毒后接種在1/2MS(0)培養(yǎng)基上，22±2。。，光照 培養(yǎng)至萌發(fā)小苗，剪取靠頂端的帶葉莖段作為外植體，然后將外植體轉入含0. 5?2. Omg/L 6-BA+O. 25mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，22±2°C，光照培養(yǎng)，獲得無菌苗；（2)侵染菌液：將含有 核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示cyp2el基因的質粒導入發(fā)根農(nóng)桿菌，篩選得到抗性菌落； 將抗性菌落活化后接種至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，200r/min 培養(yǎng)至0D_為0. 4-0. 6,離心，沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心去除清洗液后再用MS液體 培養(yǎng)基懸浮，制成光密度OD值為0. 1-0. 2菌懸液，作為侵染菌液；（3)轉基因植株的獲取： 將步驟（1)培育的無菌苗轉入1/2MS(0)培養(yǎng)基上，22±2°C，光照培養(yǎng)至株高5. 5-6cm時在 植株的莖上刺出傷口，然后將步驟（2)制備的侵染菌液滴加在植株的傷口處，22±2°C，光 照培養(yǎng)，在傷口處獲得轉基因毛狀不定根；(4)轉基因復合型植株：當步驟（3)獲得的毛狀 不定根長達5-6cm時，將著生有毛狀不定根的莖與原植株分離剪斷并保留完整的毛狀不定 根的莖，然后將著生有毛狀不定根的莖直接插入含質量濃度0.6%瓊脂的1/2MS(0)的培養(yǎng) 基中，22±2°C，光照培養(yǎng)10-15天，然后打開瓶蓋練苗2-3天，取出洗去根部的瓊脂，轉移至 1/2MS液體培養(yǎng)基中生長，即獲得轉基因復合型水蕹菜植株。
2. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步驟（1)所述水蕹菜種子消毒方法為：將水蕹菜種子進入體積濃度〇. 1%氯化汞水溶液 中，消毒7. 5min。
3. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步驟（1)所述無菌苗培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為含〇. 5mg/L 6-BA+O. 25mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。
4. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步驟（2)所述質粒為pSLD50-6。
5. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步驟（2)所述發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌K599。
6. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步 驟（2)抗性菌落按如下方法制備：將含cyp2el基因的質粒導入感受態(tài)發(fā)根農(nóng)桿菌K599細 胞，構建重組發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pSLD50-6。
7. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步 驟（3)所述帶有傷口的植株按如下步驟獲取：在無菌苗莖高l_5cm處用無菌針尖刺入，形成 傷口。
8. 如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述水體有機污染物為苯或三氯乙烯。
【文檔編號】C02F3/32GK104313050SQ201410493727
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權日:2014年9月24日
【發(fā)明者】孫揚, 向太和, 韓依萱, 王嫚, 宋亞玲, 吳玲 申請人:杭州師范大學