一種快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法及黑29品種特異性分子身份證的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法及黑29品種特異性分子身份證，通過SSR分子標(biāo)記對(duì)黑木耳品種進(jìn)行研究，采用資源特征分析軟件分析研究結(jié)果，將研究結(jié)果量化，得出字符串形式的結(jié)果，構(gòu)建黑木耳品種分子身份證特異性指紋圖譜。分子身份證把品種特征數(shù)字化，這樣可簡(jiǎn)單明了地區(qū)分不同黑木耳品種間的差異，這種分子身份證可用于黑木耳品種的真?zhèn)舞b定和遺傳關(guān)系分析，為黑木耳品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了有效的科學(xué)依據(jù)。在黑木耳品種鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，只需將黑木耳品種與已有特異性分子身份證比較分析，即可確定其是否為已通過審定的黑木耳品種。這大大降低了黑木耳種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)的時(shí)間和費(fèi)用，提高了黑木耳品種鑒定評(píng)價(jià)的效率。
【專利說(shuō)明】
一種快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法及黑29品種特 異性分子身份證
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑木耳種質(zhì)資源評(píng)價(jià)鑒定方法及按照該方法構(gòu)建的黑29品種特 異性分子身份證。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑龍江省作為黑木耳主產(chǎn)區(qū)，黑木耳產(chǎn)量居全國(guó)首位，據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)， 2014年黑龍江省黑木耳種植63.5億袋，總產(chǎn)量316.44萬(wàn)噸，產(chǎn)值166.7億元。黑龍江省氣溫 低、晝夜溫差大、日照時(shí)間長(zhǎng)等獨(dú)特的氣候特點(diǎn)使生產(chǎn)的黑木耳色黑肉厚，品質(zhì)好。隨著黑 龍江省黑木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)于黑木耳菌種的需求越來(lái)越大。但是，市場(chǎng)對(duì)于黑木耳品種管 理混亂，不同菌種生產(chǎn)企業(yè)之間相互引種頻繁并自主命名，導(dǎo)致黑木耳菌種市場(chǎng)"同物異 名、同名異物"現(xiàn)象普遍存在，這給黑木耳品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、菌種質(zhì)量管理和新品種審 定帶來(lái)了很大的困難。
[0003] 為了保護(hù)優(yōu)良的黑木耳種質(zhì)資源，需要對(duì)黑木耳品種進(jìn)行科學(xué)鑒定和評(píng)價(jià)。但目 前缺乏簡(jiǎn)潔高效的菌種檢測(cè)手段，因此迫切需要研制一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌種鑒定評(píng)價(jià) 技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)方法，以保證生產(chǎn)用種的準(zhǔn)確無(wú)誤。
[0004] 黑龍江省從2008年開始實(shí)施黑木耳品種的審定，黑木耳審定品種的區(qū)別性鑒定工 作主要通過農(nóng)藝性狀、RAro和ISSR方法進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒定。
[0005] 農(nóng)藝性狀主要根據(jù)表型分析的DUS (Distinctness，Uniformity和Stability)測(cè)試 來(lái)鑒定，但是，由于黑木耳子實(shí)體形態(tài)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在不同的栽培模式、不同的管理方式下，黑 木耳子實(shí)體的形態(tài)、色澤、產(chǎn)量存在較大差異，且部分性狀的鑒定易受人為因素影響。分子 標(biāo)記方法克服了農(nóng)藝性狀受人為因素的影響，但是RAPD為單引物分子標(biāo)記，擴(kuò)增結(jié)果不夠 穩(wěn)定，重復(fù)性較差。ISSR也是單引物分子標(biāo)記，雖然提高了退火溫度，克服了 RAPD的不足，但 是在黑木耳品種評(píng)價(jià)鑒定時(shí)，結(jié)果易受到操作批次的影響，結(jié)果的重復(fù)性較差。采用成對(duì)引 物的SRAP和TRAP分子標(biāo)記重復(fù)性較好，但是針對(duì)食用菌類種質(zhì)使用此方法時(shí)，遺傳多樣性 較低，需要大量引物對(duì)才能有效區(qū)分，工作量大且繁瑣。而且，在進(jìn)行新品種的鑒定評(píng)價(jià)時(shí)， 每當(dāng)有新品種需要鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，都需要對(duì)已鑒定評(píng)價(jià)的品種再次進(jìn)行分析，工作量大，不利 于新品種的快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)。
[0006] 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR)是以2~6個(gè)堿基為重復(fù)單元的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛存在于高 等生物的基因組中。SSR分子標(biāo)記符合品種鑒別的基本準(zhǔn)則，即環(huán)境穩(wěn)定性、品種間變異可 識(shí)別性、最小的品種內(nèi)變異和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。因此，SSR分子標(biāo)記在黑木耳品種鑒定評(píng)價(jià) 中具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于通過SSR分子標(biāo)記對(duì)黑木耳品種進(jìn)行研究，建立一種快速準(zhǔn)確 鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法及黑29品種特異性分子身份證，采用資源特征分析軟件分 析研究結(jié)果，將研究結(jié)果量化，得出字符串形式的結(jié)果，構(gòu)建黑木耳品種分子身份證特異性 指紋圖譜。特異性分子身份證把品種特征數(shù)字化，這樣可以簡(jiǎn)單明了地區(qū)分不同黑木耳品 種間的差異，這種特異性分子身份證可用于黑木耳品種的真?zhèn)舞b定和遺傳關(guān)系分析，為黑 木耳品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了有效的科學(xué)依據(jù)。而且，在黑木耳品種鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，只需要 以待檢測(cè)黑木耳品種為實(shí)驗(yàn)材料，按照黑木耳種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)方法操作，通過與已有特 異性分子身份證的比較分析，即可確定其是否為已通過審定的黑木耳品種。這大大降低了 黑木耳種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)的時(shí)間和費(fèi)用，提高了黑木耳品種鑒定評(píng)價(jià)的效率，且精確度較 尚。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法，包括如下步驟：
[0010] ⑴母種活化
[0011] 將母種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將母種轉(zhuǎn)接到cPDA固體培養(yǎng)皿中央，25 °C恒 溫避光培養(yǎng)8d活化備用。
[0012] ⑵液體培養(yǎng)
[0013] 接種時(shí)用0.5cm打孔器在相同菌齡處打孔，接種錐形瓶中，每瓶錐形瓶中裝有液體 培養(yǎng)基200mL，每個(gè)錐形瓶接種10個(gè)接種塊，120r/min，25°C恒溫避光培養(yǎng)10d。
[0014] (3)菌絲收集
[0015] 液體搖瓶菌絲體用四層紗布過濾，過濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，收集 的菌絲體于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0016] (4)總 DNA 提取
[0017]采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。
[0018] (5)總DNA質(zhì)量檢測(cè)
[0019] 采用DYY-12型電泳儀用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0020] 采用UV757CRT紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度，測(cè)定A260值和A280值，要求A280/ A260為1.8至2.0時(shí)可用于后續(xù)試驗(yàn)操作，樣品稀釋到50mgAiL，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] (6)SSR 引物
[0022] SSR引物如表1所示。
[0023] 表1SSR引物表
[0026] (7)SSR 擴(kuò)增
[0027] 擴(kuò)增體系：2.0yL lOXEx Taq Buffer(Takara)，2.0yL dNTP(0.2mmol/L)，1.0yL 上游引物(〇 · 5μL?〇 1 /L)，1 · OyL下游引物(0 · 5μL?〇 1 /L)，0 · 5U DNA聚合酶(Takara)，1 · OyL模板 DNA(50ngAiL)，ddH20補(bǔ)至20yL。
[0028] 擴(kuò)增程序:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 3〇8,54~60°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸21^11，35個(gè) 循環(huán);72°C延伸7min，退火溫度如表1所示。
[0029] 電泳成像:采用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳結(jié)果。
[0030] (8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
[0031]對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0,構(gòu)建 初始〇、1數(shù)據(jù)矩陣。
[0032] (9)資源特征分析軟件分析
[0033]采用資源特征分析軟件ID Analysis軟件按照SSR引物編號(hào)順序，構(gòu)建黑木耳種質(zhì) 資源的特異性分子身份證。
[0034] (10)黑木耳品種鑒定評(píng)價(jià)
[0035]當(dāng)黑木耳品種需要鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，以待檢測(cè)黑木耳品種為實(shí)驗(yàn)材料，執(zhí)行步驟（1)- (9)，通過與已有特異性分子身份證比較分析，即可確定其是否為已通過審定的黑木耳品 種。
[0036] 一種黑29品種特異性分子身份證，其構(gòu)建方法如下：
[0037] (1)母種活化
[0038] 將黑29母種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將母種轉(zhuǎn)接到cPDA固體培養(yǎng)皿中央，25 °C恒溫避光培養(yǎng)8d活化備用。
[0039] (2)液體培養(yǎng)
[0040]接種時(shí)用0.5cm打孔器在相同菌齡處打孔，接種錐形瓶中，每瓶錐形瓶中裝有液體 培養(yǎng)基200mL，每個(gè)錐形瓶接種10個(gè)接種塊，120r/min，25°C恒溫避光培養(yǎng)10d。
[00411 (3)菌絲收集
[0042] 液體搖瓶菌絲體用四層紗布過濾，過濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，收集 的菌絲體于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0043] (4)總 DNA 提取
[0044]采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。
[0045] (5)總DNA質(zhì)量檢測(cè)
[0046]采用DYY-12型電泳儀用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0047] 采用UV757CRT紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度，測(cè)定A260值和A280值，要求A280/ A260為1.8至2.0時(shí)可用于后續(xù)試驗(yàn)操作，樣品稀釋到50mgAiL，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0048] (6)SSR 引物 [0049] SSR引物如表1所示。
[0050] (7)SSR 擴(kuò)增
[0051] 擴(kuò)增體系：2.0yL lOXEx Taq Buffer(Takara)，2.0yL dNTP(0.2mmol/L)，1.0yL 上游引物(〇 · 5ymo 1 /L)，1 · OyL下游引物(0 · 5ymo 1 /L)，0 · 5U DNA聚合酶(Takara)，1 · OyL模板 DNA(50ngAiL)，ddH20補(bǔ)至20yL。
[0052] 擴(kuò)增程序:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 3〇8,54~60°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸21^11，35個(gè) 循環(huán);72°C延伸7min，退火溫度如表1所示。
[0053]電泳成像:采用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳結(jié)果。
[0054] (8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
[0055]對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0,構(gòu)建 初始〇、1數(shù)據(jù)矩陣。
[0056] (9)資源特征分析軟件分析
[0057]采用資源特征分析軟件ID Analysis軟件按照SSR引物編號(hào)順序，構(gòu)建黑29的特異 性分子身份證，其特異分子身份證為111010110011011110101011。
[0058]本發(fā)明建立了一種快速準(zhǔn)確的黑木耳種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法，每個(gè)黑木耳 品種形成獨(dú)特的分子身份證，以期能構(gòu)建黑木耳品種分子身份證特異性指紋圖譜。當(dāng)黑木 耳品種需要鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，只需要以待檢測(cè)黑木耳品種為實(shí)驗(yàn)材料，按照黑木耳種質(zhì)資源鑒 定評(píng)價(jià)方法操作，通過與已有特異性分子身份證的比較分析，即可確定其是否為已通過審 定的黑木耳品種。這大大降低了黑木耳種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)的時(shí)間和費(fèi)用，提高了黑木耳品 種鑒定評(píng)價(jià)的效率，且精確度較高。特異性分子身份證把品種特征數(shù)字化，采用資源特征分 析軟件分析得出了字符串形式的結(jié)果，這樣可以簡(jiǎn)單明了地區(qū)分品種間的差異，其中的分 子數(shù)據(jù)可用于黑木耳品種的真?zhèn)舞b定和遺傳關(guān)系分析，為黑木耳品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供 了有效的科學(xué)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù) 方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的保護(hù)范圍中。
【具體實(shí)施方式】 [0060] 一:本實(shí)施方式提供了一種快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方 法，具體步驟如下：
[0061] (1)母種活化
[0062] 配制cPDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方:土豆20 % (用浸出汁），硫酸鎂0.05 %，磷酸二 氫鉀0.2 %，瓊脂2 %。將母種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將母種轉(zhuǎn)接到cPDA固體培養(yǎng)皿中 央，25 °C恒溫避光培養(yǎng)8d活化備用。
[0063] (2)液體培養(yǎng)
[0064] 接種時(shí)用0.5cm打孔器在相同菌齡處打孔，接種錐形瓶中，每瓶錐形瓶中裝有液體 PD培養(yǎng)基200mL，每個(gè)錐形瓶接種10個(gè)接種塊，采用ZHWY-211B搖床，120r/min，25 °C恒溫避 光培養(yǎng)10d。
[0065] (3)菌絲收集
[0066] 液體搖瓶菌絲體用四層紗布過濾，過濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，收集 的菌絲體于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0067] (4)總 DNA 提取
[0068] 采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03,天根生化)提取總DNA。
[0069] (5)總DNA質(zhì)量檢測(cè)
[0070] 采用DYY-12型電泳儀用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，要求提取的總DNA電泳條帶清 晰，濃度較大。
[0071] 采用UV757CRT紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度，測(cè)定A260值和A280值，要求A280/ A260為1.8至2.0時(shí)可用于后續(xù)試驗(yàn)操作，樣品稀釋到50mgAiL，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0072] (6)SSR 引物
[0073] 從食用菌其他品種中篩選應(yīng)用效果較好的SSR引物，從SSR隨機(jī)引物中篩選應(yīng)用效 果較好的SSR引物，利用NCBI中黑木耳SSR序列設(shè)計(jì)SSR引物。其中篩選出8對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增 穩(wěn)定、重復(fù)性好的SSR引物，可用于黑木耳種質(zhì)資源的快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)。篩選出的8對(duì)引物 如表1所示。
[0074] 表1SSR引物表
[0077] (7)SSR 擴(kuò)增
[0078] 擴(kuò)增體系：2.0yL lOXEx Taq Buffer(Takara)，2.0yL dNTP(0.2mmol/L)，1.0yL 上游引物(〇 · 5μL?〇 1 /L)，1 · OyL下游引物(0 · 5μL?〇 1 /L)，0 · 5U DNA聚合酶(Takara)，1 · OyL模板 DNA(50ngAiL)，ddH20補(bǔ)至20yL。
[0079] 擴(kuò)增程序:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 3〇8,54~60°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸21^11，35個(gè) 循環(huán);72 °C延伸7min。擴(kuò)增反應(yīng)在S1000? Thermal Cycler (BIO-RAD)儀器上進(jìn)行。具體退貨 溫度如表1所示。
[0080] 電泳成像:采用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳結(jié)果。
[0081] (8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
[0082]對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0,構(gòu)建 初始〇、1數(shù)據(jù)矩陣。
[0083] (9)資源特征分析軟件分析
[0084]采用資源特征分析軟件ID Analysis軟件按照SSR引物編號(hào)順序，構(gòu)建黑木耳種質(zhì) 資源的特異性分子身份證。
[0085]本實(shí)施方式中，構(gòu)建黑木耳種質(zhì)資源的特異性分子身份證所用試驗(yàn)材料如表2所 示，共計(jì)8株黑木耳品種。表2中所有的黑木耳品種均已通過審定，為黑龍江省黑木耳主栽黑 木耳品種。基于本實(shí)施方式提供的方法已構(gòu)建出這8株黑木耳品種特異性分子身份證，并形 成黑木耳特異性分子身份證指紋圖譜。
[0086] 表2黑木耳品種
[0089] (10)新品種鑒定評(píng)價(jià)
[0090]當(dāng)黑木耳品種需要鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，以待檢測(cè)黑木耳品種為實(shí)驗(yàn)材料，執(zhí)行步驟（1)- (9)，通過與已有特異性分子身份證比較分析，即可確定其是否為已通過審定的黑木耳品 種。
[0091 ]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式提供了黑29品種特異性分子身份證，其構(gòu)建方法如 下：
[0092] (1)母種活化
[0093]將黑29母種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將母種轉(zhuǎn)接到cPDA固體培養(yǎng)皿中央，25 °C恒溫避光培養(yǎng)8d活化備用。
[0094] (2)液體培養(yǎng)
[0095] 接種時(shí)用0.5cm打孔器在相同菌齡處打孔，接種錐形瓶中，每瓶錐形瓶中裝有液體 PD培養(yǎng)基200mL，每個(gè)錐形瓶接種10個(gè)接種塊，采用ZHWY-211B搖床，120r/min，25 °C恒溫避 光培養(yǎng)10d。
[0096] (3)菌絲收集
[0097] 液體搖瓶菌絲體用四層紗布過濾，過濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，收集 的菌絲體于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0098] (4)總 DNA 提取
[0099] 采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03,天根生化)提取總DNA。
[0100] (5)總DNA質(zhì)量檢測(cè)
[0101] 采用DYY-12型電泳儀用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，要求提取的總DNA電泳條帶清 晰，濃度較大。
[0102] 采用UV757CRT紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度，測(cè)定A260值和A280值，要求A280/ A260為1.8至2.0時(shí)可用于后續(xù)試驗(yàn)操作，樣品稀釋到50mgAiL，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0103] (6)SSR 引物
[0104] 引物如表1所示。
[0105] (7)SSR 擴(kuò)增
[0106] 擴(kuò)增體系：2.0yL lOXEx Taq Buffer(Takara)，2.0yL dNTP(0.2mmol/L)，1.0yL 上游引物(〇 · 5ymo 1 /L)，1 · OyL下游引物(0 · 5ymo 1 /L)，0 · 5U DNA聚合酶(Takara)，1 · OyL模板 DNA(50ngAiL)，ddH2〇補(bǔ)至20yL。
[0107] 擴(kuò)增程序:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 3〇8,54~60°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸21^11，35個(gè) 循環(huán);72 °C延伸7min。擴(kuò)增反應(yīng)在S1000? Thermal Cycler (BIO-RAD)儀器上進(jìn)行。具體退貨 溫度如表1所示。
[0108]電泳成像:采用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳結(jié)果。
[0109] (8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
[0110] 對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0,構(gòu)建 初始〇、1數(shù)據(jù)矩陣。
[0111] (9)資源特征分析軟件分析
[0112] 采用資源特征分析軟件ID Analysis軟件按照SSR引物編號(hào)順序，構(gòu)建黑29品種的 特異性分子身份證，其特異性分子身份證為111010110011011110101011。具體表示為:第一 對(duì)引物的第一、第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶;第二對(duì)引物的第一個(gè)等位基因 位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第二對(duì)引物的第二個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶;第三對(duì)引物的第一個(gè) 等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第三對(duì)引物的第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶;第四 對(duì)引物的第一和第二個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第四對(duì)引物的第三個(gè)等位基因位點(diǎn)有 擴(kuò)增條帶;第五對(duì)引物的第一和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶，第五對(duì)引物的第二個(gè)等 位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶;第六對(duì)引物的第一、第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶； 第七對(duì)引物的第一和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第七對(duì)引物的第二和第四個(gè)等位 基因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶;第八對(duì)引物的第一個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第八對(duì)引物的 第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶。
[0113] 黑29黑木耳品種為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所選育的優(yōu)良黑木耳品種，多年來(lái) 一直被廣泛栽培。2008年，黑29通過全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心認(rèn)定，認(rèn)定編號(hào)為國(guó)品認(rèn)菌 2007018。現(xiàn)在，黑29在東北地區(qū)的栽培量仍有增無(wú)減，一直深受種植戶青睞，已成為東北地 區(qū)黑木耳栽培的首選品種，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但是，在黑木耳栽培種植期 間出現(xiàn)過多次菌種侵權(quán)等問題，一直不能通過一種快速準(zhǔn)確的方法對(duì)黑29品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)進(jìn) 行有效保護(hù)。因此本實(shí)施方式構(gòu)建了黑29品種特異性的分子身份證，將黑29黑木耳品種特 征數(shù)字化，形成字符串的形式，簡(jiǎn)單明了的與其他黑木耳品種區(qū)分開，以期能有效保護(hù)黑29 黑木耳品種。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法，其特征在于所述方法步驟如下： (1) 母種活化 將母種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將母種轉(zhuǎn)接到CPDA固體培養(yǎng)皿中央，25°C恒溫避 光培養(yǎng)8d活化備用； (2) 液體培養(yǎng) 接種時(shí)用〇.5cm打孔器在相同菌齡處打孔，接種錐形瓶中，每瓶錐形瓶中裝有液體培 養(yǎng)基200mL，每個(gè)錐形瓶接種10個(gè)接種塊，120r/min，25 °C恒溫避光培養(yǎng)10d; (3) 菌絲收集 液體搖瓶菌絲體用四層紗布過濾，過濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，收集的菌 絲體于-20°C保存?zhèn)溆茫? (4) 總DNA提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA; (5) 總DNA質(zhì)量檢測(cè) 采用DYY-12型電泳儀用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 采用UV757CRT紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度，測(cè)定A260值和A280值，樣品稀釋到 50mg/yL，-20°C 保存?zhèn)溆茫? (6) SSR引物 SSR引物如表1所示： 表1 SSR引物表⑴SSR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：2.0yL lOXEx Taq Buffer，2.0yL 0.2mmol/L dNTP，1.0yL 0.5ymol/L上游 引物，l.OyL 0.5ymol/L游引物，0.5U DNA聚合酶，l.OyL 50ng/yL模板DNA，ddH20補(bǔ)至20yL; 擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min; 94 °C變性30s，54~60 °C復(fù)性30s，72 °C延伸2min，35個(gè)循 環(huán);72°C延伸7min，退火溫度如表1所示； 電泳成像:采用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳結(jié)果； (8) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0,構(gòu)建初始 〇、1數(shù)據(jù)矩陣； (9) 資源特征分析軟件分析 采用資源特征分析軟件ID Analysis軟件按照SSR引物編號(hào)順序，構(gòu)建黑木耳種質(zhì)資源 的特異性分子身份證； (10) 新品種鑒定評(píng)價(jià) 當(dāng)黑木耳品種需要鑒定評(píng)價(jià)時(shí)，以待檢測(cè)黑木耳品種為實(shí)驗(yàn)材料，執(zhí)行步驟（1)-(9)， 通過與已有特異性分子身份證比較分析，即可確定其是否為已通過審定的黑木耳品種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法，其特征在于所述 A280/A260為1.8至2.0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速準(zhǔn)確鑒定評(píng)價(jià)黑木耳種質(zhì)資源的方法，其特征在于構(gòu)建 黑木耳種質(zhì)資源的特異性分子身份證所用試驗(yàn)材料為黑29、黑威15號(hào)、黑威單片、黑威10 號(hào)、黑威981、S1、林科3號(hào)和宏大2009。4. 一種黑29品種特異性分子身份證，其特征在于所述黑29品種特異性分子身份證按照 如下方法構(gòu)建： (1) 母種活化 將黑29母種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將母種轉(zhuǎn)接到cPDA固體培養(yǎng)皿中央，25 °C恒 溫避光培養(yǎng)8d活化備用； (2) 液體培養(yǎng) 接種時(shí)用〇.5cm打孔器在相同菌齡處打孔，接種錐形瓶中，每瓶錐形瓶中裝有液體培 養(yǎng)基200mL，每個(gè)錐形瓶接種10個(gè)接種塊，120r/min，25 °C恒溫避光培養(yǎng)10d; (3) 菌絲收集 液體搖瓶菌絲體用四層紗布過濾，過濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，收集的菌 絲體于-20°C保存?zhèn)溆茫? (4) 總DNA提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA; (5) 總DNA質(zhì)量檢測(cè) 采用DYY-12型電泳儀用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 采用UV757CRT紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度，測(cè)定A260值和A280值，樣品稀釋到 50mg/yL，-20°C 保存?zhèn)溆茫? (6) SSR引物 SSR引物如表1所示： 表1 SSR引物表⑴SSR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：2.0yL lOXEx Taq Buffer，2.0yL 0.2mmol/L dNTP，1.0yL 0.5ymol/L上游 引物，l.OyL 0.5ymol/L游引物，0.5U DNA聚合酶，l.OyL 50ng/yL模板DNA，ddH20補(bǔ)至20yL; 擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min; 94 °C變性30s，54~60 °C復(fù)性30s，72 °C延伸2min，35個(gè)循 環(huán);72°C延伸7min，退火溫度如表1所示； 電泳成像:采用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳結(jié)果； (8) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0,構(gòu)建初始 〇、1數(shù)據(jù)矩陣； (9) 資源特征分析軟件分析 采用資源特征分析軟件ID Analysis軟件按照SSR引物編號(hào)順序，構(gòu)建黑木耳種質(zhì)資源 的特異性分子身份證。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的黑29品種特異性分子身份證，其特征在于所述A280/A260為 1.8至2.0〇6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的黑29品種特異性分子身份證，其特征在于構(gòu)建黑木耳種質(zhì)資 源的特異性分子身份證所用試驗(yàn)材料為黑29、黑威15號(hào)、黑威單片、黑威10號(hào)、黑威981、S1、 林科3號(hào)和宏大2009。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的黑29品種特異性分子身份證，其特征在于所述特異性分子身 份證為111010110011011110101011，具體表示為:第一對(duì)引物的第一、第二和第三個(gè)等位基 因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶;第二對(duì)引物的第一個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第二對(duì)引物的第 二個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶;第三對(duì)引物的第一個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第三對(duì) 引物的第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶;第四對(duì)引物的第一和第二個(gè)等位基因位點(diǎn) 沒有擴(kuò)增條帶，第四對(duì)引物的第三個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶;第五對(duì)引物的第一和第三 個(gè)等位基因位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶，第五對(duì)引物的第二個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶;第六對(duì)引 物的第一、第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶;第七對(duì)引物的第一和第三個(gè)等位基 因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第七對(duì)引物的第二和第四個(gè)等位基因位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶;第八對(duì)引 物的第一個(gè)等位基因位點(diǎn)沒有擴(kuò)增條帶，第八對(duì)引物的第二和第三個(gè)等位基因位點(diǎn)均有擴(kuò) 增條帶。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105950777SQ201610565772
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】馬銀鵬, 張介馳, 張丕奇, 戴肖東, 孔祥輝, 馬慶芳, 韓增華, 劉佳寧, 陳鶴, 王玉文
【申請(qǐng)人】黑龍江省科學(xué)院微生物研究所