研磨方法
【專利摘要】提供了用于處理作物籽粒的方法，這些方法包括以下步驟：a)將籽粒浸泡在水中，以產(chǎn)生浸泡的籽粒；b)碾磨這些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽的存在下處理這些浸泡的籽粒。
【專利說明】研磨方法
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包含計算機(jī)可讀形式的序列表。該計算機(jī)可讀形式通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種處理作物籽粒的改進(jìn)方法，以提供具有高品質(zhì)的適于將淀粉轉(zhuǎn)化 為單糖和寡糖、乙醇、甜味劑等的淀粉產(chǎn)品。另外，本發(fā)明還涉及一種酶組合物并且涉及本 發(fā)明的組合物的用途，該酶組合物包括一種或多種適于本發(fā)明的方法的酶活性。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 作為大部分作物(例如玉米、小麥、水稻、高粱大豆、大麥或果殼)籽粒的重要成分， 在可以將淀粉用于將淀粉轉(zhuǎn)化為糖(例如右旋糖、果糖）、醇(例如乙醇)和增甜劑之前，必須 使淀粉可供使用并以一種提供高純度淀粉的方式加以處理。如果淀粉包含多于0.5%的雜 質(zhì)（包括蛋白質(zhì)），則它不適于作為淀粉轉(zhuǎn)化工藝的起始材料。為了從作物籽粒開始提供這 樣的純的且高品質(zhì)的淀粉產(chǎn)品，通常研磨籽粒，如將在下文進(jìn)一步所描述。
[0006] 通常使用濕磨將玉米籽粒分離為其四種基本組分:淀粉、胚芽、纖維以及蛋白質(zhì)。
[0007] 典型地，濕磨方法包括四個基本步驟。首先，將籽粒浸泡或浸漬約30分鐘至約48小 時，以開始使淀粉和蛋白鍵斷裂。該方法的下一步驟涉及粗磨，以破壞果皮并使胚芽與剩余 的籽粒分離。剩余的漿液由纖維、淀粉和蛋白質(zhì)組成，將其細(xì)磨并篩選，以將纖維與淀粉和 蛋白質(zhì)分離。在水力旋流器中將淀粉與剩余的漿液分離。然后，可以將淀粉轉(zhuǎn)化為糖漿或 醇，或干燥并銷售為玉米淀粉，或用化學(xué)方法或物理方法修飾以產(chǎn)生改性玉米淀粉。
[0008] 已經(jīng)表明了酶對濕磨方法的浸漬步驟的用途。已經(jīng)顯示，商業(yè)酶產(chǎn)品 Steepzyme?(可獲得自諾維信公司（Novozymes A/S))適于濕磨方法的第一步驟，即將玉 米籽粒浸泡在水中的浸漬步驟。
[0009] 最近，已經(jīng)研發(fā)了"酶研磨（enzymatic milling)"，這是一種改性濕磨方法，該方 法使用蛋白酶以在玉米濕磨過程中顯著減少總的處理時間并消除了對作為加工劑的二氧 化硫的需求。參見約翰斯頓（Johnston)等人，谷物化學(xué)（Cereal Chem)，81，第626-632頁 (2004)。
[0010] US 6,566,125披露了一種用于從玉蜀黍獲得淀粉的方法，該方法涉及將玉蜀黍籽 粒浸泡在水中以產(chǎn)生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以產(chǎn)生碾磨的玉蜀黍漿液 并用酶(例如，蛋白酶)孵育該經(jīng)碾磨的玉蜀黍漿液。
[0011] US 5,066,218披露了一種研磨谷物(尤其是玉米）的方法，該方法包括清洗谷物， 將谷物浸漬在水中以將其軟化，并且然后用纖維素酶研磨谷物。
[0012] W0 2002/000731披露了一種處理作物籽粒的方法，該方法包括將籽粒在水中浸泡 1-12小時，濕磨浸泡的籽粒并用一種或多種酶(包括酸性蛋白酶)處理籽粒。
[0013] W0 2002/000911披露了一種分離淀粉面筋的方法，該方法包括使研磨淀粉經(jīng)受酸 性蛋白酶。
[0014] W0 2002/002644披露了一種洗滌獲得自研磨方法的淀粉面筋分離步驟的淀粉漿 液的方法，該方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗滌淀粉漿液。
[0015] 仍需要改進(jìn)用于提供適于轉(zhuǎn)化為單糖和寡糖、乙醇、甜味劑等的淀粉的方法。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明涉及一種用于處理作物籽粒的方法，該方法包括以下步驟：
[0018] a)浸泡籽粒以產(chǎn)生浸泡的籽粒；
[0019] b)碾磨這些浸泡的籽粒；
[0020] c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下處理這些浸泡的籽粒，
[0021 ]其中在步驟b)之前、與其同時或之后進(jìn)行步驟c)，
[0022]并且所述多肽是一種肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶或選自下組，該組由以下各項 組成：
[0023] (a)-種多肽，該多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性；
[0024] (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多 核苷酸編碼：
[0025] (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列，
[0026] (ii)SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，
[0027] (iii)(i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈；
[0028] (c)一種多肽，該多肽由與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多核苷酸編碼；
[0029] (d)SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多 肽的一種變體，該變體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及
[0030] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0031]在一個優(yōu)選實施例中，具有蛋白酶活性的該多肽是一種絲氨酸蛋白酶，例如家族 S53的一種絲氨酸蛋白酶，如來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶、或來自污叉絲孔菌 (Dichomitus squalens)或變色檢菌（Trametes vericolor)的S53蛋白酶。
[0032]在一個優(yōu)選實施例中，該蛋白酶包括以下各項或由其組成：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6。
[0033] 在一個優(yōu)選實施例中，該蛋白酶包括以下各項或由其組成：披露于WO 2014/ 037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25。
[0034] 本發(fā)明還涉及在處理作物籽粒的方法中使用的多肽的用途以及包括在本發(fā)明中 使用的多肽的酶組合物。
[0035] 序列表綜述
[0036] SEQ ID N0:1是如分離自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3的cDNA序列。
[0037] SEQ ID N0:2是如從SEQ ID NO: 1推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID從):3是具有即標(biāo)記的重組表達(dá)0嫩序列的0嫩序列。
[0039] SEQ ID N0:4是如從SEQ ID N0:3推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0:5是來自大型亞灰樹花菌的成熟S53蛋白酶3的氨基酸序列。
[0041 ] SEQ ID NO:6是從SEQ ID NO:3獲得的成熟S53蛋白酶的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID N0:7是引物597。
[0043] SEQ ID NO:8是引物598
[0044] 定義
[0045] 等位基因變體:術(shù)語"等位基因變體"意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或 更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序 列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0046] cDNA:術(shù)語"cDNA"意指可以通過從成熟的剪接的mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄制備的DNA分子， 該mRNA分子是從真核細(xì)胞獲得的。cDNA缺乏可以存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早 先的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟 進(jìn)行加工，包括剪接。
[0047]編碼序列：術(shù)語"編碼序列"意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序 列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架通常以ATG起始密碼子或替代性起始 密碼子(例如GTG和TTG)開始，并且以終止密碼子(例如TAA、TAG、和TGA)結(jié)束。編碼序列可以 是DNA、cDNA、合成或重組的多核苷酸。
[0048]控制序列：術(shù)語"控制序列"意指對于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的（即，來自相同 基因）或外源的（即，來自不同基因），或相對于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少， 控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多 肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個 接頭。
[0049]表達(dá)：術(shù)語"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
[0050]表達(dá)載體:術(shù)語"表達(dá)載體"意指包括編碼多肽的多核苷酸并可操作地連接至提供 其表達(dá)的其他核苷酸的線性或環(huán)形DNA分子。
[0051]片段:術(shù)語"片段"意指使一個或多個(例如若干個)氨基酸從成熟多肽的氨基和/ 或羧基末端缺失的多肽;其中該片段具有蛋白酶活性。在一個方面，一個片段包含至少330 個氨基酸殘基（例如，SEQ ID N0:2的氨基酸20至349);在另一個方面，一個片段包含至少 345個氨基酸殘基(例如，SEQ ID N0:2的氨基酸10至354);在一個另外的方面，一個片段包 含至少355個氨基酸殘基(例如，SEQ ID N0:2的氨基酸5至359)。
[0052]宿主細(xì)胞:術(shù)語"宿主細(xì)胞"意指易于用包括本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表 達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的 突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0053]分離的多核苷酸:術(shù)語"分離的多核苷酸"意指相對于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種多核苷 酸通過人工手動修飾的多核苷酸。在一個方面，該分離的多核苷酸是至少1%純的，例如至 少5 %純的、至少10 %純的、至少20 %純的、至少40 %純的、至少60 %純的、至少80 %純的、至 少90%純的、以及至少95%純的，如通過瓊脂糖電泳所確定的。多核苷酸可以是基因組、 cDNA、RNA、半合成、合成來源的、或其任意組合。
[0054]分離的多肽:術(shù)語"分離的多肽"意指相對于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種多肽通過人工手 動修飾的多肽。在一個方面，該多肽是至少1 %純的，例如至少5 %純的、至少10 %純的、至少 20 %純的、至少40 %純的、至少60 %純的、至少80 %純的、以及至少90 %純的，如通過SDS-PAGE所確定的。
[0055] 成熟多肽:術(shù)語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端 截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一個方面，基于使用具有 N-末端HQ標(biāo)記的成熟多肽的埃德曼(Edman)降解和整體分子量分析的測序，該成熟多肽是 SEQ ID N0:2的編號中的氨基酸1至366。使用預(yù)測程序SignalP(尼爾森(Nielsen)等人， 1997,蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering)10:1-6)，SEQ ID N0:2的編號中的氨基酸-198 至-182被預(yù)測為信號肽。本領(lǐng)域已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達(dá)的兩種或更 多種不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
[0056] 成熟多肽編碼序列:術(shù)語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多 肽的多核苷酸。在一個方面，基于通過具有N-末端HQ標(biāo)記的成熟多肽的埃德曼降解和整體 分子量分析對該成熟多肽的確定，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: 1的編碼中的核苷酸 605至1702。此外，基于預(yù)測程序SignalP(尼爾森（Nielsen)等人，1997,蛋白質(zhì)工程 (Protein Engineering)10:l-6)，SEQ ID N0:1的編號中的核苷酸11至61被預(yù)測編碼信號 肽。
[0057] 核酸構(gòu)建體:術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意指從天然存在的基因中分離的、或以一種方式 被修飾成包含在自然界中不會另外存在的核酸區(qū)段的、或合成的單鏈或雙鏈核酸分子。當(dāng) 核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明編碼序列所需要的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá) 盒"含義相同。
[0058]可操作地連接:術(shù)語"可操作地連接"意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對于多核 苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。
[0059] 蛋白酶活性:術(shù)語"蛋白酶活性"意指蛋白水解活性(EC 3.4)。存在若干種蛋白酶 活性類型，例如在Arg和Lys殘基的羧基末端側(cè)切割的胰蛋白酶樣蛋白酶以及在疏水性氨基 酸殘基的羧基末端側(cè)切割的糜蛋白酶樣蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶是具有酸性最適pH(最適 pH〈pH 7)的絲氨酸內(nèi)肽酶(EC3.4.21)。
[0060] 可以使用任何測定來測量蛋白酶活性，其中采用一種底物，該底物包括與所討論 的蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。pH測定和溫度測定同樣適用于所討論的蛋白酶。pH值測定 的實例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。溫度測定的實例是15°C、20°C、25°C、30°C、35 °(：、37°(：、40°(：、45°(：、50°(：、55°(：、60°(：、65°(：、70°(：、80°(：、90°(：、或95°(：。普通蛋白酶底物的 實例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血紅蛋白。在經(jīng)典的安森(Anson)和米爾斯基(Mirsky)方 法中，將變性的血紅蛋白用作底物并且在用所討論的蛋白酶孵育測定后，確定三氯乙酸可 溶的血紅蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米爾斯基(Mirsky)，A.E.， 1932,普通生理學(xué)雜志（J.Gen.Physiol. )16:59以及安森，M.L.，1938,普通生理學(xué)雜志22: 79)〇
[0061] 序列一致性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性通過參數(shù)"序 列一致性"來描述。
[0062]出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， 賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet ·) 16:276-277)(優(yōu)選3 · 0 · 0版或更新版 本)的尼德爾(Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德爾曼 (Needleman)和翁施(Wunsch)，1970,分子生物學(xué)雜志(J.Mol .Biol. )48:443-453)來確定兩 個氨基酸序列之間的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所使用的任選參數(shù)是空位開放罰分 10、空位延伸罰分0.5,及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最 長的一致性"的輸出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0063](一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0064]出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， 賴斯(Rice)等人，2000,同上）（優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾 曼-翁施算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970,同上)來確定兩個脫氧核糖核 苷酸序列之間的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所使用的任選參數(shù)是空位開放罰分10、 空位延伸罰分0.5,及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長 的一致性"的輸出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0065](一致的脫氧核糖核苷酸X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0066] 嚴(yán)格條件:不同的嚴(yán)格條件定義如下。
[0067] 術(shù)語"非常低嚴(yán)格條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn) DNA印跡程序，在42 °C下在5X SSTO、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和 25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在45°C下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料 洗滌三次，每次15分鐘。
[0068]術(shù)語"低嚴(yán)格條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印 跡程序，在42 °C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25 %甲酰 胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在50°C下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料洗滌三次， 每次15分鐘。
[0069] 術(shù)語"中嚴(yán)格條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印 跡程序，在42 °C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35 %甲酰 胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在55°C下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料洗滌三次， 每次15分鐘。
[0070] 術(shù)語"中-高嚴(yán)格條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn) DNA印跡程序，在42 °C下在5X SSTO、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和 35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在60°C下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料 洗滌三次，每次15分鐘。
[0071] 術(shù)語"高嚴(yán)格條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印 跡程序，在42 °C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50 %甲酰 胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在65°C下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料洗滌三次， 每次15分鐘。
[0072] 術(shù)語"非常高嚴(yán)格條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn) DNA印跡程序，在42 °C下在5X SSTO、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和 50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在70°C下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料 洗滌三次，每次15分鐘。
[0073] 子序列:術(shù)語"子序列"意指使一個或多個(若干個)核苷酸從成熟多肽編碼序列的 5'端和/或3'端缺失的多核苷酸;其中該子序列編碼具有蛋白酶活性的片段。在一個方面， 一個子序列包含至少990個核苷酸(例如，SEQ ID NO: 1的核苷酸662至1651)，例如，以及至 少1035個核苷酸（例如，SEQ ID NO: 1的核苷酸632至1666);例如，以及至少1065個核苷酸 (例如，SEQ ID N0:1的核苷酸617至1681)。
[0074] 基本上純的多核苷酸:術(shù)語"基本上純的多核苷酸"意指不含其他外來的或不需要 的核苷酸的多核苷酸制劑，并且其存在的形式適于在基因工程化多肽生產(chǎn)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行使 用。因而，基本上純的多核苷酸包含按重量計最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多 4%、最多3%、最多2%、最多1 %和最多0.5%與該多核苷酸天然或重組關(guān)聯(lián)的其他多核苷 酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5 '和3 '非翻譯區(qū)，如啟動子和終止 子。優(yōu)選地，該多核苷酸是按重量計至少90 %純的，例如至少92 %純的、至少94 %純的、至少 95 %純的、至少96 %純的、至少97 %純的、至少98 %純的、至少99 %純的、以及至少99.5 %純 的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選處于基本上純的形式。
[0075] 基本上純的多肽:術(shù)語"基本上純的多肽"意指這樣一種制劑，該制劑包含與其天 然關(guān)聯(lián)或重組關(guān)聯(lián)的按重量計至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至 多2%、至多1%、以及至多0.5%的其他多肽材料。優(yōu)選地，該多肽按存在于制劑中的總多肽 材料的重量計是至少92 %純的，例如至少94 %純的、至少95 %純的、至少96 %純的、至少 97 %純的、至少98 %純的、至少99 %純的、至少99.5 %純的、以及100 %純的。本發(fā)明的多肽 優(yōu)選處于基本上純的形式。例如，這可以通過采用熟知的重組方法或采用經(jīng)典的純化方法 制備多肽來完成。
[0076] 變體:術(shù)語"變體"意指在一個或多個(若干個)位置包含改變（即，一個或多個(若 干個)氨基酸殘基的取代、插入和/或缺失）的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用一個不同 氨基酸置換占用一個位置的氨基酸;缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸;并且插入意指 鄰近占據(jù)一個位置的氨基酸添加1-3個氨基酸。本發(fā)明的這些變體具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至 少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的蛋白酶活性。 [0077]在一個方面，該變體與如在此鑒定的SEQ ID N0:的成熟多肽相差多達(dá)10個(例如， 1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)氨基酸。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及 在一個或多個(例如，若干個)位置處包括取代、缺失和/或插入的在此的SEQ ID N0:的成熟 多肽的變體。在一個實施例中，引入在此的SEQ ID NO:的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失 和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。這些氨基酸變化可以具有微 小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地Ι-βο個氨基酸的小缺失； 小的氨基-或羧基-末端延伸 ，如氨基末端的甲 硫氨酸殘基； 多達(dá)20-25個殘基的小接頭肽;或便于通過改變凈電荷或另一種功能來純化的小延伸。
[0078] β_葡糖苷酶:術(shù)語"β_葡糖苷酶"意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E. C. 3.2.1.21)，其 催化末端非還原β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)文丘 里(Venturi)等人，2002，來自嗜熱毛殼菌嗜糞變種的胞外β-D-葡糖苷酶:產(chǎn)生、純化以及一 些生物化學(xué)特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties)，基石出 微生物學(xué)雜志(J. Basic Microbiol. )42:55-66的程序，使用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖 苷作為底物來測定葡糖苷酶活性。一個單位的葡糖苷酶定義為在25°C、pH 4.8下，在含 有0.01 % T剪EEN? 20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖 苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對硝基苯酚陰離子。
[0079] β-木糖苷酶:術(shù)語"β-木糖苷酶"意指β-D木糖苷木糖水解酶(E. C. 3.2.1.37)，其催 化短β(1-4)木寡糖的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。出于本發(fā)明的目的，一 個單位的β-木糖苷酶定義為在40°C、ρΗ 5下，在含有0.01 % TWEEN? 20的100mM檸檬酸鈉 中從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對硝基苯酚陰離子。
[0080] 纖維二糖水解酶:術(shù)語"纖維二糖水解酶"意指一種1，4-β-?-葡聚糖纖維二糖水解 酶(E. C. 3.2.1.91和E. C. 3.2.1.176)，其催化纖維素、纖維寡糖或任何含β-l，4-連接的葡萄 糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵水解，從該鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖（泰里 (Teeri)，1997,晶態(tài)纖維素降解:纖維二糖水解酶功能的新見解(Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技術(shù)趨勢 (Trends in Biotechnology) 15:160-167;泰里等人，里氏木霉纖維二糖水解酶:為何對晶 態(tài)纖維素如此有效？ (Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?)，生物化學(xué)學(xué)會學(xué)報（Biochem. Soc · Trans .)26:173-178)。根據(jù) 里弗（Lever)等人，1972，分析生物化學(xué)(Anal · Biochem. )47 : 273-279 ;范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982,歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(FEBS Letters)，149:152_156;范?帝伯 赫和克萊森斯（Claeyssens)，1985，歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報，187 : 283-288 ;以及湯美 (Tomme)等人，1988,歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem. )170:575-581所描述的程序來測 定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，湯美(Tomme)等人的方法可以用于測定纖維二糖水解 酶活性。
[0081 ]纖維素分解酶或纖維素酶：術(shù)語"纖維素分解酶"或"纖維素酶"意指一種或多種 (例如，若干種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶、一種或多種纖 維二糖水解酶、一種或多種葡糖苷酶、或其組合。用于測量纖維素分解活性的兩種基本方 法包括：（1)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨的纖維素分解活性（內(nèi)切葡聚糖酶、纖 維二糖水解酶以及葡糖苷酶），如在張(Zhang)等人，纖維素酶改進(jìn)的展望:篩選和選擇策 略（Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies)， 2006，生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnology Advances)24:452-481中所綜述的。通常使用不溶性 底物，包括沃特曼(Whatman)Nal濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、預(yù)處理 的木質(zhì)纖維素等，測量總纖維素分解活性。最常用的總纖維素分解活性測定是使用沃特曼 Nal濾紙作為底物的濾紙測定。該測定是由國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC)(高斯 (Ghose)，1987,纖維素酶活性的測量(Measurement of cellulase activities)，純粹與應(yīng) 用化學(xué)(Pure Appl.Chem. )59:257-68)確立的。
[0082]纖維素材料:術(shù)語"纖維素材料"意指含有纖維素的任何材料。纖維素是脫水纖維 二糖的均聚物，并且因此是線性i3-(l-4)_D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如具有一 系列取代基以復(fù)雜支鏈結(jié)構(gòu)存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露聚糖。盡 管纖維素一般為多態(tài)的，但發(fā)現(xiàn)其在植物組織中主要以平行葡聚糖鏈的不溶性晶體基質(zhì)存 在。半纖維素通常氫鍵合至纖維素以及其他半纖維素，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。
[0083]內(nèi)切葡聚糖酶:術(shù)語"內(nèi)切葡聚糖酶"意指一種內(nèi)切-1，4-(1，3; 1，4)-i3_D-葡聚糖 4_葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基 纖維素）、地衣多糖中的1，4-?Η)_糖苷鍵和混合β-l，3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖 以及含有纖維素組分的其他植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)切水解。可以通過測量底物粘度的 降低或通過還原糖測定所確定的還原末端的增加來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性(張(Zhang)等 人，2006,生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnology Advances)24:452-481)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù) 高斯(Ghose)，1987,純粹與應(yīng)用化學(xué)(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的程序，在pH 5、 40°C下，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0084]家族61糖苷水解酶:術(shù)語"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61"意指根據(jù)亨 利薩特（Henri s sat) B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分類（A classification of glycosy1 hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化學(xué)雜志（Biochem.J. )280 :309-316;和亨利薩特B.和貝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化學(xué)雜志316:695-696屬于糖昔水解酶 家族61的多肽。這個家族中的酶最初基于在一個家族成員中測量到的非常弱的內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶活性而被分類為糖苷水解酶家族。這些酶的結(jié)構(gòu)和作用模式是不規(guī)范的，并 且它們不能被視為真正的糖苷酶。然而，基于它們在與纖維素酶或纖維素酶的混合物結(jié)合 使用時增強(qiáng)木質(zhì)纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。
[0085] 半纖維素分解酶或半纖維素酶:術(shù)語"半纖維素分解酶"或"半纖維素酶"意指一種 或多種（例如，若干種）水解半纖維素材料的酶。參見例如，沙洛姆（Shallom)，D.和肖漢姆 (Shoham)，Y.微生物半纖維素酶(Microbial hemicellulases)，微生物學(xué)新見(Current Opinion In Microbiology)，2003,6(3):219-228)。半纖維素酶是在植物生物質(zhì)的降解中 的關(guān)鍵組分。半纖維素酶的實例包括但不限于，乙酰基甘露聚糖酯酶、乙?；揪厶酋ッ浮?阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷 酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。這些酶的底物即半纖 維素是支鏈和線性多糖的異質(zhì)群體，這些多糖經(jīng)由氫鍵與植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維鍵 合，從而將它們交聯(lián)成一個穩(wěn)固網(wǎng)絡(luò)。半纖維素還共價附接至木質(zhì)素，從而與纖維素一起形 成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變結(jié)構(gòu)和組織要求許多酶的協(xié)同作用以使其完全降解。 半纖維素酶的催化模塊是水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸側(cè)基的酯 鍵的碳水化合物酯酶(CE)。這些催化模炔基于它們一級序列的同源性，可以被分配到GH和 CE家族中。具有總體相似的折疊的一些家族可以進(jìn)一步被分組為以字母標(biāo)記的氏族(例如， GH-A)。這些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分類可在碳水化合物活性酶 (Carbohydrate-Active Enzymes) (CAZy)數(shù)據(jù)庫中獲得?？梢愿鶕?jù)高斯(Ghose)和比薩拉 (Bisaria)，1987,純粹與應(yīng)用化學(xué)（Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752,在適合的溫度（例如 50°C、55°C、或60°C)和pH(例如5.0或5.5)下測量半纖維素分解酶活性。
[0086] 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽:術(shù)語"具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽"意指促 進(jìn)具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強(qiáng)的GH61多肽。在一個方面，使用在 總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)W0 02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或 總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重 組產(chǎn)生）的纖維素酶蛋白負(fù)載量存在的情況下CELLUCIAST⑩1.5L(諾維信公司，巴格 斯瓦爾德，丹麥)的混合物作為纖維素分解活性的來源。
[0087] 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過將達(dá)到相同的水解程度所需要的纖維 素分解酶的量降低優(yōu)選至少1. 〇 1倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5 倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，來增強(qiáng)由具有纖維素分解 活性的酶催化的纖維素材料的水解。
[0088] 木聚糖酶:術(shù)語"木聚糖酶"意指1，4-?Η)_木聚糖-木糖水解酶(E. C. 3.2.1.8)，其 催化木聚糖中的1，4-0-〇-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。出于本發(fā)明的目的，在37°(：下，在〇.〇1% TRITON?X-100和200mM磷酸鈉緩沖液(pH 6)中用0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作為底 物來測定木聚糖酶活性。一個單位的木聚糖酶活性定義為在200mM磷酸鈉緩沖液(pH 6)中， 在37°C、pH 6下，從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青 精。
[0089] 其他定義
[0090]作物籽粒:術(shù)語"作物籽粒"包括來自例如玉米(玉蜀黍）、水稻、大麥、高粱大豆、果 殼以及小麥的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多種玉米籽粒，包括例如馬齒型玉米、硬粒 玉米、有稃種玉米、具條紋玉米、甜玉米、糯玉米等。
[0091]在一個實施例中，該玉米籽粒是黃色馬齒型玉米籽粒。黃色馬齒型玉米籽粒具有 稱為"果皮(Pericarp)"的外部覆蓋物，保護(hù)籽粒中的胚芽。它防水和水蒸氣并且是昆蟲和 微生物所不希望的。
[0092]未被"果皮"覆蓋的籽粒的唯一區(qū)域是"頂帽（Tip Cap)"，它是籽粒至穗軸的附著 點。
[0093]胚芽："胚芽"是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生長為玉米植株所必需的 遺傳信息、酶、維生素以及礦物質(zhì)。在黃色馬齒型玉米中，約25%的胚芽是玉米油。覆蓋且包 圍胚芽的胚乳構(gòu)成約82%的籽粒干重并且是種子萌發(fā)的能量(淀粉)和蛋白來源。存在兩種 類型的胚乳，軟胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被緊緊地堆積在一起。在軟胚乳中，淀粉是 松散的。
[0094]淀粉:術(shù)語"淀粉"意指由植物的復(fù)雜多糖構(gòu)成、由廣泛出現(xiàn)在植物組織中的呈貯 藏粒形式的葡萄糖單元構(gòu)成、由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成且表示為(C6H1005)n (其中η是任 何數(shù)字)的任何材料。
[0095]研磨的：術(shù)語"研磨的"是指植物材料已經(jīng)例如通過粉碎、分級、碾磨、磨碎等而被 分解成更小的顆粒。
[0096]碾磨(grind或grinding):術(shù)語"碾磨"意指破壞果皮并打開作物籽粒的任何方法。 [0097]浸漬(steep或steeping):術(shù)語"浸漬"意指用水以及任選地S〇2浸泡作物籽粒。
[0098] 干固體:術(shù)語"干固體"是在干重基礎(chǔ)上的漿液的全固體（以百分比計）。
[0099] 寡糖:術(shù)語"寡糖"是具有2至10個單糖單位的化合物。
[0100]濕磨益處：術(shù)語"濕磨益處"意指改進(jìn)的淀粉產(chǎn)量和/或純度，改進(jìn)的面筋產(chǎn)量和/ 或純度，改進(jìn)的纖維純度、或浸漬水過濾、脫水和蒸發(fā)，更容易地分離胚芽和/或更好的糖化 后過濾及其過程能源節(jié)約中的一種或多種。
[0101] 發(fā)明詳述
[0102] 具有蛋白酶活性的多肽
[0103] 具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有時還被指定為肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水 解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽鏈內(nèi)部發(fā)揮作用的內(nèi)切 型蛋白酶（內(nèi)肽酶）。內(nèi)肽酶對N-和c-末端被封閉的肽底物顯示出活性，這些底物與所討論 的蛋白酶的特異性有關(guān)。
[0104] 術(shù)語"蛋白酶"在此被定義為水解肽鍵的酶。蛋白酶的定義也適用于如在此使用的 術(shù)語"親本蛋白酶"和"蛋白酶變體"的蛋白酶部分。術(shù)語"蛋白酶"包括屬于EC 3.4酶組(包 括其十八個亞類中的每一個)的任何酶。EC編號參考加利福尼亞州(California)的圣迭戈 (San Diego)的NC-IUBMB學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分別包括出版 于1994,歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem. )223:1-5; 1995,歐洲生物化學(xué)雜志232:1-6; 1996，歐洲生物化學(xué)雜志237:1-5; 1997，歐洲生物化學(xué)雜志250:1-6;以及1999，歐洲生物化 學(xué)雜志264 :610-650的增刊1-5。命名會定期得以增補(bǔ)和更新；參見例如萬維網(wǎng)（WWW)于 http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htmlo
[0105] 用于本發(fā)明的方法的蛋白酶選自下組，該組由以下各項組成：
[0106] (a)屬于EC 3.4.21酶組的蛋白酶;和/或
[0107] (b)屬于EC 3.4.14酶組的蛋白酶;和/或
[0108] (c)肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶，其包含兩種不同類型的肽酶:三肽基氨肽酶(外 切型）和內(nèi)切肽酶；如在1993，生物化學(xué)雜志（Biochem. J.) 290: 205-218和在MER0PS蛋白酶 數(shù)據(jù)庫，發(fā)行9.4(2011年1月31日）（www.merops.ac.uk)中所述的。該數(shù)據(jù)庫描述于羅林斯 (Rawlings)，N.D·，巴雷特（Barrett)，A. J.和貝特曼（Bateman)，A.，2010，"MER0PS:肽酶數(shù) 據(jù)庫（MER0PS:the peptidase database)"，核酸研究（Nucl.Acids Res. )38:D227_D233 中。
[0109] 為了確定給定蛋白酶是否為絲氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可參考上述手冊 和其中述及的原理?？梢詫λ蓄愋偷牡鞍酌高M(jìn)行這樣的測定，而不論其是天然存在的或 野生型蛋白酶;還是基因工程化的或合成的蛋白酶。
[0110] S53肽酶家族包含酸起作用的內(nèi)肽酶和三肽基-肽酶。催化三聯(lián)體的殘基是Glu、 Asp、Ser，并且在氧陰離子穴中存在一個另外的酸性殘基Asp。這些殘基的次序是Glu、Asp、 Asp、Ser。該Ser殘基在枯草桿菌蛋白酶的六8口、把8、361'三聯(lián)體中是等價于361'的親核體，并 且該三聯(lián)體的Glu是枯草桿菌蛋白酶中的廣義堿基His的一個代替物。
[0111] 該催化三聯(lián)體或氧陰離子穴的任意氨基酸的突變將導(dǎo)致酶活性的變化或損失。來 自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID N0:5)的催化三聯(lián)體和氧陰離子穴的氨基酸可能 是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175和Ser-283。來自變色栓菌（披露于W0 2014/037438中的SEQ ID勵:24)的553蛋白酶的催化三聯(lián)體和氧陰離子穴的氨基酸可能是位置6111-85)叩-89、 Asp-175和Ser-283〇
[0112] 該S53家族的肽酶傾向于在酸性pH下最有活性(不像同源的枯草桿菌蛋白酶），并 且這可歸因于羧基殘基(尤其是Asp)在氧陰離子穴中的功能重要性。這些氨基酸序列不與 家族S8(即絲氨酸內(nèi)肽酶枯草桿菌蛋白酶和同系物）中的那些密切相似，并且這一點與完全 不同的活性位點殘基以及關(guān)于最大活性的所得的較低的pH-起，為該家族提供了實質(zhì)性差 異。肽酶單元的蛋白質(zhì)折疊對于這個家族的成員來說與枯草桿菌蛋白酶的類似，具有氏族 類型SB。
[0113]關(guān)于本發(fā)明，鑒定并克隆了在低pH(3_4)下對濕磨具有高活性的來自大型亞灰樹 花菌的新的S53蛋白酶。為了確定給定蛋白酶是否為絲氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可 參考上述手冊和其中述及的原理?？梢詫λ蓄愋偷牡鞍酌高M(jìn)行這樣的測定，而不論其是 天然存在的或野生型蛋白酶;還是基因工程化的或合成的蛋白酶。
[0114]用于本發(fā)明的方法中的蛋白酶是肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶。這些蛋白酶展現(xiàn) 了 pH特性，尤其是pH穩(wěn)定性特性，這使它們作為用于在濕磨和其他應(yīng)用中使用的候選物具 有實質(zhì)性利益。
[0115] 用于本發(fā)明的方法中的蛋白酶是酸性蛋白酶，其中在P1位置中偏好疏水性氨基酸 殘基，例如Leu、Tyr、Phe和Met。這些蛋白酶在一個寬的從2-5的pH范圍下對Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有活性，并在經(jīng)受低至3的pH 2小時之后保留 多于95 %的活性。
[0116] 用于本發(fā)明的方法中的具有蛋白酶活性的多肽選自下組，該組由以下各項組成：
[0117] (a)-種多肽，該多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
[0118] (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多 核苷酸編碼：
[0119] (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列，
[0120] (ii)SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，
[0121] (iii)(i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈；
[0122] (c)一種多肽，該多肽由與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的多核苷酸編碼；
[0123] (d)SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多 肽的一種變體，該變體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及
[0124] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0125] 在一個實施例中，該蛋白酶可以按以下量存在：0.00005-2.5mg酶蛋白/g干固體 (DS)籽粒，優(yōu)選0.0005至1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.001至lmg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選 0.01至0.5mg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。
[0126] 在一個實施例中，該蛋白酶是一種按以下量添加的酸性蛋白酶：1-20,000HUT/ 10(^03籽粒，例如1-10,000!11]1'/10(^03籽粒，優(yōu)選300-8,000!11]1'/10(^03籽粒，尤其是3， 000-6，000HUT/100g DS籽粒，或4，000-20，000HUT/100g DS籽粒酸性蛋白酶，優(yōu)選5，000-10，000HUT/100g，尤其是從6，000-16，500HUT/100g DS籽粒。
[0127] 在一個實施例中，使用描述于以下"材料與方法"部分中的測定確定蛋白酶活性， 如動力學(xué)Suc-AAPF-pNA測定、Protazyme AK測定、動力學(xué)Suc-AAPX-pNA測定以及鄰苯二甲 醛(0ΡΑ)。對于Protazyme AK測定，當(dāng)用該蛋白酶孵育時，不可溶Protazyme AK(天青精-交 聯(lián)的酪蛋白）底物釋放藍(lán)色并且確定該顏色作為蛋白酶活性的量度。對于Suc-AAPF-pNA測 定，當(dāng)用該蛋白酶孵育時，無色的Suc-AAPF-pNA底物釋放黃色的對硝基苯胺并且確定該黃 色作為蛋白酶活性的量度。
[0128] 在一個實施例中，這些多肽具有SEQ ID N0:6的多肽的至少20%，例如至少40%、 至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、以及至少100 %的蛋白酶活 性。
[0129] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少80%、至少85%、至少 90 %、或至少91 %的序列一致性。
[0130] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少92%的序列一致性。
[0131] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少93%的序列一致性。
[0132] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少94%的序列一致性。
[0133] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少95%的序列一致性。
[0134] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少96%的序列一致性。
[0135] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少97%的序列一致性。
[0136] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少98%的序列一致性。
[0137] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少99%的序列一致性。
[0138] 本發(fā)明的一個實施例，具有蛋白酶活性的該多肽或由多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有100%的序列一致性。
[0139] 在本發(fā)明的一個實施例中，具有蛋白酶活性的該多肽包括以下各項或由其組成： SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6或者披露于W0 2014/037438中的 SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽。
[0140] 在一個方面，這些多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或 SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的 多肽相差不多于三十個氨基酸，例如，相差二十五個氨基酸、相差二十個氨基酸、相差十五 個氨基酸、相差十二個氨基酸、相差十個氨基酸、相差九個氨基酸、相差八個氨基酸、相差七 個氨基酸、相差六個氨基酸、相差五個氨基酸、相差四個氨基酸、相差三個氨基酸、相差兩個 氨基酸、以及相差一個氨基酸。
[0141] 在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法中的蛋白酶優(yōu)選地包括以下各項或由其組 成：SEQIDN0:5、SEQIDN0:6或者SEQIDN0:2或SEQIDN0:4的成熟多肽或者披露于TO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽的氨基酸序列、其等位基因變體;或 是從N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5個氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。 在另一個方面，該多肽包括SEQ ID N0:5的多肽或由其組成。在另一個優(yōu)選方面，該多肽包 括SEQ ID N0:2的氨基酸1至366或由其組成。
[0142] 在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法中的多肽具有蛋白酶活性并且由以下多核苷 酸編碼，這些多核苷酸在低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件或非常高嚴(yán) 格條件下與（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、或的全長互補(bǔ)鏈雜交(J.薩姆布 魯克（Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.馬尼亞蒂斯(Maniatis)，1989,分子克隆實驗 手冊(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港（Cold Spring Harbor)， 紐約）。
[0143] SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列，連同SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽的氨基酸序列或其片段可以用于設(shè)計核酸探針，用以根據(jù) 本領(lǐng)域中眾所周知的方法從不同屬或種的菌株中鑒定并且克隆出編碼具有蛋白酶活性的 多肽的DNA。具體地說，此類探針可以用于遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序與感興趣的屬或種的基因 組或cDNA雜交，以便鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。此類探針可以明顯短于完整序列，但是長 度應(yīng)為至少14,例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少 100個核苷酸，例如長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500 個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸或至少900個核苷酸。DNA 和RNA探針二者均可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記(例如，用3￥、3!1、353、生物素、或抗生物素 蛋白），以檢測相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針。
[0144] 可以篩選從此類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫的與上述探針雜交并編碼 具有蛋白酶活性的多肽的DNA。來自此類其他菌株的基因組DNA或其他DNA可以通過瓊脂糖 或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并 固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為鑒定與SEQ ID NO: 1或其子序列同源的克 隆或DNA，在DNA印跡法中優(yōu)選使用載體材料。
[0145] 出于本發(fā)明的一個目的，雜交表明多核苷酸在非常低至非常高嚴(yán)格條件下與被標(biāo) 記的核酸探針雜交，該探針對應(yīng)于SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列、其全長互補(bǔ)鏈或其子 序列。可以使用例如X-射線膠片或本領(lǐng)域已知的任何其他檢測手段來檢測在這些條件下核 酸探針雜交的分子。
[0146] 在一個方面，該核酸探針是SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，該 核酸探針是其片段。在另一個方面，該核酸探針是編碼SEQ ID N0:2的多肽或其片段的多核 苷酸。在另一個優(yōu)選方面，該核酸探針是SEQ ID N0:1。
[0147] 對于長度為至少100個核苷酸的長探針而言，高至非常高嚴(yán)格條件定義為最佳地 遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子 DNA中，以及對于非常低和低嚴(yán)格條件在25%甲酰胺中，對于中和中-高嚴(yán)格條件在35%甲 酰胺中，或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格條件在50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在65 °C (高嚴(yán)格條件）和在70°C (非常高嚴(yán)格條件）下使用2X SSC、0.2%SDS將載體材料洗滌三 次，每次15分鐘。
[0148] 對于長度為約15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針而言，嚴(yán)格條件定義為最佳地 遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在比使用根據(jù)博爾頓(Bolton)和麥卡錫(McCarthy) (1962,美國國 家科學(xué)院院刊（Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA) 48:1390)的計算所計算的Tm低約5 °C至約10 °C 下，在每ml 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、(h5%NP-40、lX登哈特氏溶液 (Denhardt ' s solution)、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0 · ImM ATP、以及0 · 2mg的酵母RNA 中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后，將載體材料在比所計算的Tm低5 °C至10 °C下，在6X SCC 加0.1 % SDS中洗滌一次(持續(xù)15分鐘)并且使用6X SSC洗滌兩次(每次15分鐘）。
[0149] 在另一個實施例中，本發(fā)明涉及使用在SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于W02014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽或其同源序列的一個或多個(或若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入的 變體。這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的 保守氨基酸取代、插入或缺失;典型地一個至約30個氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末 端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多達(dá)約20-25個殘基的小接頭肽;或便于通過改變凈 電荷或另一種功能來純化的小延伸，如聚組氨酸標(biāo)記或HQ標(biāo)記、抗原表位或結(jié)合域。
[0150] 保守取代的實例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸性 氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸(亮氨酸、 異亮氨酸及纈氨酸）、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且 例如由H.諾伊拉特(Neurath)和R.L.希爾(Hill)，1979在蛋白質(zhì)(The Proteins)，學(xué)術(shù)出版 社(Academic Press)，紐約中描述。預(yù)期不會實質(zhì)上改變比活性的最常發(fā)生的交換是Ala/ Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、 Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly 〇
[0151] 可替代地，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸 改變可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH，等。
[0152]親本多肽中的必需氨基酸可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序來鑒定，如定點誘變或丙 氨酸掃描誘變（坎寧安（Cunningham)和韋爾斯(WeiIs)，1989，科學(xué)（Science)244:1081-1085)。在后一項技術(shù)中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得突變 體分子的蛋白酶活性進(jìn)行測試以鑒定對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見， 希爾頓(Hilton)等人，1996,生物化學(xué)雜志（J. Biol. Chem.)271:4699-4708。也可結(jié)合假定 接觸位點氨基酸的突變，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記 進(jìn)行確定，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點或其他生物學(xué)相互作用。參見， 例如德沃斯(de Vos)等人，1992,科學(xué)（Science)255:306-312;史密斯(Smith)等人，1992， 分子生物學(xué)雜志(11〇1.8丨〇1.)224 :899-904;烏樂達(dá)維爾(11〇(1&￥6〇等人，1992，歐洲生化 學(xué)會聯(lián)合會快報(FEBS Lett.)309:59-64。還可以從與親本多肽相關(guān)的多肽的一致性分析 推斷必需氨基酸的身份。
[0153] 可以做出單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組 的已知方法進(jìn)行測試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(Reidhaar-Olson)和 薩奧爾（Sauer )，1988，科學(xué)（Science) 241:53-57;博維(Bowie)和薩奧爾，1989，美國國家科 學(xué)院院刊（Proc .Natl .Acad· Sci .USA)86:2152-2156 ;W0 95/17413;或W0 95/22625披露的 那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族ePCR、噬菌體展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物 化學(xué)(Biochemistry)30:10832-10837;美國專利號5,223,409;TO 92/06204)以及區(qū)域定向 誘變(德比什爾（Derbyshire)等人，1986,基因（Gene)46:145;內(nèi)爾（Ner)等人，1988，DNA 7: 127)。
[0154] 可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆 的、誘變的多肽的活性（內(nèi)斯(Ness)等人，1999,自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology) 17: 893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方 法對其進(jìn)行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
[0155] SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的成熟多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多 肽或者披露于W0 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽的氨基酸取代、缺 失和 / 或插入的總數(shù)不多于 20 個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20個。
[0156] 該多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的一部分在另一種多肽的一部分的N-末端 或C-末端處融合。
[0157] 該多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的N-末端或C-末端處融合。通過將編碼另一種多肽的多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸融合而產(chǎn)生融 合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列，這 樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個或多個啟動子和終止子的控 制下。融合蛋白還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建，其中融合在翻譯后產(chǎn)生(庫珀（Cooper)等人， 1993，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志（ΕΜΒ0 J.) 12: 2575-2583;道森(Dawson)等人，1994，科學(xué) (Science)266:776-779)〇
[0158] 融合多肽可以在兩種多肽之間進(jìn)一步包括切割位點。在融合蛋白分泌之時，該位 點被位點，從而釋放出這兩種多肽。切割位點的實例包括但不限于以下各項中披露的位點： 馬丁(Martin)等人，2003,工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志（J. Ind.Microbiol .Biotechnol ·) 3:568-576;斯韋蒂納（Svetina)等人，2000,生物技術(shù)雜志（J.Biotechnol .)76:245-251;拉 斯馬森（Rasmussen) -威爾遜（Wilson)等人，1997，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué) (Appl.Environ.Microbiol.)63:3488_3493;華德（Ward)等人，1995,生物技術(shù) (Biotechnology) 13:498-503;以及孔特拉斯（Contreras)等人，1991，生物技術(shù)9:378-381; 伊頓（Eaton)等人，1986，生物化學(xué)（Biochemistry)25 : 505-512;柯林斯（Col 1 ins)-萊斯 (Racie)等人，1995,生物技術(shù)13:982-987;卡特(Carter)等人，1989,蛋白：結(jié)構(gòu)、功能和遺 傳學(xué)（Proteins:Structure, Function, and Genetics)6:240_248;以及史蒂文斯 (Stevens)，2003,世界藥物發(fā)現(xiàn)(Drug Discovery World)4:35_48〇
[0159] 該多肽可以由包含對于His標(biāo)記或HQ標(biāo)記的編碼的重組DNA序列來表達(dá)，以在任意 翻譯后修飾之后給出包含該Hi s標(biāo)記或HQ標(biāo)記的全部或部分的成熟多肽。該HQ標(biāo)記(具有序 列-RHQHQHQ)可以在翻譯后修飾過程中完全或部分切割掉，得到例如附接至成熟多肽的N-末端的另外的氨基酸-RHQHQ。
[0160] 碳水化合物分子通常在翻譯后修飾過程中附接至來自真菌來源的多肽。為了輔助 質(zhì)譜分析，該多肽可以用內(nèi)切糖苷酶孵育以使各N-連接的位置去糖基化。對于每個去糖基 化的N-連接位點，一個N-乙酰己糖胺仍然在該蛋白質(zhì)主鏈上。
[0161] 具有蛋白酶活性的多肽的來源
[0162] 可以從任何屬的真菌獲得根據(jù)本發(fā)明所使用的具有蛋白酶活性的多肽。出于本發(fā) 明的目的，如在此結(jié)合給定的來源使用的術(shù)語"從…中獲得"應(yīng)意指由多核苷酸編碼的多肽 是由該來源或者由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生的。在一個方面，從給 定來源獲得的多肽被分泌到細(xì)胞外。
[0163] 該多肽可以是一種真菌多肽。例如，該多肽可以是來自一個門，例如擔(dān)子菌門內(nèi)的 具有蛋白酶活性的多肽。在一個方面，該多肽是來自傘菌綱的真菌的蛋白酶，例如來自多孔 菌目，或來自革菌科，或來自亞灰樹花菌屬。在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法中的多肽 來自大型亞灰樹花菌。
[0164]在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法中的多肽來自叉絲孔菌屬(Dichomitus)，優(yōu) 選來自污叉絲孔菌。在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法中的多肽來自栓菌屬，優(yōu)選來自變 色栓菌。
[0165] 將理解的是，以上提到的物種涵蓋完全狀態(tài)和不完全狀態(tài)（perfect and imperfect states)二者、以及其他分類學(xué)等效物，例如無性型，而不管它們已知的物種名 稱是什么。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地識別適當(dāng)?shù)刃锏纳矸荨?br>[0166] 這些分類群的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國典型 培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)、德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美國農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏中心北方地區(qū)研究 中心(NRRL)〇
[0167] 可以使用以上提到的探針從其他來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等）分 離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得該多肽。 用于從自然生活環(huán)境中直接分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可以通過類似 地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼該多肽的多核苷 酸。一旦用一種或多種探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就可以通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員已知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸(參見例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989,同 上)。
[0168] 多核苷酸
[0169] 用來分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括從基因 組DNA分離、從cDNA制備或其組合?？梢岳缤ㄟ^使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá) 文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，實現(xiàn)從這樣的基因組DNA克隆多 核苷酸。參見，例如，伊尼斯（Innis)等人，1990，PCR:方法和應(yīng)用指南（PCR:A Guide to Methods and Application)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約。可以使用其他核酸擴(kuò)增 程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)?？梢?從芽孢桿菌屬的一種菌株或來自芽孢桿菌目的另一種或相關(guān)生物中克隆多核苷酸，并且因 此，例如可以是多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或物種變體。
[0170] 在一些實施例中，這些多核苷酸包括以下多核苷酸或由其組成，所述多核苷酸與 SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列具有至少90%，例如至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性程度，這 些多核苷酸編碼具有蛋白酶活性的多肽。
[0171] 修飾編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸對于合成與該多肽基本上類似的多肽可能是必 需的。術(shù)語"基本上類似"于該多肽是指該多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以某種 工程化方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不 同的變體。該變體可以基于以SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列（例如其子序列）形式呈現(xiàn) 的多核苷酸，和/或通過引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生該酶的 宿主有機(jī)體的密碼子使用的核苷酸取代，或通過引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取 代來構(gòu)建。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表達(dá)與純化 (Protein Expression and Purification)2:95_107〇
[0172] 在實施例中，編碼具有蛋白酶活性的多肽的多核苷酸在非常低嚴(yán)格條件、低嚴(yán)格 條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與（i)SEQ ID N0:1的 成熟多肽編碼序列、（ii)包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列或（iii) (i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈;或其等位基因變體及子序列雜交(薩姆布魯克(Sambrook)等人， 1989,同上），如在此所定義。
[0173] 在一個方面，該多核苷酸包括以下各項或由其組成：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 1的 成熟多肽編碼序列、或SEQ ID NO: 1的子序列，該子序列編碼具有蛋白酶活性的SEQ ID NO: 2的一個片段，例如SEQ ID NO: 1的核苷酸605至1702的多核苷酸。
[0174] 研磨方法
[0175] 研磨籽粒，以便打開結(jié)構(gòu)并且允許進(jìn)一步加工并且將籽粒分離成四種主要成分： 淀粉、胚芽、纖維以及蛋白質(zhì)。
[0176] 在一個實施例中，使用濕磨方法。濕磨使纖維和/或胚芽與粗粉(淀粉顆粒和蛋白 質(zhì))很好分離并且時常應(yīng)用于平行生產(chǎn)糖漿的場所。
[0177]本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，可以通過在如在此描述的方法中處理 作物籽粒而改進(jìn)淀粉和/或面筋終產(chǎn)物的品質(zhì)。
[0178] 本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法相比，產(chǎn)生了更高的淀粉和/或面筋產(chǎn)量和或品質(zhì)，因為 淀粉和面筋終產(chǎn)物更純和/或獲得了更高的產(chǎn)量和/或使用更少的加工時間。另一種優(yōu)勢可 以是可以減少需要使用的化學(xué)品（例如S02和NaHS03)的量或甚至完全除去。
[0179]
[0180] 淀粉是在植物細(xì)胞內(nèi)作為不溶于水的微小顆粒形式而形成。當(dāng)放入冷水中時，這 些淀粉顆?？梢晕丈倭康囊后w并膨脹。在高達(dá)約50°C至75°C的溫度下，膨脹可以是可逆 的。然而，在更高溫度下，開始不可逆膨脹，稱為"糊化"。有待根據(jù)本發(fā)明加工的顆粒狀淀粉 可以是含有粗淀粉的材料，該材料包括(例如，研磨的）全谷物，這些全谷物包括非淀粉級 分，如胚芽殘余物和纖維?？梢岳缤ㄟ^濕磨將原料(如全谷物)的粒度減少，以便打開結(jié)構(gòu) 并允許進(jìn)一步加工。濕磨使胚芽與粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))很好分離并且時常應(yīng)用于在例 如糖漿的生產(chǎn)中使用淀粉水解物的場所。
[0181 ] 在一個實施例中，粒度被減少至0.05-3.0mm、優(yōu)選0.1-0.5mm之間，或使得至少 30%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、甚至更優(yōu)選至少90%的含淀粉材料適合通過具有 0.05_3.0mm篩網(wǎng)、優(yōu)選0.1_0.5mm篩網(wǎng)的篩子。
[0182]更具體而言，將玉米籽粒以及其他作物籽粒降解為適于將淀粉轉(zhuǎn)化為單糖和寡 糖、乙醇、甜味劑等的淀粉基本由四個步驟組成：
[0183] 1.浸漬并分離胚芽，
[0184] 2.洗滌纖維并干燥，
[0185] 3.分離淀粉面筋，并且
[0186] 4.洗滌淀粉。
[0187] 1.浸漬并分離胚芽
[0188] 通過在約50 °C的溫度(例如約45 °C至60 °C之間）下，在水中浸泡約30分鐘至約48小 時之間(優(yōu)選30分鐘至約15小時)而軟化玉米籽粒。在浸漬過程中，籽粒吸水，從而將其水分 含量從15 %增加至45%并使大小增加超過一倍。任選地向水中添加例如0.1 %二氧化硫 (S02)和/或NaHS03以防止細(xì)菌在溫暖環(huán)境中生長。隨著玉米膨脹并軟化，浸漬水的溫和酸 度開始使玉米內(nèi)的面筋鍵松散并釋放淀粉。在將玉米籽粒浸漬后，它們裂了開來，以釋放胚 芽。胚芽包含有價值的玉米油?；旧贤ㄟ^使不含其他物質(zhì)的胚芽段在密切受控的條件下 "漂浮(floating)"而將胚芽與淀粉、外殼和纖維的較重密度的混合物分離。這一方法用于 消除痕量的玉米油在后面的加工步驟中的任何不利影響。
[0189] 在本發(fā)明的一個實施例中，于范圍在40與60°C之間的溫度(優(yōu)選大約50°C)下，將 籽粒在水中浸泡2-10小時，優(yōu)選約3-5小時。
[0190] 在一個實施例中，在浸泡過程中可以添加0.01 %-1 %，優(yōu)選0.05 %-0.3 %，尤其是 0.1%502和/或恥邯03。
[0191] 2.洗滌纖維并干燥
[0192] 為了得到最大的淀粉回收同時將終產(chǎn)物中的任何纖維保持至絕對最小值，在加工 過程中必須從纖維中洗滌出游離淀粉。收集纖維，并使其成漿并過篩，以回收任何殘留的淀 粉或蛋白質(zhì)。
[0193] 3.分離淀粉面筋
[0194] 將來自纖維洗滌步驟的淀粉-面筋懸浮液(稱作研磨淀粉)分離成淀粉和面筋。與 淀粉相比，面筋具有較低的密度。通過使研磨淀粉穿過離心機(jī)而容易地旋出面筋。
[0195] 4.洗滌淀粉。
[0196] 來自淀粉分離步驟的淀粉漿液包含一些不溶性蛋白質(zhì)和許多的可溶物。在可以生 產(chǎn)頂級品質(zhì)的淀粉(高純度淀粉)之前，必須將其除去。在水力旋流器中，將僅僅剩余1%或 2%蛋白質(zhì)的淀粉稀釋，洗滌8至14次，重新稀釋并再次洗滌，以除去最后痕量的蛋白質(zhì)并產(chǎn) 生高品質(zhì)淀粉，典型地純度大于99.5 %。
[0197] 產(chǎn)物
[0198] 可以使用濕磨生產(chǎn)(但不限于)玉米漿、玉米面筋飼料、胚芽、玉米油、玉米面筋粉、 玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖漿(例如玉米糖漿）、以及玉米乙醇。
[0199] 其他酶
[0200] 下面描述的一種或多種酶和多肽有待以"有效量"用于本發(fā)明的方法中。下文應(yīng)在 上文的"定義"部分中的酶披露的背景下加以閱讀。
[0201] 纖維素分解組合物
[0202] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物來源于木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌 株;腐質(zhì)霉屬的菌株，例如特異腐質(zhì)霉的菌株，和/或金孢子菌屬的菌株，例如盧克諾文思金 抱子菌（Chrysosporium lucknowense)的菌株。
[0203] 在一個優(yōu)選實施例中，該纖維素分解組合物來源于里氏木霉的菌株。
[0204] 該纖維素分解組合物可以包括以下多肽(包括酶）中的一種或多種:具有纖維素分 解增強(qiáng)活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII，內(nèi)切葡聚糖酶，木聚糖酶 或其兩種、三種或四種的混合物。
[0205]在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽以及一種葡糖苷酶。
[0206] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽以及一種木糖苷酶。
[0207] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽以及一種內(nèi)切葡聚糖酶。
[0208] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽以及一種木聚糖酶。
[0209] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種木聚糖酶。
[0210] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種β-葡糖苷酶以及一種β-木糖苷酶。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一 種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽、一種β-葡糖苷酶以及一種內(nèi)切葡聚糖酶。在一個 實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽、一種β-葡 糖苷酶以及一種木聚糖酶。
[0211] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種β-木糖苷酶以及一種內(nèi)切葡聚糖酶。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括 一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽、一種β-木糖苷酶以及一種木聚糖酶。
[0212] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種β-葡糖苷酶、一種β-木糖苷酶以及一種內(nèi)切葡聚糖酶。在一個實施例中，該纖維 素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽、一種β-葡糖苷酶、一種β-木 糖苷酶以及一種木聚糖酶。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分 解增強(qiáng)活性的GH61多肽、一種β-葡糖苷酶、一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種木聚糖酶。
[0213] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種β-木糖苷酶、一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種木聚糖酶。
[0214] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種β-葡糖苷酶、一種β-木糖苷酶、一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種木聚糖酶。
[0215] 在一個實施例中，該內(nèi)切葡聚糖酶是一種內(nèi)切葡聚糖酶I。
[0216] 在一個實施例中，該內(nèi)切葡聚糖酶是一種內(nèi)切葡聚糖酶II。
[0217] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種內(nèi)切葡聚糖酶I以及一種木聚糖酶。
[0218] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61 多肽、一種內(nèi)切葡聚糖酶II以及一種木聚糖酶。
[0219] 在另一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的 GH61多肽、一種β-葡糖苷酶以及一種CBHI。
[0220] 在另一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的 GH61多肽、一種β-葡糖苷酶、一種CBHI以及一種CBHII。
[0221] 該纖維素分解組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項 組成：酯酶、棒曲霉素、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、膨脹蛋白以及植 酸酶。
[0222] 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽
[0223] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物可以包括一種或多種具有纖維素分解增強(qiáng) 活性的GH61多肽。
[0224] 在一個實施例中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽來源于嗜熱子嚢菌屬，例 如金黃色嗜熱子囊菌的菌株(例如在W0 2005/074656中描述為序列號2的一種）；或以下具 有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，該多肽與W0 2005/074656中的序列號2具有至少80%， 例如至少85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至 少99 % -致性。
[0225] 在一個實施例中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的該GH61多肽來源于來自青霉屬的菌 株，例如埃默森青霉菌的菌株(例如在W0 2011/041397中披露的一種），或以下具有纖維素 分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，該多肽與W0 2011/041397中的序列號2具有至少80%，例如至少 85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % - 致性。
[0226] 在一個實施例中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的該GH61多肽來源于梭孢殼屬，例如 土生梭孢殼霉的菌株(例如在W0 2005/074647中披露為序列號7和序列號8的一種）；或來源 于曲霉屬的菌株的多肽，例如煙曲霉的菌株(例如在W0 2010/138754中描述為序列號2的一 種），或以下具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，該多肽與其具有至少80%，例如至少 85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % - 致性。
[0227] 內(nèi)切葡聚糖酶
[0228] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶，例如一種內(nèi)切葡 聚糖酶I或內(nèi)切葡聚糖酶II。
[0229] 可以在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不限于:解纖維熱 酸菌(Acidothermus cellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(WO 91/05039;W0 93/15186;美國專 利號5,275,944;W0 96/02551;美國專利號5,536,655;TO 00/70031 ;W0 05/093050);褐色 高溫雙歧菌（Thermobifida fusca)內(nèi)切葡聚糖酶III(W0 05/093050);以及褐色高溫雙歧 菌內(nèi)切葡聚糖酶V(W0 05/093050)。
[0230] 可以用于本發(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不限于:里氏木霉內(nèi)切葡聚糖 酶K彭蒂萊(Penttila)等人，1986,基因（Gene)45 :253-263);里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶 KGENBANK?登錄號M15665);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶11(薩洛黑莫（Saloheimo)等人，1988， 基因63:11-22);里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II(GENBANK?登錄號M19373);里氏木霉內(nèi)切 葡聚糖酶111(奧卡達(dá)（Okada)等人，1988,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) (Appl · Environ .Microbiol · )64:555-563，GENBANK?登錄號AB003694);里氏木霉內(nèi)切葡聚 糖酶V(薩洛黑莫等人，1994，分子微生物學(xué)（Molecular Microbiology) 13 : 219-228， GENBANK?登錄號Z33381);棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(黃(Ooi)等人，1990,核酸研究(Nucleic Acids Research)18:5884);川地曲霉（spergillus kawachii)內(nèi)切葡聚糖酶（坂元 (Sakamoto)等人，1995，當(dāng)代遺傳學(xué)（Current Gene tics) 27:435-439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌 (Erwinia carotovara)內(nèi)切葡聚糖酶（薩里拉赫蒂（Saarilahti)等人，1990，基因90 :9-14);尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號L29381);灰腐質(zhì)霉高溫變種內(nèi)切葡聚糖酶 (GENBANK?登錄號AB003107);熱白絲菌（Melanocarpus albomyces)內(nèi)切葡聚糖酶 (GENBANK?登錄號MAL515703);粗糙鏈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號XM_324477);特 異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V ;嗜熱毀絲霉CB S 1 1 7 . 6 5內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱 (basidiomycete)CBS 495.95內(nèi)切葡聚糖酶;擔(dān)子菌綱CBS 494.95內(nèi)切葡聚糖酶;土生梭孢 殼霉NRRL 8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶;土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶;土生梭 孢殼霉NRRL 8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶;土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶;土生 梭抱殼霉NRRL 8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株號VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄 號M15665)。
[0231] 在一個實施例中，該內(nèi)切葡聚糖酶是一種內(nèi)切葡聚糖酶II，例如來源于木霉屬的 內(nèi)切葡聚糖酶，例如里氏木霉的菌株(例如在W0 2011/057140中描述為序列號22的一種）； 或以下內(nèi)切葡聚糖酶，該內(nèi)切葡聚糖酶與W0 2011/057140中的序列號22具有至少80%，例 如至少85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少 99%-致性。在一個方面，該蛋白酶與W0 2011/057140中的序列號22的成熟多肽相差多達(dá) 10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)氨基酸。在另一個實施例中， 本發(fā)明涉及在一個或多個（例如，若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入的W0 2011/ 057140中的序列號22的成熟多肽的變體。在一個實施例中，引入W0 2011/057140中的序列 號22的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10個。這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性 的保守氨基酸取代或插入;典型地1-30個氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸，如 氨基末端的甲硫氨酸殘基;多達(dá)20-25個殘基的小接頭肽;或便于通過改變凈電荷或另一種 功能來純化的小延伸。
[0232] 木聚糖酶
[0233] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種木聚糖酶。在一個優(yōu)選方面，該木 聚糖酶是一種家族10木聚糖酶。
[0234] 有用于本發(fā)明的方法的木聚糖酶的實例包括但不限于來自以下各項的木聚糖酶： 棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790;W0 94/21785)、煙曲霉(W0 2006/078256)、嗜松青霉菌(TO 2011/041405)、青霉菌屬種(WO 2010/126772)、土生梭孢殼霉NRRL 8126(W0 2009/079210) 以及褐抱長毛盤菌（Trichophaea saccata)GH10(W0 2011/057083) 〇
[0235] 在一個實施例中，該GH10木聚糖酶來源于曲霉屬，例如棘孢曲霉的菌株(例如在WO 94/021785中描述為序列號5(稱為Xyl II)的一種）；或以下GH10木聚糖酶，該木聚糖酶與TO 94/021785中的序列號5具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%，優(yōu)選95%，例如至少 96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99%-致性。在一個方面，該蛋白酶與描述于W0 94/021785中的序列號5的成熟多肽相差多達(dá)10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8 個、9個或10個)氨基酸。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及在一個或多個(例如，若干個)位置 處包括取代、缺失和/或插入的描述于W0 94/021785中的序列號5的成熟多肽的變體。在一 個實施例中，引入描述于W0 94/021785中的序列號5的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/ 或插入的數(shù)目多達(dá)10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。這些氨基酸變化可以具有微小性 質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地1-30個 氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多達(dá)20-25個 殘基的小接頭肽;或便于通過改變凈電荷或另一種功能來純化的小延伸。
[0236] 在一個實施例中，該GH10木聚糖酶來源于曲霉屬，例如煙曲霉的菌株，例如在W0 2006/078256中描述為SEQ ID N0:6(作為Xyl III);或以下GH10木聚糖酶，該木聚糖酶與TO 2006/078256中的Xyl III具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%，優(yōu)選95%，例如至 少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % -致性。在一個方面，該蛋白酶與描述于TO 2006/078256中的SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多達(dá)10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6 個、7個、8個、9個或10個)氨基酸。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及在一個或多個(例如，若干 個)位置處包括取代、缺失和/或插入的描述于W0 2006/078256中的SEQ ID N0:6的成熟多 肽的變體。在一個實施例中，引入描述于W0 2006/078256中的SEQ ID N0:6的成熟多肽中的 氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。這些氨基酸 變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或 插入;典型地1-30個氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸 殘基；多達(dá)20-25個殘基的小接頭肽;或便于通過改變凈電荷或另一種功能來純化的小延 伸。
[0237] β-木糖苷酶
[0238] 有用于本發(fā)明的方法的β-木糖苷酶的實例包括但不限于來自以下各項的β-木糖 苷酶:粗糙鏈孢菌（SwissProt登錄號Q7S0W4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458) 以及埃默森踝節(jié)菌(Talaromyces emersonii) (SwissProt登錄號Q8X212) 〇
[0239] 在一個實施例中，該β-木糖苷酶來源于曲霉屬，例如煙曲霉的菌株（例如在W0 2011/057140中描述為序列號206的一種）；或以下β-木糖苷酶，該β-木糖苷酶與W0 2011/ 057140中的序列號206具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%，優(yōu)選95%，例如至少 96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99%-致性。在一個方面，該蛋白酶與描述于W0 2011/057140中的SEQ ID N0:206的成熟多肽相差多達(dá)10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6 個、7個、8個、9個或10個)氨基酸。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及在一個或多個(例如，若干 個)位置處包括取代、缺失和/或插入的描述于W0 2011/057140中的SEQ ID N0:206的成熟 多肽的變體。在一個實施例中，引入描述于W0 2011/057140中的SEQ ID N0:206的成熟多肽 中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。這些氨 基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取 代或插入;典型地1-30個氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫 氨酸殘基;多達(dá)20-25個殘基的小接頭肽;或便于通過改變凈電荷或另一種功能來純化的小 延伸。
[0240] 在一個實施例中，該β-木糖苷酶來源于曲霉屬的菌株，例如煙曲霉的菌株(例如在 美國臨時號61/526，833或PCT/US 12/052163(實例16和17)中披露的一種），或來源于木霉 屬的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如W0 2011/057140中的序列號58的成熟多肽，或以下β-木糖苷酶，該木糖苷酶與其具有至少80%，例如至少85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95%，例如 至少96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99% -致性。
[0241] β-葡糖苷酶
[0242] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物可以包括一種或多種β-葡糖苷酶。在一個 實施例中，該葡糖苷酶可以是來源于曲霉屬的菌株的葡糖苷酶，例如來源于米曲霉的， 例如披露于W0 2002/095014中的一種或在W0 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性 的融合蛋白，或來源于煙曲霉的，例如在W0 2005/047499中披露的一種或煙曲霉β-葡糖苷 酶變體，例如披露于PCT申請PCT/US 11/054185(或美國臨時申請?zhí)?1/388,997)中的一種， 例如具有以下取代的一種:F100D、S283G、N456E、F512Y。
[0243] 在一個實施例中，該β-葡糖苷酶來源于曲霉屬，例如煙曲霉的菌株，例如在W0 2005/047499中描述的一種，或以下β-葡糖苷酶，該β-葡糖苷酶與其具有至少80%，例如至 少85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % 一致性。
[0244] 在一個實施例中，該β-葡糖苷酶來源于曲霉屬，例如煙曲霉的菌株，例如在W0 2012/044915中描述的一種，或以下β-葡糖苷酶，該β-葡糖苷酶與其具有至少80%，例如至 少85 %、例如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % 一致性。
[0245] 纖維二糖水解酶I
[0246] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物可以包括一種或多種CBH 1(纖維二糖水解 酶I)。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種纖維二糖水解酶I(CBHI)，例如來源 于曲霉屬的菌株的纖維二糖水解酶I，例如煙曲霉的菌株，例如披露于W0 2011 /057140中的 序列號2中的Cel7A CBHI，或來源于木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株。
[0247] 在一個實施例中，該纖維二糖水解酶I來源于曲霉屬，例如煙曲霉的菌株，例如在 TO 2011/057140中描述的一種，或以下CBHI，該CBHI與其具有至少80%，例如至少85%、例 如至少90 %，優(yōu)選95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % -致性。
[0248] 纖維二糖水解酶II
[0249] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物可以包括一種或多種CBH II(纖維二糖水 解酶II)。在一個實施例中，該纖維二糖水解酶II(CBHII)，例如來源于曲霉屬的菌株的纖維 二糖水解酶II，例如煙曲霉的菌株;或木霉屬的菌株，例如里氏木霉，或梭孢殼屬的菌株，例 如土生梭孢殼霉的菌株，例如來自土生梭孢殼霉的纖維二糖水解酶II CEL6A。
[0250]在一個實施例中，該纖維二糖水解酶II來源于曲霉屬，例如煙曲霉的菌株，例如在 TO 2011/057140中描述的一種，或以下CBHII，該CBHII與其具有至少80%，例如至少85%、 例如至少90%，優(yōu)選95%，例如至少96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99% -致性。
[0251] 示例性纖維素分解組合物
[0252] 如以上提及的，該纖維素分解組合物可以包括多種不同的多肽(例如酶）。
[0253] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種里氏木霉纖維素酶制劑，該制劑 包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白（例如W0 2008/057637中的SEQ ID N0:74或76)以及金黃 色嗜熱子囊菌GH61A多肽（例如，W0 2005/074656中的SEQ ID N0:2)。
[0254] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，TO 94/ 021785中的SEQ ID N0:5(Xyl II))和一種里氏木霉纖維素酶制劑的共混物，該制劑包含煙 曲霉β-葡糖苷酶(例如，W0 2005/047499中的SEQ ID N0:2)和金黃色嗜熱子囊菌GH61A多肽 (例如，W0 20〇5/〇74656中的SEQ ID N0:2)。
[0255] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括煙曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/ 078256中的SEQ ID N0:6(Xyl III))和煙曲霉β-木糖苷酶（例如，W0 2011/057140中的SEQ ID NO: 206)與一種里氏木霉纖維素酶制劑的共混物，該制劑包含煙曲霉纖維二糖水解酶I (例如，W0 2011/057140中的SEQ ID N0:6)、煙曲霉纖維二糖水解酶11(例如，W0 2011/ 057140中的SEQ ID N0:18)、煙曲霉β-葡糖苷酶變體(例如，披露于W0 2012/044915中的具 有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的變體）以及青霉屬(埃默森青霉菌)GH61多肽（例如，TO 2011/041397中的SEQ ID Ν0:2)。
[0256] 在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種里氏木霉纖維素分解酶組合物， 該里氏木霉纖維素分解酶組合物進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的金黃色嗜熱子囊 菌GH61A多肽（例如，W0 2005/074656中的SEQ ID Ν0:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白 (例如，W0 2008/057637的SEQ ID Ν0:74或76)。
[0257] 在另一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種里氏木霉纖維素分解酶組合 物，該里氏木霉纖維素分解酶組合物進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的金黃色嗜熱子 囊菌GH61A多肽(例如，W0 2005/074656中的SEQ ID N0:2)以及煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，TO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。
[0258] 在另一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種里氏木霉纖維素分解酶組合 物，該里氏木霉纖維素分解酶組合物進(jìn)一步包括例如在W0 2011/041397中披露為SEQ ID NO: 2的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，TO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的變體:F100D、S283G、N456E、F512Y。
[0259] 本發(fā)明的酶組合物可以處于任何適于使用的形式，例如像除去或未除去細(xì)胞的粗 發(fā)酵液、具有或不具有細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解液、半純化或純化的酶組合物、或作為酶的來源 的宿主細(xì)胞(例如，木霉屬宿主細(xì)胞）。
[0260] 該酶組合物可以是干粉或顆粒、非塵顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體或穩(wěn)定化的受保護(hù) 的酶?？梢愿鶕?jù)已建立的方法例如通過添加穩(wěn)定劑(如糖、糖醇或其他多元醇）、和/或乳酸 或另一種有機(jī)酸，對液體酶組合物進(jìn)行穩(wěn)定化。
[0261] 酶量
[0262] 在具體實施例中，蛋白酶以酶蛋白的總量的約5 % w/w至約65 % w/w的范圍存在于 酶組合物中。在其他實施例中，蛋白酶以約5 % w/w至約60 % w/w、約5 % w/w至約50 % w/w、約 5 %w/w 至約40 %w/w、約5 %w/w 至約30 %w/w、約 10 %w/w 至約30 %w/w、或約 10 %w/w 至約 20%w/w 存在。
[0263] 可以按有效量添加酶，可以根據(jù)從業(yè)者和具體過程需要調(diào)節(jié)該有效量。通常，酶可 以按以下量存在 :〇.〇〇〇1-2.51^總酶蛋白/^干固體(05)籽粒，優(yōu)選0.001-111^酶蛋白/^03 籽粒，優(yōu)選0.0025-0.5mg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.025-0.25mg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選 0.05-0.125mg酶蛋白/g DS籽粒。在具體實施例中，該酶可以按以下量存在，例如2.5yg、 12.5以8、25以8、5(^8、7548、10(^8、12548、15(^8、17548、20(^8、25(^8、50(^8酶蛋白/^03籽 粒。
[0264] 其他酶活性
[0265] 根據(jù)本發(fā)明，以下活性中的一種或多種的有效量可以在處理籽粒的過程中存在或 添加:戊聚糖酶、果膠酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯咲喃糖苷酶(8^13；[110；^^81(^86)、木葡聚 糖酶、植酸酶活性。
[0266] 據(jù)信在將籽粒分為更細(xì)的顆粒后，該一種或多種酶可以更直接地作用于籽粒的細(xì) 胞壁和蛋白基質(zhì)并且因此更有效。因而，在隨后的步驟中，更加容易地將淀粉洗出。 優(yōu)選實施例
[0267] 本發(fā)明的以下實施例是示例性的。
[0268] 1. -種用于處理作物籽粒的方法，該方法包括以下步驟：
[0269] a)浸泡籽粒以產(chǎn)生浸泡的籽粒；
[0270] b)碾磨這些浸泡的籽粒；
[0271] c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下處理這些浸泡的籽粒，
[0272] 其中在步驟b)之前、與其同時或之后進(jìn)行步驟c)，
[0273] 并且所述多肽是一種肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶或選自下組，該組由以下各項 組成：
[0274] (a)-種多肽，該多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽 具有至少80%序列一致性；
[0275] (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多 核苷酸編碼：
[0276] (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列，
[0277] (ii)SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，
[0278] (iii)(i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈；
[0279] (c)一種多肽，該多肽由與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有 至少80 %序列一致性的多核苷酸編碼；
[0280] (d)SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多 肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽的一種變體，該變 體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及
[0281] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0282] 2.如實施例1所述的方法，其中所述多肽是一種與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多 肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多 肽。
[0283] 3.如實施例1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷 酸與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有至少85%、至少90%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性。
[0284] 4.如實施例1所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各項或由其 組成：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5或SEQIDN0:6或者披露于W0 2014/037438 中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽。
[0285] 5.如以上實施例中任一項所述的方法，其中具有蛋白酶活性的該多肽是一種絲氨 酸蛋白酶，例如家族S53的一種絲氨酸蛋白酶，例如來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3、來 自污叉絲孔菌的S53蛋白酶或來自變色栓菌的S53蛋白酶。
[0286] 6.如以上實施例中任一項所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽來自亞灰 樹花菌屬，優(yōu)選來自大型亞灰樹花菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽來自叉絲孔菌屬，優(yōu)選 來自污叉絲孔菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽來自栓菌屬，優(yōu)選來自變色栓菌。
[0287] 7.如以上實施例中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在β_木糖苷酶的存在下 處理這些浸泡的籽粒。
[0288] 8.如以上實施例中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在纖維素酶和/或半纖 維素酶的存在下處理這些浸泡的籽粒。
[0289] 9.如以上實施例中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在木聚糖酶的存在下處 理這些浸泡的籽粒。
[0290] 10 .如以上實施例中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在纖維素分解組合物 的存在下處理這些浸泡的籽粒，該纖維素分解組合物包括:1)纖維素酶或半纖維素酶，和2) GH61多肽。
[0291] 11.如以上實施例中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在乙酰木聚糖酯酶的 存在下處理這些浸泡的籽粒。
[0292] 12.如以上實施例中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在一種選自下組的酶 的存在下處理這些浸泡的籽粒，該組由以下各項組成：內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、纖維二糖 水解酶I、纖維二糖水解酶II、GH61多肽、或其組合。
[0293] 13.如以上實施例中任一項的方法，其中所述多肽按以下量存在:優(yōu)選0.0005至 1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.001至lmg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.01至0.5mg酶蛋白質(zhì)/g DS籽粒，優(yōu)選0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。
[0294] 14.如以上實施例中任一項所述的方法，其中這些作物籽粒來自玉米(玉蜀黍）、水 稻、大麥、高粱大豆、或果殼或小麥。
[0295] 15.-種酶組合物，包括一種具有蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽選自下組，該 組由以下各項組成：
[0296] (a)-種多肽，該多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性；
[0297] (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多 核苷酸編碼：
[0298] (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列，
[0299] (ii)SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，
[0300] (iii)(i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈；
[0301] (c)一種多肽，該多肽由與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多核苷酸編碼；
[0302] (d)SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多 肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽的一種變體，該變 體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及
[0303] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0304] 16.如實施例15所述的組合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各項或 由其組成：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6或者披露于W0 2014/ 037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽。
[0305] 17.如實施例15或16所述的組合物，其中具有蛋白酶活性的該多肽是一種絲氨酸 蛋白酶，例如家族S53的一種絲氨酸蛋白酶，例如來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3。
[0306] 18.如實施例15-17中任一項所述的組合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽來自 亞灰樹花菌屬，優(yōu)選來自大型亞灰樹花菌。
[0307] 19.如實施例15-18中任一項所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包括一種選自下組的 酶，該酶由以下各項組成:木糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、 GH61多肽、或其組合。
[0308] 20.如實施例15-19中任一項所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包括β-木糖苷酶、木 聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶。
[0309] 21.肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽或如實施例15-20中任 一項所述的酶組合物在如以上實施例1-14中任一項所述的方法中的用途，其中所述多肽選 自下組，該組由以下各項組成：
[0310] (a)-種多肽，該多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6的多肽或者SEQ ID Ν0:2或SEQ ID Ν0:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID Ν0:24或SEQ ID Ν0:25的多肽 具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性；
[0311] (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多 核苷酸編碼：
[0312] (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列，
[0313] (ii)SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，
[0314] (iii)(i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈；
[0315] (c)-種多肽，該多肽由與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多核苷酸編碼；
[0316] (d)SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多 肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽的一種變體，該變 體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及
[0317] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0318] 22.如實施例21所述的用途，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各項或由 其組成：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6 或者披露于 W0 2014/ 037438中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽。
[0319] 23.如實施例2卜22中任一項所述的用途，其中具有蛋白酶活性的該多肽是一種絲 氨酸蛋白酶，例如家族S53的一種絲氨酸蛋白酶，例如來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3、 來自污叉絲孔菌的S53蛋白酶或來自變色栓菌的S53蛋白酶。
[0320] 24.如實施例21-23中任一項所述的用途，其中具有蛋白酶活性的所述多肽來自亞 灰樹花菌屬，優(yōu)選來自大型亞灰樹花菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽來自叉絲孔菌屬，優(yōu) 選來自污叉絲孔菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽來自栓菌屬，優(yōu)選來自變色栓菌。
[0321] 實例
[0322] 材料與方法
[0323] 酶
[0324] 蛋白酶I:來自披露于W0 95/02044中的棘孢曲霉CBS 101.43的酸性蛋白酶。
[0325] 蛋白酶A:來自金黃色嗜熱子囊菌(AP025)的具有如WO 2003/048353-A1中的SEQ ID N0:2的氨基酸1-177所示的成熟氨基酸序列的金屬蛋白酶。
[0326] 蛋白酶B:產(chǎn)生于米曲霉中的可獲得自丹麥的諾維信公司的米黑根毛霉衍生的天 冬氨酸內(nèi)肽酶(Novoren?)。
[0327] 蛋白酶3M.g.:如披露于下文實例1和2制備的并且可獲得自丹麥的諾維信公司的 來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3。
[0328] 蛋白酶C:來自污叉絲孔菌的具有如W0 2014/037438中的SEQ ID N0:25所示的氨 基酸序列的S53蛋白酶。
[0329] 蛋白酶D:來自變色栓菌的具有如W0 2014/037438中的SEQ ID N0:24所示的成熟 氨基酸序列的S53蛋白酶。
[0330] 纖維素酶F:-種里氏木霉纖維素分解酶組合物，該里氏木霉纖維素分解酶組合物 包含煙曲霉GH10木聚糖酶(TO 2006/078256中的SEQ ID N0:6(Xyl III))和煙曲霉β-木糖 苷酶（W0 2013/028928中的SEQ ID Ν0:16)。
[0331] 菌株
[0332] 菌株大型亞灰樹花菌分離自諾維信公司于1993年在丹麥?zhǔn)占淖訉嶓w。
[0333] 越
[0334] 蛋白酶HUT活性的測定:
[0335] 1HUT是在40°C和pH 4.7下經(jīng)30分鐘在27511111處的吸光度下將變性的血紅蛋白等效 物消化為吸光度為〇.0084的1.10μg/ml酪氨酸于0.006N HC1中的溶液而形成水解物的酶 量。在給定條件下，在〇. 5M乙酸鹽緩沖液中通過酶消化變性的血紅蛋白底物。將未消化的血 紅蛋白用三氯乙酸加以沉淀并且測量上清液中的水解物在275nm下的吸光度。
[0336]蛋白酶測定
[0337] 動力學(xué)Suc-AAPF-pNA 測定:
[0338] pNA 底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨（Bachem)L_1400)〇
[0339] 溫度:室溫（25。〇
[0340] 測定緩沖液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，lmM CaCl2， 150mM KCl，0.01%Triton X-100,用HC1 或NaOH調(diào)節(jié)至pH值2·0、3·0、4·0、5·0、6·0、7·0、 8.0、9.0、10.0、及11.0〇
[0341] 將20μ1蛋白酶樣品（稀釋于0.01%Triton X-100中）與100μΙ測定緩沖液混合。通 過添加 100μΙ pNA底物（50mg，溶解在1.0ml DMS0中，并進(jìn)一步地用0.01%Triton Χ-100稀 釋45倍)開始進(jìn)行測定。監(jiān)測0D4q5的增加作為蛋白酶活性的量度。
[0342] 端點 Suc-AAPF-pNA測定:
[0343] pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨L-1400) 〇
[0344] 溫度:受控的（測定溫度）。
[0345] 測定緩沖液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，lmM CaCl2， 150mM KCl,0.01%Triton X-100,pH 4.0
[0346] 將200μ1 pNA底物（50mg，溶解在1.0ml DMS0中，并進(jìn)一步地用測定緩沖液稀釋45 倍)用移液管移至艾本德管(Eppendorf tube)中并置于冰上。添加20μ1蛋白酶樣品（稀釋在 0.01%Triton Χ-100中）。通過將艾本德管轉(zhuǎn)移至設(shè)定為測定溫度的艾本德恒溫混勻儀 (Eppendorf thermomixer)來啟動測定。將管在艾本德恒溫混勾儀上在最高振搖速率 (1400rpm.)下孵育15分鐘。通過轉(zhuǎn)移該管返回至冰浴并添加600μ1 500mM H3B03/Na0H(pH 9.7)停止孵育?；旌显摴懿?00μ1混合物轉(zhuǎn)移至微量滴定板中，將其在OD4〇5處讀取。在該 測定中包括空白緩沖液(buf f er blind)(代替酶）。0D4Q5(樣品）-0D4Q5(空白）是蛋白酶活性 的量度。
[0347] Protazyme AK測定:
[0348] 底物:Protazyme AK片劑(交聯(lián)和染色的酪蛋白；來自麥格酶公司(Megazyme))
[0349] 溫度:受控的（測定溫度）。
[0350] 測定緩沖液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，lmM CaCl2， 150mM KCl，0.01%Triton X-100，pH 6.5。
[0351] 通過溫和攪拌，將Protazyme AK片劑懸浮于2.0ml 0.01%Triton X-100中。將500 μL的這種懸浮液和500μ1的測定緩沖液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μ1蛋白酶樣 品（稀釋在〇.01 %Triton Χ-100中）。通過將艾本德管轉(zhuǎn)移至設(shè)定為測定溫度的艾本德恒溫 混勻儀來啟動測定。將管在艾本德恒溫混勻儀上在最高振搖速率（1400rpm.)下孵育15分 鐘。通過轉(zhuǎn)移該管返回至冰浴停止孵育。隨后將管在冰冷的離心機(jī)中離心數(shù)分鐘并將200yL 上清液轉(zhuǎn)移至微量滴定板中，將其在〇D65Q處讀取。在該測定中包括空白緩沖液(代替酶）。 〇D65Q (樣品）-0D65Q (空白）是蛋白酶活性的量度。
[0352] 動力學(xué)Suc-AAPF-pNA 測定:
[0353] pNA 底物：Suc-AAPA-pNA(巴亨 L-1775)
[0354] Suc-AAPR-pNA(巴亨 L_l72〇)
[0355] Suc-AAPD-pNA(巴亨 L-1835)
[0356] Suc-AAPI-pNA(巴亨 L_l79〇)
[0357] Suc-AAPM-pNA(巴亨 L-1395)
[0358] Suc-AAPV-pNA(巴亨 L_l77〇)
[0359] Suc-AAPL-pNA(巴亨 L_l39〇)
[0360] Suc-AAPE-pNA(巴亨 L-1710)
[0361] Suc-AAPK-pNA(巴亨 L-1725)
[0362] Suc-AAPF-pNA(巴亨 L-1400)
[0363] 溫度：室溫（25。〇
[0364] 測定緩沖液：100mM琥珀酸，lOOmM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，lmM CaCl2， 150mM KCl，0.01%Triton X-100，pH 4.0或pH 9·0〇
[0365] 將20μ1蛋白酶(稀釋于0.01%Triton X-100中）與100μΙ測定緩沖液混合。通過添 加 100μΙ ρΝΑ底物（50mg，溶解在 1.0ml DMS0中，并進(jìn)一步地用0.01%Triton Χ-100稀釋45 倍)開始進(jìn)行測定。監(jiān)測〇D4Q5的增加作為蛋白酶活性的量度。
[0366] 鄰苯二甲醛(0ΡΑ)測定:
[0367] 這一測定檢測伯胺并且因此可以將肽鍵由一種蛋白酶的切割測量為蛋白酶處理 的樣品與對照樣品之間的吸光度的差異?；旧细鶕?jù)尼爾森（Nielsen)等人（尼爾森 (Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，達(dá)姆麥妮(Dampmann)，C.用于確定食物蛋白水解程度 的改進(jìn)方法（Improved method for determining food protein degree of hydrolysis)，食品科學(xué)雜志(J Food Sci)，2001，66:642_646)進(jìn)行該測定。
[0368] 將500以1樣品通過1001<1)&微量濃縮(]\1;[(31'0(3011)離心過濾器（60111；[11，11，000印111，5 °C)過濾。將這些樣品在去離子水中稀釋大約(例如10倍、50倍或100倍），并將25yL的每份樣 品裝載到96孔微量滴定板中（5個重復(fù)）。將200μ1 0ΡΑ試劑（100mM四硼酸二鈉十水合物， 3.5mM十二烷基硫酸鈉(SDS)，5.7mM二硫蘇糖醇(DDT)，6mM鄰苯二甲醛)分配在所有孔中，振 蕩該板（l0sec，750rpm)并且在340nm下測量吸光度。
[0369] 實例1:來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID N0:3)的重組表達(dá)
[0370] 為了獲得用于測試并表征來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3的材料，將來自SEQ ID NO: 1的DNA序列克隆進(jìn)曲霉屬表達(dá)載體中并在米曲霉中加以表達(dá)。
[0371] 通過使用以下引物，用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)擴(kuò)增來自cDNA質(zhì)粒克隆pA2PR22的在Seq ID NO: 1中沒有DNA的終止密碼子的編碼區(qū)而將來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶3基因亞克隆 進(jìn)曲霉屬表達(dá)載體pMStr100 (W0 10/009400)中：
[0372] 597TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT(SEQ ID NO:7)
[0373] 598CAGGCCGACCGCGGTGAG(SEQ ID NO:8)
[0374] 用BamHI限制性酶切PCR產(chǎn)物并將其連接進(jìn)pMStrlOO的BamHI和Nrul位點，從而在 表達(dá)載體中形成具有C-末端標(biāo)記序列RHQHQHQH(終止序列）的框內(nèi)融合。對所得曲霉屬表達(dá) 構(gòu)建體pMStr 121中的S53蛋白酶3基因測序，并且確認(rèn)該序列的蛋白酶編碼部分與SEQ ID NO: 1的原編碼序列一致。還確認(rèn)了標(biāo)記編碼序列的框內(nèi)融合，從而產(chǎn)生SEQ ID NO: 3的序 列，該序列編碼SEQ ID NO :4的肽序列。
[0375] 使用如由克里斯滕森（Christensen)等人，1988，生物技術(shù)（Biotechnology )6， 1419-1422和W0 04/032648描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用pMStrl21轉(zhuǎn)化米曲霉菌株BECh2(W0 00/ 39322)。為了鑒定產(chǎn)生重組蛋白酶的轉(zhuǎn)化體，將這些轉(zhuǎn)化體和BECh2在30°C和200RPM下在 10ml的YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在3天生長之后取出樣品并用SDS-PAGE分析，以鑒 定重組蛋白酶產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中觀察到一個35與50kDa之間的新帶，在未轉(zhuǎn)化的 BECh2的培養(yǎng)物中并未觀察到該新帶。將似乎以較高水平表達(dá)重組蛋白酶的若干轉(zhuǎn)化體在 30 °C和200RPM下在500ml搖瓶中的100ml的YP+2 %葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。在2、3和4天 生長之后取出樣品并且通過用SDS-PAGE分析樣品而比較表達(dá)水平。選擇以相對較高的水平 表達(dá)重組蛋白酶的單個轉(zhuǎn)化體并將其指定為EXP01737。通過在包含0.01 % ΤΕΙΤΟΝΦΧ-100的選擇培養(yǎng)基上稀釋劃線分生孢子而將ΕΧΡ01737分離兩次，以限制菌落大小，并將其如 上所述地在搖瓶中的ΥΡ+2%葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，以提供供純化用的材料。4天生長之 后收獲搖瓶培養(yǎng)物并且通過Miracloth(卡爾生化公司（Calbiochem))過濾發(fā)酵液而除去真 菌菌絲體，然后如實例2中所描述加以純化。
[0376] YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基
[0377] 10g酵母提取物
[0378] 20g蛋白胨
[0379] 水補(bǔ)至1L
[0380] 在121Γ下高壓滅菌20分鐘
[0381] 添加100ml 20%無菌葡萄糖溶液
[0382] 實例2:從大型亞灰樹花菌中純化具有N-末端HQ標(biāo)記的S53蛋白酶3
[0383] 將培養(yǎng)液離心（20000x g，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。上清液 通過耐潔(Nal gene) 0.2μηι過濾裝置過濾，以便除去剩余曲霉屬宿主細(xì)胞。將0.2μηι濾液轉(zhuǎn)移 至G25交聯(lián)葡聚糖柱(來自GE醫(yī)療集團(tuán)（GE Healthcare))上的10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)。 將G25交聯(lián)葡聚糖轉(zhuǎn)移的酶施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)中平衡的〇-交聯(lián)葡聚糖?？ 柱(來自GE醫(yī)療集團(tuán)）上。收集1 OmM丁二酸/NaOH(pH 3.5)的貫通流(run-through)和洗滌物 并包含S53蛋白酶(使用pH 4下的動力學(xué)Suc-AAPF-pNA測定確認(rèn)活性）。在將貫通流和洗滌 物級分充分混合的同時用1M HC1將該級分的pH調(diào)節(jié)至pH 3.25。將經(jīng)pH調(diào)節(jié)的溶液施加至 在10mM丁二酸/Na0H(pH 3.25)中平衡的SP-交聯(lián)葡聚糖FF柱(來自GE醫(yī)療集團(tuán)）上。在將柱 用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在相同的緩沖液中的線性NaCl梯度(0->0.5M) 洗脫超過十個柱體積。分析來自該柱的級分的蛋白酶活性(使用pH 4下的動力學(xué)Suc-AAPF-pNA測定），并且合并峰級分。向合并物中添加固體硫酸銨，至2.0M最終(NH4)2S〇4濃度。將酶 溶液施加至在101^丁二酸/恥0!1、2.01(順4)2304化113.25)中平衡的苯基-1'〇7〇?63^柱(來 自東曹公司（TosoHaas))上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將S53蛋白酶用在平衡 緩沖液與10mM丁二酸/Na0H(pH 3.25)之間的線性梯度洗脫超過十個柱體積。分析來自該柱 的級分的蛋白酶活性(使用pH 4下的動力學(xué)Suc-AAPF-pNA測定）。合并具有較高活性的級分 并且將其轉(zhuǎn)移至G25交聯(lián)葡聚糖柱(來自GE醫(yī)療集團(tuán)）上的10mM丁二酸/Na0H(pH 3.5)。將 G25交聯(lián)葡聚糖轉(zhuǎn)移的蛋白酶施加至在10mM丁二酸/Na0H(pH 3.5)中平衡的SP-交聯(lián)葡聚糖 HP柱(來自GE醫(yī)療集團(tuán)）上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在相同的緩 沖液中的線性NaCl梯度(0->0.5M)洗脫超過五個柱體積。將來自該柱的構(gòu)成主峰的級分合 并為純化產(chǎn)物。通過SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物并且在凝膠上看到一個主帶和三個次帶。這些 帶的埃德曼N-末端測序顯示，所有這些帶均與S53蛋白酶相關(guān)并且因此我們預(yù)期這些次帶 代表一些S53蛋白酶分子的切口。將純化產(chǎn)物用于進(jìn)一步表征。
[0384] 實例3:來自大型亞灰樹花菌的具有N-末端HQ標(biāo)記的S53蛋白酶3的表征
[0385] 將動力學(xué)Su c-AAPF-pNA測定用于獲得pH-活性曲線和pH-穩(wěn)定性曲線(在指示的pH 值下2小時之后的殘余活性）。對于pH-穩(wěn)定性曲線，將蛋白酶在不同測定緩沖液中稀釋10倍 以達(dá)到這些緩沖液的pH值并且然后在37°C下孵育2小時。在孵育之后，通過稀釋于pH 4.0測 定緩沖液中，使該蛋白酶孵育的pH轉(zhuǎn)至與殘余活性測定之前相同的pH值。使用端點Suc-AAPF-pNA測定以獲得在pH 4.0下的溫度-活性曲線。使用動力學(xué)Suc-AAPX-pNA測定和十種 不同的Suc-AAPX-pNA底物以獲得酶在pH 4.0下的P1-特異性。
[0386] 結(jié)果示于下表1-4中。在這些表中包括蛋白酶10R(其在W0 2014/037438中披露為 蛋白酶10R)的數(shù)據(jù)。對于表1，活性是相對于酶的最適pH而言。對于表2,活性是相對于樣品 的殘余活性而言，將這些樣品保持在穩(wěn)定條件(5°C，pH 4.0針對來自實例2的S53蛋白酶;pH 9.0針對蛋白酶1 OR)下。對于表3，活性是相對于酶(pH 4.0針對來自實例2的S53蛋白酶;pH 6.5針對蛋白酶101〇的最適溫度而言。對于表4，活性是相對于酶的最佳底物（311〇-44?1^-ρΝΑ-ρΝΑ針對來自實例2的S53蛋白酶)而言。使用Protazyme AK測定以獲得蛋白酶10R在pH 6.5下的溫度-活性曲線。
[0387] 表1:如使用動力學(xué)Suc-AAPF-pNA測定確定的在25°C下的pH-活性曲線
[0389] 表2:如使用動力學(xué)Suc-AAPF-pNA測定確定的pH-穩(wěn)定性曲線(在37°C下2小時之后 的殘余活性）
[0391] 表3:如使用端點511(；44??1嫩測定確定的在口!14.0或口!16.5下的溫度活性曲線
[0393] 表4:如使用動力學(xué)Suc-AAPX-pNA測定確定的在37°C下在pH 4.0或pH 9.0下對10 種Suc-AAPX-pNA底物的P1 -特異性
[0396] 來自實例2的S53蛋白酶的其他特征
[0397] 確定 N-端序列為:AIPASCASTI。
[0398] 如通過SDS-PAGE所確定的相對分子量大約是Mr = 43kDa。
[0399] 附接至成熟序列的N-末端HQ標(biāo)記的確認(rèn)
[0400]使用安裝有10KD截留過濾器的vivaspin超濾裝置將此樣品與50mM乙酸鈉緩沖液 (pH 5.5)進(jìn)行緩沖液交換。緩沖液交換后，添加2yL的內(nèi)切糖苷酶Η并且然后將該樣品在5°C 下孵育過夜。注:對于每個去糖基化的N-連接位點，一個N-乙酰己糖胺仍然在該蛋白質(zhì)主鏈 上，從而使每個位點的分子量增加203.19Da。然后通過質(zhì)譜來分析樣品。
[0401 ] 通過主峰的完整分子量分析確定的分子量為：38088.6Da，對應(yīng)于成熟序列加- RHQHQ和單個乙酰己糖胺。
[0402] 通過次峰的完整分子量分析確定的分子量為：37961Da，對應(yīng)于成熟序列加 -RHQH 和單個乙酰己糖胺。
[0403]成熟序列(來自埃德曼N-末端測序數(shù)據(jù)和完整分子量分析）：
[0405]來自這一成熟序列的計算的分子量是37882.6Da。
[0406]實例4:在來自實例2的S53蛋白酶3M. g.的存在下的濕磨
[0407] 根據(jù)以下程序，使玉米的處理經(jīng)受模擬玉米濕磨過程。兩個處理涉及施用來自實 例2的S53蛋白酶(浸漬B和浸漬C)，而一個處理是無酶的(浸漬A)。
[0408] 對于經(jīng)酶處理的浸漬(浸漬B和浸漬C)，配制包含0.06%(w/v)S02和0.5%(w/v)乳 酸的浸漬溶液。針對每個燒瓶，清洗100克的干燥整齊的（黃色馬齒型）玉米，以除去破碎籽 粒，并且將其放入200mL上述浸漬水中。然后，將所有燒瓶放入設(shè)置為52°C同時輕輕振蕩的 定軌空氣加熱搖床中并允許在此溫度下混合16小時。16小時后，將所有燒瓶從空氣搖床中 移出。
[0409] 以類似方式制作無酶的對照浸漬（浸漬A);除了將它浸漬于0.15% (w/v)S02和 0.5% (w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸漬28小時之外。
[0410] 將玉米混合物傾倒在布氏漏斗上，以使其脫水，并且然后向原浸漬燒瓶中添加 100mL的淡自來水并旋渦，用于沖洗目的。然后，將其作為洗滌液傾倒在玉米上并捕獲在與 原玉米導(dǎo)液(draining)相同的燒瓶中。這一洗滌步驟的目的在于保留含有盡可能多的可溶 物的濾液。將包含可溶物的濾液稱為"輕浸漬水（light steep water)"（ "LSW"）。然后，將收 集的總輕浸漬水級分烘干，以確定存在的干物質(zhì)的量。通過以下方式完成干燥:在設(shè)置為 105°C的烘箱中過夜干燥。
[0411]然后，將玉米放置在具有反向葉片的瓦林實驗室攪拌器（WaringLaboratory Blender)中（所以前緣是鈍的）。向該攪拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后將玉米在 低速設(shè)置下碾磨一分鐘，以有助于釋放胚芽。碾磨后，立即將漿液轉(zhuǎn)移回?zé)?，用于酶孵?步驟。使用50mL淡水沖洗攪拌器并且還向燒瓶中添加洗滌水。在酶處理燒瓶(浸漬B和浸漬 C)中加入酶并將其返回至定軌搖床中，以在52°C下以更高的混合速率再孵育4小時。如下表 5所示進(jìn)行加酶。
[0412] 表5.實驗設(shè)計(每克的玉米干物質(zhì)施用的劑量)
[0414] 孵育后，將漿液轉(zhuǎn)移至較大的燒杯中，用于除去釋放的胚芽。對照浸漬不經(jīng)歷行這 一孵育步驟，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工。
[0415] 對于脫胚，使用漏勺輕輕地簡單地攪拌混合物。停止攪拌后，大量的胚芽片浮至表 面。使用漏勺手動地將這些胚芽片從液面上撇出。將胚芽片放置于在其下方具有托盤的US No. 100(150μπι)篩網(wǎng)上。重復(fù)這一混合與撇出過程，直到可忽略不計的量的胚芽上浮至表面 供撇出。對漏勺中的漿醪的檢查也未顯示出在此時有大量的胚芽留在混合物中的證據(jù)，所 以停止脫胚。然后，將已經(jīng)積聚在No. 100篩網(wǎng)上的胚芽片添加至燒瓶中，在該燒瓶中，將它 們與125mL的淡水組合并旋渦，以模擬胚芽洗罐。然后，再次將燒瓶的內(nèi)容物傾倒在篩網(wǎng)上， 確保輕敲燒瓶并且完全清除出其中的胚芽。然后，將撇出燒杯中的脫胚漿液傾倒回攪拌器 中，并且使用在篩網(wǎng)的下方的托盤中的胚芽洗滌水將胚芽從燒杯沖洗至攪拌器中。然后，再 使用125mL的淡水第二次沖洗燒杯并將其添加至攪拌器中。在分析之前，將篩網(wǎng)上的經(jīng)洗滌 的胚芽在105°C下過夜烘干。
[0416] 然后，將已經(jīng)脫胚的纖維、淀粉和面筋漿液在高速下在攪拌器中碾磨3分鐘。利用 這一增加的速度從纖維中釋放盡可能多的淀粉和面筋。將攪拌器中的所得碾磨漿液用下方 具有托盤的No. 100振動篩(萊馳(Retsch)型號AS200搖篩裝置)過篩。將萊馳裝置的振蕩頻 率設(shè)為大約60HZ。一旦停止過濾，便將托盤中的淀粉和面筋濾液(稱作"研磨淀粉"）轉(zhuǎn)移進(jìn) 燒瓶中，直到進(jìn)一步加工。然后，使篩網(wǎng)上的纖維在500mL的淡水中成漿并且然后重新傾倒 在振動篩上，以從纖維中洗去未結(jié)合的淀粉。再一次，將托盤中的淀粉和面筋濾液添加至先 前的研磨淀粉燒瓶中。
[0417] 然后，以此方式連續(xù)三次洗滌纖維并使其過篩，每次使用240mL的淡洗滌水。然后 是單次125mL洗滌同時振動，以實現(xiàn)從纖維級分釋放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗滌 后，將纖維輕輕地按在篩網(wǎng)上以在將它轉(zhuǎn)移至用于在105°C下(過夜）烘干的鋁制秤盤中之 前將其脫水。將來自洗滌和按壓的所有濾液添加至研磨淀粉燒瓶中。
[0418] 然后，在烘干之前，通過布氏漏斗中的沃特曼濾紙真空過濾包括淀粉和面筋的研 磨淀粉。測量來自真空燒瓶的總濾液體積。將250ml濾液轉(zhuǎn)移至塑料瓶中，用于在105°C下烘 干48小時。通過將面筋溶液的體積乘以面筋濾液的總固體而計算這一級分的總可溶性固體 含量。將濾餅轉(zhuǎn)移至不銹鋼皿中，用于首先在50°C下過夜干燥，以使糊化最小化并且然后在 105°C下過夜干燥，以獲得干重(淀粉和面筋產(chǎn)量）。表6顯示了兩個實驗中的不同級分產(chǎn)量。
[0419] 表6實驗4中的實驗對照和蛋白酶的級分產(chǎn)量。
[0420]
[0421 ]注:A是兩個批次的實驗數(shù)據(jù)的平均值
[0422] 實例5.在S53蛋白酶3M. g.和纖維素酶F的存在下的濕磨
[0423] 根據(jù)以下程序，使玉米的處理經(jīng)受模擬玉米濕磨過程。兩個處理涉及施用蛋白酶 和纖維素酶F的組合(浸漬B和浸漬C)，而一個處理是無酶的(浸漬A)，其中S53蛋白酶來自實 例2。對于經(jīng)酶處理的浸漬(浸漬B和浸漬C)，配制包含0.06% (w/v)S02和0.5% (w/v)乳酸的 浸漬溶液。針對每個燒瓶，清洗1 〇〇克的干燥整齊的(黃色馬齒型)玉米，以除去破碎籽粒，并 且將其放入200mL上述浸漬水中。然后，將所有燒瓶放入設(shè)置為52°C同時輕輕振蕩的定軌空 氣加熱搖床中并允許在此溫度下混合16小時。16小時后，將所有燒瓶從空氣搖床中移出。
[0424] 以類似方式制作無酶的對照浸漬（浸漬A);除了將它浸漬于0.15% (w/v)S02和 0.5% (w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸漬28小時之外。
[0425] 將玉米混合物傾倒在布氏漏斗上，以使其脫水，并且然后向原浸漬燒瓶中添加 l〇〇mL的淡自來水并旋渦，用于沖洗目的。然后，將其作為洗滌液傾倒在玉米上并捕獲在與 原玉米導(dǎo)液相同的燒瓶中。這一洗滌步驟的目的在于保留含有盡可能多的可溶物的濾液。 將包含可溶物的濾液稱為"輕浸漬水"（"LSW"）。然后，將收集的總輕浸漬水級分烘干，以確 定存在的干物質(zhì)的量。通過以下方式完成干燥:在設(shè)置為l〇5°C的烘箱中過夜干燥。
[0426] 然后，將玉米放置在具有反向葉片的瓦林實驗室攪拌器中（所以前緣是鈍的）。向 該攪拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后將玉米在低速設(shè)置下碾磨一分鐘，以有助于 釋放胚芽。碾磨后，立即將漿液轉(zhuǎn)移回?zé)?，用于酶孵育步驟。使用50mL淡水沖洗攪拌器并 且還向燒瓶中添加洗滌水。在酶處理燒瓶(浸漬B和浸漬C)中加入酶并將其返回至定軌搖床 中，以在52°C下以更高的混合速率再孵育4小時。如下表7所示進(jìn)行加酶。
[0427] 表7.實驗設(shè)計(每克的玉米干物質(zhì)施用的劑量)
[0429] 孵育后，將漿液轉(zhuǎn)移至較大的燒杯中，用于除去釋放的胚芽。對照浸漬不經(jīng)歷行這 一孵育步驟，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工。
[0430] 對于脫胚，使用漏勺輕輕地簡單地攪拌混合物。停止攪拌后，大量的胚芽片浮至表 面。使用漏勺手動地將這些胚芽片從液面上撇出。將胚芽片放置于在其下方具有托盤的US No. 100(150μπι)篩網(wǎng)上。重復(fù)這一混合與撇出過程，直到可忽略不計的量的胚芽上浮至表面 供撇出。對漏勺中的漿醪的檢查也未顯示出在此時有大量的胚芽留在混合物中的證據(jù)，所 以停止脫胚。然后，將已經(jīng)積聚在No. 100篩網(wǎng)上的胚芽片添加至燒瓶中，在該燒瓶中，將它 們與125mL的淡水組合并旋渦，以模擬胚芽洗罐。然后，再次將燒瓶的內(nèi)容物傾倒在篩網(wǎng)上， 確保輕敲燒瓶并且完全清除出其中的胚芽。然后，將撇出燒杯中的脫胚漿液傾倒回攪拌器 中，并且使用在篩網(wǎng)的下方的托盤中的胚芽洗滌水將胚芽從燒杯沖洗至攪拌器中。然后，再 使用125mL的淡水第二次沖洗燒杯并將其添加至攪拌器中。在分析之前，將篩網(wǎng)上的經(jīng)洗滌 的胚芽在105°C下過夜烘干。
[0431] 然后，將已經(jīng)脫胚的纖維、淀粉和面筋漿液在高速下在攪拌器中碾磨3分鐘。利用 這一增加的速度從纖維中釋放盡可能多的淀粉和面筋。將攪拌器中的所得碾磨漿液用下方 具有托盤的No. 100振動篩(萊馳型號AS200搖篩裝置)過篩。將萊馳裝置的振蕩頻率設(shè)為大 約60HZ。一旦停止過濾，便將托盤中的淀粉和面筋濾液(稱作"研磨淀粉"）轉(zhuǎn)移進(jìn)燒瓶中，直 到進(jìn)一步加工。然后，使篩網(wǎng)上的纖維在500mL的淡水中成漿并且然后重新傾倒在振動篩 上，以從纖維中洗去未結(jié)合的淀粉。再一次，將托盤中的淀粉和面筋濾液添加至先前的研磨 淀粉燒瓶中。
[0432] 然后，以此方式連續(xù)三次洗滌纖維并使其過篩，每次使用240mL的淡洗滌水。然后 是單次125mL洗滌同時振動，以實現(xiàn)從纖維級分釋放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗滌 后，將纖維輕輕地按在篩網(wǎng)上以在將它轉(zhuǎn)移至用于在105°C下(過夜）烘干的鋁制秤盤中之 前將其脫水。將來自洗滌和按壓的所有濾液添加至研磨淀粉燒瓶中。
[0433] 然后，在烘干之前，通過布氏漏斗中的沃特曼濾紙真空過濾淀粉和面筋漿液。測量 來自真空燒瓶的總濾液體積。將250ml濾液轉(zhuǎn)移至塑料瓶中，用于在105°C下烘干48小時。通 過將面筋溶液的體積乘以面筋濾液的總固體而計算這一級分的總可溶性固體含量。將濾餅 轉(zhuǎn)移至不銹鋼皿中，用于首先在50°C下過夜干燥，以使糊化最小化并且然后在105°C下過夜 干燥，以獲得干重。表8顯示了兩個實驗中的不同級分產(chǎn)量。
[0434] 表8實驗5中的實驗對照和所有共混物的級分產(chǎn)量。
[0435]
[0437] 注:A是兩個批次實驗數(shù)據(jù)的平均值;B是四個批次實驗數(shù)據(jù)的平均值;C是兩個批 次實驗數(shù)據(jù)的平均值
[0438] 實例6.在不同蛋白酶的存在下的纖維洗滌
[0439] 根據(jù)以下程序，使來自植物的經(jīng)壓制纖維的四個處理(測試A、B、C和D)經(jīng)受模擬纖 維洗滌過程。
[0440] 將來自植物的10g(干重)經(jīng)壓制纖維與200mL pH 3.8(用乳酸調(diào)節(jié)）水混合。按下 表添加酶并在52C孵育lh。
[0441 ] 表9加蛋白酶計劃
[0442]
[0443] 在下方具有托盤的75um篩上分離纖維碎片和淀粉/面筋漿液并且用平面刮刀手動 擠壓纖維以脫水。一旦停止過濾，便將托盤中的淀粉和面筋濾液轉(zhuǎn)移進(jìn)研磨淀粉和面筋燒 瓶中，直到進(jìn)一步加工。然后，使篩網(wǎng)上的纖維在200ml的淡水中成漿并且然后重新傾倒在 篩上，以從纖維中洗去未結(jié)合的淀粉和蛋白質(zhì)。再一次，將托盤中的淀粉和面筋濾液添加至 先前的研磨淀粉和面筋燒瓶中。然后，以此方式再連續(xù)兩次洗滌纖維并使其過篩，每次使用 200mL的淡洗滌水。
[0444] 完成所有洗滌后，將纖維輕輕地按在篩網(wǎng)上以在將它轉(zhuǎn)移至用于在105°C下（過 夜)烘干的鋁制秤盤中之前將其脫水。將來自洗滌和按壓的所有濾液添加至研磨淀粉和面 筋燒瓶中。
[0445] 使用布氏漏斗過濾研磨淀粉和面筋，并且此外在105°C烘箱中過夜干燥之前，將所 得固體濾餅連同濾紙一起于50°C下放置在預(yù)稱重的皿中過夜。完全烘干后，對每個級分稱 重，以獲得干物質(zhì)重量。
[0446] 下表10示出了對照和酶運行的產(chǎn)物產(chǎn)量(每個級分的干固體/5g玉米干物質(zhì)的百 分比）以及纖維中的殘余淀粉含量。這些結(jié)果表明，與常規(guī)方法和其他蛋白酶相比，蛋白酶 3M.g.可以從纖維中釋放更多的淀粉和面筋。
[0447] 表10.實驗對照和所有酶處理的級分產(chǎn)量(干物質(zhì)的總纖維干重％ )
[0448]
[0450] 實例7.在具有不同S53蛋白酶和纖維素酶的共混物存在下的纖維洗滌
[0451] 根據(jù)以下程序，使來自植物的經(jīng)壓制纖維的五個處理(測試A、B、C和D)經(jīng)受模擬纖 維洗滌過程。
[0452] 將來自植物的5g(干重)經(jīng)壓制纖維與100mL 0.05M pH 4.0乙酸鈉緩沖液混合。按 下表添加酶并在52C孵育4h。
[0453] 表11加蛋白酶計劃
[0454]
[0455] 在下方具有托盤的75um篩上分離纖維碎片和淀粉/面筋漿液并且用平面刮刀手動 擠壓纖維以脫水。一旦停止過濾，便將托盤中的淀粉和面筋濾液轉(zhuǎn)移進(jìn)研磨淀粉和面筋燒 瓶中，直到進(jìn)一步加工。然后，使篩網(wǎng)上的纖維在l〇〇ml的淡水中成漿并且然后重新傾倒在 篩上，以從纖維中洗去未結(jié)合的淀粉和蛋白質(zhì)。再一次，將托盤中的淀粉和面筋濾液添加至 先前的研磨淀粉和面筋燒瓶中。然后，以此方式再連續(xù)兩次洗滌纖維并使其過篩，每次使用 100mL的淡洗滌水。
[0456] 完成所有洗滌后，將來自洗滌和按壓的所有濾液添加至研磨淀粉和面筋燒瓶中。 使用布氏漏斗過濾研磨淀粉和面筋，并且此外在l〇5°C烘箱中過夜干燥之前，將所得固體濾 餅連同濾紙一起于50°C下放置在預(yù)稱重的皿中過夜。完全烘干后，對每個級分稱重，以獲得 干物質(zhì)重量。
[0457] 下表12示出了對照和酶運行的濾液的不溶物產(chǎn)量(淀粉和面筋）（每個級分的干固 體/5g玉米干物質(zhì)的百分比）。這些結(jié)果表明，與常規(guī)方法相比，所有S53蛋白酶都可以從纖 維中釋放更多的淀粉和面筋。
[0458] 表12.實驗對照和所有酶處理的不溶物產(chǎn)量(干物質(zhì)的總纖維干重％)
【主權(quán)項】
1. 一種用于處理作物籽粒的方法，該方法包括以下步驟： a) 浸泡籽粒以產(chǎn)生浸泡的籽粒； b) 碾磨這些浸泡的籽粒； c) 在具有蛋白酶活性的多肽存在下處理這些浸泡的籽粒， 其中在步驟b)之前、與其同時或之后進(jìn)行步驟c)， 并且所述多肽是一種肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶或選自下組，該組由以下各項組成： (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽具有至少80 %序列一致性； (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多核苷 酸編碼： (i) SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列， (ii) SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列， (iii) (i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈； (c) 一種多肽，該多肽由與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有至少 80%序列一致性的多核苷酸編碼； (d) SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的 一種變體，該變體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及 (e) (a)、（b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽是一種與SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽 或者SEQ ID NO: 2或SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或至少 100%序列一致性的多肽。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸 與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至 少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或至少 100 %序列一致性。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各項或由其組 成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或者披露于WO 2014/037438中 的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。5. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中具有蛋白酶活性的該多肽是一種絲氨酸 蛋白酶，例如家族S53的一種絲氨酸蛋白酶，例如來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶、來自污 叉絲孔菌的S53蛋白酶或來自變色栓菌的S53蛋白酶。6. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽來自亞灰樹 花菌屬、叉絲孔菌屬、或栓菌屬，優(yōu)選來自大型亞灰樹花菌、污叉絲孔菌或變色栓菌。7. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在β-木糖苷酶的存在下處 理這些浸泡的籽粒。8. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在纖維素酶和/或半纖維 素酶的存在下處理這些浸泡的籽粒。9. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在木聚糖酶的存在下處理 這些浸泡的籽粒。10. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在纖維素分解組合物的 存在下處理這些浸泡的籽粒，該纖維素分解組合物包括：1)纖維素酶或半纖維素酶，和2) GH61多肽。11. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在乙酰木聚糖酯酶的存 在下處理這些浸泡的籽粒。12. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在一種選自下組的酶的 存在下處理這些浸泡的籽粒，該組由以下各項組成：內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、纖維二糖水 解酶I、纖維二糖水解酶II、GH61多肽、或其組合。13. 如以上權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多肽按以下量存在：優(yōu)選0.0005至 1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.001至Img酶蛋白/g DS籽粒，優(yōu)選0.01至0.5mg酶蛋白質(zhì)/g DS籽粒，優(yōu)選0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。14. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中這些作物籽粒來自玉米（玉蜀黍）、水 稻、大麥、高粱大豆、或果殼或小麥。15. -種酶組合物，包括一種具有蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽選自下組，該組由 以下各項組成： (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性； (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多核苷 酸編碼： (i) SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列， (ii) SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列， (iii) (i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈； (c) 一種多肽，該多肽由與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多核苷酸編碼； (d) SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的 一種變體，該變體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及 (e) (a)、（b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。16. 如權(quán)利要求15所述的組合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各項或由 其組成：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6。17. 如權(quán)利要求15或16所述的組合物，其中具有蛋白酶活性的該多肽是一種絲氨酸蛋 白酶，例如家族S53的一種絲氨酸蛋白酶，例如來自大型亞灰樹花菌的S53蛋白酶。18. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽來自亞 灰樹花菌屬，優(yōu)選來自大型亞灰樹花菌。19. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包括一種選自下組的酶， 該酶由以下各項組成:β_木糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、GH61 多肽、或其組合。20. 如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包括β-木糖苷酶、木聚糖 酶和內(nèi)切葡聚糖酶。21. 肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽或如權(quán)利要求15-20中任一 項所述的酶組合物在如以上權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法中的用途，其中所述多肽選 自下組，該組由以下各項組成： (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID NO:5、SEQ ID ΝΟ:6的多肽或者SEQ ID ΝΟ:2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少或至少90%序列一致性； (b) -種多肽，該多肽由在高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項雜交的多核苷 酸編碼： (i) SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列， (ii) SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列， (iii) (i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈； (c) 一種多肽，該多肽由與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多核苷酸編碼； (d) SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的 一種變體，該變體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入;以及 (e) (a)、（b)、（c)或(d)的多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。
【文檔編號】C12N9/58GK105899543SQ201480064159
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月26日
【發(fā)明人】龍禎, 徐望暉, 韓望, S·R·麥克勞克林, R·戴因哈默, P·桑德斯, B·小維達(dá)爾, 沈心妤, M·J·阿克曼, T·吉本斯
【申請人】諾維信公司