一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物及其提取方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物及其提取方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的云牛膝多糖從云牛膝的莖和/或葉和/或根中提取得到，分子量范圍為0.5～3kD，結(jié)構(gòu)單元包括葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸，單糖摩爾比為(10?30):1(2.5?4)。本發(fā)明主要開(kāi)發(fā)云牛膝莖和/或葉和/或根部位，成本低，變廢為寶，具有顯著的社會(huì)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，云牛膝莖和/或葉和/或根的多糖提取物對(duì)腫瘤有顯著的抑制作用及增強(qiáng)免疫力的功能，可用于制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保健品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物及其提取方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種具有抗腫瘤活性和具有免疫增 強(qiáng)活性的云牛膝莖和/或葉和/或根多糖及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾十年來(lái)，在抗腫瘤、抗病毒藥及延緩衰老藥等方面，免疫調(diào)節(jié)劑藥物已日益凸 顯出其優(yōu)越性。大量的藥理和臨床研究表明，多糖類(lèi)化合物是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑，它能 激活免疫細(xì)胞，提高細(xì)胞的免疫功能，而對(duì)正常的細(xì)胞沒(méi)有毒副作用。例如從天然產(chǎn)物中分 離得到的靈芝多糖、香菇多糖等，它們與感染、腫瘤、炎癥和一些自身免疫性疾病有密切關(guān) 系，它們通過(guò)影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、巨噬細(xì)胞、抗體和補(bǔ)體的產(chǎn)生及干擾素等來(lái)促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞 和體液免疫反應(yīng)，達(dá)到治療疾病和保健的目的。
[0003] 目前，關(guān)于植物提取多糖的抗腫瘤研究報(bào)道很多。例如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?201510169864.0,申請(qǐng)公布日為2015年9月2日的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了樹(shù)莓多糖在抗腫瘤中的應(yīng) 用，樹(shù)莓多糖對(duì)起源于人的皮膚、頭頸部、腦、甲狀腺、胰腺、食管、結(jié)腸或直腸、卵巢、前列腺 的腫瘤都有良好的抑制作用，且作用與化療藥物相近似，毒副作用更小，為治療或預(yù)防腫瘤 提供了新的選擇。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01210551228.0，授權(quán)公告日為2014年12月10日的專(zhuān) 利申請(qǐng)公開(kāi)了具有抗腫瘤活性的黃蜀葵花多糖及其制備方法，該多糖是由摩爾比為1:0.9: 1:2.14:1.0的β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-半乳糖和α-L-吡喃巖藻糖構(gòu)成，分子 量為8867。該多糖的基本單元的結(jié)構(gòu)式為a-D-吡喃半乳糖（1-6)，和a-D-吡喃甘露糖(2- 6)為主鏈及甘露糖C-3分支連接a-L-吡喃巖藻糖（1-3)連接β-D-吡喃葡萄糖( - 1)。該發(fā)明 通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取分離工藝，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再脫蛋白，然后DEAE-52纖維素樹(shù)脂和SephadexG-100凝膠樹(shù)脂聯(lián)用進(jìn)行純化，制得純度高的黃蜀葵花多糖，經(jīng)過(guò) 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該發(fā)明提供的黃蜀葵花多糖具有很好的抗腫瘤活性，并且長(zhǎng)期使用 無(wú)不良反應(yīng)，可以方便和藥學(xué)上可接受的載體制備成各種劑型的藥物，臨床上服用方便。
[0004] 牛膝，別名：牛??膝，拉丁文名:Achyranthes bidentata Blume·莧科、牛膝屬多年 生草本，高70-120厘米;根圓柱形，直徑5-10毫米，土黃色;莖有棱角或四方形，綠色或帶紫 色，有白色貼生或開(kāi)展柔毛，或近無(wú)毛，分枝對(duì)生。葉片橢圓形或橢圓披針形，少數(shù)倒披針 形，基部楔形或?qū)捫ㄐ?，兩面有貼生或開(kāi)展柔毛;退化雄蕊頂端平圓，稍有缺刻狀細(xì)鋸齒。胞 果矩圓形，黃褐色，光滑。種子矩圓形，黃褐色?；ㄆ?-9月，果期9-10月。根入藥，生用，活血 通經(jīng)。牛膝根據(jù)產(chǎn)地不同可分為懷牛膝和川牛膝，科學(xué)家們從懷牛膝和川牛膝中提取到2種 結(jié)構(gòu)不同、相對(duì)分子質(zhì)量較小的多糖，分別命名為懷牛膝多糖(Aehyranthes Mdentata polysaeeharides，AbPS)和川牛膝多糖(RCP)。由于對(duì)AbPs的研究較為深入，所以一般意義 上的牛膝多搪是指AbPS。研究發(fā)現(xiàn)AbPS是一種果聚糖，其相對(duì)分子質(zhì)量小，水溶性好，易被 人體吸收，具有廣譜的免疫調(diào)節(jié)活性和較好的抗腫瘤作用。純化后的AbPS為均一多糖，相對(duì) 分子質(zhì)量為1300-1400;經(jīng)完全酸水解后進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，顯示AbPS是由果糖 和葡萄糖以8:1(物質(zhì)的量比）組成的，同時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量分布顯示AbPS含有4-21糖。對(duì)牛膝 多糖的研究由來(lái)已久，例如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?81055 24.7，授權(quán)公告日為1989年12月6日的 專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了從中藥牛膝中提取牛膝多糖的方法。該發(fā)明以中藥牛膝為原料，對(duì)其浸泡 液用與水互溶的丙酮進(jìn)行二級(jí)分級(jí)沉淀后，再透析及冷凍干燥，得到的粗牛膝多糖再進(jìn)行 一次醇類(lèi)沉淀后，即得牛膝多糖精制品。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?2110987.7，授權(quán)公告日為2003 年2月19日的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了牛膝多糖衍生物、制備方法和用途。其牛膝多糖衍生物包括牛 膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖，其是用磷酸化試劑或羥烷基化試劑，在相應(yīng)條件下 與牛膝多糖生成不同取代度的牛膝多糖衍生物，這一系列不同取代度的牛膝多糖衍生物經(jīng) 生物活性試驗(yàn)表明，具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能的作用。
[0005] 云牛膝（Achyranthes aspera L · var · rubrafusca(Wight)Hook · f · [A · rubro-fusca Wi-ght])別名昆明土牛膝、拐牛膝、雞豚草，為土牛膝的變種，為莧科植物紅褐粗毛 牛膝的根及根莖。味苦、性平，歸肝、腎經(jīng)，具有活血通經(jīng)、利尿通淋、清熱解毒之功效。主腰 膝疼痛、風(fēng)濕痹痛、閉經(jīng)、淋濁、疔瘡癰腫、毒蛇蛟傷。形似原種粗毛牛膝多年生草本，高20-120cm。根細(xì)長(zhǎng)，直徑3-5mm，土黃色。據(jù)《滇南本草》記載，云牛膝可治疔瘡、癰疽，敷患處；亦 能打胎；同豬肉煨食之，能明日。川牛膝呈近圓柱形，微扭曲，向下略細(xì)或有少數(shù)分枝，表面 黃棕色或灰褐色，具縱皺紋、支根痕和多數(shù)橫長(zhǎng)的皮孔樣突起。質(zhì)韌，不易折斷，斷面淺黃色 或棕黃色，維管束點(diǎn)狀，排列成數(shù)輪同心環(huán)。氣微，味甜。懷牛膝因產(chǎn)于歷史上的懷慶府而得 名，位于今河南焦作一帶。其條子粗壯、明亮、色澤鮮艷、油性多。懷牛膝側(cè)重補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨， 川牛膝側(cè)重活血化瘀。川牛膝主治血瘀經(jīng)閉，痛經(jīng)，難產(chǎn)，胞衣不下，關(guān)節(jié)痹痛，足痿筋攣，尿 血，血淋，跌撲損傷。通過(guò)對(duì)比云牛膝、川牛膝、懷牛膝的特征及功能，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地不同，其藥用 價(jià)值及成分也有一定差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 1.要解決的問(wèn)題
[0007] 針對(duì)目前云牛膝的研究存在空白、藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)不足的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種云 牛膝莖和/或葉和/或根多糖的提取方法及多糖在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力保健品中 的應(yīng)用。本發(fā)明中的云牛膝多糖從云牛膝的莖和/或葉和/或根中提取得到，分子量范圍為 0.5~3kD，結(jié)構(gòu)單元包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和巖藻糖，具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力 活性。
[0008] 2.技術(shù)方案
[0009] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物，提取物的組分為多糖。
[0011]優(yōu)選地，所述的多糖的分子量范圍為〇. 5~3kD。
[0012] 優(yōu)選地，所述多糖的結(jié)構(gòu)單元包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和巖藻糖，葡萄糖、 半乳糖、半乳糖醛酸和巖藻糖之間的摩爾比為(12-40): 1: (3-5): (0.5-6)。
[0013] 優(yōu)選地，所述多糖的結(jié)構(gòu)單元包括葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸，葡萄糖、半乳糖 和半乳糖醛酸之間的摩爾比為（10-30) :1(2.5-4)。
[0014] 上述的云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保 健品中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選地，所述的腫瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和宮 頸癌以及起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié) 腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤以及肉瘤。
[0016] 云牛膝莖和/或葉和/或根多糖在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保健品中的應(yīng) 用。
[0017] 云牛膝莖和/或葉和/或根在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保健品中的應(yīng)用。
[0018] 一種抗腫瘤藥物，包括云牛膝莖和/或葉和/或根多糖。
[0019] 一種云牛膝莖和/或葉和/或根的資源化利用方法，其步驟包括：（1)采集云牛膝的 莖和/或葉和/或根；（2)從云牛膝的莖和/或葉和/或根中提取多糖；（3)將步驟(2)中提取的 多糖制備成抗腫瘤藥物或增強(qiáng)免疫力型保健品。
[0020] 本發(fā)明首次對(duì)云牛膝及云牛膝莖和/或葉和/或根多糖進(jìn)行開(kāi)發(fā)，包括其相對(duì)分子 量、單糖組成、免疫增強(qiáng)活性及抗腫瘤活性。云牛膝多糖的提取與一般植物多搪的提取方法 相同，可經(jīng)洗凈、烘干、粉碎、用水提醇沉，或用丙酮沉淀，再經(jīng)濃縮，離心和透析，即可得云 牛膝多糖粗品。粗云牛膝多糖的分離純化，一般要經(jīng)過(guò)CM-Sephadex C50和Sephadex G50兩 次纖維柱層析，可得到較純的云牛膝多糖。云牛膝多糖（A c h y r a n t h e s a s p e r a polysaccharid^AAP)是指從云牛膝的莖和/或葉和/或根中提取獲得。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道 其成分及活性的研究。
[0021] 3.有益效果
[0022] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0023] (1)本發(fā)明中的從云牛膝的莖、葉、根提取得到的多糖對(duì)腫瘤有顯著的抑制作用及 增強(qiáng)免疫力的功能，可用于制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保健品；
[0024] (2)本發(fā)明中云牛膝多糖通過(guò)細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞和增強(qiáng)NK細(xì)胞 活性方面等測(cè)定其有增強(qiáng)機(jī)體免疫力活性，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)云牛膝多糖能有效的抑制 胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤和血管癌的增殖，在75yg/mL濃度下，對(duì) 卵巢癌、胃癌、子宮頸癌抑制率達(dá)到50%以上；lOOyg/mL濃度下，對(duì)子宮癌細(xì)胞抑制率達(dá)到 65%以上，對(duì)肺癌細(xì)胞抑制率達(dá)到50%以上;在體內(nèi)檢測(cè)其對(duì)S180小鼠肉瘤的抑制作用，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)75mg/kg，其抑瘤率可達(dá)53.61 %，與陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺效果相當(dāng)，且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用； [0025] (3)本發(fā)明首次采用云牛膝莖、葉、根提取多糖，并發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫 活性的作用，并公開(kāi)了將云牛膝莖、葉、根中提取的多糖應(yīng)用于制備抗腫瘤輔助藥物和增強(qiáng) 免疫力保健品，能夠抑制腫瘤的惡化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，可作為包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺 癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和宮頸癌以及起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、 肺臟、肝臟、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱、睪丸的原 發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤以及肉瘤等的治療或輔助治療用藥及增強(qiáng)免疫力保健品；
[0026] (4)本發(fā)明主要開(kāi)發(fā)云牛膝莖、葉、根部位，成本低，變廢為寶，具有顯著的社會(huì)價(jià) 值和市場(chǎng)價(jià)值，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為本發(fā)明中混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖；
[0028]圖2為本發(fā)明中云牛膝多糖樣品1的HPLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 云牛膝多糖的提取
[0032]本發(fā)明分別從云牛膝的莖、葉和根中提取多糖，在提取過(guò)程中，將云牛膝的莖和葉 放在一起提取，對(duì)云牛膝的根單獨(dú)提取，具體的提取方法如下：稱(chēng)取干燥云牛膝莖和葉（或 根)細(xì)段20g，超聲波破碎2h，功率比為90%，后用沸水加熱提取3h，抽濾后濃縮至原體積的 I/15;用4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，1000 rpm離心，5min;得到沉淀并用蒸餾水溶解，后用1 /3 倍體積的Sevag(氯仿:正丁醇=5:1，體積比）試劑除蛋白，重復(fù)3次，1000 rpm離心，5min，濃 縮并凍干得到云牛膝多糖粗品。
[0033] 用葡聚糖凝膠Sephadex G-50對(duì)云牛膝多糖粗品進(jìn)行初步純化。取Sephadex G-50 干粉100g，蒸餾水溶脹72h后，將溶脹好的葡聚糖凝膠用3倍體積的NaOH(0.02moI/L)浸泡 30min，蒸餾水洗至中性，再用HCl(0·02mol/L)同樣處理，第三遍用0·02mol/L NaOH處理，蒸 餾水洗至中性。蒸餾水洗至中性。脫氣后濕法裝柱（IcmX 100cm)，蒸餾水平衡過(guò)夜后上樣。 稱(chēng)取云牛膝多糖40mg，溶于2mL去離子水，充分溶解，0.45μπι濾膜過(guò)濾后上樣。去離子水做流 動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流出液用DSB-100A自動(dòng)部份收集器收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)。以A 49q為縱 坐標(biāo)，管號(hào)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線(xiàn)，收集主峰，得到云牛膝多糖。
[0034]云牛膝多糖含量及單糖組成的測(cè)定 [0035] 一、主要試劑的配置
[0036] 80%硫酸蒽酮溶液：向裝有20mL蒸餾水的燒杯沿壁緩慢加入SOmL濃硫酸，并不斷 攪拌;待濃硫酸溫度降至常溫，向其中加入〇.2g的硫酸蒽酮固體，并不斷攪拌，至完全溶解。 避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0037] 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立
[0038] 精確稱(chēng)取105°C干燥至恒重的葡萄糖100mg，定容至500mL容量瓶中，加蒸餾水至刻 度，混勾。在8支試管中分別加入0.2mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL、0 . lmL、0.2mL、0.3mL、 0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL，補(bǔ)蒸餾水至1.0 mL，然后加入3mL 80%硫酸蒽酮溶液試劑 1.5mL，充分混勻。置于100°C沸水浴中煮沸15min，然后用流水迅速冷卻。在620nm處讀OD值。 以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到其線(xiàn)性回歸方程:y = 9 · 5415x+0 · 003，R2 = 0 · 9994;線(xiàn)性范圍為 0-0 · 2mg/mL。
[0039]三、多糖含量的測(cè)定
[0040] 吸取I.OmL的樣品，按照上述步驟測(cè)定OD值，并代入回歸方程中計(jì)算樣品中的云牛 膝總多糖含量。
[0041 ]四、柱前衍生化HPLC法(PMP-HPLC)測(cè)定云牛膝多糖的單糖組成 [0042] 1.樣品水解
[0043]分別稱(chēng)取3份5mg云牛膝多糖樣品，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5(五種樣品分別從不同采 集時(shí)間的云牛膝莖、葉、根中提取得到，提取方法如前所述，且均用葡聚糖凝膠Sephadex G-50進(jìn)行初步純化)于安瓿中，加入ImL 2mol/L的TFA，封口，于100°C水解8h，水解產(chǎn)物置于蒸 發(fā)皿中，80°C蒸干后加甲醇洗5次，洗滌后加 ImL雙蒸水溶解水解樣品。
[0044] 2.混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
[0045]稱(chēng)取核糖Rib、甘露糖Man、巖藻糖Fuc、鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal、葡萄 糖Glc、木糖Xyl、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA標(biāo)準(zhǔn)品各5mg，分別溶于ImL水中，再?gòu)闹?各吸取相同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合均勻，作為混合單糖對(duì)照品溶液。
[0046] 3.1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化HPLC
[0047] 取50yL上述樣品水解液，加入50yL 0.6mol/L的NaOH，混勻后加入IOOyL 0.5mol/L 的PMP-甲醇液，混勻后置于70°C烘箱反應(yīng)30min(注意避光），取出冷卻后，再加入100μ LO. 3mol/L HCl，混勻后用ImL三氯甲烷萃取過(guò)量的PMP，靜止后吸取上層水層再加入ImL氯 仿萃取，重復(fù)三次，將水層過(guò)0.45μπι濾膜作為樣品溶液。
[0048] HPLC條件：島津LC-20AT高效液相色譜儀，色譜柱為waters symmetry C18(150mm X 4 · 6mm，5μπι)，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，柱溫30°C。流動(dòng)相：KH2PO4溶液 (pH6.7)和乙腈按體積比83:17混合。進(jìn)樣量:20yL，流速:lmL/min。
[0049] 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0050] 通過(guò)對(duì)比相同條件下混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間可以得出云牛膝多糖樣品1、2、3的 單糖組成包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、巖藻糖，其中樣品1的單糖摩爾比為31:1: 3 : 0.5;樣品2的單糖摩爾比為12:1:5:2.5;樣品3的單糖摩爾比為40:1:3:6(圖1，圖2)。
[0051 ]樣品4、5的單糖主要由葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成，其中樣品4的單糖摩爾比 為10:1: 2.5;樣品5的單糖摩爾比為30:1:4。得出葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸之間的摩爾比 為（10-30):1(2.5-4)。
[0052] 實(shí)施例2
[0053]云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官的影響 [0054] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0055]按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為8組，每組12只；分為空 白組、環(huán)磷酰胺(CY)模型組、香菇多糖+CY組(50mg/kg)、懷牛膝多糖組+CY組(50mg/kg)、云 牛膝多糖高劑量+CY組（100mg/kg)、云牛膝多糖中劑量組+CY組(75mg/kg)、云牛膝多糖低劑 量+CY組(50mg/kg)、云牛膝多糖小劑量+CY組(25mg/kg)。每天上午空腹稱(chēng)重一次，云牛膝多 糖按l〇〇mg/kg、75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg高中低小四個(gè)劑量組給小鼠灌胃，1次/d，連續(xù)給 藥19天，空白組和CY模型組給予蒸餾水，自由采食。第15天除空白組其余7組開(kāi)始腹腔注射 CY 75mg/kg，l次/d，連續(xù)5天。
[0056] 第20天，小鼠稱(chēng)重，脫頸椎處死小鼠后無(wú)菌取脾臟、胸腺，稱(chēng)重。
[0057]胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重/體重；
[0058]脾指數(shù)(mg/g)=脾重/體重。
[0059] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0060]表1云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠體重的影響
[0062]與模型組比較，*P〈0 · 05，林 P〈0 · 01。
[0063]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠造模前兩周各組平均體重都有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，第三周造模后除 空白組外其余各組的體重都有不同程度的下降。其中模型組體重下降趨勢(shì)較明顯，而且經(jīng) 試驗(yàn)觀察模型組小鼠活動(dòng)明顯遲緩、消瘦、兩眼呆滯、毛發(fā)無(wú)光澤、說(shuō)明CY能抑制小鼠體重 的增長(zhǎng)，推測(cè)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)有抑制作用。也說(shuō)明了免疫抑制小鼠模型建立成功。而多糖能 促進(jìn)CY小鼠體重的增長(zhǎng)。
[0064]表2云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾、胸腺的重量及指數(shù)的影響
[0066] 與模型組比較，*P〈0 · 05，林 P〈0 · 01。
[0067] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量+CY組和高劑量+CY組脾重、胸腺重與模型組比較差異均顯 著(P〈0.05);高劑量+CY組的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)與模型組比較差異顯著(P〈0.05);說(shuō)明云牛 膝多糖能促進(jìn)免疫抑制小鼠胸腺、脾臟的增長(zhǎng)，提高其指數(shù)，對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官有一 定的促進(jìn)作用。
[0068] 實(shí)施例3
[0069] 云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫細(xì)胞的影響-碳廓清法試驗(yàn)方法
[0070] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0071] 按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為8組，每組12只；分為空 白組、環(huán)磷酰胺(CY)模型組、香菇多糖+CY組(50mg/kg)、懷牛膝多糖組+CY組(50mg/kg)、云 牛膝多糖高劑量+CY組（100mg/kg)、云牛膝多糖中劑量組+CY組(75mg/kg)、云牛膝多糖低劑 量+CY組(50mg/kg)、云牛膝多糖小劑量+CY組(25mg/kg)。每天上午空腹稱(chēng)重一次，云牛膝多 糖按l〇〇mg/kg、75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg高中低小四個(gè)劑量組給小鼠灌胃，1次/d，連續(xù)給 藥19天，空白組和CY模型組給予蒸餾水，自由采食。第15天除空白組其余7組開(kāi)始腹腔注射 CY 75mg/kg，l次/d，連續(xù)5天。
[0072]末次給藥Ih后每只尾靜脈注入50%印度墨汁，注入印度墨汁的量按小鼠空腹體重 0.1 mL/109計(jì)算。2min(Tl)和10min(T2)后立即分別從眼眶靜脈叢采取20yL，同時(shí)立即注入 4mL 0.1 ^NaHCO3溶液中。兩次采血完畢之后脫頸處死，取脾臟和肝臟并稱(chēng)重。以正常小鼠 血注入4mL 0.1 ^NaHCO3溶液中作對(duì)照。在可見(jiàn)分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)處，以NaHCO3。溶液作 校對(duì)，測(cè)A值。結(jié)果以吞噬指數(shù)來(lái)表示。
[0073] !^(lgODi-lgODd/Urti))，吞噬指 α =體重/(肝重+脾重)*K1/3。
[0074] 二、試劑配制
[0075]印度墨水:用生理鹽水稀釋10倍，臨用前配置。注射體積為0.1mL/10g。
[0076] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0077] 表3云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠吞噬指數(shù)α的影響
[0079] 與模型組比較，*Ρ〈〇 · 05，林 Ρ〈0 · 01。
[0080] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY模型組吞噬指數(shù)與空白組比較差異極顯著(Ρ〈0.01)，與高劑量+ CY組比較差異極顯著（Ρ〈0.01);中劑量+CY組和低劑量+CY組與模型組比較差異顯著（Ρ〈 0.05)，小劑量+CY組與模型組比較無(wú)顯著差異，說(shuō)明云牛膝多糖能在一定程度上提高免疫 抑制小鼠的吞噬指數(shù)，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能。
[0081 ] 實(shí)施例4
[0082]云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫細(xì)胞的影響-脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定 [0083] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0084]按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為8組，每組12只；分為空 白組、環(huán)磷酰胺(CY)模型組、香菇多糖+CY組(50mg/kg)、懷牛膝多糖組+CY組(50mg/kg)、云 牛膝多糖高劑量+CY組（100mg/kg)、云牛膝多糖中劑量組+CY組(75mg/kg)、云牛膝多糖低劑 量+CY組(50mg/kg)、云牛膝多糖小劑量+CY組(25mg/kg)。每天上午空腹稱(chēng)重一次，云牛膝多 糖按l〇〇mg/kg、75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg高中低小四個(gè)劑量組給小鼠灌胃，1次/d，連續(xù)給 藥19天，空白組和CY模型組給予蒸餾水，自由采食。第15天除空白組其余7組開(kāi)始腹腔注射 CY 75mg/kg，l次/d，連續(xù)5天。
[0085] 第18天，將小鼠摘眼球處死，于75%乙醇中浸泡5-10min。于超凈工作臺(tái)中無(wú)菌取 小鼠脾臟，PBS清洗，5mL注射器芯研磨，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，離心1000r/min， 5min)，棄上清;TriS-NH4CI破解紅細(xì)胞，離心（1000r/min，5min)，棄上清，重復(fù)3次;最后用 PBS清洗細(xì)胞，離心后加入10 %小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。用血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞 濃度為5 X IO6個(gè)/mL，于96孔板中培養(yǎng)。
[0086] 二、主要試劑的配置
[0087] 1.紅細(xì)胞裂解液（Tris-NH4Cl):稱(chēng)取3.735g氯化銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris) 1.3g加超純水溶解并稀釋至500mL，0.22μπι濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0088] 2.磷酸鹽緩沖液(？85):恥(：18.(^，1((：10.28，恥2冊(cè)〇4.12!12〇2.9 8，詘2?〇4〇.28， 溶于1000 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，高壓滅菌后于4°C保存。
[0089]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0090]表4云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響
[0093] 與模型組比較，*P〈0 · 05，#P〈0 · 01。
[0094] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY模型組與空白組比較差異極顯著(P〈0.01);三個(gè)劑量+CY組與模 型組比較差異顯著(P〈〇. 05);小劑量+CY組和中劑量+CY組之間無(wú)顯著差異，高劑量+CY組與 空白組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明云牛膝多糖能在一定程度上促進(jìn)免疫抑制小鼠的脾淋巴細(xì)胞 的增殖，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能。
[0095] 實(shí)施例5
[0096] 云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清血溶素水平的影響
[0097] -、實(shí)驗(yàn)方法
[0098]按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為8組，每組12只；分為空 白組、環(huán)磷酰胺(CY)模型組、甘露聚糖肽+CY組(4mg/kg)、懷牛膝多糖組+CY組(50mg/kg)、云 牛膝多糖高劑量+CY組（100mg/kg)、云牛膝多糖中劑量組+CY組(75mg/kg)、云牛膝多糖低劑 量+CY組(50mg/kg)、云牛膝多糖小劑量+CY組(25mg/kg)。每天上午空腹稱(chēng)重一次，云牛膝多 糖按l〇〇mg/kg、75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg高中低小四個(gè)劑量組給小鼠灌胃，給藥體積為 0.1ml/10g，l次/d，連續(xù)給藥19天，空白組和CY模型組給予蒸餾水，自由采食。第15天除空白 組其余7組開(kāi)始腹腔注射CY 75mg/kg，1次/d，連續(xù)5天。給藥后第14天上午，各鼠腹腔注射 20% (V/V)的生理鹽水兔紅細(xì)胞0.2mL進(jìn)行免疫，同日下午繼續(xù)給藥。
[0099] 免疫后d6(免疫當(dāng)天為d0)，動(dòng)物摘眼球取血，收集盡量多的血液于1.5mL的EP管 中，置電熱恒溫培養(yǎng)箱中37°C下斜放溫育1.5h，此時(shí)血清充分析出，2000rpm離心5min，收集 上清。取50yL血清樣品于盛有450yL生理鹽水的EP管中，即為10倍稀釋;再取10倍稀釋的樣 品IOOyL加入96孔板(反應(yīng)板)小孔中；來(lái)自一個(gè)動(dòng)物的血清樣品作為一個(gè)樣本，每個(gè)動(dòng)物的 樣品進(jìn)行同樣的處理。然后每孔加體積分?jǐn)?shù)為2%生理鹽水兔紅細(xì)胞和10%補(bǔ)體各50yL。再 做一組補(bǔ)紅本底孔(2%生理鹽水兔紅細(xì)胞和10%補(bǔ)體各50yL+生理鹽水IOOyL)和全溶血孔 (2%生理鹽水兔紅細(xì)胞50yL+蒸餾水150yL)，各3孔。置37°C恒溫箱中溫育3h，然后，取上清 液IOOyL移至另一96孔板(測(cè)量板）中，于450nm處用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，此時(shí)得到的數(shù)據(jù)分別為 樣品溶血測(cè)量值、補(bǔ)紅本底測(cè)量值、全溶血測(cè)量值。另取一 96孔板按照測(cè)量板的分布，每孔 加10倍稀釋的樣品和生理鹽水各5〇yL，此為樣品本底孔;另做3孔空白本底孔(每孔加生理 鹽水IOOyL)。在450nm處測(cè)OD值，得到的數(shù)據(jù)分別為樣品本底測(cè)量值和空白本底測(cè)量值，將 樣品本底測(cè)量值減去空白本底測(cè)量值的平均值即為樣品本底凈值。結(jié)果以樣品溶血OD凈值 表示，樣品溶血OD凈值等于樣品溶血測(cè)量值減去樣品本底凈值和補(bǔ)紅本底測(cè)量值(3孔的均 值）。加2%生理鹽水兔紅細(xì)胞時(shí)要邊混勻邊加入，最好是樣品按組別橫向排列，紅細(xì)胞按順 序縱向依次加入小孔中。
[0100] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0101]表5云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清血溶素水平的影響 [0103]與模型組比較，*P〈0 · 05，林 P〈0 · 01。
[01 04]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY( 75mg/kg)體內(nèi)給藥，可以明顯抑制小鼠血清溶血素水平，與陰 性對(duì)照組比較具有極顯著性差異(P〈〇. 01)。云牛膝多糖高、中劑量（100，75mg/kg)體內(nèi)給 藥，可以顯著提高由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的血清溶血素水平，與CY組比較具有顯 著性差異（P〈〇.05)且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)趨勢(shì)。陽(yáng)性對(duì)照藥甘露聚糖肽（4mg/kg)、懷牛膝多糖 (50mg/kg)均可以顯著提高由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的血清溶血素水平，與CY組比 較具有極顯著性差異(P〈〇. 01)。
[0105] 實(shí)施例6
[0106]云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠 NK細(xì)胞活性的影響-乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定法
[0107] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0108] 按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為8組，每組12只；分為空 白組、環(huán)磷酰胺(CY)模型組、香菇多糖+CY組(50mg/kg)、懷牛膝多糖組+CY組(50mg/kg)、云 牛膝多糖高劑量+CY組（100mg/kg)、云牛膝多糖中劑量組+CY組(75mg/kg)、云牛膝多糖低劑 量+CY組(50mg/kg)、云牛膝多糖小劑量+CY組(25mg/kg)。每天上午空腹稱(chēng)重一次，云牛膝多 糖按l〇〇mg/kg、75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg高中低小四個(gè)劑量組給小鼠灌胃，1次/d，連續(xù)給 藥19天，空白組和CY模型組給予蒸餾水，自由采食。第15天除空白組其余7組開(kāi)始腹腔注射 CY 75mg/kg，1次/d，連續(xù)5天。于末次給藥Ih后處死動(dòng)物，取脾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0109] (一)脾臟單細(xì)胞懸液的制備(效應(yīng)細(xì)胞）
[0110] 將小鼠摘眼球處死，于75%乙醇中浸泡5-10min。于超凈工作臺(tái)中無(wú)菌取小鼠脾 臟，PBS清洗，5mL注射器芯研磨，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，離心1000r/min，5min)， 棄上清;Tris-MMCl破解紅細(xì)胞，離心（1000r/min，5min)，棄上清，重復(fù)3次;最后用I3BS清洗 細(xì)胞，離心后用ImL含10 %胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞 數(shù)(應(yīng)在95%以上），最后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7個(gè)/mL。
[0111](二)靶細(xì)胞的傳代(YAC-1細(xì)胞）
[0112]實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用前以PBS液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào) 整細(xì)胞濃度為4 X IO5個(gè)/mL。
[0113] (三)NK細(xì)胞活性檢測(cè)
[0114] 取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各IOOyL (效靶比50:1 )，加入U(xiǎn)型96孔板中：靶細(xì)胞自然釋放 孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各IOOyU靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40或2.5%Triton各100 yL;上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)平行孔，于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔板以1500r/min 離心5min，每孔吸取上清IOOyL置平底96孔板中。同時(shí)加入LDH基質(zhì)液IOOyL，根據(jù)室溫不同 反應(yīng)3-10min，每孔加入lmol/L的HCl 30yL，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值(0D)。
[0115] 按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性，受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK細(xì)胞活 性，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。
[0116] NK細(xì)胞活性（％ )=(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/ (最大釋放孔OD-自然釋放孔OD) X 100%
[0117] 二、LDH基質(zhì)液的配置
[0118] 乳酸鋰 5X10-2mol/L
[0119] 硝基氯化四氮唑（ΙΝΤ)6·6Χ10-4mol/L
[0120] 吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)2 · 8 X 10-4moI/L [0121 ]氧化型輔酶I (NAD) 1.3 X 10-3mol/L
[0122] 將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH 8.2)
[0123] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0124] 表6云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠 NK細(xì)胞活性的影響
[0126] 與模型組比較，*p〈0 · 05，**P〈0 · 01。
[0127] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云牛膝多糖高、中、低3個(gè)劑量均能顯著增強(qiáng)CY免疫抑制小鼠脾臟 NK細(xì)胞活性(P〈〇. 05)，藥效隨劑量的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。
[0128] 實(shí)施例7
[0129] 云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫因子的影響-血清細(xì)胞因子的檢測(cè)
[0130] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0131] 按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為8組，空白組、環(huán)磷酰胺 (CY)模型組、香菇多糖+CY組(50mg/kg)、懷牛膝多糖組+CY組(50mg/kg)、云牛膝多糖高劑量 +CY組（100mg/kg)、云牛膝多糖中劑量組+CY組(75mg/kg)、云牛膝多糖低劑量+CY組(50mg/ kg)、云牛膝多糖小劑量+CY組(50mg/kg);每組12只。每天上午空腹稱(chēng)重一次，云牛膝多糖按 100mg/kg、75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg高中低小四個(gè)劑量組給小鼠灌胃，1次/d，連續(xù)給藥19 天，空白組和CY模型組給予蒸餾水，自由采食。第15天除空白組其余7組開(kāi)始腹腔注射CY 75mg/kg，l 次/d，連續(xù) 5天。
[0132] 末次給藥Ih后摘眼球取血，分離血清，4°C保存?zhèn)溆?。血清中各因子的檢測(cè)嚴(yán)格按 照IL-6、TNF-a、IFN- γ ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)具體操作測(cè)定。
[0133] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0134] 表7云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠 IL-6的影響

[0137] 與模型組比較，*p〈0 · 05，林 P〈0 · 01。
[0138] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY模型組IL-60D值與空白組比較差異極顯著(P〈0.01)，云牛膝多 糖高劑量+CY組與CY模型組比較差異極顯著(P〈0.01);中劑量+CY組與CY模型組比較差異顯 著(P〈0.05)。說(shuō)明中劑量組和高劑量組云牛膝多糖能增強(qiáng)免疫抑制小鼠 IL-6的OD值。
[0139] 表8云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠干擾素 IFN-γ的影響
[0141] 與模型組比較，*Ρ〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01。
[0142] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY模型組IFN-γ OD值與空白組比較差異極顯著(Ρ〈0.01)，云牛膝 多糖高、中、低三個(gè)劑量+CY組與CY模型組比較差異極顯著(Ρ〈0.01);高劑量+CY組OD值與空 白組比較差異極顯著(Ρ〈〇.01)，小劑量+CY組和中劑量+CY組OD值之間無(wú)顯著差異。說(shuō)明云 牛膝多糖能提高免疫抑制小鼠干擾素 IFN- γ OD值，并恢復(fù)到正常水平。
[0143] 表9云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠腫瘤壞死因子TNF-α的影響
[0145] 與模型組比較，*P〈0 · 05，林 P〈0 · 01。
[0146] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY模型組TNF-a〇D值與空白組比較差異極顯著(P〈0.01)，云牛膝多 糖高、中、低三個(gè)劑量+CY組與CY模型組比較差異極顯著(P〈0.0 l);小劑量+CY組與模型組比 較差異顯著(P〈0.05);中劑量+CY組和高劑量+CY組OD值與空白組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明云 牛膝多糖能提高免疫抑制小鼠腫瘤壞死因子水平，中劑量組和高劑量組能使免疫抑制小鼠 腫瘤壞死因子TNF-α恢復(fù)到正常水平。
[0147] 實(shí)施例8
[0148] 云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫球蛋白的影響
[0149] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0150] 同實(shí)施例9。
[0151] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0152] 表10云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量(mg%)的影響
[0154] 與模型組比較，*P〈〇 · 05，**P〈0 · 01。
[0155] CY模型組IgA含量與空白組比較差異顯著(P〈0.05);云牛膝多糖高劑量+CY組和低 劑量+CY組與模型組比較差異顯著(P〈0.05)，小劑量+CY組和中劑量+CY組與模型組無(wú)顯著 差異，高劑量+CY組和空白組無(wú)顯著差異。說(shuō)明云牛膝多糖高劑量組能促進(jìn)免疫抑制小鼠免 疫球蛋白IgA含量的提高。
[0156] CY模型組IgM含量與空白組比較差異極顯著(P〈0.01);中劑量+CY組和高劑量+CY 組與模型組比較差異顯著(P〈〇.05)，與空白組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明云牛膝多糖中劑量組 和高劑量組能促進(jìn)免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgM含量的提高。
[0157] CY模型組IgG含量與空白組比較差異極顯著(P〈0.01);高劑量組+CY和中劑量組+ CY組與模型組比較差異顯著(P〈0.05)，與空白組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明云牛膝多糖高、中劑 量組能促進(jìn)免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgG含量的提高。
[0158] 實(shí)施例9
[0159] 云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠補(bǔ)體的影響 [0160] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0161] 同實(shí)施例9。
[0162] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0163] 表11云牛膝多糖對(duì)免疫抑制小鼠補(bǔ)體C3、C4含量(mg%)的影響
[0165] 與模型組比較，*P〈0 · 05，林 P〈0 · 01。
[0166] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CY模型組C3含量與空白組比較差異顯著(P〈0.05);中劑量組+CY組 和高劑量組+CY組與模型組比較差異顯著(P〈0.05);三個(gè)劑量+CY組之間無(wú)顯著差異，與空 白組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明云牛膝多糖高劑量組和中劑量組能促進(jìn)免疫抑制小鼠補(bǔ)體C 3含 量的提尚。
[0167] CY模型組C4含量與空白組比較差異顯著(P〈0.05)，高劑量+CY組與模型組比較差 異顯著(P〈0.05)，其中，中劑量+CY組與CY模型組比較差異極顯著(P〈0.01)。說(shuō)明云牛膝多 糖高劑量組和中劑量組能促進(jìn)免疫抑制小鼠補(bǔ)體C 4含量的提高。
[0168] 實(shí)施例10
[0169] 云牛膝多糖對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制試驗(yàn) [0170] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0171] 采用MTT法檢測(cè)云牛膝多糖抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。腫瘤細(xì)胞在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90 %以上的匯合度時(shí)用胰蛋白酶消化收集，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并在 顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2 X IO4個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，IOOyL/孔，并 于37 °C，5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。云牛膝多糖用培養(yǎng)液稀釋到高（100μg/ml)、中（75yg/ ml)、低(50μg/ml)、?。?5μg/ml)四個(gè)濃度。多西他賽用培養(yǎng)液稀釋到終濃度(2.5μg/ml)。待 細(xì)胞完全貼壁后，將各個(gè)稀釋液分別加入96孔板中（100μL孔）。以加入云牛膝多糖稀釋液 作為給藥組，以加入多西他賽作為陽(yáng)性對(duì)照組，以不加任何藥物的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。 在37°C，5%⑶ 2培養(yǎng)箱孵育48h。向96孔板中加入5mg/mL的MTT，每孔20yL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸掉 培養(yǎng)基，每孔加入150yL DMSO溶解，搖床IOmin輕輕混勻。用酶標(biāo)儀在測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參 比波長(zhǎng)為630nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率(pro liferat ion inhibit ion，PI)，公式 如下：
[0172] PI(%) = 1-給藥組/陰性組
[0173] 試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，試驗(yàn)得到的結(jié)果以mean 土 SD表示，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表19。
[0174] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0175] 表19云牛膝多糖對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制試驗(yàn)
[0177] 結(jié)果：與陰性對(duì)照相比，云牛膝多糖對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均有一定程度的抑制 作用，其中云牛膝多糖高劑量組（lOOyg/rnl)對(duì)部分腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用效果超過(guò)了陽(yáng) 性藥，為本發(fā)明開(kāi)發(fā)為有效的抗腫瘤藥物提供了良好的前景。
[0178] 實(shí)施例11
[0179] 云牛膝多糖對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180體內(nèi)增殖的抑制作用及其對(duì)免疫器官的影響
[0180] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0181] (一)接種動(dòng)物模型的建立
[0182] 取一只腹腔接種S180細(xì)胞生長(zhǎng)5-7d的小鼠，處死后抽取腹水4mL，加生理鹽水以1: 4的比例稀釋成細(xì)胞懸液，于冰上放置，混勻。取50只健康的雄性BALB/c小鼠，分別于右腋下 皮下接種〇. 2mL細(xì)胞懸液，即得Sl 80荷瘤小鼠模型。
[0183] (二)分組及給藥
[0184] 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為9組，每組12只，分別為云牛膝多糖給藥組:高劑量組（100mg/kg)、中 劑量組（75mg/kg)、低劑量組（50mg/kg)和小劑量組（25mg/kg);陽(yáng)性對(duì)照組：環(huán)磷酰胺 (25mg/kg)、香燕多糖(5Omg/kg)、懷牛膝多糖（50mg/kg);陰性對(duì)照組:等劑量的生理鹽水。 每天每只小鼠腹腔注射〇.2mL樣品溶液或生理鹽水，連續(xù)給藥10d。另設(shè)空白對(duì)照組，小鼠不 做任何處理。各組小鼠隔天稱(chēng)重一次，記錄體重變化情況。
[0185] 末次給藥后禁食一晚，次日稱(chēng)重后處死小鼠。小鼠處死前先進(jìn)行眼眶取血，每只小 鼠取血ImL置于EDTA抗凝管中，測(cè)血常規(guī)。小鼠處死后剝離出腫瘤組織，并取脾臟、胸腺，稱(chēng) 重。
[0186] 按以下公式計(jì)算云牛膝多糖對(duì)S180體內(nèi)增殖的抑制率、脾指數(shù)：
[0187] 抑瘤率=(陰性對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/陰性對(duì)照組平均瘤重X 100% ；
[0188] 胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重/體重；
[0189]脾指數(shù)(mg/g)=脾重/體重。
[0190] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0191]表23云牛膝多糖對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180體內(nèi)增殖的抑瘤率
[0193 ] 與陰性對(duì)照組比較，*P〈〇 · 05，#P〈0 · 01。
[0194] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云牛膝多糖各劑量對(duì)S180體內(nèi)增殖均有抑制作用。與陰性對(duì)照組 相比，高、中劑量組表現(xiàn)出良好的抑瘤效果，有極顯著性差異(P〈〇.01)，低劑量有顯著性差 異(P〈0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照比較，中劑量組與環(huán)磷酰胺組、黃芪多糖組相比，抑瘤率接近;說(shuō)明 云牛膝多糖具有良好的體內(nèi)抑瘤效果。云牛膝多糖給藥組的體重增長(zhǎng)率均大于環(huán)磷酰胺 組，說(shuō)明云牛膝多糖比環(huán)磷酰胺毒副作用小，對(duì)正常細(xì)胞影響相對(duì)較小。
[0195] 表24云牛膝多糖對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響
[0197] 與陰性對(duì)照組比較，*P〈0 · 05，#P〈0 · 01。
[0198] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較，云牛膝多糖四個(gè)劑量組脾臟指數(shù)都有顯著提 高，高、中劑量組差異極顯著(P〈〇. 01 )，與陽(yáng)性藥香菇多糖、懷牛膝多糖脾臟指數(shù)相近，低劑 量組與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P〈〇.05);云牛膝多糖高劑量組胸腺指數(shù)較陰性對(duì)照組有 顯著提高(P〈〇.05)，與陽(yáng)性藥香菇多糖、懷牛膝多糖胸腺指數(shù)相近；陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組中， 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)較陰性對(duì)照組均顯著下降(P〈〇.01)，說(shuō)明其雖能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)但 同時(shí)降低了宿主免疫功能，對(duì)正常細(xì)胞也有傷害;而云牛膝多糖在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)可 刺激宿主免疫組織，促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖分化，提高宿主的免疫功能發(fā)揮抗腫瘤的效果，對(duì)正 常細(xì)胞亦無(wú)損害。
[0199] 經(jīng)血常規(guī)檢測(cè)，云牛膝多糖對(duì)S180荷瘤小鼠血液中各種免疫細(xì)胞（白細(xì)胞WBC、淋 巴細(xì)胞LY、單核細(xì)胞MO、紅細(xì)胞RBC)均有不同程度的影響，具體結(jié)果見(jiàn)表所示。
[0200] 表25云牛膝多糖對(duì)荷瘤小鼠血液中免疫細(xì)胞的影響
[0203] 與陰性對(duì)照組比較，*P〈0 · 05，#P〈0 · 01。
[0204] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云牛膝多糖各劑量下對(duì)S180荷瘤小鼠血液中各種免疫細(xì)胞均有影 響。云牛膝多糖給藥組的白細(xì)胞數(shù)目對(duì)比陰性組、環(huán)磷酰胺組、空白組，均顯著性增多，且隨 劑量的增加而增大，特別是高劑量組白細(xì)胞數(shù)比中、低劑量組明顯增多(**P〈〇.01)，而環(huán)磷 酰胺組與空白組相比白細(xì)胞數(shù)大幅度減少。云牛膝多糖給藥組的淋巴細(xì)胞數(shù)目及比例與陰 性組、環(huán)磷酰胺組、空白組的相比同樣增加，且隨劑量的增大而增大，其中高劑量組具有明 顯優(yōu)勢(shì)(**P〈0.01)，而環(huán)磷酰胺組淋巴細(xì)胞數(shù)目及比例同樣是最低的。云牛膝多糖給藥組 的單核細(xì)胞數(shù)目及比例依舊比其他對(duì)照組大，其中高劑量組單核細(xì)胞數(shù)最多，陽(yáng)性組單核 細(xì)胞數(shù)最少。云牛膝多糖給藥四個(gè)劑量組隨劑量的增加紅細(xì)胞數(shù)有所增多，但都與空白組 無(wú)顯著性差異，而陽(yáng)性組比空白組紅細(xì)胞數(shù)減少，陰性組比空白組紅細(xì)胞數(shù)增多。免疫細(xì)胞 數(shù)目的變化說(shuō)明未給予治療的陰性組可以激活自身免疫功能對(duì)抗入侵的外源性物質(zhì);環(huán)磷 酰胺組則體現(xiàn)了化療藥物在抑制腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程中對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的過(guò) 多破壞及造成的免疫缺陷；而云牛膝多糖給藥組不僅未對(duì)各種免疫細(xì)胞造成損傷和破壞， 更能刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，提高機(jī)體的自身免疫功能，從而可以更好的對(duì)抗入侵的外源性 物質(zhì)，如抗腫瘤。免疫細(xì)胞的變化與脾指數(shù)的變化趨勢(shì)相符。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物，其特征在于:提取物的組分為多糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物，其特征在于:所述的 多糖的分子量范圍為0.5~3kD。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物，其特征在于:所述多 糖的結(jié)構(gòu)單元包括葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物，其特征在于:所述多 糖的結(jié)構(gòu)單元包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和巖藻糖。5. 權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物在制備抗腫瘤藥 物和增強(qiáng)免疫力型保健品中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的云牛膝莖和/或葉和/或根的提取物在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng) 免疫力型保健品中的應(yīng)用，其特征在于:所述的腫瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、 膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和宮頸癌以及起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、 胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的 癌、黑色素瘤以及肉瘤。7. 云牛膝莖和/或葉和/或根多糖在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保健品中的應(yīng)用。8. 云牛膝莖和/或葉和/或根在制備抗腫瘤藥物和增強(qiáng)免疫力型保健品中的應(yīng)用。9. 一種抗腫瘤藥物，其特征在于:包括云牛膝莖和/或葉和/或根多糖。10. -種云牛膝莖和/或葉和/或根的資源化利用方法，其步驟包括：（1)采集云牛膝的 莖和/或葉和/或根；（2)從云牛膝的莖和/或葉和/或根中提取多糖；（3)將步驟(2)中提取的 多糖制備成抗腫瘤藥物或增強(qiáng)免疫力型保健品。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105859904SQ201610283822
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】康夢(mèng)實(shí), 戚微巖, 羅燕平
【申請(qǐng)人】南京安吉生物科技有限公司