一種規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，具體涉及一種用14L生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)輪狀病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：1)Vero細胞的復蘇與傳代，2)細胞收集與接種生物反應器，3)細胞的生物反應器培養(yǎng)，4)換液與細胞的洗滌，5)輪狀病毒的活化及感染，6)輪狀病毒的維持培養(yǎng)及收獲；本發(fā)明的一個目的在于解決大規(guī)模輪狀病毒疫苗生產(chǎn)中輪狀病毒不易釋放出細胞導致獲得的病毒毒力滴度低的缺陷，從而獲得了高滴度輪狀病毒病毒，極大地提高了輪狀病毒的產(chǎn)量；另一個目的在于解決大生產(chǎn)過程中輪狀病毒的吸附感染力度低的缺陷，從而極大地提高了輪狀病毒質(zhì)量，進而提升輪狀病毒滅活疫苗的抗原性和免疫原性。
【專利說明】
一種規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法
技術領域：
[0001] 本發(fā)明屬于制備病毒滅活疫苗的方法，特別是涉及一種用14L生物反應器大規(guī)模 培養(yǎng)輪狀病毒的方法。
【背景技術】：
[0002] 輪狀病毒是全球?qū)е聥胗變喊l(fā)生嚴重脫水性腹瀉（severe dehydrating diarrhea)的主要病原體。幾乎所有的兒童在2~3歲之前都被輪狀病毒感染過。甚至在衛(wèi)生 水平很高的發(fā)達國家，輪狀病毒也是導致嚴重腹瀉最常見的病原體。據(jù)報道，輪狀病毒引起 的腹瀉約占秋季腹瀉的50%。全世界每年因輪狀病毒感染可導致就診的約2400萬人次，其 中約有230萬人次住院治療，約有60萬人死亡輪狀病毒感染。通過全球范圍內(nèi)的多方努力， 在發(fā)展中國家推廣的口服補液治療降低了腹瀉死亡率。然而，不斷出現(xiàn)的與輪狀病相關的 死亡病例(每天約1200~1600例）告訴我們，只有通過廣泛使用安全、經(jīng)濟且有效的疫苗，才 能顯著降低輪狀病毒感染所致的患病率和死亡率。
[0003] 目前，國內(nèi)外先后開發(fā)上市的輪狀病毒疫苗均為口服了輪狀病毒減毒活疫苗，包 括GSK公司的單價減毒活疫苗Rotarix，Merck公司生產(chǎn)的5價重配減毒活疫苗RotaTeq，越南 生產(chǎn)的單價減毒活疫苗Rotavin-Ml，以及國內(nèi)蘭州生物制品研究所生產(chǎn)的單價羊株減毒活 疫苗羅特威。迄今為止，尚未有輪狀病毒滅活疫苗生產(chǎn)。從預防免疫角度來講，輪狀病毒活 疫苗雖然起到了一定的免疫和預防作用，但由于疫苗的成份為活病毒，在應用過程中，極易 與機體在自然界中獲得的輪狀病毒進行重配，進而肯能演變成新的輪狀病毒株，或者，疫苗 活病毒株在特殊情況下可能發(fā)生返祖現(xiàn)象。因此，輪狀病毒活疫苗對人體具有潛在的感染 性，對自然界產(chǎn)生新的未知病毒種類風險。為了避免以上風險，輪狀病毒滅活疫苗的開發(fā)勢 在必行。
[0004] 據(jù)報道，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所已開展了輪狀病毒滅活疫苗的研究 (專利申請?zhí)?00710065708.5 )，采用的人二倍體細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)模僅是在培養(yǎng)瓶上小規(guī) 模培養(yǎng)。蘭州生物制品研究所開展的輪狀病毒滅活疫苗研究（專利申請?zhí)?200510041858.3)，采用的是細胞培養(yǎng)瓶小規(guī)模的培養(yǎng)原代細胞或Vero細胞，尚未實現(xiàn)疫苗 的規(guī)?；a(chǎn)。
[0005] 輪狀病毒滅活疫苗大規(guī)模生物反應器產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)不同于小規(guī)模的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)工 藝疫苗生產(chǎn)，有許多需要攻克的技術難點，具體如下：
[0006] 1、傳統(tǒng)的利用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)輪狀病毒過程中，是將感染后的細胞培養(yǎng)了數(shù)天后，將 細胞與培養(yǎng)液進行反復凍融，使細胞破碎，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。這樣的病毒培養(yǎng)及收獲 方式不僅繁瑣、費時費力，而且培養(yǎng)工藝不易大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。然而，傳統(tǒng)工藝中，如果不破碎 細胞，僅收獲上清的培養(yǎng)液，其病毒毒力滴度卻很低。所以，要想利用生物反應器大規(guī)模培 養(yǎng)輪狀病毒，首先需解決不采用凍融細胞的方式，而又能夠獲得高毒力滴度的病毒收獲液。
[0007] 2、輪狀病毒是溫和式病毒，相較于其他病毒而言，培養(yǎng)過程中不能很好地釋放到 細胞外，在傳統(tǒng)小規(guī)模培養(yǎng)過程中該缺點不明顯，但工業(yè)化大生產(chǎn)過程中，輪狀病毒不易釋 放出細胞的缺陷被放大，導致獲得的病毒毒力滴度很低，因此需要對工藝進行摸索改進，以 提高收獲液的產(chǎn)量。
[0008] 3、輪狀病毒吸附感染細胞的前提是輪狀病毒的VP4(-種輪狀病毒蛋白）活化成 VP5和VP8，這一活化過程需要胰蛋白酶和Ca++參與，而細胞培養(yǎng)基中的某些成分，如牛血清， 終止胰蛋白酶的作用或影響Ca ++的參與，導致病毒吸附感染作用減弱，所以如何改善培養(yǎng)條 件從而如何提高輪狀病毒吸附感染也是輪狀病毒疫苗大生產(chǎn)過程中的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009] 本發(fā)明涉及一種規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒滅活疫苗的方法，具體涉及一種用14L生物 反應器大規(guī)模培養(yǎng)輪狀病毒疫苗的方法。本發(fā)明的一個目的在于解決大規(guī)模輪狀病毒疫苗 生產(chǎn)中輪狀病毒不易釋放出細胞導致獲得的病毒毒力滴度低的缺陷，從而獲得了高滴度輪 狀病毒病毒，極大地提高了輪狀病毒的產(chǎn)量。本發(fā)明的另一個目的在于解決大生產(chǎn)過程中 輪狀病毒的吸附感染力度低的缺陷，從而極大地提高了輪狀病毒質(zhì)量，進而提升輪狀病毒 滅活疫苗的抗原性和免疫原性。
[0010] 本發(fā)明所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：
[0011] l)Vero細胞的復蘇與傳代:將Vero細胞加入細胞生長液后放入到C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，細胞長成單層后，消化貼壁細胞，并制成均勻的細胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中，然后加入細 胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞在培養(yǎng)瓶中傳代3次，最后一次使用細胞工廠培養(yǎng)細胞。
[0012] 2)細胞收集與接種生物反應器：當?shù)谌蝹鞔募毎L滿單層后，對每一瓶的貼 壁細胞用消化液進行消化，并將細胞收集到接種瓶中，從瓶中取樣計數(shù)細胞，接種于事先加 入細胞生長液和載體的14L的生物反應器中。
[0013] 3)細胞的生物反應器培養(yǎng):細胞接種后，采用灌流的方式加進細胞生長液，同時排 除細胞培養(yǎng)廢液，并且每天從反應器中取樣計數(shù)細胞，細胞生長液是含有6 %牛血清的M199 培養(yǎng)液；
[0014] 4)換液與細胞的洗滌：當細胞達到5.4~6.4\106(^118/1111時，更換生物反應器的 進液，即由不含牛血清的細胞維持液更換含有牛血清的細胞生長液，繼續(xù)灌流培養(yǎng)；
[0015] 5)輪狀病毒的活化及感染：生物反應器中換為細胞維持液后24小時，調(diào)整生物反 應器的控制條件，維持1~4小時后，取樣計數(shù)細胞，并將Μ0Ι值控制在0.05~0.5接種活化后 的輪狀病毒種子；
[0016] 6)輪狀病毒的維持培養(yǎng)及收獲:毒種接種后采用連續(xù)灌流的方式進行培養(yǎng)，并調(diào) 整生物反應器培養(yǎng)條件，每天從反應器中取樣并用膠體金試紙卡檢測，檢測卡樣品條帶顏 色深淺與陽性條帶相同，開始連續(xù)收獲病毒液，檢測卡樣品條帶顏色深淺度低于陽性條帶 顏色深淺度，停止收獲病毒液。
[0017] 具體地，步驟1)所述的細胞生長液組成成分為含有6 %~10 %牛血清的M199培養(yǎng) 液。
[0018] 具體地，步驟2)所述的細胞接種的分種率為1:3~1:4。
[0019] 具體地，步驟2)所述的載體為球狀微載體或者片狀載體，所述細胞生長液是:含有 6 %牛血清的Ml 99培養(yǎng)液。
[0020] 優(yōu)選地，步驟2)所述的球狀微載體為Cytodexl，0}^〇(1612,〇71:〇(1613中的一種。
[0021] 具體地，步驟3)所述的14L生物反應器的培養(yǎng)條件為，溫度:37.0°C ;pH: 7.3;溶氧： 35%〇
[0022] 具體地，步驟3)所述的14L生物反應器培養(yǎng)的灌流速度:0.5~1.5WV/D。
[0023] 具體地，步驟4)所述的不含牛血清的細胞維持液組成成分為含有0.5ug/ml胰蛋白 酶的Ml 99培養(yǎng)液。
[0024] 具體地，步驟4)所述的灌流培養(yǎng)的灌流速度為5~7WV/D。
[0025] 具體地，步驟5)所述活化后的輪狀病毒種子，采用的活化母液為含有胰蛋白酶終 濃度 1 〇_20ug/ml，Ca++終濃度40~80ug/ml 的D-Hank ' s溶液。
[0026]具體地，步驟5)所述的生物反應器的控制條件為:溫度34.0~36.5°C，pH值7.3~ 7.6,溶氧 20%~30%;
[0027]具體地，步驟6)所述的生物反應器維持培養(yǎng)條件為:溫度：36.5~37.0 °C，pH: 7.3 ~7.4，溶氧:30 %~50 %，采用連續(xù)灌流的灌流速度為1.0~1.5WV/D。
[0028] 本發(fā)明涉及一種規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，優(yōu)點如下：
[0029] 1)本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的利用培養(yǎng)瓶或細胞工廠靜止培養(yǎng)輪狀病毒的缺陷，采用 14L生物反應器培養(yǎng)輪狀病毒的方法大大地提高了輪狀病毒的產(chǎn)量和質(zhì)量，每14L生物反應 器單次培養(yǎng)收獲病毒液65~75L，相當于85~90個3L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)收獲的病毒總量；35~40個 10L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)收獲的病毒總量;30~35個10層細胞工廠培養(yǎng)收獲的病毒總量。生物反應器培 養(yǎng)獲得的輪狀病毒液的毒力滴度平均為7.0~7.51gCCID50/ml，而轉(zhuǎn)瓶或細胞工廠培養(yǎng)收 獲輪狀病毒液，其毒力滴度一般在6.0~7.01gCCID 5Q/ml，提高近1個數(shù)量級。生物反應器培 養(yǎng)的抗原含量平均為2.5ug/ml，而利用培養(yǎng)瓶或細胞工廠培養(yǎng)的輪狀病毒抗原含量一般不 高于 2 · Oug/ml。
[0030] 2)本發(fā)明采用連續(xù)灌流的方式進行輪狀病毒的增殖培養(yǎng)以及連續(xù)收獲輪狀病毒 上清液，不同于細胞培養(yǎng)瓶或細胞工廠培養(yǎng)病毒時，一次性收獲，并需要連同細胞一起收 獲，再進行凍融、離心，收取病毒上清，本發(fā)明避免了凍融細胞，離心收獲病毒的繁瑣工藝步 驟，更有利于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0031] 3)輪狀病毒與其他劇烈式病毒不同，它是一種溫和式病毒，不易從細胞內(nèi)釋放出 來，在大生產(chǎn)過程中此缺陷會進一步放大，本發(fā)明通過大量實驗，調(diào)整大生產(chǎn)過程中的各項 反應參數(shù)，使細胞持續(xù)性的裂解衰亡，釋放出病毒，進而可以連續(xù)收獲高毒力滴度的輪狀病 毒液；
[0032] 4)輪狀病毒吸附感染細胞的前提是輪狀病毒的VP4(-種輪狀病毒蛋白）活化成 VP5和VP8，這一活化過程需要胰蛋白酶和Ca++參與，而細胞培養(yǎng)基中的某些成分，如牛血清， 終止胰蛋白酶的作用或影響Ca++的參與，導致病毒吸附感染作用減弱。本發(fā)明在生物反應器 培養(yǎng)Vero細胞的后期，采用連續(xù)洗換的方式，將細胞培養(yǎng)液(含有一定濃度的牛血清)更換 成了無血清的細胞維持液，并相應地增加了 Ca++，并在病毒種子接種到生物反應器內(nèi)的同 時，調(diào)整生物反應器的控制條件，使細胞狀態(tài)達到一種"病態(tài)"，同時將這種"病態(tài)"需要控制 在一定的時間內(nèi)（2~3小時），使病毒更容易感染細胞，本發(fā)明貼合輪狀病毒溫和性的特點， 通過調(diào)整培養(yǎng)條件有效提高了輪狀病毒的吸附感染力度。
[0033] 5)輪狀病毒吸附感染細胞之后，及時調(diào)整生物反應器的控制條件，改善細胞的營 養(yǎng)環(huán)境和狀態(tài)環(huán)境，使Vero細胞保持良好的生長狀態(tài)，一方面有利于病毒的增殖，另一方面 保障細胞可以較長時間維持新陳代謝，即較長時間的作為病毒的"培養(yǎng)基"，進而提高病毒 產(chǎn)量。其實，病毒感染細胞后，病毒增殖與細胞保持良好的狀態(tài)是一對矛盾，平衡好這對矛 盾，就會提高病毒的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過大量的試驗，我們特別針對輪狀病毒溫和的特性，建 立了克服這對矛盾的辦法。首先，通過調(diào)整是細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)環(huán)境，增強傳質(zhì)和傳氧能力， 如采用連續(xù)灌流的補液和收獲方式，提高了傳質(zhì)能力;改善反應器的攪拌轉(zhuǎn)速，以及換氣次 數(shù)和維持合適的罐內(nèi)壓，提高了傳氧能力等等。其次，通過調(diào)整細胞培養(yǎng)的狀態(tài)環(huán)境，改善 細胞培養(yǎng)環(huán)境，如及時調(diào)整合適的培養(yǎng)溫度，維持穩(wěn)定的培養(yǎng)液酸堿度，采用無泡式通氣等 等。通過維持良好的營養(yǎng)環(huán)境和狀態(tài)環(huán)境，不僅提高了病毒在細胞中的增殖，并且充分地釋 放到培養(yǎng)液中，而且維持良好細胞狀態(tài)，也為提高病毒的產(chǎn)量奠定了良好的基礎。
[0034] 綜上所述，本發(fā)明可利用14L生物反應器培養(yǎng)輪狀病毒，克服了培養(yǎng)瓶或細胞工廠 培養(yǎng)過程中，需要一并收獲細胞及培養(yǎng)液，進行凍融后還需要離心，污染風險極大，不利于 疫苗規(guī)模化的生產(chǎn)的缺陷，特別針對溫和性輪狀病毒設計各反應參數(shù)，大大地提高病毒毒 力和抗原含量，并且病毒液的收獲也大幅提高，收獲的上清液僅需要簡單的管道連接式的 微濾就可進行后續(xù)的純化了，污染風險極小，適合規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)疫苗生產(chǎn)的理念。
【附圖說明】：
[0035] 圖1:膠體金試紙卡樣品色帶與標準色帶的比較說明圖；
[0036]卡上標示:C為標準色帶；T為樣品色帶；S為加樣孔；1號上樣卡為樣品色帶淺于標 準色帶;2號上樣卡為樣品色帶與標準色帶相近;3號上樣卡為樣品色帶深于標準色帶。 具體實施例：
[0037]實施例1:輪狀病毒液的制備
[0038] l)Vero細胞的復蘇與傳代:裝有Vero細胞工作種子(細胞來源于ATCC，細胞工作種 子為自制）的凍存管從液氮中取出后，快速放入40 °C的水浴中融化，然后在超凈臺中取出細 胞懸液，加入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入細胞生長液，放入到C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng);細胞長成單層 后，將貼壁細胞進行消化，并制成均勻的細胞懸液，按照1:3的分種率，接種于細胞瓶中，加 入細胞生長液后，放入到C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，本次細胞接種生物反應器前傳代3次，最后 一次使用的是10層細胞工廠培養(yǎng)；
[0039] 2)細胞收集與接種生物反應器：當?shù)谌蝹鞔募毎L滿單層后，對貼壁的細胞 用消化液進行消化，并將細胞收集到接種瓶中，從瓶中取樣計數(shù)細胞，然后將細胞接種于事 先加入6%牛血清的M199培養(yǎng)液(細胞生長液)和載體Cytodexl的14L生物反應器中；
[0040] 3)細胞在生物反應器內(nèi)培養(yǎng)：細胞接種后，設置培養(yǎng)條件為，溫度：36.8 °C; pH: 7.2;溶氧:35 % ;灌流速度:1.5WV/D。每天從反應器中取樣計數(shù)細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0041 ] 4)換液與細胞的洗滌：當細胞計數(shù)為6.4 X 106cellS/ml時，更換生物反應器的進 液，生物反應器的進液為:含有0.5ug/ml胰蛋白酶的M199培養(yǎng)液，并加大灌流速度(6WV/D) 繼續(xù)灌流培養(yǎng)；
[0042] 5)輪狀病毒的活化及感染:毒種接種生物反應器之前，需要將病毒種子活化，即按 照胰蛋白酶終濃度為20ug/ml，Ca++終濃度為80ug/ml，向毒種液中加入活化母液，然后，放置 在37°C培養(yǎng)箱中孵育1.5小時，用于接種生物反應器內(nèi)，以感染細胞;而在生物反應器換液 后24小時，調(diào)整生物反應器的控制條件為:溫度36.0°C，pH值7.5，溶氧20 %，維持灌流速度 為1.5WV/D，這種狀態(tài)維持在2小時，然后取樣計數(shù)細胞，按照MOI為0.3接種活化后的病毒種 子；
[0043] 6)輪狀病毒的維持培養(yǎng)及收獲:毒種接種后，調(diào)整培養(yǎng)條件為，溫度:37.0°C;pH: 7.3;溶氧:45% ;連續(xù)灌流的灌流速度：1. OWV/D。每天從生物反應器中取樣，并用膠體金試 紙卡檢測，感染后第4天，檢測卡樣品條帶顏色深淺與陽性條帶相近，便開始連續(xù)收獲病毒 液，檢測卡樣品條帶顏色深淺度低于陽性條帶顏色深淺度，這時停止收獲病毒液，總收獲液 約 75L。
[0044] 輪狀病毒毒力滴定與抗原檢測:每天從生物反應器中取的樣，以及總的收獲液(收 獲合并液)取樣，利用輪狀病毒檢測細胞MA104細胞進行病毒毒力的滴定(滴度檢測），利用 ELISA試劑盒檢測輪狀病毒抗原含量。本次病毒合并液的滴度達7.31gCCID5Q/ml，抗原含量 達2.5ug/ml〇
[0045] 實施例2:
[0046] 14L生物反應器培養(yǎng)輪狀病毒疫苗的方法，制備方法同實施例1所示，其中步驟4) 所述的生物反應器進液，以及更換液體的灌流速度，對生物反應器生產(chǎn)輪狀病毒也有一定 的影響，具體如表1所示。
[0047] 表1:
[0049] 結論:如表1所示，組1與組5比，組5僅僅是沒有換液，即一直使用含6%牛血清細胞 生長液作為感染后的細胞維持液，但膠體金試劑盒檢測的結果是，感染后10天，取樣的檢測 條帶顏色還遠淺于陽性條帶的顏色，病毒滴度和抗原含量也都非常低。所以感染前是否更 換成不含血清的維持液，以及更換維持液的徹底性，會直接影響收毒的效果，同時，灌流速 度為5-7WV/D，病毒滴度和抗原含量含量較高。
[0050] 實施例3:
[00511 14L生物反應器培養(yǎng)輪狀病毒疫苗的方法，制備方法同實施例1所示，其中步驟5) 所述的病毒種子活化與生物反應器換液后24小時到細胞感染期間的生物反應器控制條件 如表2所示。
[0052]表2:
[0054]結論:如表2所示，組1-3收獲的輪狀病毒合并液可達65L以上，收液的病毒滴度達 到7.01gCCID5Q/ml以上，抗原含量達2.2ug/ml以上，符合大規(guī)模生產(chǎn)要求，其中組1 (即為實 施例1)的輪狀病毒合并液的滴度及抗原含量最優(yōu)。而組4，組5收獲的的收獲液，收獲液的病 毒滴度較低，抗原含量也較低，因此，步驟5)所述的生物反應器的控制條件為:溫度34.0~ 36.5°C，pH值7.3~7.6，溶氧20%~30%，這種狀態(tài)維持1~4小時；
[0055] 實施例4:
[0056] 14L生物反應器培養(yǎng)輪狀病毒疫苗的方法，制備方法同實施例1所示，其中步驟6) 所述的感染后維持培養(yǎng)的控制條件和病毒收獲情況如表3所示。
[0057] 表3:
[0058]
[0059]結論:如表3所示，組1-3收獲的輪狀病毒合并液可達65L以上，收液的病毒滴度達 到7.01gCCID5Q/ml以上，抗原含量達2.2ug/ml以上，符合大規(guī)模生產(chǎn)要求，其中組1 (即為實 施例1)的輪狀病毒合并液的滴度及抗原含量最優(yōu)。而組4，組5收獲的的收獲液，不僅病毒收 獲液的體積較少，而且收獲液的病毒滴度較低，抗原含量也較低，因此，步驟6)所述的培養(yǎng) 條件，溫度：36.5~37.0°C，pH: 7.3~7.4，溶氧：30 %~50 %，采用連續(xù)灌流的灌流速度為 1.0~1.5WV/D〇
【主權項】
1. 一種規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，包括以下步驟： 1. Vero細胞的復蘇與傳代:將Vero細胞加入細胞生長液后放入到C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細 胞長成單層后，消化貼壁細胞，并制成均勻的細胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中，然后加入細胞生 長液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞在培養(yǎng)瓶中傳代3次，最后一次使用細胞工廠培養(yǎng)細胞； 2) 細胞收集與接種生物反應器：當?shù)谌蝹鞔募毎L滿單層后，對每一瓶的貼壁細 胞用消化液進行消化，并將細胞收集到接種瓶中，從瓶中取樣計數(shù)細胞，接種于事先加入細 胞生長液和載體的14L的生物反應器中； 3) 細胞的生物反應器培養(yǎng):細胞接種后，采用灌流的方式加進細胞生長液和排除細胞 培養(yǎng)廢液，并且每天從反應器中取樣計數(shù)細胞，所述細胞生長液是含有6 %牛血清蛋白的 Ml 99培養(yǎng)液； 4) 換液與細胞的洗滌：當細胞達到5.4~6.4 X 106cellS/ml時，更換生物反應器的進液， 即由不含牛血清的細胞維持液更換含有牛血清的細胞生長液，繼續(xù)灌流培養(yǎng)； 5) 輪狀病毒的活化及感染:生物反應器中換為細胞維持液后24小時，調(diào)整生物反應器 的控制條件，維持1~4小時后，取樣計數(shù)細胞，并將M0I值控制在0.05~0.5接種活化后的輪 狀病毒種子； 6) 輪狀病毒的維持培養(yǎng)及收獲:毒種接種后采用連續(xù)灌流的方式進行培養(yǎng)，并調(diào)整生 物反應器培養(yǎng)條件，每天從反應器中取樣并用膠體金試紙卡檢測，檢測卡樣品條帶顏色深 淺與陽性條帶相同，開始連續(xù)收獲病毒液，檢測卡樣品條帶顏色深淺度低于陽性條帶顏色 深淺度，停止收獲病毒液。2. 如權利要求1所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟1)所述的細 胞生長液組成成分為含有6 %~10 %牛血清的M199培養(yǎng)液。3. 如權利要求2所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟2)所述的細 胞接種的分種率為1:3~1:4。4. 如權利要求3所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟3)所述的 14L生物反應器的培養(yǎng)條件為，溫度:37.0 °C ; pH: 7.3;溶氧:35 %。5. 如權利要求4所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟3)所述的 14L生物反應器培養(yǎng)的灌流速度:0.5~1.5WV/D。6. 如權利要求5所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟4)所述的不 含牛血清的細胞維持液組成成分為含有0.5ug/ml胰蛋白酶的M199培養(yǎng)液。7. 如權利要求6所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟4)所述的灌 流培養(yǎng)的灌流速度為5~7WV/D。8. 如權利要求7所述的規(guī)模化生產(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟5)所述活化 后的輪狀病毒種子，采用的活化母液為含有胰蛋白酶終濃度10_20ug/ml，Ca++終濃度40~ 80ug/ml 的 D-Hank' s 溶液。9. 如權利要求8所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟5)所述的生 物反應器的控制條件為:溫度34.0~36.5°C，pH值7.3~7.6，溶氧20%~30%。10. 如權利要求9所述的規(guī)?；a(chǎn)輪狀病毒疫苗的方法，其特征在于，步驟6)所述的 生物反應器維持培養(yǎng)條件為:溫度:36.5~37.0 °C，pH :7.3~7.4,溶氧:30%~50%，采用連 續(xù)灌流的灌流速度為1.0~1.5WV/D。
【文檔編號】C12N7/00GK105969737SQ201610338801
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】李云富, 李剛, 黃勇, 付臻鵬, 劉春庭, 羅翀, 胡雪芹, 肖俊光
【申請人】麗珠集團疫苗工程股份有限公司