治療性方法和組合物的制作方法
【專利摘要】提供了用于診斷或治療受試者中的免疫病癥的方法。所述方法基于不應(yīng)狀態(tài)誘導(dǎo)因子(RIF)的檢測(cè)或調(diào)控。
【專利說明】治療性方法和組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于調(diào)控有此需要的受試者中的免疫系統(tǒng)的組合物和方法。更具體 地，本發(fā)明公開了免疫應(yīng)答的關(guān)鍵的內(nèi)源因子的存在和表征，并且基于此因子的調(diào)控提供 了新的治療和診斷性方法和組合物。具體地，本發(fā)明提供了適合于刺激或抑制受試者中的 CD4T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的組合物和方法，以及用于監(jiān)測(cè)免疫缺陷的方法和組合物，包括 與人免疫缺陷病毒(HIV)感染有關(guān)的免疫缺陷。還提供了診斷和測(cè)定抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法后 持續(xù)的CD4T細(xì)胞缺陷的方法和組合物，以及開發(fā)能夠特異性治療此免疫缺陷的藥物的方 法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] CD4T淋巴細(xì)胞在控制免疫系統(tǒng)(細(xì)胞和體液應(yīng)答二者）中發(fā)揮卓越的作用，并且在 各種疾病狀況中是至關(guān)重要的。
[0004] 在與HIV發(fā)病機(jī)制有關(guān)的免疫學(xué)疾病期間，所有CD4T細(xì)胞的小于0.5%實(shí)際上被感 染（如在外周血中測(cè)量），但是絕大多數(shù)的CD4T細(xì)胞顯示重大的調(diào)節(jié)功能障礙。未感染的 CD4T淋巴細(xì)胞進(jìn)行性松開其功能，變得無反應(yīng)性的，并且其數(shù)目減少，導(dǎo)致CD4淋巴細(xì)胞減 少。無反應(yīng)性和淋巴細(xì)胞減少是表征感染HIV的患者的免疫缺陷的標(biāo)志。這些現(xiàn)象背后的機(jī) 制從未完全闡明（1)。
[0005] 免疫活化和炎癥在HIV發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮重要的作用（2,3)。發(fā)明人先前已經(jīng)證明 了對(duì)白介素-2(IL-2)的響應(yīng)性降低，導(dǎo)致CD4無反應(yīng)性(4)，和對(duì)白介素-7(IL-7)的響應(yīng)性 的降低，所述白介素-7通過破壞IL-7/CD4調(diào)節(jié)環(huán)，參與導(dǎo)致CD4淋巴細(xì)胞減少的機(jī)制(5)。牽 涉的機(jī)制已經(jīng)歸因于Janus激酶(Jak)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄活化物（Signal Tranducer and Activator of Transcription)(STAT)途徑(6,7)中的缺陷。其它實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得了相似的 結(jié)果(8，9)。在這方面，需要IL-7受體（IL-7R)的區(qū)室化以啟動(dòng)正常的⑶4T細(xì)胞應(yīng)答（10)。在 IL-7結(jié)合后，首先將IL-7R的兩條鏈(IL-7R alpha和gamma-c)驅(qū)動(dòng)到膜微域(MMD)中。這些 是細(xì)胞區(qū)室，其與脂筏一樣富含膽固醇和鞘磷脂，但是它們也含有非常大量的結(jié)構(gòu)和功能 性蛋白質(zhì)（11) JL-7R復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，所述細(xì)胞骨架然后與其網(wǎng)絡(luò)相互作用。 這兩個(gè)連續(xù)的步驟將是啟動(dòng)Jak/STAT途徑需要的（12)。
[0006] 本發(fā)明人已經(jīng)調(diào)查了感染病毒血HIV的患者(VP)中的⑶4T淋巴細(xì)胞的無應(yīng)答性背 后的機(jī)制。本文中提供的實(shí)驗(yàn)證明了 CD4T淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)期活化將它們驅(qū)動(dòng)成活化/分化的 異常狀態(tài)，這使它們對(duì)某些生理學(xué)信號(hào)（如那些由白介素-7遞送的生理學(xué)信號(hào))不應(yīng)。此外， 本發(fā)明報(bào)告了造成CD4T細(xì)胞活化的此異常狀態(tài)的蛋白質(zhì)從人血漿中的鑒定、分離和表征。 因此，本發(fā)明第一次公開了可以通過內(nèi)源循環(huán)蛋白介導(dǎo)免疫抑制，所述內(nèi)源循環(huán)蛋白在表 達(dá)后能夠誘導(dǎo)CD4-T細(xì)胞的改變和失活，并且在抑制后可以刺激受試者中的免疫系統(tǒng)。 [0007]部分基于這些值得注意的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明現(xiàn)在提供了用于調(diào)控免疫系統(tǒng)，特別是用 于調(diào)控具有改變的免疫(例如免疫抑制或病理學(xué)免疫反應(yīng)）的受試者中的免疫系統(tǒng)的新方 法、組合物和化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過調(diào)控CD4T細(xì)胞治療免疫病癥的新方法。本發(fā) 明特別適合于治療與CD4T細(xì)胞損傷有聯(lián)系的免疫缺陷，如與HIV感染有關(guān)的免疫缺陷綜合 征。本發(fā)明還提供了用于表征異常活化狀態(tài)，對(duì)IL7的反應(yīng)性和/或用于監(jiān)測(cè)感染HIV的患者 中受損的免疫應(yīng)答的試劑和方法。可以在未治療的患者或用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的患者 中評(píng)估CD4T細(xì)胞的應(yīng)答，并且量化其對(duì)治療的響應(yīng)并且評(píng)估其CD4T細(xì)胞的勝任性。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的涉及用于調(diào)控受試者中的免疫應(yīng)答的方法，其包括使受試者暴 露于調(diào)控GIBsPLA2的量(例如表達(dá))或活性的化合物。
[0010] 本發(fā)明的又一個(gè)目的涉及治療受試者中的免疫病癥的方法，其包括使受試者暴露 于調(diào)控GI BsPLA2的量(例如表達(dá))或活性的化合物。
[0011] 本發(fā)明的又一個(gè)目的涉及治療受試者中的免疫病癥的方法，其包括調(diào)控受試者中 的GIBsPLA2的量(例如表達(dá))或活性。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及調(diào)控GIBsPLA2的量(例如表達(dá))或活性的化合物用于制 備藥物的用途，所述藥物用于調(diào)控免疫應(yīng)答或用于治療受試者中的免疫病癥。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及在調(diào)控免疫應(yīng)答或治療受試者中的免疫病癥的方法中 使用的GIBsPLA2調(diào)控劑。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及GIBsPLA2調(diào)控劑，用于調(diào)控受試者中的白細(xì)胞的用途。
[0015] 在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明用于誘導(dǎo)或刺激受試者中的免疫應(yīng)答，并且包括抑 制所述受試者中的GIBsPLA2,或者使受試者暴露于GIBsPLA2抑制劑。此類實(shí)施方案特別適 合于治療免疫缺陷的受試者或者需要刺激的免疫(例如傳染病，癌癥等)的受試者。
[0016] 因此，本發(fā)明的一個(gè)具體的目的存在于刺激受試者中的免疫應(yīng)答的方法，其包括 抑制所述受試者中的GIBsPLA2或者使受試者暴露于GIBsPLA2抑制劑。
[0017] 本發(fā)明的又一個(gè)目的涉及治療受試者中的傳染病的方法，其包括抑制所述受試者 中的GIBsPLA2或使受試者暴露于GIBsPLA2抑制劑。
[0018]本發(fā)明的一個(gè)更具體的實(shí)施方案涉及治療感染HIV的受試者中的AIDS的方法，其 包括抑制所述受試者中的GIBsPLA2或使受試者暴露于GIBsPLA2抑制劑。
[0019] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使受試者暴露于抑制劑包括對(duì)受試者施用抑制劑。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，使受試者暴露于抑制劑包括針對(duì)GIBsPLA2對(duì)受試者接種疫苗。
[0020] 在這方面，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于刺激有此需要的受試者的 免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括針對(duì)GIBsPLA2對(duì)受試者接種疫苗。
[0021] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及GIBSPLA2抗原，用于對(duì)有此需要的受試 者接種疫苗的用途。
[0022] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明用于降低或抑制受試者中的不想要的或有害的免疫應(yīng) 答，并且包括引起或增加所述受試者中的GIBsPLA2,或者使受試者暴露于GIBsPLA2激動(dòng)劑 或活化劑。此類實(shí)施方案特別適合于治療具有異常和/或病理學(xué)免疫應(yīng)答(例如自身免疫性 疾病、炎癥、蕁麻疹，濕疹，變態(tài)反應(yīng)，哮喘等)的受試者。
[0023]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于診斷與CD4T細(xì)胞改變有關(guān)的人免疫缺陷的方 法。在一些實(shí)施方案中，方法包括(a)提供含有體液的樣品，優(yōu)選來自受試者的血漿，并且 (b)檢測(cè)樣品中的GIBsPLA2的存在。在方法的一些實(shí)施方案中，免疫缺陷是與人免疫缺陷病 毒(HIV)感染有關(guān)的免疫缺陷。在一些實(shí)施方案中，方法包括使樣品與對(duì)GIBsPLA2特異性的 抗體接觸。在方法的一些實(shí)施方案中，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA)檢測(cè)樣品中的 GIBsPLA2的存在。
[0024]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于鑒定候選免疫缺陷治療劑的方法。在一些實(shí) 施方案中，免疫缺陷與CD4T細(xì)胞改變有關(guān)。在方法的一些實(shí)施方案中，與CD4T細(xì)胞改變有關(guān) 的人免疫缺陷由病毒感染，特別是人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起。在一些實(shí)施方案中，方 法包括：（a)在存在藥劑的情況下使⑶4T淋巴細(xì)胞與GIBsPLA2接觸，（b)測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo) 的CD4T細(xì)胞活化，并且(c)比較在存在藥劑的情況下的GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水 平與在缺乏藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平。在方法的一些實(shí)施方案 中，若在存在藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平低于在缺乏藥劑的情況下 GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平，則將藥劑鑒定為候選免疫缺陷治療劑。在方法的一 些實(shí)施方案中，若在存在藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平不低于在缺乏 藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平，則將藥劑鑒定為候選免疫抑制治療 劑。在一些實(shí)施方案中，方法包括通過測(cè)定每個(gè)⑶4T細(xì)胞的MMD數(shù)目測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo)的 ⑶4T細(xì)胞活化。在一些實(shí)施方案中，方法包括通過測(cè)定⑶4T細(xì)胞上的MMD的均值直徑測(cè)量 GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化。在一些實(shí)施方案中，方法包括通過測(cè)定⑶4T細(xì)胞的IL-7響 應(yīng)性測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化。
[0025]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含GIBsPLA2調(diào)控劑和藥學(xué)可接受 載體或賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2調(diào)控劑是GIBsPLA2抑制劑，更優(yōu)選地選 自抗體或其片段或衍生物、抑制性核酸、肽或小藥物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中， GIBsPLA2調(diào)控劑是GIBsPLA2激動(dòng)劑或活化劑，更具體地，GIBsPLA2蛋白。
[0026]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及疫苗組合物，其包含GIBsPLA2抗原（例如免疫原性 GIBsPLA2蛋白或其含有表位的片段）、藥學(xué)可接受載體或賦形劑和任選地佐劑。在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原是GIBsPLA2蛋白或其片段，其經(jīng)處理以（i)增加其在人受試者 中的免疫原性和/或（i i)降低其生物學(xué)活性。
[0027] 本發(fā)明可以在任何哺乳動(dòng)物中使用。它特別適合于用于人受試者。它可以用于提 高任何哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答，并且它特別適合于誘導(dǎo)免疫抑制受試者中的有力的CD4-T 細(xì)胞活性。
[0028] 附圖簡(jiǎn)述
[0029]圖la至le顯示了在任何刺激前，來自VP的CD4T細(xì)胞顯示異常的活化狀態(tài)，具有不 受IL-7影響的許多大的膜微域。
[0030] (a)用霍亂毒素亞基B (CtxB-AF488)標(biāo)記膜微域(MMD)，并且通過STED顯微術(shù)分析。 從上到下，來自經(jīng)HD、VP和PHA活化的（40μg/ml，30min)HDT細(xì)胞的純化的CD4T細(xì)胞。對(duì)于每 組，從Z堆疊圖像系列（Z-stack image series)中顯示了IL-7刺激（2nM, 15min)之前和之后 的代表性⑶4T細(xì)胞的上半部。在通過IL-7刺激前還用膽固醇氧化酶(C0ase，31yM，25min)加 上鞘磷脂酶（sphyngomyelinase) (SMase，2 · 7μΜ, 5min)處理 CD4T 淋巴細(xì)胞。
[0031] (b，c)在純化的⑶4T細(xì)胞的整個(gè)表面上對(duì)MMD計(jì)數(shù)。檢查平均值50個(gè)細(xì)胞。（b) IL-7 刺激之前(HDc:NS)和之后(HDc:IL-7)的HD細(xì)胞。（c)IL-7刺激VP之前(VPc:NS)和之后(VPc: IL-7)的VP細(xì)胞，IL-7刺激之前(HDc: PHA)和之后（HDc: PHA/IL-7)的經(jīng)PHA活化的HD細(xì)胞。 [0032] (d，e)在純化的CD4T細(xì)胞的表面上測(cè)量MMD大小(d)經(jīng)IL-7刺激的HD細(xì)胞(冊(cè)〇:11^- 7)，（ e)經(jīng)IL-7刺激的VP細(xì)胞(VPc: IL-7)和經(jīng)IL-7刺激的經(jīng)PHA預(yù)活化的HD細(xì)胞(HDc : IL- 7)。
[0033] 圖2a至2c顯示了來自VP CD4T細(xì)胞的IL-7R鏈包埋于不受IL-7影響的去污劑抗性 微域(DRM)中。將純化的CD4T淋巴細(xì)胞裂解(0.5%Triton X-100)，并且在5-40%蔗糖梯度 上加載200μ1裂解物。在于4°C離心（50krpm)16h后，收集18個(gè)級(jí)份(#1左=管頂部=5%蔗 糖;#18右=管底部= 40%蔗糖）。在SDS-PAGE(7%雙丙烯酰胺(acrylamide-bis))上分析每 個(gè)級(jí)份。通過免疫印跡法檢測(cè)閥蛋白（Flottilin)、IL_7R alpha和gamma-c(lO)。
[0034] (a)使用閥蛋白作為標(biāo)記物來指示與DRM對(duì)應(yīng)的低密度級(jí)份和閥外部的高密度級(jí) 份。
[0035] (b)對(duì)純化的非刺激的HD CD4T細(xì)胞(HDc: NS)、經(jīng)IL-7刺激的HD細(xì)胞(HDc: IL-7)、 非刺激的VP細(xì)胞(VPc: NS)和經(jīng)PHA活化的HD細(xì)胞(HDc: PHA)顯示了 IL-7Ralpha和（c) gamma-c條帶。
[0036] 圖3a至3e顯示了IL-7R功能在VP CD4T-細(xì)胞的膜微域中改變。
[0037] (a)測(cè)量IL_7Ralpha的二維有效擴(kuò)散速率Deff，如圖7中形成。還在添加各種藥物后 測(cè)量擴(kuò)散速率：C0ase(31yM，30minWplSMase(2.7yM，5min)(C0/SM)、Col(10yM，30min)W 上CytD(20yM，30min)(CytD/Col)，或者在存在所有這些抑制劑(所有）的情況下。研究了來 自HD(HDc)和VP(VPc)的CD4T細(xì)胞，也研究了經(jīng)PHA活化的HD CD4T細(xì)胞(HDc:PHA)。棒標(biāo)示來 自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。圖8中給出了更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0038] (b)使用用山羊抗兔Atto642標(biāo)記的兔磷酸-STAT5追蹤IL-7誘導(dǎo)的磷酸化和STAT5 的核轉(zhuǎn)位，并且通過脈沖STED顯微術(shù)(0.5μπι切片）分析。實(shí)驗(yàn)牽涉純化的非刺激的HD CD4T 細(xì)胞(HDc:NS)、經(jīng)IL-7-刺激的HD CD4T細(xì)胞(HDc:IL-7)、非刺激的VP CD4T細(xì)胞(VPc:NS)、 經(jīng)IL-7-刺激的VP CD4T細(xì)胞(VPc: IL-7)、經(jīng)PHA-活化的HD CD4T細(xì)胞(HDc:PHA)和經(jīng)PHA-活 化的通過IL-7刺激的HD CD4T細(xì)胞（HDc : PHA/1L-7 )。在左邊小圖中顯示了秋水仙素 (colchicine)加上松胞菌素 D的效果。
[0039] (c，d，e)在IL-7刺激后，使用Image J軟件測(cè)量胞質(zhì)中的磷酸-STAT5出現(xiàn)和核中的 積累的動(dòng)力學(xué)。（c)HD CD4T細(xì)胞（黑線）和用Col加上CytD處理的HD CD4T細(xì)胞(藍(lán)線），（d)VP ⑶4T細(xì)胞(紅線）和(e)經(jīng)PHA-活化的HD⑶4T細(xì)胞(綠線）。
[0040] 圖4a至4d顯示了來自VP的血漿誘導(dǎo)HD⑶4T細(xì)胞中的異?；罨Ｊ剑缤ㄟ^MMD的 數(shù)目測(cè)量。
[0041 ] (a)顯示了 用來自 ￥?(^(3:￥?口）、!11(：(肋(3:!110口）或八1?1'患者（!10(3:41^^)的血漿 (10 % )處理的HD⑶4T細(xì)胞的代表性圖像。用霍亂毒素(CtxB-AF488)染色MMD。對(duì)于每組，顯 示了 IL-7刺激(2nM，15min)之前（左）和之后（右）的來自Z堆疊圖像的代表性⑶4T細(xì)胞的上 半部。
[0042] (b)通過來自5種不同VP(VPpl至VPp5)血漿（10%)在CD4T-細(xì)胞(HDc)的表面上誘 導(dǎo)的MMD。從對(duì)IL-7刺激之前（白色)和之后(藍(lán)色）的50個(gè)細(xì)胞的分析獲得結(jié)果。顯示了均值 和四分位數(shù)。
[0043] (c)比較IL-7刺激之后（藍(lán)色）和之前（白色）的來自HD(HDp)、VP(VPp)、HIC(HICp) 和ART患者(ARTp)的血漿的效果。
[0044] (d)用c中描述的血漿獲得的劑量(0.01%至10%)-響應(yīng)。顯示了在HDc⑶4T細(xì)胞 的表面上誘導(dǎo)的MMD的數(shù)目。VP血漿的效果顯示為平紅線。
[0045] 圖5a至5d顯示了來自VP的血漿抑制HD⑶4T淋巴細(xì)胞中的IL-7誘導(dǎo)的STAT5磷酸 化和磷酸-STAT5的核轉(zhuǎn)位。
[0046] (a)在IL-7刺激前，將純化的HD CD4T細(xì)胞與血漿（10% )預(yù)溫育。通過脈沖-STED顯 微術(shù)(0.5μπι切片)追蹤IL-7誘導(dǎo)的磷酸化和磷酸STAT5的核轉(zhuǎn)位。研究以下血漿（10 % ):對(duì) 照（HDc: NS)、VP (HDc: VPp)、HIC(HDc: HICp)和ART患者（HDc: ARTp)。
[0047] (b)用5種不同VP的血漿（10%)預(yù)處理的經(jīng)IL-7-刺激的HD⑶4T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（藍(lán) 色)和核(紅色）中回收的磷酸-STAT5的分析。
[0048] (c)比較血漿（10% )預(yù)溫育對(duì)經(jīng)IL-7-刺激的HD CD4T細(xì)胞的影響。血漿來自HD (HDp)、VP(VPp)、HIC(HICp)和ART患者（ARTp)
[0049] (d)用血漿獲得劑量(0.01%-10%)_響應(yīng)，如通過抑制經(jīng)IL-7-刺激的HD CD4T細(xì) 胞中的磷酸-STAT5核轉(zhuǎn)位測(cè)量。VP血漿的效果顯示為平紅線。
[0050] 圖6a至6d顯示了從VP血漿回收的不應(yīng)狀態(tài)誘導(dǎo)因子(RIF)的分子表征。
[0051 ] (a)通過胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶和PNG酶處理VP血漿。通過測(cè)量HD CD4T-細(xì)胞中的 MMD數(shù)目和對(duì)IL-7誘導(dǎo)的核磷酸-STAT5的影響追蹤RIF活性。
[0052] (b)通過在Sephadex G100柱上的凝膠過濾測(cè)量RIF MW。通過測(cè)量由柱的不同級(jí)份 誘導(dǎo)的MMD數(shù)目追蹤HD⑶4T細(xì)胞上的RIF活性(厚紅線）。還通過使用來自VP血漿的多克隆 抗體的點(diǎn)印跡對(duì)每個(gè)級(jí)份測(cè)試病毒蛋白的存在。已經(jīng)扣除了用HD血漿獲得的背景。將實(shí)驗(yàn) 重復(fù)二次。
[0053] (c)還在Sephadex G100柱上的凝膠過濾后測(cè)量RIF MW，并且通過抑制IL-7誘導(dǎo)的 磷酸-STAT5追蹤其活性，如通過FACS測(cè)量。記錄了最大IL-7-誘導(dǎo)的磷酸-STAT5的百分比。 還報(bào)告了每個(gè)級(jí)份中的蛋白質(zhì)的量。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
[0054] (d)如下測(cè)量等電點(diǎn)。將從Sephadex G100柱洗脫的RIF加載到陰離子(MonoQ)或陽 離子(MonoS)交換柱上。通過pH-步進(jìn)緩沖液洗脫RIF活性。相對(duì)pH繪制HD⑶4T細(xì)胞上的MMD 數(shù)目。
[0055] 圖7a至7c顯示了來自經(jīng)HD、VP和IL-7-刺激的HD細(xì)胞的純化的CD4T細(xì)胞的IL-7信 號(hào)體(signalosome)的2D凝膠分析。（a)非刺激的（NS)HD CD4T細(xì)胞。（b)VP CD4T細(xì)胞。（c)經(jīng) IL-7-刺激的HD CD4T細(xì)胞。
[0056] 圖8a至8g顯示了來自經(jīng)HD、VP和PHA-刺激的HD細(xì)胞的純化的CD4T細(xì)胞的表面上的 IL-7Ralpha的擴(kuò)散速率的分析。（a，d)在HD CD4T細(xì)胞的表面上，（b，e)在VP CD4T細(xì)胞的表 面上，（c，f)在用PHA(lμg/ml)預(yù)活化的HD⑶4T細(xì)胞的表面上。（g)在通過MMD抑制劑或細(xì)胞 骨架抑制劑處理之前和之后MMD中包埋的IL-7Ralpha擴(kuò)散的機(jī)制的圖解。
[0057] 圖9a至9d顯示了RIF對(duì)HD CD4T細(xì)胞作用的假設(shè)模式和IL-7無應(yīng)答性機(jī)制的圖示。 RIF誘導(dǎo)非功能性的異常MMD。因此，IL-7信號(hào)體被改變，并且細(xì)胞仍然對(duì)細(xì)胞因子無應(yīng)答， 與在VP⑶4T細(xì)胞中一樣。RIF誘導(dǎo)的HD⑶4T細(xì)胞中和VP⑶4T細(xì)胞中的異?；罨Ｊ胶托?號(hào)傳導(dǎo)缺陷不能區(qū)分。圖解的左部分顯示了 HD中的IL-7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制中的不同步驟（10， 12)〇
[0058] (a)在靜息CD4T細(xì)胞中，在E-7識(shí)別前，IL-7R鏈聯(lián)合，但是它們的胞質(zhì)內(nèi)域離得很 遠(yuǎn)，并且信號(hào)傳導(dǎo)分子Jakl和Jak3不是相互作用的。
[0059] (b)在經(jīng)IL-7-活化的CD4T細(xì)胞中，IL-7R在正常MMD(直徑為90nm)中區(qū)室化，并且 信號(hào)體變?yōu)楣δ苄缘?。在?xì)胞骨架構(gòu)造后，STAT5A和STAT5B與IL-7R/Jakl/Jak3復(fù)合物接觸 是磷酸化的，然后通過沿著微管移動(dòng)迀移到核，如先前討論(12)。
[0060]圖解的右邊部分顯示了 RIF作用的假設(shè)機(jī)制。提出的作用機(jī)制源自初步數(shù)據(jù)和RIF 誘導(dǎo)的缺陷與在來自VP的純化的CD4T細(xì)胞中表征的變化的比較(未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。
[0061 ] (c)RIF誘導(dǎo)許多較大的異常MMD<JL-7R包埋于異常的MMD中，并且它們誘導(dǎo)功能性 信號(hào)體的能力被改變。
[0062] (d)經(jīng)RIF處理的HD CD4T細(xì)胞不響應(yīng)IL-7<Jakl和Jak3磷酸化STAT5,盡管以降低 的動(dòng)力學(xué)，但是磷酸-STAT5由于缺乏細(xì)胞骨架和微管構(gòu)造而不迀移到核中。
[0063] 小圖a、b、c和d顯示了用CtxB:AF488標(biāo)記的MMD的STED顯微術(shù)圖像(來自CW-STED的 Z堆疊的半堆）。小圖b和d顯示了用兔抗微管/山羊抗兔Att〇642染色的微管蛋白，用小鼠抗 肌動(dòng)蛋白/山羊抗小鼠 Chr494染色的肌動(dòng)蛋白和用兔抗磷酸-STAT5/山羊抗兔Att〇642染色 的磷酸-STAT5。脈沖STED顯微術(shù)顯示了經(jīng)甲醇透化的⑶4T細(xì)胞的0.5μπι切片。在IL-7刺激 后，與在HD中不一樣，經(jīng)RIF處理的HD CD4T淋巴細(xì)胞的MMD細(xì)胞質(zhì)區(qū)中的肌動(dòng)蛋白不能濃縮 為有結(jié)構(gòu)的墊，并且不形成核周圍的皮層。此外，與在VP⑶4Τ細(xì)胞中一樣，在這些經(jīng)RIF處 理的HD CD4T細(xì)胞中的微管蛋白不能形成微管，所述微管已經(jīng)假設(shè)為橋接質(zhì)膜和核膜的重 要桿，并且從而對(duì)于STAT5核轉(zhuǎn)位是必需的。
[0064]缺陷的匯總：畫圈的數(shù)字1、2、3和4標(biāo)示了與經(jīng)RIF處理的HD Τ細(xì)胞中的異?；罨?模式和IL-7無應(yīng)答性相關(guān)的不同缺陷步驟：（1)信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物的異常蛋白質(zhì)模式，如通過 2D凝膠描述，（2)異常膜結(jié)構(gòu)，諸如大MMD，如通過STED顯微術(shù)看出，（3)異常細(xì)胞骨架構(gòu)造， 如通過擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)和STED顯微術(shù)測(cè)量，和(4)異常信號(hào)傳導(dǎo)中間體和抑制磷酸-STAT5核轉(zhuǎn) 位，如通過STCD顯微術(shù)顯示。
[0065] 圖10:PLA2sGIB抑制健康供體(HD)的CD4T細(xì)胞中的IL-2誘導(dǎo)的PStat5核轉(zhuǎn)位:在 37°C用來自5個(gè)￥?(￥?63、￥?68、￥?69、￥?74和￥?75)和來自用作對(duì)照的3個(gè)冊(cè)的3%或1%血漿 處理從4名健康供體純化的靜息⑶4T細(xì)胞30分鐘。在指定時(shí)，在37°C用2nM IL-2刺激它們15 分鐘。顯示了 IL-2刺激之前（藍(lán)色點(diǎn)）和之后(紅色點(diǎn)）的整個(gè)⑶4T細(xì)胞(a)中和⑶4+⑶25+T 細(xì)胞(b)中在核PStat5方面呈陽性的細(xì)胞的百分比，均值和SD。在用兔抗人PStat5(pY694)， 接著用驢抗兔IgG-Die light 405的間接染色后使用激光掃描共焦顯微術(shù)（LSM 700， Zeiss)觀察PStat5的胞內(nèi)定位。用山羊抗人b-微管蛋白，接著用驢抗山羊IgG-AF555處理染 色總⑶4T細(xì)胞。用小鼠抗人⑶25，接著用驢抗小鼠 IgG-AF488靶向⑶25+⑶4T細(xì)胞。
[0066] 圖ll:PLA2sGIB抑制健康供體(HD)的CD4T細(xì)胞中的IL-4誘導(dǎo)的PStat6核轉(zhuǎn)位:在 37°C用來自5個(gè)￥?(￥?63、￥?68、￥?69、￥?74和￥?75)和來自用作對(duì)照的3個(gè)冊(cè)的3%或1%血漿 處理從4名健康供體純化的靜息⑶4T細(xì)胞30分鐘。在指定時(shí)，在37°C用2nM IL-4刺激它們15 分鐘。顯示了 IL-2刺激之前(藍(lán)色點(diǎn)）和之后(紅色點(diǎn)）的整個(gè)⑶4T細(xì)胞在核PStat6方面呈陽 性的細(xì)胞的百分比，均值和SD。在用兔抗人PStat6(pY694)，接著用山羊抗兔IgG-AF488的間 接染色后使用激光掃描共焦顯微術(shù)(LSM 700,2&^)觀察？5七&七6的胞內(nèi)定位。用小鼠抗人 a-微管蛋白，接著用山羊抗小鼠 IgG-AF647染色總⑶4T細(xì)胞。
[0067] 圖12:突變體pPLA2GIB H48Q的活性的缺乏。
[0068]圖13:野生型克隆豬PLA2GIB和其突變體H48Q的活性比較。A:異常膜微域(aMMD)的 誘導(dǎo);B:對(duì)IL-7誘導(dǎo)的磷酸STAT5核轉(zhuǎn)位(pSTAT5的NT)的影響。
[0069] 圖14顯示了用與Sepharose珠偶聯(lián)的山羊抗PLA2G1B抗體處理來自病毒血患者的 血漿。綠色:VP68;粉紅色:VP69;藍(lán)色:VP LJT。在處理（30min室溫）后，測(cè)試血漿：
[0070] a.在用霍亂毒素 B(CtxB-AF488)染色后測(cè)量顯示異常MMD/細(xì)胞的⑶4T細(xì)胞的百分 比
[0071] b.在IL-7刺激后測(cè)量PSTAT5的核轉(zhuǎn)位，并且計(jì)數(shù)陽性核的百分比。
[0072] 圖15:抗PLA2GIB抗體對(duì)aMMD誘導(dǎo)和對(duì)NT pSTAT5的抑制的影響。
[0073] 圖16:可溶性PLA2G1B小鼠受體（sMR)抑制人PLA2GlB(huPLA2GlB)對(duì)響應(yīng)來自健康 供體的CD4T細(xì)胞的IL-7的活性，表示為PStat5的核轉(zhuǎn)位方面呈陽性的細(xì)胞的百分比。響應(yīng) 的恢復(fù)計(jì)算為：
[0074] l〇〇x( %P〇s細(xì)胞huGlB+sMR-%Pos細(xì)胞huGlB)/( %Pos細(xì)胞賴er%Pos細(xì)胞hUQB)
[0075] 圖17顯示了來自CD4非響應(yīng)者（CD4-NR)患者的血漿誘導(dǎo)HD CD4T細(xì)胞中的異常 MMD- (a)使用結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)（Structured Illumination Microscopy) (SIM)獲得的用來 自CD4-NR患者的血漿（1 % )處理的HD CD4T細(xì)胞的圖像。用霍亂毒素 B(CtxB-AF488)染色 MMD。顯示了代表性⑶4T細(xì)胞的Z堆疊圖像的投影。在IL-7刺激(2nM，15min)后，沒有圖像修 改(右邊）。（13)用來自5名⑶4-NR患者(藍(lán)色曲線，均值和SD)和來自代表性病毒血患者(紅色 曲線）的血漿獲得的劑量曲線響應(yīng)(0. 〇〇〇 1 %至1 % )。在HD CD4T細(xì)胞的表面上誘導(dǎo)的異常 MMD的數(shù)目。
[0076] 發(fā)明詳述
[0077] 本發(fā)明涉及用于調(diào)控有此需要的受試者中的免疫系統(tǒng)的組合物和方法。更具體 地，本發(fā)明公開了 GIBSPLA2作為免疫應(yīng)答的關(guān)鍵內(nèi)源因子的鑒定，并且提供了基于此因子 的調(diào)控的新治療和診斷方法和組合物。
[0078]本發(fā)明的假設(shè)是感染HIV的患者中的免疫系統(tǒng)的長(zhǎng)期活化是異常的，并且將CD4T 細(xì)胞驅(qū)動(dòng)為活化/分化的異常狀態(tài)，其不響應(yīng)參與控制免疫防御的許多方面和CD4區(qū)室的穩(wěn) 態(tài)的gamma-c細(xì)胞因子，盡管實(shí)際上來自外周區(qū)室的超過99.5 %⑶4T細(xì)胞是未感染的。發(fā)明 人評(píng)估了此假設(shè)，并且本發(fā)明闡明了活化的此異常狀態(tài)的性質(zhì)和重要性。
[0079]更具體地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明證明了可以如下匯總此狀態(tài)的特征：1)在任何刺 激前，感染HIV的病毒血患者(VP)中的所有CD4T細(xì)胞在其表面上擁有許多大MMD，2)這些異 常MMD隔離所有細(xì)胞的IL-7Ralpha和gamma-c鏈，并且3)鏈在異常MMD中的此隔絕改變了它 們誘導(dǎo)功能性信號(hào)體形成的能力，4)導(dǎo)致STAT5磷酸化的減速和降低和5)磷酸-STAT5核輸 入的降低。在VP CD4T淋巴細(xì)胞表面上的預(yù)先存在的MMD的此異常模式具有多種后果，并且 是解釋感染HIV的患者中的免疫缺陷的各種表現(xiàn)的基本機(jī)制。IL-7響應(yīng)性的喪失是部分解 釋了觀察到的CD4淋巴細(xì)胞減少的重要因素。VP中的這些細(xì)胞的持續(xù)喪失（由于其對(duì)凋亡的 敏感性和其被低水平但連續(xù)的病毒增殖的破壞)不能被補(bǔ)償，盡管有升高的IL-7水平。另 外，由于異常MMD隔離非功能性狀態(tài)的所有g(shù)amma-c鏈，這阻斷了此家族中的其它細(xì)胞因子 的功能。
[0080]本發(fā)明進(jìn)一步公開了關(guān)鍵的內(nèi)源因子的鑒定，所述內(nèi)源因子造成感染的受試者中 的免疫系統(tǒng)的此異常狀態(tài)，并且更一般地，造成各種病理生理學(xué)狀況中的免疫應(yīng)答的激烈 調(diào)控。實(shí)際上，顯示了來自VP的血漿樣品含有稱作RIF的活性，其能夠誘導(dǎo)健康供體(HD) CD4T淋巴細(xì)胞的異?；罨?。在檢查的VP的所有血漿樣品中找到RIF。此活性的病理生理學(xué)意 義通過其在HIV控制者(Controller) (HIC)患者中的缺乏得到證明，其中IL-7/IL-7R系統(tǒng)是 正常的，并且免疫活化是有益的。RIF在ART患者的血漿中也是缺乏的，所述ART患者已經(jīng)降 低其免疫活化，修復(fù)IL-7R功能并且恢復(fù)⑶4計(jì)數(shù)>500/mm 3(5)。
[0081 ]如此，RIF代表一種控制免疫應(yīng)答(特別是經(jīng)由調(diào)控⑶4T淋巴細(xì)胞）的主要因素。值 得注意的是，RIF誘導(dǎo)HD CD4T細(xì)胞中的異常活化模式，其與純化的VP CD4T細(xì)胞中離體直接 觀察到的模式不能區(qū)分。本發(fā)明進(jìn)一步顯示了RIF是來自I B組的分泌性磷脂酶A2 ("PLA2GIB"）。本申請(qǐng)中公開的結(jié)果顯示了（i)PLA2GIB的過表達(dá)導(dǎo)致有力的免疫抑制，并且 (ii)抑制PLA2GIB導(dǎo)致免疫功能的明顯增加或刺激。GIBsPLA2抑制劑能夠校正來自受試者 的血漿中的免疫細(xì)胞的不適當(dāng)狀態(tài)，并且因此可以用于治療(例如預(yù)防，校正)哺乳動(dòng)物中 的免疫缺陷或免疫病癥。GIBsPLA2抑制也可以誘導(dǎo)、刺激或幫助維持CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)和功能， 并且由此幫助刺激患者中的有效的免疫應(yīng)答。特別地，在感染HI V的患者中，ART可以被省 下，或者可以被推遲，是要在患者免疫防御和病毒之間達(dá)到的平衡。如果在感染后非常早期 給出ART以與RIF抑制劑組合，如由最近的研究提示，這會(huì)防止免疫系統(tǒng)的任何RIF誘導(dǎo)的變 化。另外，在一些目前的ART失敗的背景中，在延長(zhǎng)的ART后具有低CD4計(jì)數(shù)的患者可以受益 于這些抑制劑。因而，本發(fā)明提供了用于通過調(diào)控受試者中的GIBsPLA2表達(dá)或活性治療受 試者的方法。更具體地，本發(fā)明提供了用于調(diào)控有此需要的受試者中的免疫應(yīng)答的方法，其 包括調(diào)控所述受試者中的GIBsPLA2活性或表達(dá)。
[0082]實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)還證明了受試者的血漿中的RIF的存在指示⑶4T細(xì)胞的HIV-誘導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制狀態(tài)。因而，除了別的之外，本發(fā)明提供了通過檢測(cè)受試者的血漿中的RIF 水平監(jiān)測(cè)和/或診斷受試者中的HIV感染的方法。
[0083]實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了受試者的T細(xì)胞上的膜微域(MMD)的數(shù)目和/或 大小指示CD4T細(xì)胞的HIV-誘導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制狀態(tài)。因而，除了別的之外，本公開還提供了監(jiān)測(cè) 和/或診斷受試者中的HIV感染的方法，其通過測(cè)量受試者的T細(xì)胞上的膜微域(MMD)的數(shù)目 和/或大小進(jìn)行。
[0084]實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)還指示RIF在創(chuàng)建和/或維持感染HIV的受試者中的CD4T細(xì)胞 疾病狀態(tài)的作用。因而，本公開還提供了用于鑒定候選HIV治療劑的方法，其包括在存在藥 劑的情況下測(cè)量RIF誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化。在一些實(shí)施方案中，方法包括比較在存在藥劑的 情況下的RIF誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化水平與在缺乏藥劑的情況下的RIF誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化 水平。
[0085] 定義
[0086] 如對(duì)核酸或蛋白質(zhì)序列應(yīng)用，術(shù)語"序列同一性"指使用標(biāo)準(zhǔn)化算法，諸如Smith-Waterman算法（Smith and Waterman(1981)J Mol Biol 147:195_197)、CLUSTALW (Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680)或BLAST2(Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res 25:3389-3402)比對(duì)至少兩種序列之間的核苷酸或氨基酸殘基 匹配的量化(通常是百分比）?？梢砸詷?biāo)準(zhǔn)化且可重復(fù)的方式使用BLAST2以在序列之一中插 入缺口以優(yōu)化比對(duì)并且實(shí)現(xiàn)它們之間的更有意義的比較。
[0087] 如本文中使用，"治療/處理"指試圖改變治療的個(gè)體的天然過程的臨床干預(yù)，并且 可以為了預(yù)防或治愈目的實(shí)施。期望的治療效果包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減 輕癥狀、疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果的降低、預(yù)防轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展率、改善或減 輕疾病狀態(tài)、和消退或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的組合物和方法延遲疾 病或病癥的形成或者延遲疾病或病癥的進(jìn)展。
[0088] 如本文中使用，術(shù)語"分離的"指從其天然環(huán)境的組分取出，與它們天然聯(lián)合的其 它組分分離或分開，并且至少60 %不含，優(yōu)選75 %不含，且最優(yōu)選90 %不含所述其它組分的 分子(例如核酸或氨基酸）的分子。例如，"分離的"多肽(或蛋白質(zhì))是與其天然環(huán)境的組分 分開，并且優(yōu)選根據(jù)例如電泳(例如SDS-PAGE，等電聚焦（IEF)、毛細(xì)管電泳)或?qū)游?例如離 子交換或反相HPLC)迀移測(cè)定，純化到大于90%或95%純度的多肽。"分離的"核酸指與其天 然的環(huán)境的組分分開和/或在不同構(gòu)建體(例如載體、表達(dá)盒、重組宿主等）中裝配的核酸分 子。
[0089] "編碼抗GIBsPLA2抗體的核酸"指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段）的一個(gè)或多個(gè) 核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的此類核酸分子，和存在于宿主細(xì)胞中的一個(gè) 或多個(gè)位置上的此類核酸分子。
[0090 ] "受試者"指哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括人和非人動(dòng)物，諸如但不限于家養(yǎng)動(dòng) 物(例如牛、山羊、貓、犬和馬）、非人靈長(zhǎng)類(諸如猴）、兔和嚙齒類(例如小鼠和大鼠）。
[0091] "免疫應(yīng)答的調(diào)控"在本發(fā)明的上下文內(nèi)指免疫細(xì)胞，優(yōu)選白細(xì)胞(例如T淋巴細(xì) 胞、B淋巴細(xì)胞、NK、NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞）的量或活性或比率的任何修飾。在一個(gè)具 體的實(shí)施方案中，調(diào)控免疫應(yīng)答包括調(diào)控T淋巴細(xì)胞，優(yōu)選CD4-T淋巴細(xì)胞的量或活性。 [0092] 不應(yīng)狀態(tài)誘導(dǎo)因子(RIF)或磷脂酶A2組IB
[0093] 術(shù)語RIF與磷脂酶A2組IB、GIBsPLA2(或PLA2GIB)可互換使用。磷脂酶A2組IB是一 種具有約15kDa MW和約6.5至約8.0的等電點(diǎn)的分泌性蛋白質(zhì)。
[0094]在本發(fā)明的上下文內(nèi)，術(shù)語"GIBsPLA2"或"磷脂酶A2組IB"指來自任何脊椎動(dòng)物來 源，包括哺乳動(dòng)物，諸如靈長(zhǎng)類（例如人）和嚙齒類（例如小鼠和大鼠）的任何天然的 GIBsPLA2蛋白，除非另有指示。術(shù)語涵蓋"全長(zhǎng)"未加工的GIBsPLA2，以及源自細(xì)胞內(nèi)部或外 部的加工的GIBsPLA2的任何形式。術(shù)語還涵蓋天然存在的GIBsPLA2變體，例如剪接變體或 等位變體。
[0095] 在下文顯示了例示性的GIBsPLA2的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2) 〇MKLLVLAVLL TVAAADSGIS PRAVWQFRKM IKCVIPGSDP FLEYNNYGCY CGLGGSGTPV DELDKCCQTH DNCYDQAKKL DSCKFLLDNP YTHTYSYSCS GSAITCSSKN KECEAFICNC DRNAAICFSK APYNKAHKNL DTKKYCQS
[0096] SEQ ID N0:2的氨基酸1至15(加下劃線）是信號(hào)序列，并且SEQ ID N0:2的氨基酸 16至22(為粗體)是前肽序列。成熟的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2的氨基酸殘基23-148,其是 例示性的經(jīng)加工的人GIBsPLA2蛋白。
[0097] 天然存在的變體包括包含SEQ ID N0: 2的序列，或者SEQ ID N0: 2的氨基酸殘基 23-148的序列的任意蛋白，且具有一個(gè)或幾個(gè)(通常1、2或3)氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸取代、添加和/或缺失，優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè)(通常1、2或3)氨基酸殘基的不超過10個(gè)獨(dú)特的氨 基酸取代、添加和/或缺失。典型的天然存在的變體保留SEQ ID N0:2的生物學(xué)活性。
[0098]在這方面，在一些實(shí)施方案中，GIBsPLA2具有至少一種活性，其選自在來自健康受 試者的CD4T細(xì)胞中誘導(dǎo)膜微域(MMD)的形成，或者使健康受試者的CD4T細(xì)胞對(duì)白介素信號(hào) 傳導(dǎo)不應(yīng)，諸如對(duì)IL-2信號(hào)傳導(dǎo)不應(yīng)或?qū)L-7信號(hào)傳導(dǎo)不應(yīng)。
[0099]在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)MMD的形成包括增加健康受試者的⑶4T細(xì)胞上的MMD數(shù)目 到每個(gè)細(xì)胞至少約80，每個(gè)細(xì)胞至少約80，每個(gè)細(xì)胞至少約90，每個(gè)細(xì)胞至少約100，每個(gè)細(xì) 胞至少約110,或每個(gè)細(xì)胞至少約120。在一個(gè)非限制性的優(yōu)選實(shí)施方案中，誘導(dǎo)MMD的形成 包括增加健康受試者的CD4T細(xì)胞上的MMD數(shù)目到每個(gè)細(xì)胞超過100。
[0100]在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)MMD的形成包括刺激比在其它情況下存在于⑶4T細(xì)胞上 的MMD大的MMD的形成。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)較大的MMD的形成包括刺激具有至少100nm、 至少llOnm、至少120nm、至少130nm、或至少140nm的直徑的MMD的形成。在一個(gè)非限制性的優(yōu) 選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)較大的MMD的形成包括刺激具有大于120nm的直徑的MMD的形成。
[0101] 在一些實(shí)施方案中，使健康受試者的CD4T細(xì)胞對(duì)白介素-7信號(hào)傳導(dǎo)不應(yīng)包括所述 細(xì)胞中的STAT5A和/或B磷酸化降低至少約10 %、至少約20 %、至少約30 %或至少約40 %。在 一些實(shí)施方案中，使健康受試者的CD4T細(xì)胞對(duì)白介素-7信號(hào)傳導(dǎo)不應(yīng)包括將磷酸-STAT5A 和/或磷酸-STAT5B的核轉(zhuǎn)位速率降低至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。
[0102] 可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法測(cè)量GIBSPLA2活性，如實(shí)施例中例示或 后來開發(fā)。可以使用例如配體募集測(cè)定法、免疫測(cè)定法和/或酶促測(cè)定法在血漿樣品，諸如 例如分級(jí)的血漿樣品中測(cè)量GIBsPLA2活性。
[0103] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語GIBSPLA2指人蛋白質(zhì)，特別是包含或具有SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)，或其天然存在的變體。
[0104] 根據(jù)本公開的GIBsPLA2可以是分離的、純化的和/或重組的。在某些實(shí)施方案中， 代替GIBsPLA2蛋白或在GIBsPLA2蛋白外，本發(fā)明可以使用編碼GIBsPLA2的核酸。核酸可以 是DNA或RNA，單鏈或雙鏈。
[0105] 例示性的編碼GIBSPLA2的核酸序列在下文的SEQ ID N0:1中顯示：
[0107] 編碼GIBsPLA2的備選核酸分子包括源自遺傳密碼簡(jiǎn)并性的SEQ ID N0:1的任何變 體，以及在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1雜交，更優(yōu)選與SEQ ID N0;1具有至少80%、85%、 90%、95%或更多序列同一性，并且編碼6四8?1^2蛋白的任何序列。
[0108] 生成GIBSPLA2的方法
[0109] 可以通過任何常規(guī)已知的蛋白質(zhì)表達(dá)方法和純化方法生成GIBsPLA2。例如：（i)用 于合成肽的方法；（ii)用于從活體或培養(yǎng)的細(xì)胞純化和分離它們的方法;或（iii)通過使用 遺傳重組技術(shù)生成它們的方法；以及其組合等等（例如，例如Molecular Cloning (Sambrook，J·，F(xiàn)ritsch，E·F·，Maniatis，T·，Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F(xiàn).M·，John Wiley and Sons，Inc. (1989)中描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)）。
[0110]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于生成GIBsPLA2的方法，其通過在宿主 細(xì)胞中表達(dá)編碼核酸，并且收集或純化GIBsPLA2進(jìn)行。在這方面，本發(fā)明還描述了重組宿主 細(xì)胞，其包含編碼GIBsPLA2的核酸。此類細(xì)胞可以是原核（諸如細(xì)菌）或真核（諸如酵母細(xì) 胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。核酸可以置于任何合適的調(diào)節(jié)序列，諸如啟動(dòng) 子、終止子等的控制下。或者，可以在宿主細(xì)胞在通過內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的位置中中插入 核酸。用于在細(xì)胞中插入核酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。
[0111] GIBSPLA2 調(diào)控
[0112]本發(fā)明提供了新的方法，其包括調(diào)控有此需要的受試者中的GIBSPLA2。術(shù)語"調(diào) 控"指受試者中的GIBsPLA2的水平(例如表達(dá))或活性的任何修飾。還有，調(diào)控指GIBsPLA2的 水平或活性的升高或降低。更優(yōu)選地，調(diào)控指與非調(diào)控的情況相比變化至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。因此，抑制GIBsPLA2指降低至少 10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多6188?1^2水平或活性，以及完全阻斷或抑制 GIBsPLA2水平或活性。相反，刺激GIBsPLA2指提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70 %、80 %或更多GIBsPLA2水平或活性。根據(jù)情況，調(diào)控可以是瞬時(shí)的，持續(xù)的或永久的。還 有，調(diào)控活性包括調(diào)控受試者中，特別是體液中的GIBsPLA2量，調(diào)控蛋白質(zhì)的效能(例如通 過調(diào)控受試者中的輔因子或底物的水平），以及調(diào)控由GIBsPLA2生成的降解產(chǎn)物的水平或 活性。
[0113] GIBsPLA2 抑制
[0114] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制受試者中的GIBsPLA2的組合物 和方法。GIBsPLA2抑制可以通過使用GIBsPLA2抑制劑獲得，即抑制GIBsPLA2表達(dá)或活性的 任何化合物。GIBsPLA2抑制劑包括表達(dá)抑制劑、詰抗劑、隔離劑(sequestrators)、或祀標(biāo)掩 蔽化合物。GIBsPLA2抑制劑的優(yōu)選類型包括GIBsPLA2配體(共價(jià)或非共價(jià)）、抗GIBsPLA2抗 體(或其片段和衍生物）、編碼抗GIBsPLA2抗體(或其片段和衍生物）的核酸、抑制性核酸、 肽、或小藥物、或其組合。或者/另外，GIBsPLA2抑制可以通過針對(duì)GIBsPLA2抗原對(duì)受試者接 種疫苗，使得抗體由需要PLA2-GIB抑制的受試者生成獲得。
[0115] 針對(duì)GIBsPLA2的抗體
[0116] GIBsPLA2抑制劑的具體例子是特異性結(jié)合GIBsPLA2的抗體。
[0117] 抗體可以是合成的、單克隆、或多克隆，并且可以通過本領(lǐng)域中公知的技術(shù)生成。 此類抗體經(jīng)由抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合（與非特異性結(jié)合形成對(duì)比KGIBSPLA2多 肽、片段、變體、融合蛋白等可以在生成與其具有免疫反應(yīng)性的抗體中作為免疫原采用。更 具體地，多肽、片段、變體、融合蛋白等含有引發(fā)抗體形成的抗原決定簇或表位。
[0118] 這些抗原決定簇或表位可以是線性或構(gòu)象的（不連續(xù)的）。線性表位由多肽的氨基 酸的單一部分構(gòu)成，而構(gòu)象或不連續(xù)表位由在蛋白質(zhì)折疊時(shí)變得緊密接近的來自多肽鏈的 不同區(qū)域的氨基酸部分構(gòu)成（C.A.Janeway,Jr.and P.Travers，Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc.，2nd ed.1996))。由于折疊的蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的表面，可用的 表位數(shù)目是相當(dāng)大量的;然而，由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象和位阻，實(shí)際上結(jié)合表位的抗體的數(shù)目小 于可用表位的數(shù)目（C.A.Janeway Jr.and P.Travers，Immuno Biology 2:14(Garland Publishing Inc.，2nd ed. 1996))?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法鑒定表位。多克隆和 單克隆抗體二者都可以通過常規(guī)技術(shù)制備。
[0119] 本發(fā)明的優(yōu)選抗體針對(duì)GIBsPLA2表位，和/或已經(jīng)通過用包含GIBsPLA2表位的多 肽免疫生成，所述GIBsPLA2表位選自：成熟GIBsPLA2蛋白、包含SEQ ID N0:2的至少8個(gè)連續(xù) 氨基酸殘基的GIBsPLA2片段(或SEQ ID如:2的天然變體的相應(yīng)殘基），所述片段包含至少 氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71或其組合。本發(fā)明的優(yōu)選的 抗體結(jié)合SEQ ID NO:2的氨基酸殘基50-71或SEQ ID NO:2的天然變體的相應(yīng)殘基之間包含 的表位。
[0120] 術(shù)語"抗體"意圖包括多克隆抗體、單克隆抗體、其片段，諸如F(ab'）2和Fab片段、 單鏈可變片段(scFv)、單域抗體片段(VHH或納米抗體(Nanobodies))、二價(jià)抗體片段(雙抗 體），以及任何重組和合成生成的結(jié)合配偶體、人抗體或人源化抗體。
[0121] 優(yōu)選地，若抗體以大于或等于約107M-1的Ka結(jié)合GIBsPLA2,則它們限定為特異性 結(jié)合。可以容易地使用常規(guī)技術(shù)，例如那些由Scatchard et al · ,Αηη.Ν. Y.Acad. Sci · ,51: 660( 1949)描述的技術(shù)測(cè)定抗體的親和力。
[0122] 可以使用本領(lǐng)域中公知的規(guī)程容易地從多種來源，例如馬、牛、驢、山羊、綿羊、犬、 雞、兔、小鼠或大鼠生成多克隆抗體。一般地，通常經(jīng)由胃腸外注射，對(duì)宿主動(dòng)物施用適當(dāng)綴 合的純化的GIBsPLA2或基于GIBsPLA2的氨基酸序列的肽?？梢越?jīng)由使用佐劑，例如弗氏完 全或不完全佐劑增強(qiáng)GIBsPLA2的免疫原性。在加強(qiáng)免疫后，收集血清的小樣品，并且測(cè)試對(duì) GIBsPLA2多肽的反應(yīng)性?？捎糜诖祟悳y(cè)定的各種測(cè)定法的例子包括那些記載于 Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中的；以及諸如對(duì)流免疫電泳(CIEP)、放射性免疫測(cè)定法、放射性 免疫沉底、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、點(diǎn)印跡測(cè)定法、和三明治式測(cè)定法的規(guī)程。參見美 國(guó)專利No · 4，376，110和4，486，530。
[0123] 可以使用公知的規(guī)程容易地制備單克隆抗體。參見例如美國(guó)專利No.RE 32,011， 4，902,614,4,543,439和4,411，993;Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses ,Plenum Press，Kennett，McKeam,and Bechtol (eds. ),1980中描述的規(guī)程。
[0124] 例如，以約3周時(shí)間間隔在任選地存在佐劑的情況下用分離的且純化的野生型或 突變體GIBsPLA2蛋白或綴合的GIBsPLA2肽腹膜內(nèi)注射宿主動(dòng)物，諸如小鼠至少一次，且優(yōu) 選至少兩次。然后，通過常規(guī)的點(diǎn)印跡技術(shù)或抗體俘獲(ABC)測(cè)定小鼠血清以測(cè)定哪個(gè)動(dòng)物 是最佳融合的。約2至3周后，對(duì)小鼠給予蛋白質(zhì)或肽的靜脈內(nèi)加強(qiáng)。隨后，處死小鼠，并且遵 循建立的方案將脾細(xì)胞與商品化的骨髓瘤細(xì)胞，諸如Ag8.653(ATCC)融合。簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng) 基中將骨髓瘤細(xì)胞清洗幾次，并且以約3個(gè)脾細(xì)胞與1個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的比率與小鼠脾細(xì)胞融 合。融合劑可以是本領(lǐng)域中使用的任何合適的藥劑，例如聚乙二醇(PEG)。將融合鋪開到含 有培養(yǎng)基的板中，所述培養(yǎng)基容許融合細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。然后，可以容許融合的細(xì)胞生長(zhǎng) 約8天。收集來自所得的雜交瘤的上清液，并且添加到首先用山羊抗小鼠 Ig包被的板。在清 洗后，將標(biāo)記物，諸如經(jīng)標(biāo)記的GIBsPLA2多肽添加到每孔，接著溫育。隨后，可以檢測(cè)陽性 孔?？梢栽诖笈囵B(yǎng)物中培養(yǎng)陽性克隆，隨后在蛋白A柱(Pharmacia)上純化上清液。
[0125]可以使用備選技術(shù)，諸如那些由Alting-Mees et al ·，"Monoclonal Antibody Expression Libraries : A Rapid Alternative to Hybridomas"，Strategies in Molecular Biology 3:1-9( 1990)(其通過提及并入本文)描述的技術(shù)生成本公開的單克隆 抗體。類似地，可以使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建結(jié)合配偶體以摻入編碼特定結(jié)合抗體的基因的可 變區(qū)。此類技術(shù)記載于Larrick et al.，Biotechnology,7:394(1989)。
[0126]本發(fā)明也涵蓋此類抗體的抗原結(jié)合片段(其可以通過常規(guī)的技術(shù)生成）。此類片段 的例子包括但不限于Fab和F(ab'）2片段。還提供了通過遺傳工程技術(shù)生成的抗體片段和衍 生物。
[0127] 本公開的單克隆抗體包括嵌合抗體，例如鼠單克隆抗體的人源化形式。此類人源 化抗體可以通過已知的技術(shù)制備，并且當(dāng)對(duì)人施用抗體時(shí)提供降低的免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，人源化單克隆抗體包含鼠抗體的可變區(qū)（或僅其抗原結(jié)合位點(diǎn)）和源自人 抗體的恒定區(qū)?；蛘撸嗽椿目贵w片段可以包含鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)和源自人 抗體的可變區(qū)片段(缺乏抗原結(jié)合位點(diǎn)）。用于生成嵌合和別的工程化單克隆抗體的規(guī)程包 括那些記載于Riechmann et al.(Nature 332:323，1988)，Liu et al.(PNAS 84:3439， 1987) ，Larrick et al.(Bio/Technology 7: 934,1989)，以及Winter and Harris(TIPS 14:139，May,1993)的。轉(zhuǎn)基因生成抗體的規(guī)程可以參見GB 2，272,440,美國(guó)專利No.5,569， 825和5,545,806。
[0128] 可以使用通過遺傳工程方法生成的抗體，諸如可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生成的 嵌合和人源化單克隆抗體(其包含人和非人部分兩者）。此類嵌合和人源化的單克隆抗體可 以使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)，例如使用記載于Robinson et al. International Publication No.WO 87/02671；Akira,et al.European Patent Application 0184187； Taniguchi,M.,European Patent Application 0171496；Morrison et al.European Patent Application 0173494；Neuberger et al.PCT International Publication 1'1〇.?0 86/01533;〇&13；[117 6七&1.美國(guó)專利1'10.4,816,567;0&13；[117 6七&1上111'0卩6已11 Patent Application 0125023；Better et al.,Science 240:1041 1043,1988；Liu et al.，PNAS 84:3439 3443，1987;Liu et al.，J.Immunol.l39:3521 3526，1987;Sun et al.PNAS 84:214 218,1987；Nishimura et al., Cane . Res .47:999 1005,1987；ffood et al.,Nature 314:446 449,1985；and Shaw et al.,J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559, 1988) ；Morrison,S.L.,Science 229:1202 1207,1985；0i et al.,BioTechniques 4:214, 1986;Winter 美國(guó)專利No.5,225,539;Jones et al·, Nature 321:552 525,1986; Verhoeyan et al·, Science 239:1534,1988;以及 Beidler et al.,J.Immunol.l41:4053 4060,1988的方法通過遺傳工程生成。
[0129] 關(guān)于合成和半合成抗體，此類術(shù)語意圖覆蓋但不限于抗體片段、同種型變換抗體、 人源化抗體(例如小鼠-人，人-小鼠）、雜合物、具有復(fù)數(shù)種特異性的抗體、和完全合成的抗 體樣分子。
[0130] 對(duì)于治療應(yīng)用，具有人恒定區(qū)和可變區(qū)的"人"單克隆抗體經(jīng)常是優(yōu)選的，從而最 小化患者針對(duì)抗體的免疫應(yīng)答。此類抗體可以通過免疫含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物生成。參見Jakobovits et al.Ann NY Acad Sci 764:525-535(1995)。
[0131] 也可以使用從源自受試者的淋巴細(xì)胞的mRNA制備的免疫球蛋白輕鏈和重鏈cDNA 通過構(gòu)建組合免疫球蛋白文庫，諸如Fab噬菌體展示文庫或scFv噬菌體展示文庫制備針對(duì) GIBsPLA2多肽的人單克隆抗體。參見例如McCafferty et al.PCT公開文本W(wǎng)0 92/01047; Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581 597;及Griffths et al.(1993)EMB0 J 12:725 734。另外，可以通過突變已知的人抗體產(chǎn)生抗體可變區(qū)的組合文庫。例如，可以通過例如使 用隨機(jī)改變的誘變的寡核苷酸突變已知結(jié)合GIBsPLA2的人抗體的可變區(qū)以產(chǎn)生突變可變 區(qū)的文庫，然后可以篩選所述文庫以結(jié)合GIBsPLA2。誘導(dǎo)免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的CDR 區(qū)內(nèi)的隨機(jī)誘變的方法，雜交隨機(jī)化的重鏈和輕鏈以形成配對(duì)的方法和篩選方法可以參見 例如Barbas et al.PCT公開文本W(wǎng)O 96/07754;Barbas et al.(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4457 4461。
[0132] 可以通過展示包裝群體(優(yōu)選源自絲狀噬菌體)表達(dá)免疫球蛋白文庫，以形成抗體 展示文庫。特別適合于用于產(chǎn)生抗體展示文庫的方法和試劑的例子可以參見例如Ladner 6七&1.美國(guó)專利如.5,223,409;1(&即6七&1.?(：1'公開文本機(jī)）92/18619 ;0〇￥616七&1.?(^ 公開文本TO 91/17271 ;Winter et al.PCT公開文本TO 92/20791 ;Markland et al.PCT公 開文本TO 92/15679;Breitling et al.PCT公開文本TO 93/01288;McCafferty et al.PCT 公開文本TO 92/01047;Garrard et al.PCT公開文本TO 92/09690;Ladner et al.PCT公開 文本TO 90/02809 ;Fuchs et al .(1991 )Bio/Technology 9:1370 1372 ;Hay et al .(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 85；Huse et al.(1989)Science 246:1275 1281； Griffths et al.(1993)supra；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889 896； Clackson et al.(1991)Nature 352:624 628；Gram et al.(1992)PNAS 89:35763580； Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373 1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133 4137;和Barbas et al.(1991)PNAS 88:79787982。一旦在展示包裝（例如絲 狀噬菌體）的表面上展示，篩選抗體文庫以鑒定和分離表達(dá)結(jié)合GIBsPLA2多肽的抗體的包 裝。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，文庫的初步篩選牽涉用固定化的GIBsPLA2多肽淘選，并且選 擇表達(dá)結(jié)合固定化的G IBsPLA2多肽的抗體的展示包裝。
[0133] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含抗GIBsPLA2抗體(或其片段 或衍生物)和藥學(xué)可接受賦形劑。
[0134] 存在的抗磷脂酶A2-GIB單克隆抗體包括Mab CH-7(Labome)，MAB5018(Labome)， EPR5186(Genetex);LS-C138332(Lifespan)或CABT-17153MH(creative biomart)。多克隆 抗體的例子包括例如來自GeneTex的N1C3。如上文指示，本發(fā)明的優(yōu)選的抗GIBsPLA2抗體結(jié) 合成熟的GIBsPLA2,甚至更優(yōu)選包含氨基酸的GIBsPLA2域內(nèi)包含的表位，所述氨基酸選自 氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71或其組合。本發(fā)明的優(yōu)選抗 體結(jié)合SEQ ID N0:2的氨基酸殘基50-71或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)殘基間包含的表 位。
[0135] 在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及并且使用組合物，其包含編碼抗GIBsPLA2 抗體(或其片段或衍生物)的核酸和藥學(xué)可接受賦形劑。
[0136] 抑制性核酸
[0137] 在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抑制劑是抑制性核酸，即抑制GIBsPLA2基因 或蛋白質(zhì)表達(dá)的任何核酸分子。優(yōu)選的抑制性核酸包括反義核酸、短干擾RNA(siRNA)、小發(fā) 夾RNA(shRNA)、微小RNA、適體、或核酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抑制性核酸是阻止 GIB s P L A 2 m R N A翻譯的小干擾R N A。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抑制性核酸是阻止 GIBsPLA2mRNA翻譯的反義寡核苷酸。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抑制性核酸是阻止 G IBsPLA2mRNA翻譯的小發(fā)夾RNA。
[0138] siRNA包含感興趣的多核苷酸的有義核酸序列和反義核酸序列。構(gòu)建siRNA，使得 單一轉(zhuǎn)錄物(雙鏈RNA)具有來自靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列兩者?？梢允褂每色@自例如 萬維網(wǎng)上的Amb ion網(wǎng)址的s iRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)s iRNA的核苷酸序列。
[0139] 在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸或siRNA的長(zhǎng)度小于或等于10個(gè)核苷酸。在一些 實(shí)施方案中，反義寡核苷酸或siRNA的長(zhǎng)度與天然存在的轉(zhuǎn)錄物一樣長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案 中，反義寡核苷酸或siRNA具有18-30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸和siRNA 的長(zhǎng)度小于25個(gè)核苷酸。
[0140] 優(yōu)選的抑制性核酸分子包含具有與GIBsPLA2基因或RNA的區(qū)域完全互補(bǔ)的核苷酸 序列的域。此類域通常含有4至20個(gè)核苷酸，容許特異性雜交和基因轉(zhuǎn)錄或RNA翻譯的最佳 抑制。抑制性核酸的序列可以直接源自編碼GIBsPLA2的基因的序列，諸如SEQIDN0:1?；?者/另外，抑制性核酸可以與GIBsPLA2基因或RNA中的調(diào)節(jié)元件，諸如啟動(dòng)子，剪接位點(diǎn)等雜 交，并且防止其有效調(diào)節(jié)。
[0141]本發(fā)明的抑制性核酸分子的具體例子包括分離的單鏈核酸分子，其由SEQ ID N0: 1的10至50個(gè)連續(xù)的核苷酸組成。本發(fā)明的抑制性核酸分子的具體例子是反義核酸，其由以 下核苷酸序列或其完全互補(bǔ)鏈組成：
[0152] 肽和小藥物
[0153] 在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抑制劑是抑制GIBsPLA2活性的肽或小藥物。 肽或小藥物通常是選擇性結(jié)合GIBsPLA2的分子，或GIBsPLA2的底物，或GIBsPLA2的輔因子， 或GIBsPLA2途徑的降解產(chǎn)物或代謝物。
[0154] 優(yōu)選地，肽含有3至20個(gè)氨基酸殘基，并且其序列可以與GIBsPLA2域(誘餌肽)或者 GIBsPLA2底物、輔因子、降解產(chǎn)物或代謝物的域相同。本發(fā)明的優(yōu)選的肽含有SEQ ID N0: 2 (或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)序列）的4至30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。本發(fā)明的最優(yōu)選的肽 包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)序列）的5至25個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基， 并且進(jìn)一步包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)序列）的以下氨基酸殘基 的至少一個(gè):氨基酸7〇、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71或其組合。本 發(fā)明的肽的具體例子是包含以下序列之任一的小于25個(gè)氨基酸的肽：
[0164] 本發(fā)明的肽可以包含肽、非肽和/或經(jīng)修飾的肽鍵。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，肽 包含至少一個(gè)肽模擬鍵(peptidomimetic bond)，其選自亞甲基(-CH2-)或磷酸根(_P〇2_)基 團(tuán)、仲胺(-順-)或氧(-0-)、3]^1^-氮雜肽(323口6口1^(168)、3]^1^-經(jīng)基肽、1'|-經(jīng)基肽、氨基膦 酸酯（phosphonamidates)、縮酸酸肽（depsipeptides)、羥基亞甲基（hydroxymethylenes)、 羥基乙?。╤ydroxyethylenes)、二羥基乙?。╠ihydroxyethylenes)、羥基乙胺 (hydroxyethylamines)、逆反式肽（retro-inverso peptides)、亞甲基氧基 (methyleneoxy)、酮亞甲基（cetomethylene)、酯、次膦酸鹽（phosphinates)、次膦酸 (phosphinics)或膦酸酰胺(phosphonamides)的插入。還有，肽可以包含經(jīng)保護(hù)的N端和/或 C端官能，例如通過?；?，和/或酰胺化和/或酯化。
[0165] 可以通過本領(lǐng)域中本身已知的技術(shù)，諸如化學(xué)、生物學(xué)和/或遺傳合成生成本發(fā)明 的肽。
[0166] 分離形式的這些肽中的每種代表本發(fā)明的一個(gè)具體目的。
[0167] 優(yōu)選的小藥物是選擇性結(jié)合GIBsPLA2的烴化合物。
[0168] 優(yōu)選地，通過方法可獲得小藥物和肽，所述方法包括：（i)使測(cè)試化合物與 GIBsPLA2或其片段接觸，（ii)選擇結(jié)合GIBsPLA2或所述其片段的測(cè)試化合物，并且（iii)選 擇抑制GIBsPLA2活性的（ii)的化合物。此類方法代表本發(fā)明的一個(gè)具體的目的。
[0169] 優(yōu)選地，通過方法可獲得小藥物和肽，所述方法包括：（i)使測(cè)試化合物與 GIBsPLA2底物、輔因子或降解產(chǎn)物，或其片段接觸，（ii)選擇結(jié)合所述GIBsPLA2底物、輔因 子或降解產(chǎn)物，或其片段的測(cè)試化合物，并且（i i i)選擇抑制GIBsPLA2活性的（i i)的化合 物。此類方法代表本發(fā)明的一個(gè)具體的目的。
[0170] GIBsPLA2可溶性受體
[0171] 在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抑制劑是GIBsPLA2受體的可溶性形式。此類 可溶性受體化合物能夠結(jié)合GIBsPLA2,從而通過起誘餌或掩蔽劑作用抑制其活性。
[0172] 此類抑制劑的一個(gè)具體實(shí)施方案是人或鼠 GIBsPLA2受體，或其GIBsPLA2結(jié)合片段 的可溶性形式。
[0173] 分別在SEQ ID N0:22和23中描述了鼠和人可溶性受體的氨基酸序列。因此，術(shù)語 可溶性受體涵蓋包含SEQ ID N0:22或23序列的整個(gè)或片段的任何GIBsPLA2結(jié)合多肽。
[0174] GIBsPLA2結(jié)合片段指特異性結(jié)合PLA2GIB的此類多肽的任何片段，其包含優(yōu)選至 少5個(gè)其連續(xù)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少8、10或12。受體分子的特異性結(jié)合指示受體分子比對(duì) PLA2-IIA或IID以更高的親和力（例如至少5倍)結(jié)合PLA2GIB。最優(yōu)選地，如上文定義的片段 包含小于50個(gè)氨基酸殘基。
[0175] GIBsPLA2結(jié)合多肽的例子不限于包含以下氨基酸序列中的任一種的多肽：
[0184] SEQIDN0:24-26源自人可溶性PLA2GIB受體的序列，而SEQIDN0:27-31源自鼠 可溶性PLA2GIB受體的序列。
[0185]疫苗接種
[0186] 在一個(gè)備選(或累積)的實(shí)施方案中，通過用GIBSPLA2抗原接種(或免疫)受試者獲 得受試者中的GIBsPLA2的抑制。由于此類疫苗接種或免疫，受試者產(chǎn)生抑制GIBsPLA2的抗 體(或細(xì)胞）。具體地，GIBsPLA2抗原(例如免疫原性GIBsPLA2,其基本上無生物學(xué)活性)的注 射可以在治療的受試者中產(chǎn)生抗體。這些抗體會(huì)針對(duì)過量的GIBsPLA2表達(dá)提供保護(hù)，并且 可以作為免疫療法或疫苗預(yù)防使用。
[0187] 如此，本發(fā)明的目的在于對(duì)受試者接種疫苗的方法，其包括對(duì)受試者施用 GIBsPLA2 抗原。
[0188] 本發(fā)明的又一個(gè)目的涉及GIBSPLA2抗原，用于對(duì)有此需要的受試者接種疫苗的用 途。
[0189]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于疫苗接種的GIBsPLA2抗原是失活的免疫原性分 子，所述失活的免疫原性分子誘導(dǎo)受試者中針對(duì)GIBsPLA2的免疫應(yīng)答?？梢岳缤ㄟ^化學(xué) 或物理改變GIBsPLA2或通過突變或截短蛋白質(zhì)，或者這兩種方式獲得失活;并且可以由于 失活和/或通過進(jìn)一步綴合蛋白質(zhì)與合適的載體或半抗原，諸如KLH、HAS、聚組氨酸、病毒變 性毒素(anatoxin)等，和/或通過聚合等獲得免疫原性。如此，可以化學(xué)或物理修飾抗原，例 如以改善其免疫原性。
[0190] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GIBsPLA2抗原包含GIBsPLA2或其含有表位的 片段或模擬位。
[0191] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含全長(zhǎng)GIBsPLA2蛋白。在又一個(gè)具體 的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含含有SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)，或與SEQ ID N0:2具有至少 90%同一性的序列。
[0192] 在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含GIBsPLA2蛋白的片段，該片段包含 至少6個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基并且含有免疫原性表位，或者其模擬物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，GIBsPLA2抗原包含至少6至20個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的優(yōu)選的肽含有SEQ ID N0:2(或 SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)的序列）的4至30個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。本發(fā)明的最優(yōu)選的 肽包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)的序列）的5至25個(gè)連續(xù)的氨基酸殘 基，并且進(jìn)一步包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)的序列）的以下氨基酸 殘基的至少一個(gè):氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71、或其組 合。本發(fā)明的肽的具體例子是包含以下序列之任一的小于50個(gè)氨基酸的肽：
[0202] GIBsPLA2抗原可以為各種形式，諸如為游離形式、聚合、化學(xué)或物理修飾，和/或與 載體分子偶聯(lián)（即連接）。與載體的偶聯(lián)可以提高免疫原性，并且(進(jìn)一步)抑制GIBsPLA2多 肽的生物學(xué)活性。在這方面，載體分子可以是免疫學(xué)中常規(guī)使用的任何載體分子或蛋白質(zhì)， 諸如例如KLH(鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白）、卵清蛋白、牛血清清蛋白（BSA)、病毒或細(xì)菌變性毒素， 諸如類毒素 tetanos、類毒素白喉B霍亂毒素、其突變體，諸如白喉毒素 CRM 197、外膜泡囊蛋 白、聚賴氨酸分子、或病毒樣顆粒(VLP)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體是KLH或CRM197或 VLP〇
[0203] 可以通過使用連接化學(xué)基團(tuán)或反應(yīng)，諸如例如戊二醛、生物素等的共價(jià)化學(xué)實(shí)施 GIBsPLA2與載體的偶聯(lián)。優(yōu)選地，綴合物或GIBsPLA2蛋白或片段或模擬位進(jìn)行用甲醛處理 以完成GIBsPLA2的失活。
[0204]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含全長(zhǎng)GIBsPLA2蛋白，任選與載體蛋 白偶聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含與載體蛋白偶聯(lián)的含有SEQ ID N0:2 的蛋白質(zhì)，或者與SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的序列。
[0205]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含GIBsPLA2的免疫原性肽或模擬 位，任選地與載體蛋白偶聯(lián)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，GIBsPLA2抗原包含長(zhǎng)至少10個(gè)氨 基酸的多肽，其包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然變體的相應(yīng)的序列）的以下氨基酸 殘基的至少一個(gè):氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71、或其組 合，任選地與載體分子偶聯(lián)。
[0206]可以通過各種方法，諸如通過植入有人免疫細(xì)胞的非人動(dòng)物的免疫，接著驗(yàn)證抗 體的存在，或者通過使用人或人源化抗體的三明治式ELISA測(cè)試GIBsPLA2抗原的免疫原性。 可以通過本申請(qǐng)中描述的任何活性測(cè)試驗(yàn)證生物學(xué)活性的缺乏。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，GIBsPLA2抗原在（i)誘導(dǎo)⑶4T細(xì)胞中的膜微域(MMD)形成或（ii)使⑶4T細(xì)胞對(duì)IL-2信號(hào) 傳導(dǎo)不應(yīng)或?qū)L-7信號(hào)傳導(dǎo)不應(yīng)的體外方法中具有野生型GIBsPLA2蛋白的活性的小于 20%，更優(yōu)選小于15%、10%、5%或甚至1 %。
[0207]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及失活的且免疫原性的GIBsPLA2。
[0208]在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與載體分子，優(yōu)選與KLH綴合的GIBsPLA2 蛋白或其片段或模擬位。
[0209]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及疫苗，其包含GIBsPLA2抗原、合適的賦形劑、和任選 地合適的佐劑。
[0210] 此類分子和綴合物和疫苗代表有力的藥劑，用于免疫受試者，從而引起持續(xù)的 GIBsPLA2抑制。在重復(fù)后，此類方法可以用于引起永久的GIBsPLA2抑制。
[0211] 本發(fā)明的又一個(gè)目的涉及用于誘導(dǎo)抗體的生成的方法，所述抗體中和有此需要的 受試者中的內(nèi)源GIBsPLA2的活性，所述方法包括對(duì)所述受試者施用治療有效量的GIBsPLA2 抗原或疫苗。
[0212]可以通過任何合適的路徑，諸如通過注射，優(yōu)選肌肉內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)或動(dòng)脈 內(nèi)；通過鼻、口服、粘膜或直腸施用來施用本發(fā)明的抗原或疫苗。
[0213] GIBsPLA2抗原或疫苗可以用于治療與GIBsPLA2的過度生成相關(guān)聯(lián)的任何疾病。更 具體地，本發(fā)明涉及用于治療有此需要的受試者中的與GIBsPLA2的過度生成相關(guān)聯(lián)的疾病 的方法，其包括對(duì)受試者施用治療有效量GIBsPLA2抗原或包含GIBsPLA2抗原的疫苗組合 物。
[0214] GIBsPLA2激動(dòng)劑或活化劑
[0215] 術(shù)語GIBsPLA2"激動(dòng)劑"在本發(fā)明的上下文內(nèi)涵蓋具有、或介導(dǎo)或上調(diào)GIBsPLA2活 性的任何物質(zhì)，諸如但不限于肽、多肽、重組蛋白、綴合物、天然或人工配體、降解產(chǎn)物、同源 物、核酸、DNA、RNA、適體等，或其組合。術(shù)語"激動(dòng)劑"涵蓋完全和部分激動(dòng)劑兩者。GIBsPLA2 激動(dòng)劑的一個(gè)具體的例子是GIBsPLA2蛋白或編碼GIBsPLA2蛋白的核酸。
[0216] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于抑制受試者中的免疫應(yīng)答的方法，其 包括對(duì)受試者施用GIBsPLA2蛋白或編碼GIBsPLA2蛋白的核酸。
[0217] 組合物
[0218]本發(fā)明還涉及組合物，其包含如本文中描述為活性成分的GIBsPLA2調(diào)控劑或抗 原，和優(yōu)選地藥學(xué)可接受載體。
[0219] "藥物組合物"指本發(fā)明的化合物(活性成分)和本領(lǐng)域中公認(rèn)用于遞送生物學(xué)活 性化合物到有此需要的受試者的介質(zhì)的配制劑。因此，此類載體包括所有藥學(xué)可接受載體、 稀釋劑、介質(zhì)或支持物?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的藥學(xué)實(shí)踐對(duì)受試者提供合適的配制劑或組合物，例 如以單位劑量形式。
[0220] 根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物可以配制為軟膏劑、凝膠、糊劑、液體溶液、懸浮液、 片劑、明膠膠囊、膠囊、栓劑、粉末、滴鼻劑或氣霧劑的形式，優(yōu)選為可注射溶液或懸浮液的 形式。對(duì)于注射，化合物一般以液體懸浮液的形式包裝，所述液體懸浮液可以經(jīng)由例如注射 器或灌注注射。在這點(diǎn)上，化合物一般溶解于與藥學(xué)用途相容并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的鹽水、生理、等張或緩沖的溶液中。如此，組合物可以含有一種或多種藥劑或賦形劑其 選自分散劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等。值得注意地，可以在液體和/或可注射配制劑中使 用的藥劑或賦形劑是甲基纖維素、羥甲基纖維素、羧甲基纖維素 、Polysorbate 80、甘露醇、 明膠、乳糖、植物油、阿拉伯膠等。例如，載體也可以選自甲基-beta-環(huán)糊精、丙烯酸的聚合 物(如聚羧乙烯(carbopol))、聚乙二醇和聚丙二醇的混合物、單乙醇胺和羥甲基纖維素。
[0221] 組合物一般包含有效量的本發(fā)明的化合物，例如有效調(diào)控GI BsPLA2的量。一般地， 根據(jù)本發(fā)明的組合物包含約lyg至l〇〇〇mg GIBsPLA2調(diào)控劑，諸如0.001-0.01，0.01-0.1， 0.05-100,0.05-10,0.05-5,0.05-1,0.1-100,0.1-1.0,0.1-5,1.0-10,5-10,10-20,20-50 和 50-100mg，例如 0.05-100mg，優(yōu)選 0.05-5mg，例如 0·05,0·1，0·2,0·3,0·4,0·5，1，2,3,4或 5mg。技術(shù)人員可以根據(jù)調(diào)控劑和疾病調(diào)節(jié)劑量。
[0222] 本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種別的活性化合物，用于同時(shí)或序貫使 用。
[0223] 本發(fā)明還涉及用于制備藥物組合物的方法，其包括混合如先前描述的GIBsPLA2調(diào) 控劑和藥學(xué)可接受賦形劑，并且在任何合適的形式或容器(注射器、安瓿、燒瓶、瓶、小袋等） 中配制組合物。
[0224]本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含（i)包含如先前描述的GIBsPLA2調(diào)控劑的組合物， (ii)至少一個(gè)容器，和任選地(iii)關(guān)于使用試劑盒的書面用法說明。
[0225] 疾病
[0226] 可以使用本發(fā)明的化合物和組合物治療與不適當(dāng)（例如缺乏或不正確）的免疫應(yīng) 答，特別是與不適當(dāng)?shù)腃D4T細(xì)胞活性相關(guān)的任何疾病，以及增加的免疫可以改善受試者狀 況的任何疾病。這些疾病在本申請(qǐng)中有時(shí)稱為"免疫病癥"。這包括免疫缺陷的情況(例如由 病毒感染，病原性感染，癌癥等引起）、自身免疫性疾病、移植物、糖尿病、炎性疾病、癌癥、變 態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀肩病、蕁麻疹、濕疹等。
[0227] 免疫缺陷和關(guān)聯(lián)的病癥
[0228]在第一個(gè)方面中，本發(fā)明基于抑制受試者中的GIBsPLA2,從而提高或恢復(fù)免疫活 性，特別是CD4-T細(xì)胞介導(dǎo)的活性。
[0229] 因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于刺激有此需要的受試者中的免 疫應(yīng)答的方法，其包括抑制所述受試者中的GIBsPLA2。
[0230] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于調(diào)控有此需要的受試者中的白細(xì)胞的 方法，其包括抑制所述受試者中的GIBsPLA2。
[0231]可以受益于GlBsPLA2抑制劑的疾病的例子可以是所有具有免疫缺陷，諸如HIV介 導(dǎo)的免疫缺陷的疾病。在這方面，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療有此需要 的受試者中的免疫缺陷或關(guān)聯(lián)的病癥的方法，其包括抑制所述受試者中的GIBsPLA2。
[0232] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及GIBsPLA2抑制劑，用于治療有此需要的 受試者中的免疫缺陷或關(guān)聯(lián)的病癥的用途。
[0233] 免疫缺陷和關(guān)聯(lián)的病癥指由受試者中的降低的免疫功能或應(yīng)答為特征和/或引起 的任何狀況或病理學(xué)。免疫缺陷可以由例如病毒性感染(例如HIV、乙肝等）、細(xì)菌性感染、癌 癥、或其它病理學(xué)狀況引起。因此，術(shù)語"免疫缺陷關(guān)聯(lián)的病癥"指由免疫缺陷引起或與免疫 缺陷有關(guān)的任何疾病。本發(fā)明特別適合于治療與CD4-T細(xì)胞相關(guān)的免疫缺陷和關(guān)聯(lián)的疾病。 本申請(qǐng)實(shí)際上證明了 GIBsPLA2的生物學(xué)效果參與⑶4T細(xì)胞疾病狀態(tài)。因而，阻斷GIBsPLA2 的活性在對(duì)引起免疫缺陷的細(xì)胞因子具有改變的響應(yīng)的受試者中具有治療益處，如經(jīng)常在 感染HIV的患者中觀察到。
[0234] 因而，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療受試者中的HIV感染的方法，其 通過抑制受試者中的GIBsPLA2,優(yōu)選通過對(duì)受試者施用GIBsPLA2抑制劑或疫苗進(jìn)行。在一 些實(shí)施方案中，受試者是早期HIV患者，并且方法導(dǎo)致提高患者為HIV控制者的可能性。在一 些實(shí)施方案中，受試者是用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后具有低免疫重建和/或具有嚴(yán)重特發(fā)性 CD4T淋巴細(xì)胞減少（ICL)的患者。本發(fā)明還涉及用于提高感染HIV的受試者中的CD4-T細(xì)胞 活性的方法，其通過抑制受試者中的GIBsPLA2,優(yōu)選通過對(duì)受試者施用GIBsPLA2抑制劑或 疫苗進(jìn)行。
[0235] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療受試者中的急性和/或慢性炎癥和源自炎 性反應(yīng)的突起（processus)的方法，其通過直接或與抗炎藥物聯(lián)合在受試者中注射 GIBsPLA2 進(jìn)行。
[0236] 本發(fā)明還提供了通過提高受試者中的免疫應(yīng)答治療癌癥的方法，其包括抑制受試 者中的GIBsPLA2,優(yōu)選通過對(duì)受試者施用GIBsPLA2抑制劑或疫苗進(jìn)行。本發(fā)明還提供了治 療受試者中與癌癥有關(guān)的CD4T細(xì)胞關(guān)聯(lián)免疫缺陷的方法，其通過抑制受試者中的 GIBsPLA2,優(yōu)選通過對(duì)受試者施用GIBsPLA2抑制劑或疫苗進(jìn)行。
[0237] 病理學(xué)免疫應(yīng)答和關(guān)聯(lián)疾病
[0238]可以使用本發(fā)明治療與不適當(dāng)（例如病理性或不正確）的免疫應(yīng)答或與免疫系統(tǒng) 的不想要的（超)活性或(超)活化，特別是與不適當(dāng)?shù)腃D4T細(xì)胞活性相關(guān)的任何疾病。這些 疾病包括例如自身免疫性疾病、移植物、糖尿病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀肩病、蕁麻疹、濕疹等。 [0239]如此，在又一個(gè)方面中，本發(fā)明基于活化或誘導(dǎo)受試者中的GIBsPLA2,從而抑制免 疫活性，特別是CD4-T細(xì)胞介導(dǎo)的活性。
[0240]因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制有此需要的受試者中的免疫應(yīng) 答的方法，其包括誘導(dǎo)或活化所述受試者中的GIBsPLA2。
[0241] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于抑制有此需要的受試者中的白細(xì)胞的 方法，其包括抑制所述受試者中的GIBsPLA2。
[0242] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療有此需要的受試者中的由不想 要的免疫應(yīng)答引起的病癥的方法，其包括誘導(dǎo)或活化所述受試者中的GIBsPLA2。
[0243] 優(yōu)選地，誘導(dǎo)或活化受試者中的GIBsPLA2包括對(duì)受試者施用GIBsPLA2激動(dòng)劑，例 如GIBsPLA2蛋白或其功能片段。
[0244] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及GIBsPLA2激動(dòng)劑或活化劑，用于治療有 此需要的受試者中的由不想要的免疫應(yīng)答引起的病癥的用途。
[0245] 可以受益于GlBsPLA2激動(dòng)劑的疾病的例子是自身免疫性病癥、癌癥、病毒性疾病、 細(xì)菌性感染等。
[0246] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療有此需要的受試者中的自身免疫 性病癥的方法，其包括刺激或誘導(dǎo)所述受試者中的GIBsPLA2。
[0247] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物或組合物，在治療有此 需要的受試者中的自身免疫性病癥中的用途。
[0248] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療有此需要的受試者中的癌癥的方 法，其包括刺激或誘導(dǎo)所述受試者中的GIBsPLA2。
[0249] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物或組合物，在治療有此 需要的受試者中的癌癥中的用途。
[0250]本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及用于治療(例如降低或預(yù)防或抑制）移植物 排斥，或者用于治療移植受試者中的移植物抗移植物疾病的方法，其包括刺激或誘導(dǎo)所述 受試者中的GIBsPLA2。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于改善受試者中的同種移植物耐受性的方 法，其包括刺激或誘導(dǎo)所述受試者中的GIBsPLA2。
[0251] 抗微生物活性
[0252] 在又一個(gè)方面中，本申請(qǐng)還提供了使用GIBsPLA2殺死微生物的方法。通過直接對(duì) 膜起作用，GIBsPLA2可以破壞或殺死細(xì)菌、包膜病毒、寄生物等。
[0253] 在急性感染中或在感染中，可以單獨(dú)或與抗生素、抗病毒、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗寄生 物藥物聯(lián)合使用GIBsPLA2。在對(duì)已知的抗微生物藥物有抗性的微生物的情況中，GlBsPLA2 可以代表一種備選療法。它可以在非常短期的治療中使用，例如在非常危險(xiǎn)且急性的臨床 情況中。
[0254] 可以受益于根據(jù)本發(fā)明的通過GlBsPLA2的治療的疾病的具體例子是是具有免疫 系統(tǒng)的超活性的所有臨床情況或慢性炎癥，諸如多發(fā)性硬化，重癥肌無力，自身免疫性神經(jīng) 病，如Gui 1 lain-Barrg，自身免疫性葡萄膜炎，葡萄膜炎，自身免疫性溶血性貧血，惡性貧 血，自身免疫性血小板減少癥，顳動(dòng)脈炎，抗磷脂綜合征，血管炎如韋格納肉芽腫病，貝切特 氏病，動(dòng)脈粥樣硬化，銀肩病，皰疹樣皮炎，尋常型天皰瘡，白癜風(fēng)，尋常型天皰瘡，蕈樣肉芽 月中，過敏性接觸性皮炎，異位性皮炎，扁平苔蘚，PLEVA，濕疹，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，原發(fā) 性膽汁性肝硬化，自身免疫性肝炎，1型糖尿病，阿狄森氏病，格雷夫斯(Grave)氏病，橋本 (Hashimoto)氏甲狀腺炎，自身免疫性卵巢炎和睪丸炎，自身免疫性甲狀腺炎，類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，硬皮病，多發(fā)性肌炎，皮肌炎，脊柱關(guān)節(jié)病如強(qiáng)直性脊柱炎，或干燥 綜合征（Sjogren's Syndrome)。
[0255] 可以根據(jù)受試者和疾病改編施用本發(fā)明的化合物或組合物的持續(xù)時(shí)間、劑量和頻 率。可以單獨(dú)或與其它活性成分聯(lián)合同時(shí)或分開或序貫使用治療。
[0256] 可以以各種方式或路徑，諸如但不限于系統(tǒng)注射、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮膚、 皮下、真皮、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、眼（例如角膜)或直腸方式，或者通過在炎性部位上表面施用，并且 優(yōu)選通過肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射施用根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物。
[0257] 典型的方案包括在一天或幾天，直至一年，并且包括一周和約6個(gè)月之間的時(shí)段里 單一或重復(fù)施用有效量的GIBsPLA2調(diào)控劑。應(yīng)當(dāng)理解，體內(nèi)施用的本發(fā)明的藥物化合物或 組合物的劑量將取決于接受者(受試者）的年齡、健康、性別和重量、并行治療(若有的話)的 種類、治療頻率、和期望的藥學(xué)效果的性質(zhì)。本文中提供的有效劑量的范圍并不意圖為限制 性的，并且代表有效的劑量范圍。然而，將針對(duì)個(gè)別的受試者修改最有效的劑量，如相關(guān)領(lǐng) 域的技術(shù)人員理解并且確定（參見例如Berkowet et al.，eds.，The Merck Manual ,16th edition,Merck and Co·，Rahway，N.J·，1992;Goodmanetna·，eds·，Goodman和Cilman's The pharmacological Basis of Therapeutics ,10th edition,Pergamon Press , Inc., Elmsford，N.Y.，（2001))〇
[0258] 診斷
[0259]本發(fā)明還提供了基于檢測(cè)來自受試者的樣品中GIBsPLA2的存在或量或缺乏檢測(cè) 受試者中的免疫缺陷的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中本身已知的多種檢測(cè)技術(shù)或平臺(tái)，諸如但 不限于俘獲測(cè)定法、三明治式測(cè)定法、競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法、放射性免疫測(cè)定法、產(chǎn)生有色、熒光、化 學(xué)發(fā)光、或電化學(xué)活性產(chǎn)物的酶標(biāo)記物與底物、熒光、熒光極化、化學(xué)發(fā)光、光學(xué)和比色、電 化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光、表面等離振子共振、隱失波、多孔板(ELISA)、個(gè)別的測(cè)定法、多重 測(cè)定法、膠乳珠-多重測(cè)定法、微陣列(Laminar表面)-多重測(cè)定法、玻璃、基于板的測(cè)定法或 基于條的測(cè)定法實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0260]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，方法包括測(cè)定GIBsPLA2基因、RNA或蛋白質(zhì)中的多態(tài)性 的存在或量或缺乏。我們的結(jié)果顯示了 GIBsPLA2易受高多態(tài)性，并且這與受試者的生理學(xué) 狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。如此，本發(fā)明包括(i)測(cè)定GIBsPLA2的特定多態(tài)性同等型的存在或量或缺乏， 和/或（ii)測(cè)定受試者中的GIBsPLA2多態(tài)性的全局比率，所述數(shù)據(jù)與受試者的生理學(xué)狀態(tài) 相關(guān)聯(lián)。具體地，特定的同等型可以是如上文描述的病癥在受試者中的素因、存在或發(fā)作特 征性的。此類測(cè)定也可以用于個(gè)體化的藥物，以調(diào)整治療。
[0261] 監(jiān)測(cè)和/或診斷與CD4T細(xì)胞缺陷有關(guān)的免疫缺陷的方法，其包括檢測(cè)GIBsPLA2
[0262] 本公開提供了監(jiān)測(cè)和/或診斷受試者中的與CD4T細(xì)胞缺陷有關(guān)的免疫缺陷，特別 是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括(a)提供含有來自受試 者的體液，優(yōu)選血漿的樣品，并且(b)檢測(cè)高于閾值的樣品中的GIBsPLA2水平?？梢酝ㄟ^本 領(lǐng)域中已知的任何方法，諸如例如通過包括酶促測(cè)定法、配體俘獲測(cè)定法和/或免疫測(cè)定法 的方法檢測(cè)樣品中的GIBsPLA2的存在。
[0263] 在一些實(shí)施方案中，方法包括獲得包含來自受試者的血漿的樣品，并且測(cè)定血漿 是否具有至少一種選自下組的活性：誘導(dǎo)來自健康受試者的CD4T細(xì)胞中的異常膜微域 (MMD)的形成和使健康受試者的CD4T細(xì)胞對(duì)白介素（IL-7)信號(hào)傳導(dǎo)不應(yīng)。若來自受試者的 血漿包含此類活性，則在一些實(shí)施方案中，受試者確定為具有CD4T細(xì)胞關(guān)聯(lián)的免疫缺陷，如 經(jīng)常但不僅在感染HIV的患者中觀察到的。若血漿級(jí)份不含此類活性，則在一些實(shí)施方案 中，受試者確定為具有對(duì)與T CD4細(xì)胞至細(xì)胞因子調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)的變化有關(guān)的免疫缺陷的低暴 露。
[0264] 在一些實(shí)施方案中，受試者確定為具有HIV感染。比較而言，若蛋白質(zhì)級(jí)份不包含 此類活性，則在一些實(shí)施方案中，受試者確定為沒有與如本文中公開的與CD4T細(xì)胞缺陷有 關(guān)的免疫缺陷。在一些實(shí)施方案中，受試者確定為沒有HIV感染。
[0265] 在一些實(shí)施方案中，方法包括使包含來自受試者的體液，優(yōu)選血漿的樣品與對(duì) GIBsPLA2特異性的抗體接觸，并且測(cè)定免疫學(xué)反應(yīng)的存在或缺乏。在一些實(shí)施方案中，通過 包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)的方法測(cè)定免疫學(xué)反應(yīng)的存在或缺乏。對(duì)GIBsPLA2特異 性的抗體和樣品之間的免疫學(xué)反應(yīng)的存在指示樣品中的GIBsPLA2的存在，這繼而指示受試 者具有與CD4T細(xì)胞缺陷有關(guān)的免疫缺陷。在一些實(shí)施方案中，受試者確定為具有HIV感染。 比較而言，對(duì)GIBsPLA2特異性的抗體和樣品之間的免疫學(xué)反應(yīng)的缺乏指示受試者沒有與如 本文中公開的與CD4T細(xì)胞缺陷有關(guān)的免疫缺陷。在一些實(shí)施方案中，受試者確定為沒有HIV 感染。
[0266] 在一些實(shí)施方案中，用于樣品中的GIBsPLA2存在的測(cè)定法是定性的。在一些實(shí)施 方案中，用于樣品中的GIBsPLA2存在的測(cè)定法是定量的。
[0267] 在一些實(shí)施方案中，方法包括比較測(cè)定法的結(jié)果與對(duì)照樣品的相似測(cè)定法的結(jié) 果，所述對(duì)照樣品包含沒有與CD4T細(xì)胞缺陷有關(guān)的免疫缺陷的受試者的血漿。在一些實(shí)施 方案中，方法包括比較測(cè)定法的結(jié)果與包含較早收獲的同一名受試者的血漿的樣品的相似 測(cè)定法的結(jié)果。
[0268] 監(jiān)測(cè)和/或診斷與CD4T細(xì)胞改變有關(guān)的免疫缺陷的方法，包括表征CD4T細(xì)胞上的 膜微域
[0269] 實(shí)施例中的數(shù)據(jù)證明了感染HIV的患者呈現(xiàn)⑶4T細(xì)胞表面上的獨(dú)特膜微域(MMD) 的形成，盡管非常少的細(xì)胞真正被HIV感染。因而，本公開還提供了用于診斷受試者中的與 CD4T細(xì)胞改變有關(guān)的免疫缺陷，諸如例如由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的免疫缺陷的 方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括：（a)從受試者分離⑶4T淋巴細(xì)胞，并且(b)測(cè)量T細(xì)胞上 的膜微域(MMD)的數(shù)目和/或大小。在一些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括下列至少一項(xiàng)：（c) 測(cè)量T細(xì)胞中的磷酸-STAT5的量，并且(d)測(cè)定T細(xì)胞中的磷酸-STAT5的核輸入級(jí)份。在一些 實(shí)施方案中，在缺乏白介素的情況下測(cè)量T細(xì)胞上的MMD的數(shù)目和/或大小。在一些實(shí)施方案 中，在缺乏IL-2的情況下測(cè)量T細(xì)胞上的MMD的數(shù)目和/或大小。在一些實(shí)施方案中，在缺乏 IL-7的情況下測(cè)量T細(xì)胞上的MMD的數(shù)目和/或大小。在一些實(shí)施方案中，在存在亞閾值水平 的白介素的情況下測(cè)量T細(xì)胞上的MMD的數(shù)目和/或大小。
[0270] 在一些實(shí)施方案中，若從受試者分離的T細(xì)胞上的MMD的數(shù)目是至少閾值，則這指 示受試者具有與CD4T細(xì)胞改變有關(guān)的免疫缺陷。在一些實(shí)施方案中，它指示受試者具有HIV 感染。在一些實(shí)施方案中，若從受試者分離的T細(xì)胞上的MMD的數(shù)目不是至少閾值，其指示受 試者沒有如本文中公開的與CD4T細(xì)胞改變有關(guān)的免疫缺陷。在一些實(shí)施方案中，它意味著 受試者沒有對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的受損的CD-4T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，它意味著受 試者沒有對(duì)白介素-7的受損的CD-4T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，它指示受試者沒有HIV 感染。在一些實(shí)施方案中，閾值是每個(gè)細(xì)胞至少約80、每個(gè)細(xì)胞至少約90、每個(gè)細(xì)胞至少約 100、每個(gè)細(xì)胞至少約110、或每個(gè)細(xì)胞至少約120。在一個(gè)非限制性的優(yōu)選的實(shí)施方案中，閾 值是每個(gè)細(xì)胞約100。在一些實(shí)施方案中，若從受試者分離的T細(xì)胞上的MMD具有至少閾值的 直徑，則這指示受試者具有HIV感染。在一些實(shí)施方案中，若從受試者分離的T細(xì)胞上的MMD 沒有至少閾值的直徑，則這指示受試者沒有對(duì)白介素-7和更一般對(duì)細(xì)胞因子的受損的應(yīng) 答。在一些實(shí)施方案中，它指示受試者沒有HIV感染。在一些實(shí)施方案中，閾值是至少100nm、 至少llOnm、至少120nm、至少130nm、或至少140nm的直徑。在一個(gè)非限制性的優(yōu)選的實(shí)施方 案中，閾值是至少約120nm的直徑。
[0271] 由于RIF可以通過在異常大的MMD上聚集膜受體改變⑶4T細(xì)胞對(duì)IL-7的響應(yīng)性，對(duì) 其它gamma-c和細(xì)胞因子的響應(yīng)也可以受到影響，并且RIF可以也與牽涉改變的CD4T細(xì)胞應(yīng) 答的其它病理學(xué)有關(guān)。
[0272] 鑒定候選治療劑的方法
[0273] 本發(fā)明還提供了用于鑒定候選治療劑的方法，其包括：（a)在存在藥劑的情況下使 ⑶4T淋巴細(xì)胞與GIBsPLA2接觸，并且(b)測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化。在一些實(shí)施方 案中，方法包括(c)比較在存在藥劑的情況下的GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平與在 缺乏藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平。在一些實(shí)施方案中，若在存在藥 劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化的水平低于在缺乏藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo) 的CD4T細(xì)胞活化的水平，則將藥劑鑒定為候選免疫缺陷治療劑。在一些實(shí)施方案中，藥劑鑒 定為候選HIV治療劑。在一些實(shí)施方案中，若在存在藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞 活化的水平高于在缺乏藥劑的情況下GIBsPLA2誘導(dǎo)的CD4T細(xì)胞活化的水平，則將藥劑鑒定 為候選免疫抑制治療劑。
[0274] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化包括測(cè)定每個(gè)⑶4T細(xì)胞的 MMD數(shù)目。
[0275] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化包括測(cè)定⑶4T細(xì)胞上的 MMD的均值直徑。
[0276] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量GIBsPLA2誘導(dǎo)的⑶4T細(xì)胞活化包括測(cè)定通過STAT5磷酸 化和/或核輸入測(cè)定的⑶4T細(xì)胞的IL-7響應(yīng)性。
[0277] 如本文中使用，"藥劑"可以是作為潛在治療劑評(píng)估下的任何化學(xué)實(shí)體。在一些實(shí) 施方案中，藥劑是有機(jī)分子。在一些實(shí)施方案中，藥劑包含2至100個(gè)碳原子，如2至50個(gè)碳原 子，5至50個(gè)碳原子，或10至50個(gè)碳原子。在一些實(shí)施方案中，藥劑是肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、或 脂蛋白。在一些實(shí)施方案中，藥劑是抗體。
[0278] 在一些實(shí)施方案中，先前尚未確定藥劑具有暗示作為用于治療免疫缺陷的治療劑 的效用的生物學(xué)活性，諸如經(jīng)常與HIV感染有關(guān)的。在一些實(shí)施方案中，先前已經(jīng)確定藥劑 具有暗示作為用于治療免疫缺陷的治療劑的效用的生物學(xué)活性，諸如經(jīng)常與HIV感染有關(guān) 的。
[0279] 如本文中使用，"候選免疫缺陷治療劑"或"候選HIV治療劑"指在至少一種測(cè)定法 中抑制RIF活化CD4T細(xì)胞的能力的藥劑。與本文中報(bào)告的數(shù)據(jù)一致，在至少一種測(cè)定法中藥 劑抑制GIBsPLA2活化CD4T細(xì)胞的能力的能力是一種可用于鑒定藥劑的方式，所述藥劑可能 在治療上可用于治療免疫缺陷，包括與HIV感染有關(guān)的免疫缺陷。因此，它也是一種可用于 鑒定可能在治療上可用于治療HIV感染的藥劑的方式。當(dāng)然，與在所有治療分子的情況下一 樣，將需要進(jìn)一步的表征。然而，這不減損本公開的候選HIV治療劑的效用。
[0280] 在以下實(shí)施例部分中公開了本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)，所述實(shí)施例應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是例 示性的。 實(shí)施例
[0281] 1.材料和方法
[0282] 1.1.患者
[0283] 研究中包括的VP已經(jīng)呈HIV陽性超過一年。他們從未接受任何抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物， 并且在血液收集時(shí)具有病毒載量>10,000個(gè)RNA拷貝/ml以及⑶4計(jì)數(shù)>20〇Ail(ANRS EP 33 和EP20研究）。在Centre Hospitalier de Gonesse抽取來自VP的所有血液樣品。來自HD的 血液由Etablissement Frangaisdu Sang(Centre Necker-Cabanel，Paris)提供。從已經(jīng)接 受治療至少一年的個(gè)體抽取來自ART患者的血漿樣品。他們的病毒載量不能檢出至少6個(gè) 月，并且在血液收集時(shí)他們的CD4計(jì)數(shù)>500/μ1。在感染后10年從具有不能檢測(cè)病毒載量的 個(gè)體抽取來自HIC患者的血衆(zhòng)樣品。在Centre d' Infectiologie Necker-Pasteur收集血衆(zhòng) 樣品。
[0284] 1.2.分析純化的⑶4T淋巴細(xì)胞中的膜微域(MMD)、受體擴(kuò)散速率和磷酸-STAT5細(xì) 胞區(qū)室化
[0285] 通過負(fù)選擇純化CD4T-細(xì)胞，如已經(jīng)描述（10)，然后用2nM重組糖基化人IL-7 (Cytheris)或40yg PHA(Sigma)活化。已經(jīng)描述了用于研究細(xì)胞表面微域(MMD)和磷酸-STAT5細(xì)胞區(qū)室分布的共焦和STED顯微術(shù)（10，12)。還已經(jīng)描述了活細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)擴(kuò) 散的?05分析(10，12)。
[0286] 1.3.制備和分析去污劑抗性微域(DRM)
[0287] 先前已經(jīng)描述了制備來自HD或VP的CD4T淋巴細(xì)胞的Triton-XlOO裂解物，接著離 心通過鹿糖梯度，并且對(duì)收集的級(jí)份進(jìn)行Western印跡分析（12)。通過Western印跡使用對(duì) 閥蛋白、IL_7Ralpha和ga_a c特異性的單抗檢測(cè)相應(yīng)的條帶（12)。
[0288] 1.4.來自VP血漿的RIF的表征
[0289] 1.4.1.生物測(cè)定法
[0290] MMD誘導(dǎo)測(cè)定法如下：首先將VP血漿(5或10%)在培養(yǎng)基中與純化的HD⑶4T細(xì)胞 一起溫育（20min)。然后，在經(jīng)聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上鋪板細(xì)胞10min，然后通過 15miη IL-7 (2nM)活化或?qū)τ趯?duì)照(NS)不活化，然后通過在PBS/SVF 5 %中平衡1小時(shí)的PFA (PFA，1.5%，15min，于37°C，接著在室溫15min)固定，之后通過霍亂毒素 B(CtxB-AF488)染 色。通過STED顯微術(shù)計(jì)數(shù)MMD。
[0291] 用于抑制STAT磷酸化和核轉(zhuǎn)位的測(cè)定法如下：首先將VP血漿(5或10%)與純化的 HD CD4T細(xì)胞一起溫育（20min)，之后通過IL-7 (2nM，15min)刺激。然后，在經(jīng)聚賴氨酸包被 的玻璃載玻片上鋪板細(xì)胞l〇min，然后通過15min IL-7(2nM)活化或?qū)τ趯?duì)照(NS)不活化， 然后通過??4(??六，1.5%，151^11，于37°(：，接著在室溫151^11)固定，并通過甲醇(90%在-20 °C)透化。在PBS/SVF 5%中平衡細(xì)胞1小時(shí)，然后通過用山羊抗兔Atto642標(biāo)記的兔抗STAT5 染色磷酸-STAT5,并且通過FACS或STED顯微術(shù)分析。
[0292] 1.4.2.酶處理
[0293] 通過處理30kDa膜上過濾的VP血漿評(píng)估酶消化對(duì)RIF活性的影響。使用具有MW〈 lOkDa的血漿化合物作為陰性對(duì)照。測(cè)試豬胰蛋白酶(于37 °C，lU/ml持續(xù)30min，接著是PMSF 抑制，并且用Mi 11 ipore 5kDa-膜離心濾器進(jìn)行緩沖液更換）或DNA酶I (于37 °C，lU/ml持續(xù) 30min)，或RNA酶(于37°C，lU/ml持續(xù)30min)或肽N-聚糖酶(于37°C，lU/ml持續(xù)30min)的效 果。在10 %終濃度分析所有制備物。
[0294] 1.4.3.]\^測(cè)定或1?正純化
[0295] 通過將1.6ml血漿加載到用碳酸銨（0.1M)或roS預(yù)平衡的85-ml Sephadex G100 柱，然后收集洗脫液的〇 .8ml級(jí)份實(shí)施大小排阻層析。使用蛋白質(zhì)集(GE-Healthcare)校準(zhǔn) 柱。通過Bradford法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。測(cè)試了先前在lOOkDa膜上過濾的VP血漿和總VP血漿， 并且給出相同的結(jié)果。收集13-17kDa的級(jí)份，其含有半純化的RIF。
[0296] 1.4.4等電點(diǎn)測(cè)定
[0297] 在MonoQ或MonoS 1ml柱(GE-Healthcare)上實(shí)施陰離子或陽離子交換層析，通過 連續(xù)pH步進(jìn)(碳酸銨/乙酸銨緩沖液)洗脫。測(cè)量每個(gè)洗脫級(jí)份的pH，然后，將這些調(diào)節(jié)到pH 7.4,之后測(cè)試其生物學(xué)效果。在洗脫后立即在相應(yīng)的級(jí)份中測(cè)量RIF活性。
[0298] 1.4.5MS 分析
[0299] 根據(jù)本領(lǐng)域中本身已知的方法，將來自凝膠過濾(G100)的樣品凍干，然后重懸，合 并，并且用豬胰蛋白酶蛋白水解。然后，通過層析流過C18柱在12個(gè)級(jí)份中分開蛋白水解肽， 所述C18柱在乙酸銨中洗脫。經(jīng)由以反相（乙腈）洗脫的C18分開12個(gè)級(jí)份，并且通過在 orbitrap Velos(Thermo Scientific)中的電噴射直接注射，用于在二級(jí)Ar片段化的情況 下MS分析，然后是MS/MS，每個(gè)MS掃描為10個(gè)較高強(qiáng)度的峰。
[0300] 使用標(biāo)準(zhǔn)Mascot和X-Tandem程序。對(duì)于數(shù)據(jù)庫亞組的每個(gè)蛋白質(zhì)，計(jì)算3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：
[0301] -i-得分：富含具有信號(hào)肽切割的成熟蛋白質(zhì)的NextProt數(shù)據(jù)庫中來自單一蛋白 質(zhì)的胰蛋白酶消化的每個(gè)肽的理論特異性的計(jì)算(獨(dú)特的肽/蛋白質(zhì)的數(shù)目）：特定肽總體 人序列的數(shù)目（所有），每個(gè)蛋白質(zhì)的具有N端信號(hào)肽的序列(sec)
[0302] -與來自所有MS掃描系列的峰相容的肽的理論發(fā)生的計(jì)算（理論肽匹配峰/蛋白 質(zhì)）
[0303]-具有峰匹配肽的蛋白質(zhì)序列的理論覆蓋度的計(jì)算 [0304]對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)，p值以所有三個(gè)得分的計(jì)算測(cè)定。
[0305]實(shí)施例1:來自VP的⑶4T淋巴細(xì)胞的異?；罨?，如通過異常膜微域(MMD)的存在測(cè) 量。
[0306]本實(shí)施例描述了調(diào)查新的分子和細(xì)胞參數(shù)，其解釋慢性HIV感染患者的CD4T淋巴 細(xì)胞中看到的異常應(yīng)答中的一些。通常通過評(píng)估認(rèn)為是⑶4功能障礙的主要標(biāo)志物的細(xì)胞 表面分子，如⑶38、HLA-DR和⑶25的過表達(dá)測(cè)量免疫系統(tǒng)的長(zhǎng)期活化（15)。然而，盡管付出 大量努力，這些數(shù)據(jù)仍然是模糊的，并且CD4T細(xì)胞的表型不能直接解釋其免疫缺陷。
[0307] 使用STED顯微術(shù)和用霍亂毒素 B(CtxB-AF488)標(biāo)記檢測(cè)MMD的存在（12)。在任何刺 激前，發(fā)現(xiàn)從VP純化的CD4T淋巴細(xì)胞的表面攜帶遠(yuǎn)多于從HD純化的靜止CD4T淋巴細(xì)胞的 MMD(圖la)。并且更重要地，所有來自VP的⑶4T細(xì)胞顯示了增加的MMD數(shù)目。此異常模式不是 由VP血漿中的IL-7刺激的結(jié)果，因?yàn)榇搜獫{中的平均IL-7濃度(0.4pM)僅是IL-7R的Kd的百 分之一（13，14)。當(dāng)通過IL-7刺激來自HD的純化的⑶4T細(xì)胞時(shí)，觀察到大量的麗D。比較而 言，來自VP的CD4T細(xì)胞的MMD模式不受IL-7影響（圖1 a)。與對(duì)IL-7的任何響應(yīng)的缺乏偶聯(lián)的 此異常活化可以通過非生理學(xué)刺激物，諸如用植物凝集素(PHA)模擬(圖la)。
[0308] 然后，計(jì)數(shù)這些各種異常麗D。如用PHA-刺激的HD⑶4T細(xì)胞一樣，來自VP的每個(gè) ⑶4T細(xì)胞觀察到150-200個(gè)左右的MMD(圖lc)。這里再一次，獲得的結(jié)果顯示了來自VP的所 有⑶4T細(xì)胞表達(dá)MMD，包括所有主要的⑶4亞群（圖lc)。IL-7不能增加 VP中的MMD數(shù)目。比較 而言，HD⑶4T細(xì)胞中的麗D數(shù)目在IL-7刺激后從10個(gè)左右的MMD/細(xì)胞的背景水平增加到 300個(gè)。還進(jìn)行了 MMD大小的研究（圖Id和e)。這顯示了來自VP的CD4T細(xì)胞上和PHA-刺激的HD CD4T細(xì)胞上的MMD遠(yuǎn)大于（250nm)那些來自通過IL-7(90nm)刺激的HD CD4T細(xì)胞的。
[0309]實(shí)施例2:在從VP CD4T細(xì)胞分離的異常去污劑抗性膜微域(DRM)中隔離所有IL-7R alpha和gamma-c鏈
[0310] 分析靜息HD CD4T細(xì)胞以驗(yàn)證IL-7R alpha和gamma-c鏈位于MMD外部的高密度級(jí) 份中。當(dāng)通過IL-7刺激這些HD CD4T細(xì)胞時(shí)，這兩條鏈位于低密度級(jí)份中，所述低密度級(jí)份 對(duì)應(yīng)于去污劑抗性MMD或含有MMD中隔離的所有蛋白質(zhì)的DRM(圖2)。
[0311]當(dāng)在從VP純化的⑶4T細(xì)胞上重復(fù)研究時(shí)，模式是不同的（圖2)。在任何刺激前，所 有IL-7R alpha和gamma-c鏈已經(jīng)在DRM中隔離;無一位于與MMD外部的游離受體對(duì)應(yīng)的高密 度級(jí)份中。此外，在DRM制備前通過IL-7預(yù)先刺激CD4T細(xì)胞不影響此模式(數(shù)據(jù)未顯示）。這 里再一次，通過非病理學(xué)PHA預(yù)先刺激HD⑶4T細(xì)胞再現(xiàn)此病理學(xué)情況。這確認(rèn)了圖1中的數(shù) 據(jù)，并且證明了 VP中的CD4T細(xì)胞在任何刺激前進(jìn)行異?；罨?。另外，這些異常MMD含有所有 IL-7R鏈（圖 2)。
[0312] 實(shí)施例3:來自HD、VP和經(jīng)IL-7-刺激的HD細(xì)胞的純化的CD4T細(xì)胞中IL-7信號(hào)體的 2D凝膠分析。通過免疫沉淀后回收的蛋白質(zhì)模式表征異常活化狀態(tài)。
[0313] 使用2D電泳證明VP中的IL-7信號(hào)體的組成是異常的，并且與靜止且經(jīng)IL-7-活化 的HD CD4T細(xì)胞中的IL-7信號(hào)體的組成不同（圖7a，7b和7c)。
[0314] 用蛋白G-Sepharose 4G上固定化的抗_IL_7Ralpha(小鼠單抗40131，R&D System) 免疫沉淀蛋白質(zhì)，其來自純化的CD4T細(xì)胞裂解物，并且在2D-PAGE(在pH 3-10凝膠條上的 IEF，接著用雙丙稀酰胺的SDS凝膠）上分離。展示pH和MW(kDa)標(biāo)度。用Sypro-Ruby染色凝 膠。顯示的凝膠代表來自HD的8個(gè)NS/IL-7對(duì)和來自VP的3個(gè)凝膠。
[0315](圖7a)非刺激的（NS)HD CD4T細(xì)胞。
[0316](圖7b)VP CD4T細(xì)胞。從VP比從HD制備的經(jīng)Sypro Ruby染色的2D凝膠中觀察到更 多的點(diǎn)。另外，我們觀察到當(dāng)用VP提取物制備2D凝膠時(shí)，共同的點(diǎn)是更強(qiáng)烈的。
[0317] (圖7c)經(jīng)IL-7-刺激的HD CD4T細(xì)胞。通過IL-7刺激的HD CD4T細(xì)胞中的模式不同 于VP CD4T細(xì)胞中的。這進(jìn)一步支持下述提議，即VP中找到的異常活化不是可以在具有高水 平IL-7的器官中，例如在生成IL-7的器官中發(fā)生的IL-7刺激的結(jié)果。
[0318] 可以從分析得出結(jié)論，VP⑶4T細(xì)胞中的IL-7R鏈不僅是異常MMD的一部分，而且它 們與不同于正常IL-7信號(hào)體中找到的那些蛋白質(zhì)復(fù)合物的蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用。
[0319] 實(shí)施例4:在來自HD、VP和經(jīng)PHA-刺激的HD細(xì)胞的純化的⑶4T細(xì)胞表面上的IL- 7Ralpha的擴(kuò)散速率。VP CD4T細(xì)胞中的IL-7Ralpha包埋于富含脂質(zhì)的異常MMD中，如此限制 其擴(kuò)散速率，并且排除與細(xì)胞骨架的任何相互作用以及因此傳播信號(hào)的任何能力。
[0320] 在活CD4T細(xì)胞的表面上通過FCS測(cè)量用AF488-抗IL-7Ralpha單抗染色的IL-7Ralpha的二維擴(kuò)散。圖8中顯示了結(jié)果。在缺乏IL-7(?，自相關(guān)）的情況中或在存在IL-7-生物素· SAF633(籲，交叉相關(guān)）的情況下測(cè)量擴(kuò)散時(shí)間tD(以l(T3sec計(jì)），如描述的（10， ⑵。然后，相對(duì)于通過共焦體積截取的細(xì)胞表面積ω〇 2(1〇3ηπι2)繪制這些時(shí)間。在用或不用 MMD抑制劑(COase lμg/ml加上SMase 0.1μg/ml持續(xù)30min)或細(xì)胞骨架抑制劑(CytD 20μΜ 加上Col ΙΟμΜ持續(xù)30min)預(yù)處理的情況下顯示了擴(kuò)散圖。
[0321] 棒標(biāo)示來自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。線性回歸的斜率給出了有效的擴(kuò)散速率Drff，并且 y-截距外推約束時(shí)間（confinement time)τ〇,如我們先前描述（12)。在柱形圖圖3a中顯示 了 Def f 〇
[0322] (圖8a，8d)在HD CD4T-細(xì)胞的表面上，
[0323] (圖8b，8e)在VP CD4T細(xì)胞的表面上，
[0324] (圖8c，8f)在用PHA(lμg/ml)預(yù)先活化的HD CD4T細(xì)胞的表面上。
[0325] (圖8g)通過MMD抑制劑或細(xì)胞骨架抑制劑處理之前和之后包埋于MMD中的IL-7Ralpha擴(kuò)散的機(jī)制的圖解。MMD以圓盤標(biāo)示，受體以桿標(biāo)示，細(xì)胞骨架顯示為網(wǎng)。標(biāo)示擴(kuò)散 速率(快速，緩慢，非常緩慢)以促進(jìn)數(shù)據(jù)解讀。此圖解顯示了圖3a中也報(bào)告的結(jié)果。
[0326] 實(shí)施例5:VP⑶4T細(xì)胞的異常MMD中隔離的IL-7R鏈?zhǔn)欠枪δ苄缘摹?br>[0327] 在⑶4T細(xì)胞的表面上測(cè)量IL-7R alpha擴(kuò)散速率，如先前描述（10，12)并且如實(shí)施 例4中詳述。在任何刺激前，看到這些擴(kuò)散速率在VP比HD⑶4T細(xì)胞上慢三倍（圖3a)。這進(jìn)一 步證明了 IL-7R alpha鏈包埋于這些⑶4T細(xì)胞的表面上的異常麗D中（圖3a)。⑶ase加上 SMase處理從其MMD約束釋放受體，并且因此提高其擴(kuò)散速率（圖3a)。比較而言，用松胞菌素 D(Cyt D)加上秋水仙堿(Col)(其瓦解細(xì)胞骨架）的處理對(duì)VP CD4T細(xì)胞中的IL-7R alpha鏈 的擴(kuò)散速率沒有影響（圖3a)。由于細(xì)胞骨架構(gòu)造是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的絕對(duì)必要物，在IL-7R alpha 和細(xì)胞骨架網(wǎng)眼之間的任何功能或結(jié)構(gòu)聯(lián)系的此種缺乏提示了當(dāng)IL-7R復(fù)合物在異常MMD 中隔離時(shí)不能進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，在VP CD4T細(xì)胞中也是如此。
[0328] 然后，使用脈沖-STED顯微術(shù)研究HD和VP⑶4T細(xì)胞兩者的細(xì)胞質(zhì)和核中的STAT5 磷酸化(磷酸-STAT5)和磷酸-STAT5分割。圖3b顯示了 15min IL-7刺激之前和之后的磷酸-STAT5分布的STED圖像。我們注意到磷酸-STAT5在HD CD4T細(xì)胞的核中積累，并且此現(xiàn)象受 到細(xì)胞骨架瓦解抑制。比較而言，在VP⑶4T細(xì)胞中或在經(jīng)PHA預(yù)先刺激的HD⑶4T細(xì)胞中不 發(fā)生磷酸-STAT5對(duì)核的轉(zhuǎn)位(圖3b)。
[0329] 然后，追蹤磷酸-STAT5在細(xì)胞質(zhì)和核中出現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)達(dá)1小時(shí)（圖3c，d，e)。這顯示 了 VP CD4T細(xì)胞中的磷酸-STAT5主要在細(xì)胞質(zhì)中積累，并且不迀移到核（圖3d)，與在經(jīng)PHA- 刺激的HD CD4T細(xì)胞中一樣（圖3e)。當(dāng)結(jié)果與在核中找到50%磷酸-STAT5的在IL-7刺激HD CD4T細(xì)胞后5分鐘中獲得的結(jié)果比較時(shí)，這是特別清楚的（圖3c)。
[0330] 實(shí)施例6:來自VP的血漿誘導(dǎo)純化的HD⑶4T細(xì)胞表面上的異常MMD。
[0331] 然后，調(diào)查了VP⑶4T細(xì)胞的異?；罨钠鹪?。牽涉所有⑶4T細(xì)胞并且非生理學(xué)信 號(hào)，諸如PHA模擬結(jié)果的實(shí)情導(dǎo)致VP的血漿的調(diào)查。將純化的HD⑶4T細(xì)胞與10%VP血漿一 起溫育30min，并且在⑶4T細(xì)胞表面上計(jì)數(shù)MMD，如通過經(jīng)標(biāo)記的霍亂毒素 B(CtxB-AF488)檢 測(cè)。圖4a顯示了獲得的圖像。單獨(dú)的VP血漿誘導(dǎo)HD CD4T細(xì)胞上的大量MMD。添加 IL-7不影響 這些MMD的大小或數(shù)目（圖4a)。對(duì)來自5個(gè)不同VP的血漿顯示了這些結(jié)果（圖4b)，并且使用 來自這些VP的更多血漿樣品（>15)驗(yàn)證。還使用來自不同HD(>5)的⑶4T細(xì)胞報(bào)告了實(shí)驗(yàn)。對(duì) 照由在純化的HD⑶4T細(xì)胞上測(cè)試來自HIV控制者(HIC)和經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的(ART)患 者的血漿樣品組成。這些無一誘導(dǎo)MMD或抑制IL-7對(duì)MMD的誘導(dǎo)（圖4c)。
[0332] 這進(jìn)一步通過測(cè)試各種血漿的大量稀釋驗(yàn)證（圖4d)。下至0.1 %稀釋度的VP血漿 導(dǎo)致細(xì)胞表面間散布的MMD的形成。以50至100倍稀釋的VP血漿給出50 %最大活性。在任何 稀釋度，來自HI C或ART患者的血漿樣品無一誘導(dǎo)MMD。
[0333] 實(shí)施例7:來自VP的血漿抑制IL-7誘導(dǎo)的磷酸-STAT5核轉(zhuǎn)位
[0334] 通過追蹤STAT5磷酸化和核轉(zhuǎn)位測(cè)試用VP血漿處理的HD⑶4T細(xì)胞中的IL-7R的功 能。如圖5a中看到，HD⑶4T細(xì)胞與VP血漿（10 %濃度）的預(yù)溫育抑制IL-7誘導(dǎo)的STAT5磷酸 化和其核轉(zhuǎn)位。圖5b顯示了用5個(gè)VP血漿樣品獲得的結(jié)果。在10%稀釋度，全部抑制磷酸-STAT5的核轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果用來自不同VP(> 15)的血漿和HD CD4T細(xì)胞的各種來源(>5)確認(rèn)。
[0335] 源自HIC和ART患者的血漿的效果也通過將這些與純化的HD⑶4T細(xì)胞預(yù)溫育來測(cè) 試（圖5a和5c)。這里再一次，僅VP血漿能夠抑制IL-7誘導(dǎo)的磷酸-STAT5核轉(zhuǎn)位。還確定（圖 5d)VP血漿下到0.1%稀釋度有活性，并且在50至100倍稀釋獲得半最大活性，如此與誘導(dǎo)異 常MMD的能力關(guān)聯(lián)起來(圖4d)。
[0336] 源自經(jīng)ART處理但不響應(yīng)(CD4-NR)其治療（低計(jì)數(shù)的病毒RNA和低計(jì)數(shù)的⑶4T細(xì) 胞）的患者的血漿的效果也通過預(yù)溫育這些與純化的HD CD4T細(xì)胞測(cè)試。這里再一次，僅 〇)4-冊(cè)血漿能夠抑制11^-7誘導(dǎo)的磷酸-3了4了5核轉(zhuǎn)位。還確定了〇)4-冊(cè)血漿下到0.1%稀釋 度有活性，并且在50至100倍稀釋獲得半最大活性，如此與如用VP觀察到的誘導(dǎo)異常MMD的 能力關(guān)聯(lián)起來。
[0337] 實(shí)施例8:不應(yīng)狀態(tài)誘導(dǎo)因子的分子表征
[0338]調(diào)查了RIF的化學(xué)性質(zhì)。進(jìn)行的研究（圖6a)顯示了RIF是一種蛋白質(zhì)，因?yàn)槠浠钚?被胰蛋白酶破壞。用肽N-聚糖酶(PNG酶）的處理沒有影響，指示N-糖基化不是RIF活性需要 的。
[0339] 然后，通過在Sephadex G-100上的大小排阻層析測(cè)量RIF的分子量。對(duì)于從柱中洗 脫的所有級(jí)份測(cè)量MMD的誘導(dǎo)（圖6b)和對(duì)IL-7誘導(dǎo)磷酸-STAT5核轉(zhuǎn)位的抑制（圖6c)。圖6中 給出了兩個(gè)代表性的柱概況。兩者都顯示了 RIF是具有10-15kDa的MW的單一因子。
[0340] 圖6b顯示了通過從Sephadex G100柱中收集的100個(gè)級(jí)份之每個(gè)中的點(diǎn)印跡測(cè)量 的病毒肽或蛋白質(zhì)的密度。用來自VP血漿樣品的不同多克隆抗體將測(cè)量重復(fù)三次，所述多 克隆抗體的特征在于其針對(duì)病毒蛋白的高活性。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，然后從數(shù)值中扣除用HD血 漿獲得的信號(hào)。圖6b中顯示的模式證明了在含有RIF活性的級(jí)份中檢測(cè)不到病毒蛋白或片 段，而點(diǎn)印跡測(cè)定法能夠檢測(cè)較高麗(190至321^&)的病毒蛋白。
[0341] 然后，使用來自Sephadex G100柱的10至15kDa有活性的富集級(jí)份制定RIF的等電 點(diǎn)，通過在陰離子(MonoQ)或陽離子(MonoS)交換柱上保留，接著pH洗脫(在MonoS的情況下 pH增加或在MonoQ的情況下pH降低）（圖6d)。然后，在調(diào)節(jié)其pH至7.4后測(cè)量各個(gè)pH組分的 麗D誘導(dǎo)活性?？偣玻趦蓚€(gè)級(jí)份中回收了初始活性的25至30%，即與6.5至8.0的等電點(diǎn)一 致的結(jié)果。
[0342] 因此，RIF是一種分泌性蛋白質(zhì)，具有約15kDa的MW，7.5-8.0左右的pi，其含有二硫 橋。在上述結(jié)構(gòu)和功能特征后，直接獲得RIF身份（identity)。特別地，在所有36853已知的 人蛋白質(zhì)中，僅62具有RIF的上述4個(gè)特征。使用質(zhì)譜術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)Mascot程序分析從三名病毒 血患者和三名HD制備的半純化的材料。根據(jù)材料和方法中描述的p值排序回收的蛋白質(zhì)。下 文表1中顯示的結(jié)果清楚且直接指示RIF是GIBsPLA2。
[0343] 表 1
[0346]如此，病毒血患者的血漿中找到的蛋白質(zhì)是GIBsPLA2的分泌性形式。成熟的蛋白 質(zhì)具有125aa(MW14138)、PI 7.95和7個(gè)二硫橋。使用商業(yè)的純化的豬6188?1^2，我們能夠在 體外驗(yàn)證此蛋白質(zhì)誘導(dǎo)異常MDM，其阻斷病毒血患者的血漿中的IL-7pSTAT5核轉(zhuǎn)位，這進(jìn)一 步確認(rèn)RIF是GIBsPLA2，更具體地其分泌形式。人GIBsPLA2的氨基酸序列以SEQ ID N0:2提 供。
[0347] 實(shí)施例9:PLA2sGIB誘導(dǎo)⑶4淋巴細(xì)胞的無應(yīng)答性(無反應(yīng)性）
[0348] 實(shí)施例7顯示了盡管誘導(dǎo)aMMD，但PLA2sGIB誘導(dǎo)對(duì)IL-7誘導(dǎo)的磷酸STAT5核轉(zhuǎn)位 (NT pSTAT5)的阻斷。因此，⑶4T淋巴細(xì)胞不響應(yīng)IL-7,并且盡管HIV患者的血漿中的高水平 的此細(xì)胞因子，其數(shù)目減少，然后導(dǎo)致⑶4淋巴細(xì)胞減少，即感染HIV的患者的標(biāo)志。
[0349] 這里，我們調(diào)查了PLA2sGIB也參與無反應(yīng)性的誘導(dǎo)（來自慢性HIV感染患者的⑶4 淋巴細(xì)胞的另一個(gè)特征)的可能性。
[0350] 生物測(cè)定法
[0351] MMD 誘導(dǎo)：
[0352] 首先將含有PLA2sGIB的VP血漿在培養(yǎng)基中與純化的HD CD4T細(xì)胞一起溫育 (20min)。然后，在經(jīng)聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上鋪開細(xì)胞，再持續(xù)lOmin。然后，用低聚甲 醛(PFA，1.5%，15min于37°C，接著在室溫15min)固定它們，之后通過霍亂毒素 B(CtxB-AF488)染色，通過CW-STED顯微術(shù)計(jì)數(shù)MMD。
[0353] 對(duì)STAT磷酸化和核轉(zhuǎn)位的抑制：
[0354] 首先將含有PLA2sGIB的VP血漿與純化的HD⑶4T細(xì)胞一起溫育（20min)，之后，通 過IL-7(2nM，15min.)刺激。然后，在經(jīng)聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上鋪開細(xì)胞，之后通過 PFA(1.5 % )固定，并且通過甲醇(90 %在-20 °C)透化。然后，通過用山羊抗兔Atto642標(biāo)記的 兔抗STAT5染色pSTAT5,并且通過FACS或脈沖STED顯微術(shù)分析。
[0355]
[0356] 圖10a顯示了在暴露于PLA2GIB(病毒血患者的血漿)后，來自健康供體(HD)的⑶4 淋巴細(xì)胞變得不能響應(yīng)IL-2,如通過對(duì)IL-2誘導(dǎo)的NT pSTAT5的抑制測(cè)量。此抑制總體用 3%血漿，并且用1 %血漿是高度顯著的(p〈0.0001)。
[0357] 我們進(jìn)一步研究了⑶4+⑶25+T reg淋巴細(xì)胞對(duì)PLA2GIB的響應(yīng)。圖10b中呈現(xiàn)了結(jié) 果。如顯示，雖然100%的健康細(xì)胞通過NT PSTAT5響應(yīng)IL-2,但是PLA2GIB(病毒血患者的 1 %血漿)完全抑制此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。由于⑶4+⑶25+細(xì)胞代表總體⑶4T細(xì)胞的小于5%，它們 不能顯著影響圖l〇a中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)。
[0358] IL-7和IL-2是gamma c細(xì)胞因子家族的成員。為了確認(rèn)對(duì)此細(xì)胞因子的無應(yīng)答性 可以與gamma c聯(lián)系起來，我們測(cè)試了對(duì)IL-4的響應(yīng)。通過追蹤pSTAT6的IL-4誘導(dǎo)的NT測(cè)量 IL-4響應(yīng)（圖11)。我們的結(jié)果清楚顯示了 IL-4響應(yīng)受到PLA2GIB抑制（用3%血漿完全地和 1 %血漿較大地）。
[0359] 因此，這些結(jié)果顯示了由gamma c家族的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制被PLA2GIB 改變。這與我們的下述發(fā)現(xiàn)完全一致:發(fā)現(xiàn)gamma c受體鏈在來自HIV患者的CD4淋巴細(xì)胞表 面上自發(fā)找到的aMMD中完全隔離(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0360] 實(shí)施例10:PLA2GIB的重組形式的活性
[0361] 在本實(shí)施例中，測(cè)試了PLA2GIB蛋白的各種純化形式的活性，以進(jìn)一步確認(rèn)純化形 式的此蛋白質(zhì)對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，并且進(jìn)一步確認(rèn)其特異性。
[0362] 酶促測(cè)定法
[0363] 用來自Life Technologies的Enz Check PLA2測(cè)定試劑盒(ref · :E102147)進(jìn)行測(cè) 定法。此測(cè)定法提供了 PLA2酶活性的連續(xù)的快速實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。通過515nm的單一波長(zhǎng)的強(qiáng)度增 加追蹤PLA2活性。通過515/575nm的發(fā)射強(qiáng)度比率以及460nm激發(fā)的變化檢測(cè)PLA2。比活以 每秒和溶液中的每yg酶獲得的熒光底物的量(U)表示。
[0364] 莖里
[0365] 下文表2中提供了結(jié)果。
[0366] 表2:重組PLA2GIB蛋白的活性
[0367]
[0368] 結(jié)果顯示了大腸桿菌中生成的重組人PLA2GIB展現(xiàn)出有力的酶促活性。此外，結(jié)果 還顯示了大腸桿菌中生成的重組豬PLA2GIB與重組人PLA2GIB具有相似的比活。比較而言， 重組PLA2GIIA和PLA2GIID沒有活性，并且PLA2GX具有非常有限的活性。
[0369] 如此，重組PLA2GIB代表一種用于本發(fā)明的有力的活性劑。
[0370] 實(shí)施例11 :PLA2sGIB對(duì)⑶4淋巴細(xì)胞的影響牽涉其酶促活性。
[0371] 在本實(shí)施例中，我們調(diào)查了PLA2sGIB對(duì)CD4淋巴細(xì)胞的活性是否牽涉PLA2sGIB的 酶促(例如催化)活性(例如是PLA2sGIB的酶促(例如催化)活性的結(jié)果）。此類酶促活性會(huì)修 改膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致⑶4淋巴細(xì)胞的表面上形成多個(gè)aMMD。
[0372] 在這些實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了PLA2sGIB的突變體，其中第48位的重要組氨酸被替換 為谷氨酰胺（突變體H48Q)。使用實(shí)施例10中描述的酶促測(cè)試，我們比較大腸桿菌中生成的 重組豬PLA2GIB的酶促活性與也在大腸桿菌中生成的突變體H48Q的活性。在200微摩使用每 種蛋白質(zhì)。如圖12顯示，突變體已經(jīng)喪失其全部酶促活性，例示了 PLA2GIB中的第48位組氨 酸的關(guān)鍵作用。
[0373] 我們?nèi)缓笤谏餃y(cè)定法中比較了野生型豬PLA2GIB與其突變體H48Q的活性。圖13 中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了突變體已經(jīng)喪失wtPLA2GIB誘導(dǎo)aMMD或降低或消除IL-7誘導(dǎo)的pSTAT5 核轉(zhuǎn)位(NT pSTAT5)的能力。
[0374] 如此，這些結(jié)果證明了酶促活性參與PL2GIB對(duì)⑶4淋巴細(xì)胞的病理學(xué)影響。
[0375] 實(shí)施例12:抗GIBsPLA2抗體恢復(fù)HIV病毒血患者的血漿中的⑶4-T細(xì)胞活性。
[0376] 本實(shí)施例例示了在病毒血患者的血漿中，GIBsPLA2將⑶4淋巴細(xì)胞從HD轉(zhuǎn)化成"患 病"淋巴細(xì)胞，其與感染HIV的患者的血液中表征的那些淋巴細(xì)胞相當(dāng)。本實(shí)施例進(jìn)一步顯 示了抗GIBsPLA2抗體的確有效抑制病原性活性。
[0377] 在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)系列中，通過用針對(duì)人GIBsPLA2的山羊抗體或針對(duì)無關(guān)抗原的兩種 對(duì)照山羊抗體包被的Sepharose珠處理血衆(zhòng)。圖14(a)清楚顯示了抗GIBsPLA2抗體完全消除 或除去血漿的活性，其變得不能誘導(dǎo)來自HD的CD4淋巴細(xì)胞中的異常MMD。對(duì)照I和對(duì)照II抗 體沒有影響。對(duì)于每種血漿將這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并且研究來自病毒血患者的三種不同血 漿。
[0378] 圖14(b)顯示了相同的結(jié)果。在這里，如上文處理血漿，但是使用第二種生物測(cè)定 法分析。通過用抗GIBsPLA2抗體包被的Sepharose珠處理血漿不再抑制IL-7誘導(dǎo)的pSTAT5 核轉(zhuǎn)位。對(duì)照I和對(duì)照II山羊抗體不影響來自病毒血患者的血漿抑制IL-7誘導(dǎo)的pSTAT5核 轉(zhuǎn)位的能力。
[0379] 在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)系列中，我們測(cè)試了特異性針對(duì)人GIBsPLA2、-GIIA和-GIID的中和 性兔抗體的效果。在生物測(cè)定法期間將這些抗體與血漿和細(xì)胞一起溫育。獲得的結(jié)果顯示 了抗GIBsPLA2抗體中和病毒血血漿的效果，如通過誘導(dǎo)異常MMD和通過抑制IL-7誘導(dǎo)的 PSTAT5核轉(zhuǎn)位測(cè)量。值得注意的是，針對(duì)分泌性PLA2-GIIA或分泌性PLA2-GIID(與GIBsPLA2 緊密相關(guān)的兩種磷脂酶)的抗體在此測(cè)試中沒有效果。
[0380] 這些結(jié)果顯示了抗GIBsPLA2抗體可以恢復(fù)并且防止病毒血血漿的免疫抑制效果。 這些結(jié)果顯示了抗GIBsPLA2抗體可以防止免疫缺陷，并且再刺激免疫缺陷受試者中的免疫 應(yīng)答。
[0381] 這些結(jié)果進(jìn)一步證明了響應(yīng)是特異性的。GIBsPLA2是參與檢查的病理學(xué)效應(yīng)并且 表征病毒血患者的血漿的唯一效應(yīng)物。
[0382] 實(shí)施例13:抗PLA2GIB抗體抑制PLA2GIB對(duì)CD4細(xì)胞的影響。
[0383] 使用克隆并純化的人PLA2G1B免疫兔。制備相應(yīng)的血清的免疫球蛋白級(jí)份。在放射 性標(biāo)記的大腸桿菌膜上測(cè)量它們抑制PLA2G1B的酶促活性的能力。將活性免疫球蛋白級(jí)份 添加到生物測(cè)定法，其包含自健康供體的血漿純化的CD4淋巴細(xì)胞。隨后，將克隆并純化的 分泌性PLA2(GIB，GIIA，GIID和GX)添加至培養(yǎng)物。作為對(duì)照，使用自用各種分泌性PLA2免疫 的兔制備的免疫球蛋白級(jí)份。
[0384] 圖15顯示了多克隆抗體的不同濃度抑制aMMD的誘導(dǎo)（圖15a)，并且阻斷IL-7誘導(dǎo) 的NT pSTAT5(圖15b)。此活性可以獲自lμg/ml至100μg/ml含有抗PLA2GIB抗體的Ig。此活性 是完全特異性的，因?yàn)獒槍?duì)PLA2GIIA，PLA2GIID或PLA2GX的抗體在生物測(cè)定法中沒有顯示 效果(圖15a和b)。
[0385] 如此，這些結(jié)果進(jìn)一步證明了抑制PLA2GIB可以用于治療免疫缺陷并且恢復(fù)⑶4活 性。
[0386] 實(shí)施例14:可溶性PLA2GIB受體抑制PLA2GIB對(duì)CD4T細(xì)胞的影響。
[0387] 作為PLA2GIB抑制劑可以施加治療效果的進(jìn)一步證明，我們測(cè)試了PLA2GIB受體的 可溶形式。
[0388]在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)系列中，我們使用具有以下氨基酸序列（SEQ ID N0:22)的對(duì) PLA2GIB特異性的可溶性鼠受體：
[0414] 在1 OOnM的濃度，在實(shí)施例9中描述的生物測(cè)定法中測(cè)試抑制劑。圖16中呈現(xiàn)了結(jié) 果。它們顯示了重組PLA2可溶性受體可以用作有力的拮抗劑，并且此類分子能夠顯著阻斷 PLA2sGIB對(duì)pSTAT5NT的負(fù)面影響（圖16)。
[0415] 可以使用包含SEQ ID N0:25或28的序列的PLA2-GIB結(jié)合多肽在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)組 中獲得相似的結(jié)果。
[0416] 實(shí)施例15:GIBsPLA2的過表達(dá)誘導(dǎo)免疫學(xué)缺陷
[0417]先前已經(jīng)顯示了降低病毒載量的高度活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly Active Anti-Retroviral Therapy，HAART)在大多數(shù)患者中也誘導(dǎo)⑶4計(jì)數(shù)增加。然而，在一些患者 中，盡管實(shí)際上HIV變得不能檢出，CD4計(jì)數(shù)不增加。我們先前已經(jīng)研究了此臨床情況，并且 我們已經(jīng)顯示了在這些稱作⑶4非響應(yīng)者(CD4-NR)的患者中，發(fā)現(xiàn)⑶4T淋巴細(xì)胞群體的強(qiáng) 烈且持久的缺陷。
[0418]圖17顯示了⑶4-NR患者的血漿的確比用作對(duì)照的來自病毒血患者的血漿含有更 多的PLA2GIB活性。這首先通過每個(gè)細(xì)胞的異常MMD的誘導(dǎo)測(cè)量。這些數(shù)據(jù)也通過測(cè)量抑制 IL-7誘導(dǎo)的pSTAT5核轉(zhuǎn)位的能力確認(rèn)。
[0419] 結(jié)果共同顯示了 CD4-NR患者的血漿比來自病毒血患者的血漿含有多100倍的 PLA2GIB 活性。
[0420]
[0421] 我們的結(jié)果顯示了PLA2GIB誘導(dǎo)與表征來自病毒血患者的⑶4T細(xì)胞的免疫抑制相 似的免疫抑制，包括不能響應(yīng)IL-2 (無反應(yīng)性)和IL-7 (針對(duì)CD4淋巴細(xì)胞減少的中心機(jī)制）。 因此，在HIV感染期間的GIBsPLA2表達(dá)在表征這些患者的免疫疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮中 心作用。這些缺陷是細(xì)胞類型特異性的，因?yàn)閬碜訦IV患者的CD8T淋巴細(xì)胞不展現(xiàn)出異常的 MMD，并且繼續(xù)響應(yīng)IL-7(數(shù)據(jù)未顯示KPLA2GIB的作用模式可能是其酶促活性的結(jié)果。通過 攻擊CD4淋巴細(xì)胞的膜，它修飾其流動(dòng)性，并且可能容許異常且非常大的MMD的形成。
[0422]炎性反應(yīng)在HIV感染期間發(fā)揮重要的作用。然而，它們?cè)贖IV發(fā)病機(jī)制中的確切作 用仍然有待闡明?？紤]到我們的數(shù)據(jù)，可以假設(shè)HIV感染誘導(dǎo)非常奇怪的炎癥類型，其包括 GIBsPLA2。此外，可以推測(cè)在PLA2GIB誘導(dǎo)后，其分泌逃逸到正常的調(diào)節(jié)過程，因此導(dǎo)致長(zhǎng)期 生成和免疫學(xué)病癥，其是CD4T淋巴細(xì)胞功能障礙的直接后果。作為CD4T淋巴細(xì)胞功能障礙 的間接后果，還可以觀察到其它缺陷。例如，減少的干擾素 gamma生成會(huì)降低單核細(xì)胞/巨噬 細(xì)胞和天然殺傷者的功能。
[0423] 血漿PLA2GIB活性的恢復(fù)和不同組患者的特征之間的關(guān)聯(lián)也是非常有信息的。 "HIV控制者"是非常罕見的患者，其在數(shù)年里維持檢測(cè)不到的病毒載量和準(zhǔn)正常的CD4計(jì) 數(shù)。我們的結(jié)果顯示了他們?cè)谄溲獫{中不表達(dá)PLA2GIB活性。比較而言，在大多數(shù)患者中，此 酶是表達(dá)的，并且代表導(dǎo)致免疫學(xué)疾病的炎性的負(fù)面。總之，這清楚建立PLA2GIB是HIV感染 的病理生理學(xué)中的非常重要的參數(shù)。
[0424] HAART病毒載量降低繼之以免疫恢復(fù)，包括⑶4計(jì)數(shù)增加。在此治療期間，PLA2GIB 活性在患者的血漿中消失。由于認(rèn)為HAART降低炎性反應(yīng)，這進(jìn)一步提示了 PLA2GIB是這些 炎性過程的部分。更重要的是，我們?cè)诒疚拿枋隽巳匀痪哂蟹浅５偷腃D4計(jì)數(shù)的CD4-NR患者 的情況，而HAART控制器病毒載量。這些個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的PLA2GIB過度生成可以解釋免疫疾病 的持續(xù)性，其表征了此臨床狀態(tài)。因此，在HAART后，導(dǎo)致免疫修復(fù)的PLA2GIB的降低生成或 導(dǎo)致免疫疾病的不可逆性的其持續(xù)過度生成之間有強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。
[0425] 此發(fā)現(xiàn)的治療結(jié)果和效用是巨大的。對(duì)PLA2GIB的抑制的確可以用于預(yù)防或治愈 HIV患者以及更一般地免疫抑制受試者的免疫學(xué)疾病。感染期間早期應(yīng)用，PLA2GIB抑制劑 將患者引導(dǎo)到HIV控制者狀態(tài)。后來單獨(dú)或與HAART結(jié)合/交替應(yīng)用，它們加速CD4T淋巴細(xì)胞 功能的恢復(fù)，并且通過加強(qiáng)宿主防御，與在許多其它病毒慢性感染中一樣，PLA2GIB抑制劑 導(dǎo)致病毒和免疫系統(tǒng)之間的平衡。因此，PLA2GIB抑制劑代表單獨(dú)或組合用于治療與異常免 疫應(yīng)答或活性有關(guān)的病癥的非常有力的藥劑。它們也可以幫助省下HAART，并且可以導(dǎo)致這 些治療的中斷，所述治療在它們的嚴(yán)重不利效果方面是已知的。
[0426] 此外，由于GIBsPLA2表達(dá)的缺乏(與在相應(yīng)的基因方面K0的小鼠中一樣)是完全容 忍的，使用抑制劑或者經(jīng)由疫苗接種對(duì)GIBsPLA2的瞬時(shí)或永久抑制代表一種用于免疫疾 病，特別是HIV患者的強(qiáng)烈且有效的免疫療法。
[0427] 參考文獻(xiàn)
[0428] (l)Grossman Z,Meier-Schellersheim M,Sousa AE,Victorino RMM,Paul WE (2002)CD4+T_cell depletion in HIV infection:are we closer to understanding the cause?Nat Med 8(4):319-323
[0429] (2)Catalfamo M，et al·(2008)HIV infection-associated immune activation occurs by two distinct pathways that differentially affect CD4and CD8T cells.PNAS 105(50):19851-19856.
[0430] (3)Armah KA,et al.(2012)HIV status, burden of comorbid disease and biomarkers of inflammation,altered coagulation，and monocyte activation.Clin Infec Dis 55(1)126-36.
[0431] (4)David D,et al.(1998)Regulatory dysfunction of the Interleukin-2receptor during HlV-infection and the impact of triple combination therapy.PNAS 95:11348-11353.
[0432] (5)Colle JH?et al.(2006)Regulatory dysfunction of the interleukin-7receptor in CD4and CD81ymphocytes from HIV-infected patients-effects of antiretroviral therapy.J Acquir Immune Defic Syndr 42(3):277-285·
[0433] (6)Kryworuchko M,Pasquier V,Theze J(2003).Human Immunodeficiency Virus-lenvelope glycoproteins and anti_CD4antibodies inhibit Interleukin-2induced Jack/STAT signaling in human CD4T lymphocytes.Clinical and Experimental Immunology 131(3):422-427.
[0434] (7)Landires I，et al.(2011)HIV infection perturbs IL_7signaling at the step of STAT5nuclear relocalization.AIDS 25(15):1443-1453.
[0435] (8)Vranjkovic A,Crawley AM,Patey A,Angel JB(2011)IL-7dependent STAT-5activation and CD8+T cell proliferation are impaired in HIV infection.J Leukoc Biol 89(4):499-506.
[0436] (9)Benoit A，et al.(2009)Inverse association of repressor growth factor independent-lwith CD8T cell interleukin(IL)-7receptor[alpha]expression and limited signal transducers and activators of transcription signaling in response to IL-7among[gamma]-chain cytokines in HIV patients. AIDS 23(11): 1341-7.
[0437] (10)Rose T，et al.(2010)Interleukine-7compartimentilizes its receptor signaling complex to initiate CD4 T lymphocyte response.J Biol Chem 285(20): 14898-14908.
[0438] (ll)Lingwood D,Simons K(2010)Lipid rafts as a membrane-organizing principle.Science 327(5961):46-50.
[0439] (12)Tamarit B，et al.(2013)Membrane microdomains and cytoskeleton organisation shape and regulate the IL-7-receptor signalosome in human CD4T-cells.J Biol Chem.
[0440] (13)Beq S,et al.(2004)HIV infection:pre-highly active antiretroviral therapy IL-7 plasma levels correlate with long term CD4 cell count increase after treatment.AIDS 18(3):563-5.
[0441] (14)Rose T,Lambotte 0,Pallier C,Delfraissy JF,Colle JH(2009) Identification and biochemical characterization of human plasma soluble IL_ 7R:lower concentrations in HIV-1 infected patients.J Immunol 182(12):7389-97.
[0442] (15)Sauce D,Elbim C,Appay V(2013)Monitoring cellular immune markers in HIV infection:from activation to exhaustion.Curr Opin HIV AIDS 8:125-131.
[0443] (16)Younes SA,et al.(2003)HIV-1 viremia prevents the establishment of interleukin-2 producing HIV-specific memory CD4+T cells endowed with proliferative capacity.J Exp Med 198:1909-1922.
[0444] (17)Sirskyj D,Theze J,Kumar A,Kryworuchko M(2008)Disruption of the gamma c cytokine network in T cells during HIV infection.Cytokine 43(1):1-14.
[0445] (18)Pallikkuth S，Parmigiani A，Pahwa S(2012)The role of interleukin-21in HIV infection.Cytokine 23(4-5):173-80.
[0446] (19)Vingert B,et al.(2012)HIV Controllers maintain a population of highly efficient TH1 effector in contrast to patients treated in the long term.J Virol 86(19):10661-10674.
[0447] (20)Sandler NG,Douek DC(2012)Microbial translocation in HIV infection:causes，consequences and treatment opportunities.Nat Rev Microbiol 10(9):655-66.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 調(diào)控GIBSPLA2的量或活性的化合物，用于調(diào)控有此需要的受試者中的免疫應(yīng)答的用 途。2. 權(quán)利要求1的用途的化合物，其中所述化合物是GIBsPLA2抑制劑或配體。3. 權(quán)利要求1的用途的化合物，其中所述化合物誘導(dǎo)或刺激所述免疫應(yīng)答。4. 權(quán)利要求2的用途的化合物，其中所述GIBsPLA2抑制劑或配體選自：抗GIBsPLA2抗體 或其衍生物、抑制性核酸、可溶性受體、肽、或小藥物。5. 權(quán)利要求4的用途的化合物，其中所述GIBsPLA2抑制劑或配體選自：抗GIBsPLA2多克 隆抗體、單克隆抗體、其片段，所述片段選自F(ab'）2和Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、單域 抗體片段(VHH或納米抗體）、二價(jià)抗體片段(雙抗體），以及重組和合成生成的結(jié)合配偶體、 人抗體或人源化抗體或其片段。6. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的化合物，用于誘導(dǎo)或刺激所述受試者中的CD4T細(xì)胞的用 途。7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途的化合物，其中所述受試者是免疫缺陷或免疫抑制 的。8. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途的化合物，其中所述受試者具有傳染病。9. 權(quán)利要求8的用途的化合物，其中所述受試者具有病毒性感染。10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，用于治療感染HIV的受試者中的AIDS的用途。11. 權(quán)利要求10的用途的化合物，用于抑制或反轉(zhuǎn)HIV介導(dǎo)的免疫缺陷。12. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途的化合物，其中所述受試者具有癌癥。13. 權(quán)利要求1的用途的化合物，其中所述化合物是GIBsPLA2激動(dòng)劑或活化劑，并且所 述化合物降低免疫應(yīng)答。14. 權(quán)利要求13的用途的化合物，其中所述GIBsPLA2激動(dòng)劑或活化劑是GIBsPLA2蛋白 或其片段。15. 權(quán)利要求13或14的用途的化合物，其中所述受試者具有由病理性或異常免疫應(yīng)答 引起的疾病，優(yōu)選選自自身免疫性病癥、炎性疾病、癌癥、蕁麻疹、濕疹、變態(tài)反應(yīng)或哮喘。16. 權(quán)利要求1或13-15中任一項(xiàng)的化合物，用于降低受試者中的移植物排斥或者降低 GVHD的用途。17. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途的化合物，其中通過注射，優(yōu)選肌肉內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、 靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)；通過鼻、口服、粘膜、直腸施用或者通過吸入施用所述化合物。18. 藥物組合物，其包含GIBsPLA2調(diào)控劑和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。19. 誘導(dǎo)抗GIBsPLA2免疫應(yīng)答的免疫原，用于調(diào)控有此需要的受試者中的免疫系統(tǒng)的 用途。20. 權(quán)利要求19的用途的免疫原，其中所述免疫原包含人或動(dòng)物GIBsPLA2蛋白、蛋白質(zhì) 片段或肽、或其抗原性片段或模擬位。21. 權(quán)利要求19或20的用途的免疫原，其中所述免疫原為游離形式、聚合的、或化學(xué)或 物理修飾的、和/或與載體連接的。22. 權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的用途的免疫原，其中所述免疫原與佐劑組合。23. 權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)的用途的免疫原，其中所述免疫原誘導(dǎo)中和性抗體。24. 疫苗組合物，其包含誘導(dǎo)抗GIBsPLA2免疫應(yīng)答的免疫原、藥學(xué)可接受載體或賦形劑 和任選地佐劑。25. 權(quán)利要求23的組合物，其中所述免疫原包含GIBsPLA2蛋白或肽，或其抗原性片段或 模擬位。26. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述GIBsPLA2蛋白或其抗原性片段或模擬位為游離形 式、聚合的、或化學(xué)或物理修飾的、或與載體連接的，并且任選地與佐劑組合的。27. 用于診斷與T細(xì)胞改變有關(guān)的人免疫缺陷的方法，其包括： (a) 提供含有來自受試者的體液或組織碎片或細(xì)胞的樣品，并 (b) 檢測(cè)或量化所述樣品中的GIBsPLA2。28. 重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或其祖先已經(jīng)被修飾為含有編碼GIBsPLA2的核酸。29. 用于產(chǎn)生GIBsPLA2的方法，其包括在容許GIBsPLA2表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求28 的細(xì)胞，并且收集GIBsPLA2。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK105980408SQ201480075437
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年12月22日
【發(fā)明人】J.泰澤, T.羅斯, F.巴高爾特
【申請(qǐng)人】巴斯德研究院