用于聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病治療的針對聚集蛋白聚糖酶型adamts種類的人抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制人聚集蛋白聚糖酶的酶活性的抗體。在一個實施方案中，聚集蛋白聚糖酶是ADAMTS4。在一個實施方案中，所述抗體識別人ADAMTS4中的特定表位，且不僅抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性還抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。此外，本發(fā)明還提供了所述抗體在預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的用途。
【專利說明】
用于聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病治療的針對聚集蛋白聚糖酶型 ADAMTS種類的人抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及抗人聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)抗體和其藥物用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚集蛋白聚糖降解和后續(xù)的膠原纖維消化是在人體關(guān)節(jié)疾病(包括骨關(guān)節(jié)炎(0A) 和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA))中軟骨破壞的中心途徑。膠原降解是主要由膠原降解基質(zhì)金屬蛋 白酶(麗P)，諸如麗P-l、MMP-8和MMP-13[l-3]進(jìn)行。另一方面，稱為聚集蛋白聚糖酶的降解 聚集蛋白聚糖的金屬蛋白酶被認(rèn)為在聚集蛋白聚糖降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4,5]。聚集蛋白 聚糖酶屬于ADAMTS(具有血小板反應(yīng)蛋白基序的解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶）基因家族，并且 ADAMTS1、4、5、8、9和15已知具有聚集蛋白聚糖酶活性[4,6]。使用ADAMTS4和ADAMTS5敲除小 鼠的最近的研究表明，ADAMTS5，但不是ADAMTS4，在小鼠關(guān)節(jié)炎中的聚集蛋白聚糖降解中起 重要作用[7，8 ]。但是，由于關(guān)于小鼠 ADAMTS4和ADAMTS5的生化特征、表達(dá)模式或基因啟動 子結(jié)構(gòu)的信息很少，來自基因敲除小鼠的數(shù)據(jù)必須仔細(xì)解釋，并且不應(yīng)被外推到人的疾病 0A和RA[9，10]。在人類軟骨細(xì)胞中，ADAMTS4是通過用細(xì)胞因子諸如白介素 -l(IL-l)處理 而被誘導(dǎo)，但ADAMTS5的表達(dá)是組成型的[9，11-13]。我們最近的研究還表明，在聚集蛋白聚 糖酶型ADAMTS種類中，ADAMTS4在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中選擇性過表達(dá)與軟骨破壞的程度有直 接的相關(guān)性，而ADAMTS5在正常和骨關(guān)節(jié)炎軟骨中組成型表達(dá)[10]。這些表明，ADAMTS4是在 人類骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的主要聚集蛋白聚糖酶。ADAMTS4也由RA中的滑膜細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì) 胞過表達(dá)，表明該蛋白酶參與RA關(guān)節(jié)軟骨破壞。ADAMTS4和ADAMTS5不僅可以消化聚集蛋白 聚糖還可以消化蛋白聚糖lectican家族的其它成員，包括多能聚糖和短小蛋白聚糖。因為 多能聚糖是在皮膚和血管壁中的主要蛋白聚糖，其被ADAMTS4和ADAMTS5的降解還分別參與 病理條件(諸如慢性潰瘍以及皮膚和各種血管炎的纖維化)下的組織破壞以及皮膚和血管 的修復(fù)。此外，已知在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的腫瘤細(xì)胞過表達(dá)ADAMTS5，并且表明腫瘤細(xì) 胞衍生的ADAMTS5通過裂解短小蛋白聚糖在浸潤中發(fā)揮作用[14]。
[0003] 噬菌體展示法是一種展示技術(shù)，其已通過在功能肽或蛋白和編碼其的DNA之間以 噬菌體顆粒的形式形成一對一對應(yīng)，而實現(xiàn)體外的高速選擇。此噬菌體展示方法應(yīng)用于抗 體選擇，并且通過該方法得到的許多抗體已被開發(fā)作為藥物產(chǎn)品[15]。此外，已經(jīng)建立了通 過結(jié)合人人工抗體文庫和噬菌體展示法而獲得特異性抗體的方法，并且這種方法已經(jīng)由多 個公司實用化，如通過MorphoSys的HuCAL(人類組合抗體文庫)所證明。
[0004] [文獻(xiàn)列表]
[非專利文獻(xiàn)]
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[0005] 發(fā)明概述 技術(shù)問題 本發(fā)明的一個目的是提供一種抗-人聚集蛋白聚糖抗體(特別是抗人ADAMTS4抗體)可 用于其中Lectican家族分子(其是蛋白聚糖)被降解的由關(guān)節(jié)炎所代表的各種疾病的進(jìn)展 的預(yù)防或治療。
[0006] 問題的解決方案 為了解決上述問題，本發(fā)明人生產(chǎn)了結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶的多種抗人聚集蛋白聚糖 抗體。作為結(jié)果，他們已發(fā)現(xiàn)，所產(chǎn)生的抗人ADAMTS4抗體抑制人ADAMTS4的酶活性，并且可 以防止在關(guān)節(jié)炎中發(fā)生的聚集蛋白聚糖被關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞降解。此外，他們已發(fā)現(xiàn)，識別特定 表位的抗體也顯示與人ADAMTS4之外的聚集蛋白聚糖酶的交叉反應(yīng)性，并且還可以抑制它 們的活性?；谏鲜鲅芯堪l(fā)現(xiàn)，他們已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，嘗試開發(fā)用于其中聚集蛋白 聚糖作用于組織破壞的由關(guān)節(jié)炎代表的疾病的治療藥物，這導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
[0007] 因此，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
[0008] [ 1 ]特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖 酶活性的抗體。
[0009] [2]根據(jù)[1]的抗體，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0010] [3]根據(jù)[2]的抗體，其還抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。
[0011] [4]根據(jù)[2]或[3]的抗體，其在包含SEQ ID N0:9中所示的氨基酸序列的表位結(jié) 合人 ADAMTS4。
[0012] [5]根據(jù)[2]-[4]中任一項所述的抗體，其包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中 (1) 輕鏈可變區(qū)包括包含在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含在SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所示的 氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:6中所示的氨基酸序列的⑶R3;或 (2) 輕鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQ ID N0: 1-3的至少一個氨基酸序列中置換、缺失、插入或添加1-3個氨 基酸，和/或 在選自SEQ ID N0: 4-6的至少一個氨基酸序列中置換、缺失、插入或添加4-3個氨基 酸。
[0013] [6]根據(jù)[5]的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID N0: 7中所示的氨基酸 序列，并且重鏈可變區(qū)包含在SEQ ID N0: 8中所示的氨基酸序列。
[0014] [7]根據(jù)[1]_[6]任一項的抗體，其是人抗體。
[0015] [8]藥物組合物，其包含根據(jù)[1]_[7]任一項的抗體。
[0016] [9]多核苷酸，其編碼根據(jù)[1]-[7]任一項的抗體。
[0017] [10]載體，其包含根據(jù)[9]的多核苷酸。
[0018] [11]轉(zhuǎn)化子，其包含根據(jù)[10]的載體。
[0019] [12]用于預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的試劑，其包含特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑 制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性的抗體。
[0020] [13]根據(jù)[12]的試劑，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0021] [14]根據(jù)[12]或[13]的試劑，其中所述抗體是根據(jù)[1]_[7]任一項的抗體。
[0022] [15]用于預(yù)防或治療哺乳動物中關(guān)節(jié)炎的方法，其包括使用有效量的抗體，所述 抗體特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶對哺乳動物的聚集蛋白聚 糖酶活性。
[0023] [16]根據(jù)[15]的方法，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0024] [17]根據(jù)[15]或[16]的方法，其中所述抗體是根據(jù)[1]_[7]任一項的抗體。
[0025] [18]特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖 酶活性的抗體，其用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療。
[0026] [19]根據(jù)[18]的抗體，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0027] [20]根據(jù)[18]或[19]的抗體，其是根據(jù)[1]_[7]任一項的抗體。
[0028] [21]特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖 酶活性的抗體用于生產(chǎn)用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療的試劑的用途。
[0029] [22]根據(jù)[21]的用途，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0030] [23]根據(jù)[21]或[22]的用途，其中所述抗體是根據(jù)[1]-[7]任一項的抗體。
[0031]發(fā)明的有利效果 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種抗人聚集蛋白聚糖酶抗體(特別是抗人ADAMTS4抗體），其用于 預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。
【附圖說明】
[0032] 圖1候選Fab與ADAMTS4和ADAMTS5的免疫反應(yīng)性，以及它們對ADAMTS4聚集蛋白聚 糖酶活性的抑制。(A)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的重組ADAMTS4(左)和ADAMTS5(右）（各100 ng/泳道） 與每一個候選Fab(克隆237-1、237-5、237-21、237-43或237-53)反應(yīng)，然后進(jìn)行免疫印跡。 (B)ADAMTS4活性被Fab抑制。重組ADAMTS4 (180 ng)與每種Fab(克隆237-1、237-5、237-21、 237-43或237-53)或?qū)φ誇ab以1:1摩爾比反應(yīng)，并且然后與聚集蛋白聚糖（100 yg)在37°C 一起孵育16小時。用抗聚集蛋白聚糖新表位(NITEGE392)抗體通過免疫印跡評價ADAMTS4的 聚集蛋白聚糖酶活性。TS(-)，單獨緩沖液;Fab (-)，ADAMTS4不與Fab-起孵育；對照，對照 Fab〇
[0033] 圖2抗ADAMTS抗體（克隆237-53)與ADAMTS、ADAM和MMP種類的免疫反應(yīng)性。（A) ADAMTS4、5和1，ADAMIO，12和17，以及MMP1、2、3、9和13的銀染凝膠。樣品（100 ng/泳道)進(jìn)行 SDS-PAGE并且凝膠用銀染試劑盒染色。（B)抗體(克隆237-53)與ADAMTS、ADAM和MMP種類的 免疫反應(yīng)性。轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的樣品用抗ADAMTS抗體克隆237-53進(jìn)行免疫印跡。注意，抗體 與ADAMTS4和ADAMTS5反應(yīng)，但是不與其它ADAMTS、ADAM和MMP種類反應(yīng)。
[0034] 圖3抗ADAMTS抗體(克隆237-53)的結(jié)構(gòu)域圖譜分析。（A和B)抗體與ADAMTS4的每個 結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)。通過HJREfrex制備對應(yīng)ADAMTS4的金屬蛋白酶(MET)結(jié)構(gòu)域、解聯(lián)蛋白 和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域(Dis/TSP)、解聯(lián)蛋白（Dis)結(jié)構(gòu)域或血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域 (TSP)的重組FLAG/DHFR標(biāo)記的蛋白。這些蛋白用抗FLAG抗體（陽性對照；左）或抗體克隆 237-53(右)進(jìn)行免疫印跡。
[0035] 圖4通過抗ADAMTS抗體(克隆237-53)對ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性 的抑制，以及抗體對IL-la刺激的軟骨細(xì)胞中ADAMTS種類的表達(dá)和聚集蛋白聚糖酶活性的 作用。(A)抗ADAMTS抗體(克隆237-53)對ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。 重組ADAMTS蛋白與抗ADAMTS抗體以1 : 0.2-5(酶:抗體)的摩爾比或與對照正常IgG(對照； 1:5摩爾比）反應(yīng)，并然后與聚集蛋白聚糖一起孵育。通過免疫印跡用抗聚集蛋白聚糖新表 位抗體(上）監(jiān)測聚集蛋白聚糖消化。通過免疫印跡的光密度分析評價抑制（下h(B)抗體 (克隆237-53)對IL-la-刺激的軟骨細(xì)胞中ADAMTS4和ADAMTS5的mRNA表達(dá)和聚集蛋白聚糖 酶活性的作用。骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在存在和不存在IL-la和抗ADAMTS抗體或?qū)φ照gG (對照）的情況下培養(yǎng)。然后，分別通過RT-PCR和用抗聚集蛋白聚糖新表位抗體的免疫印跡 檢查這些ADAMTS種類(左)的mRNA表達(dá)和在條件培養(yǎng)基中（右)聚集蛋白聚糖酶活性。GAPDH， 針對加載的樣品的對照。 具體實施方案
[0036]本發(fā)明提供對人聚集蛋白聚糖酶具有特異性結(jié)合活性，并且抑制聚集蛋白聚糖酶 的聚集蛋白聚糖酶活性的抗體。
[0037]聚集蛋白聚糖酶是一種已知的蛋白酶，其是ADAMTS (具有血小板反應(yīng)蛋白基序的 解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)蛋白家族的成員，并且作用于和降解稱為聚集蛋白聚糖的蛋白聚 糖。聚集蛋白聚糖酶包括 ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS 1、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS 15等。
[0038] 人ADAMTS4的代表性氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 15， 人ADAMTS4的代表性cDNA序列顯示于SEQ ID NO: 14， 人ADAMTS5的代表性氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 17,和 人ADAMTS5的代表性cDNA序列顯示于SEQ ID NO: 16。
[0039]本發(fā)明的抗體具有針對人聚集蛋白聚糖的特異性結(jié)合活性。
[0040] "人聚集蛋白聚糖酶"是指聚集蛋白聚糖酶的氨基酸序列或核苷酸序列具有與人 天然表達(dá)的聚集蛋白聚糖酶的氨基酸序列或核苷酸序列相同或基本相同的氨基酸序列或 核苷酸序列。"基本上相同的"是指目的氨基酸序列或核苷酸序列具有70%或更多（優(yōu)選 80%或更多，更優(yōu)選90%或更多，進(jìn)一步優(yōu)選95%或更多，最優(yōu)選99%或更多）的與在人中 天然表達(dá)的特定聚集蛋白聚糖酶的氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，并且具有特定的人 聚集蛋白聚糖酶的功能。人以外的生物物種，聚集蛋白聚糖酶之外的蛋白，其基因和片段也 以相同的方式解釋。
[0041] 抗體對抗原X的"特異性結(jié)合"是指在抗原抗體反應(yīng)中抗體對抗原X的結(jié)合親和力 比對非特異性抗原的結(jié)合親和力更高(例如，牛血清白蛋白（BSA))。
[0042] 本發(fā)明的抗體具有抑制人聚集蛋白聚糖酶的酶活性的活性。人聚集蛋白聚糖酶的 酶活性，具體是指人聚集蛋白聚糖酶的裂解聚集蛋白聚糖(例如，人或豬聚集蛋白聚糖）的 活性。人聚集蛋白聚糖酶的切割聚集蛋白聚糖的活性可以通過如下進(jìn)行評價:將豬聚集蛋 白聚糖和人聚集蛋白聚糖在37°C孵育16小時，用軟骨素酶ABC和角蛋白酶使它們?nèi)ヌ腔?并且通過，根據(jù)例如，Yatabe T,等 Ann Rheum Dis. 2009;68:1051-8和Hashimoto G,等 J Biol Chem. 2004; 279:32483-91中所述的方法使用抗NITEGE392聚集蛋白聚糖的新表位 的抗體進(jìn)行免疫印跡分析所獲得的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0043]在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體具有對人ADAMTS4的特異性結(jié)合活性，并抑制 人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性。
[0044]除了人ADAMTS4聚集蛋白聚糖酶活性之外，本實施方案的抗體優(yōu)選還抑制，人 ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。
[0045] 在本說明書中，"抗體"用來涵蓋全長抗體和其任何抗原結(jié)合片段（8卩"抗原結(jié)合部 分"）或其單鏈的抗體。"抗體"是指包含通過二硫鍵連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈 (L)，或其抗原結(jié)合部分的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為V H)和重鏈恒定區(qū)構(gòu) 成。重鏈恒定區(qū)由Ch1，Ch2和Ch3的3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)（本文縮寫為Vl) 和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由單個結(jié)構(gòu)域Cl構(gòu)成。Vh和Vl區(qū)進(jìn)一步細(xì)分成具有更高的可 變性的區(qū)域稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，其包含分散在其中的更高度保守區(qū)域，稱為框架區(qū) (FR)。每個V H和Vl由3個CDR和4個FR構(gòu)成，其以下列順序排列，即，從氨基末端到羧基末端 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合 結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞 (例如效應(yīng)子細(xì)胞)和常規(guī)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)的結(jié)合。
[0046] 在本說明書中，抗體的"抗原結(jié)合部分"用于指保留特異性結(jié)合抗原（例如，人 ADAMTS4)的能力的抗體的一個或多個片段。已闡明，抗體的抗原結(jié)合功能由全長抗體的片 段執(zhí)行。包括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，由Vl，Vh， Cl和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；（ii )F(ab'）2片段，包含由鉸鏈區(qū)中二硫鍵連接的兩個Fab 片段的二價片段，（iii)Fab'片段，具有鉸鏈區(qū)部分的固有的Fab(參見FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed.，3. sup. rd ed. 1993)，（iv)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；（v) 在抗體的單個臂中由Vl和Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，（vi)由Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段(Ward 等，（1989) Nature 341:544_546)，（vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)和（viii)納米抗體，其 是含有單個可變結(jié)構(gòu)域和兩個恒定區(qū)的重鏈可變區(qū)。盡管V L和VH，其是Fv片段的兩個結(jié)構(gòu) 域，由不同的基因編碼，但是它們可以通過合成的接頭連接以通過重組技術(shù)從它們產(chǎn)生單 條蛋白鏈，其中，在此鏈中，Vl和Vh區(qū)彼此配對以形成單價分子(稱為單鏈FKscFv);參見，例 如Bird 等（1988) Science 242: 423-426;和Huston 等，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。這樣的單鏈抗體也涵蓋在抗體的"抗原結(jié)合部分"中。這樣的抗 體片段由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過在已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且以與未修飾的抗體的相同 方式針對有用性進(jìn)行篩選。
[0047] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選是單克隆抗體。"單克隆抗體"是指單分子組合物的抗體分子的 制備。單克隆抗體組合物顯示針對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。
[0048] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選是人抗體或人源化抗體。"人抗體"是指在框架區(qū)和CDR區(qū)兩者 中具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。此外，當(dāng)抗體含有恒定區(qū)時，所述恒 定區(qū)也衍生自人種系免疫球蛋白序列。在本說明書中，"人抗體"還甚至涵蓋包括不是由人 種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基的實施方案(例如，通過在體外的隨機(jī)或位點定向 誘變或體內(nèi)的體細(xì)胞突變引入的突變）。此外，在本說明書中，"人源化抗體"是指這樣的抗 體，其中衍生自除人之外的動物物種諸如小鼠的種系的CDR序列融合在人構(gòu)架序列上。
[0049] 在本說明書中，人抗體涵蓋"重構(gòu)的人抗體"。重構(gòu)的人抗體是指修飾的抗體，其中 包含在第一人類供體抗體中的至少一個CDR而不是第二人受體抗體的CDR，用在第二人受體 抗體中。優(yōu)選地，所有6個CDR都是被置換的。更優(yōu)選的是，使用第一人供體抗體的整個抗原 結(jié)合區(qū)（例如，F(xiàn)v、Fab或F(ab'）2)，而不是第二人受體抗體中的相應(yīng)相應(yīng)區(qū)域。更優(yōu)選，所述 第一人供體抗體的Fab區(qū)可操作地連接到第二人受體抗體的合適的恒定區(qū)從而形成全長抗 體。
[0050] 該重構(gòu)的人抗體可以通過公開于例如EP125023，W096/02576,上述文獻(xiàn)15等的常 規(guī)基因重組技術(shù)產(chǎn)生。具體地講，例如，設(shè)計以連接供體人抗體中期望的CDR和受體人抗體 中期望的框架區(qū)（FR)的DNA序列通過PCR方法合成，使用幾個寡核苷酸作為引物，生產(chǎn)所述 寡核苷酸以具有與CDR和FR兩者的末端區(qū)重疊的區(qū)域(參見W098/13388中所述方法）。將所 得的DNA連接到編碼人抗體恒定區(qū)或人抗體恒定區(qū)突變體的DNA，其被摻入到表達(dá)載體中， 并且所述載體導(dǎo)入宿主，以允許生產(chǎn)，由此可以獲得重構(gòu)的人抗體（參見EP125023，W096/ 02576) 〇
[0051] 此外，在本說明書中，人抗體涵蓋"人工的人抗體"。人工的人抗體可以通過公開于 例如上述文獻(xiàn)15等的常規(guī)基因重組技術(shù)產(chǎn)生。
[0052] 本發(fā)明的抗體還包括融合蛋白，其中上述抗體和其它肽或蛋白質(zhì)融合。融合蛋白 的制備方法包括:將編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸和編碼其它肽或多肽的多核苷酸連接，以 匹配框架，并將其引入到表達(dá)載體中，并允許其在宿主中表達(dá)，并且可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的技術(shù)。至于與本發(fā)明的抗體融合的其它的肽，可以使用已知的肽，諸如FLAG(Hopp， T.P?等，BioTechnology (1988) 6，1204-1210)、由6個His(組氨酸）殘基組成的6XHis、 10\把8、人(3-1^(3片段、￥3￥-6?片段、？18111￥片段、了7標(biāo)簽、批￥標(biāo)簽4標(biāo)簽、3￥401'抗原片段、 lck標(biāo)簽、a微管蛋白片段、B標(biāo)簽、蛋白C片段等。與本發(fā)明的抗體融合的其它多肽的實例包 括GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）、HA(流感血凝素）、免疫球蛋白恒定區(qū)、半乳糖苷酶、MBP(麥 芽糖結(jié)合蛋白）等。編碼這樣的肽或多肽的市售的多核苷酸與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸 融合，并且表達(dá)由此制備的融合多核苷酸，從而可以制備融合多肽。
[0053]本發(fā)明的抗體可以是與各種分子結(jié)合的綴合抗體，諸如，諸如聚乙二醇(PEG)、透 明質(zhì)酸等的聚合物物質(zhì)、放射性物質(zhì)、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、酶、毒素等。這種綴合抗體可以 通過化學(xué)修飾所得到的抗體來獲得。在該領(lǐng)域已經(jīng)建立了抗體的修飾方法（例如， US5057313，US5156840)。
[0054]本發(fā)明的抗體優(yōu)選是分離的或純化的。"分離的或純化的"是指除去目的組分之外 的組分的操作已經(jīng)應(yīng)用到天然存在的狀態(tài)。本發(fā)明的分離的或純化的抗體的純度(本發(fā)明 的抗體的重量與總的蛋白的重量比）通常是50%或更多，優(yōu)選70%或更多，更優(yōu)選90%或更 多，最優(yōu)選95%或更多（例如，基本上100%)。
[0055]在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗體在包含SEQ ID N0:9(YCEGRRTRF)所示的 氨基酸序列的表位特異性結(jié)合人ADAMTS4并抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性。 [0056] 包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列的表位包括，例如，由SEQ ID N0::15所示的 氨基酸序列的連續(xù)部分序列組成的表位，其包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列，并且優(yōu)選 具有20個或更少，更優(yōu)選12或更少的氨基酸長度。作為包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列 的表位，具體而目，可以提及 由SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列組成的表位， 由SEQ ID NO: lO(GGKYCEGRRTRF)所示氨基酸序列組成的表位， 由SEQ ID NO: ll(GKYCEGRRTRFR)所示氨基酸序列組成的表位， 由SEQ ID NO: 12(KYCEGRRTRFRS)所示氨基酸序列組成的表位，和 由SEQ ID NO: 13(YCEGRRTRFRSC)所示氨基酸序列組成的表位。
[0057] SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列是人ADAMTS4的部分氨基酸序列，并且沒有顯示出 與人類ADAMTS5的相應(yīng)部分序列非常高的同一性。然而，令人驚奇的是，除了人ADAMTS4的聚 集蛋白聚糖酶活性之外，在包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列的表位特異性結(jié)合人 ADAMTS4的抗體也可以抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶的活性。
[0058]特異性結(jié)合人ADAMTS4并抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性的抗體的具體實 例包括下文(1)或(2)中所述的抗體： (1) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)包括包含在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含在SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并 且重鏈可變區(qū)包括包含SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQIDN0 :5中所示 的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:6中所示的氨基酸序列的⑶R3;和 (2) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中輕鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQ ID N0: 1-3的至少一個氨基酸序列中置換、缺失、插入和/或添加1-3 個氨基酸，和/或 在選自SEQ ID N0: 4-6的至少一個氨基酸序列中置換、缺失、插入和/或添加1-3個氨 基酸。
[0059] 在實施方案(2)中，僅在輕鏈可變區(qū)的CDR3的氨基酸序列中置換，缺失，插入，和/ 或僅添加優(yōu)選1_3(優(yōu)選1或2,更優(yōu)選1)個氨基酸。
[0060] 用于用其它期望的氨基酸置換一個或多個氨基酸殘基的方法的實例包括位點定 向誘變法（Hashimoto-Gotoh, T，Mizuno，T，Ogasahara, Y，和 Nakagawa，M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152， 271-275; Zoller， MJ，和Smith， M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100， 468-500; Kramer,ff, DrutsaJansen,Hff, Kramer，B， Pflugfelder，M，和Fritz， HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12， 9441-9456; Kramer ff, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154， 350-367， Kunkel， TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82，488-492)。使用這些方法，抗體中期望的氨 基酸可以被其它目標(biāo)氨基酸置換。此外，使用文庫技術(shù)諸如框架改組(Mol Immunol. 2007 Apr; 44( 11): 3049-60)和CDR修復(fù)(US2006/0122377)等，在框架或CDR中的氨基酸，也可以 被其它適當(dāng)?shù)陌被嶂脫Q。
[0061 ]在本發(fā)明的抗體中，選擇能夠使CDR形成良好的抗原結(jié)合位點的框架，作為連接到 CDR的抗體構(gòu)架區(qū)（FR)。盡管用于本發(fā)明抗體的FR沒有特別限制，并且可以使用任意的FR， 但是優(yōu)選使用人抗體的FR。作為人抗體的FR，可以使用具有天然序列的抗體，或者根據(jù)需 要，在具有天然序列的框架區(qū)中的一個或多個氨基酸可以被置換，缺失，添加和/或插入等， 以便CDR將形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合位點。例如，可以通過測量和評價具有含有置換的氨基酸的 FR的抗體對抗原的結(jié)合活性，選擇具有期望性質(zhì)的突變FR序列（Sato, K.等，Cancer Res. (1993)53， 851-856)。
[0062]在⑴和(2)的抗體中，優(yōu)選使用人抗體的Vk4(Kabat數(shù)據(jù)庫）的FR用于輕鏈并且優(yōu) 選使用人抗體的VHla(Kabat數(shù)據(jù)庫）的FR用于重鏈。
[0063] 用于本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)沒有特別限制，并且可以使用任何恒定區(qū)。用于本發(fā) 明的抗體恒定區(qū)的優(yōu)選的實例包括人抗體的恒定區(qū)（衍生自IgG 1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、 IgM等的恒定區(qū)）。例如，在H鏈中可以使用Cy l、Cy 2、Cy 3、(：丫4、〇1、(：5、〇€[1、0€[2、0￡，并且 在L鏈中可以使用Ck、CA。
[0064] 在（1)和(2)的抗體中，優(yōu)選使用人抗體的Ck的恒定區(qū)用于輕鏈，并且優(yōu)選使用人 抗體的Cy 1的恒定區(qū)用于重鏈。
[0065] 本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括以下內(nèi)容： (T)包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID N0: 7中所示的氨基酸序列，并且重鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列。
[0066] 上述(1'）的抗體對應(yīng)上述(1)的抗體的優(yōu)選的實施方案。
[0067]除了人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性之外，上述（1)和（2)的抗體優(yōu)選地也抑制 人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。
[0068]在一個具體的實施方案中，上述（1)和（2)的抗體在包含SEQ ID N0:9所示的氨基 酸序列的表位特異性結(jié)合人ADAMTS4并抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性。除了人 ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性之外，所述抗體也可以抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活 性。
[0069] 本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的上述抗體的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷 酸可以是DNA或RNA，或DNA/ RNA嵌合體。所述多核苷酸可以是雙鏈或單鏈的。當(dāng)多核苷酸是 雙鏈的，其可以是雙鏈DNA，雙鏈RNA或DNA: RNA雜合體。
[0070] 本發(fā)明的多核苷酸涵蓋包含編碼本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者的 核苷酸序列的多核苷酸，以及包含編碼本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸 與包含編碼本發(fā)明抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸的組合。
[0071] 本發(fā)明的多核苷酸可以容易地基于本發(fā)明抗體的氨基酸序列的信息，已知序列信 息和本說明書中序列表中描述的序列信息，并利用已知的基因重組技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。例如，基 于序列信息設(shè)計合適的引物，編碼構(gòu)成本發(fā)明抗體的元件的DNA通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增，DNA片段 通過適當(dāng)?shù)拿钢T如連接酶等進(jìn)行連接，由此可以生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸?？商娲?，編碼每 個元件的多核苷酸可以由多核苷酸合成儀合成，基于本發(fā)明抗體的氨基酸序列的信息。
[0072] 所獲得的編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸可以根據(jù)上述目的直接使用，或需要時用限 制性酶消化或添加接頭后使用。多核苷酸可具有ATG作為對5 '末端側(cè)上的翻譯起始密碼子， 并且可具有TAA、TGA或TAG作為3'末端側(cè)的翻譯終止密碼子。這些翻譯起始密碼子和翻譯終 止密碼子可以用合適的合成DNA接頭來添加。
[0073] 本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是分離的或純化的。本發(fā)明的分離的或純化的多核苷酸具 有通常50 %或更多，優(yōu)選70 %或更多，更優(yōu)選90 %或更多，最優(yōu)選95%或更多（例如，基本上 100%)的純度(本發(fā)明的多核苷酸的重量與總的多核苷酸的重量比）。
[0074] 本發(fā)明提供了包含上述本發(fā)明的多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體涵蓋含有包含編 碼本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者的核苷酸序列的多核苷酸的載體，以及含有 包含編碼本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸的載體與含有包含編碼本發(fā) 明抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸的載體的組合。所述載體優(yōu)選是分離的或純 化的。載體的實例包括表達(dá)載體、克隆載體等，其可以根據(jù)目的進(jìn)行選擇。優(yōu)選地，所述載體 是表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可以表達(dá)本發(fā)明的抗體。表達(dá)載體可通過在合適的表達(dá)載體中 將本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接到啟動子的下游來生產(chǎn)。這類載體包括，例如，質(zhì)粒載 體，病毒載體等，其可以根據(jù)要使用的宿主適當(dāng)?shù)剡x擇。
[0075]作為宿主，使用埃希氏菌屬(大腸桿菌(Escherichia coli)等）、芽孢桿菌屬(枯草 芽抱桿菌(1^(3；[11113 311131：；[118)等）、酵母(釀酒酵母(3&(^11&1'01115^6306代￥181&6)等）、昆 蟲細(xì)胞（衍生自甘藍(lán)夜蛾（Mamestra brassicae)(草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)細(xì) 胞;Sfcell)等的幼蟲的建立的細(xì)胞系）、昆蟲(家蠶(Bombyx mori)幼蟲等）、哺乳動物細(xì)胞 (大鼠神經(jīng)細(xì)胞、猴細(xì)胞(C0S-7等）、中國倉鼠細(xì)胞(CH0細(xì)胞等)等)等。
[0076]哺乳動物的實例包括，但不限于，實驗動物，諸如嚙齒動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠和 豚鼠等，兔等，家養(yǎng)動物諸如豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等，陪伴動物諸如狗、貓等，靈長類動 物如人、猴、食蟹猴、獼猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等等。
[0077]質(zhì)粒載體的實例包括衍生自大腸桿菌的質(zhì)粒載體(例如，pBR3 2 2、pBR3 25、pUC 12、 pUC 13 )，衍生自枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒載體(例如，pUB 110、pTP5、pC 194)，衍生自酵母的質(zhì)粒 載體(例如，pSH19，pSH15)等，其可以根據(jù)要使用的宿主和使用的目的適當(dāng)?shù)剡x擇。
[0078] 病毒載體的種類可根據(jù)所使用的宿主種類和使用目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)使 用昆蟲細(xì)胞作為宿主時，可以使用桿狀病毒載體等。當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞作為宿主時，可以 使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，諸如Moloney鼠白血病病毒載體、慢病毒載體、新培斯病毒載體等、腺 病毒載體、皰疹病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、細(xì)小病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺病毒載體 等。
[0079] 可以根據(jù)所要使用的宿主的種類選擇啟動子，并且可以選擇能夠在宿主中起始轉(zhuǎn) 錄的啟動子。例如，當(dāng)宿主是埃希氏菌屬時，trp啟動子、lac啟動子、T7啟動子等是優(yōu)選的。 當(dāng)宿主是芽孢桿菌屬時，SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是酵母 時，PH05啟動子、PGK啟動子等是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是昆蟲細(xì)胞時，多角體蛋白啟動子、P10啟動 子等是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是哺乳動物細(xì)胞時，亞基因組(26S)啟動子、CMV啟動子、SRa啟動子等 是優(yōu)選的。
[0080] 本發(fā)明的載體可以包含用于抗體分泌的信號序列。當(dāng)抗體在大腸桿菌的周質(zhì)中生 產(chǎn)時作為用于抗體分泌的信號序列，可以使用pelB信號序列（Lei，S. P.等J. Bacteriol. (1987) 169， 4379)。
[0081] 當(dāng)需要時，本發(fā)明的載體可以包含各自以可操作模式的增強(qiáng)子、剪接信號、多聚A 添加信號、選擇標(biāo)志物、SV40復(fù)制起始點（下文有時縮寫為SV40or i )等。選擇標(biāo)志物的實例 包括二氫葉酸還原酶（下文中有時縮寫為dhfr)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]，氨芐青霉素抗 性基因（有時縮寫為AmpD，新霉素抗性基因（有時縮寫為Nec/，G418抗性)等。
[0082]通過用本身已知的基因轉(zhuǎn)移方法(例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，磷酸鈣法，微注射法，原生質(zhì) 體融合法，電穿孔法，DEAE葡聚糖法，通過基因槍的基因轉(zhuǎn)移方法等)將本發(fā)明的上述載體 導(dǎo)入上述宿主，可以生產(chǎn)其中導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化體(本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體）。當(dāng)使用表達(dá)載體作 為被導(dǎo)入的載體時，所述轉(zhuǎn)化體可表達(dá)本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可用于生產(chǎn)本發(fā)明 的抗體等。
[0083] 本發(fā)明的抗體可通過根據(jù)宿主的種類以本身已知的方法培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，并 從培養(yǎng)物分離本發(fā)明的抗體來生產(chǎn)。當(dāng)宿主是埃希氏菌屬時，轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培 養(yǎng)，諸如LB培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基等，在通常約15-43°C進(jìn)行約3-24小時。當(dāng)宿主是芽孢桿菌屬 時，轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，在通常約30_43°C進(jìn)行約6-24小時。當(dāng)宿主是酵母時，轉(zhuǎn) 化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，諸如伯克霍爾德氏培養(yǎng)基等，在通常約20°C_35°C進(jìn)行約24-24-72小時。當(dāng)宿主為昆蟲細(xì)胞或昆蟲時，轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)培養(yǎng)基中諸如添加約10%牛血清的 Grace昆蟲培養(yǎng)基等中培養(yǎng)，通常在約27°C進(jìn)行約3-5天。當(dāng)宿主為動物細(xì)胞時，轉(zhuǎn)化體在適 當(dāng)培養(yǎng)基中諸如添加約10%牛血清的MEM培養(yǎng)基等中培養(yǎng)，通常在約30°C - 40°C進(jìn)行約15 -60小時。在任何培養(yǎng)中，通氣和攪拌可以根據(jù)需要進(jìn)行。
[0084] 對于通過基因改造生產(chǎn)抗體的方法，可以參考例如Co, M. S.等，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976; Better, M?和Horwitz， A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496; Pluckthun, A?和Skerra, A.， Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515 ; Lamoyi , E. , Methods Enzymol. (1986) 121 , 652-663; Rousseaux, J?等， Methods Enzymol. (1986) 121， 663-669; Bird, R. E?和Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9，132-137等。
[0085] 本發(fā)明抗體從培養(yǎng)物中的分離和純化不以任何方式限制，并且可以采用通常用于 抗體純化的分離和純化方法。例如，抗體可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇和組合層析柱、過濾器、超濾、 鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦、透析、重 結(jié)晶等進(jìn)行分離和純化。
[0086] 所述層析的實例包括親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸 附層析等（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。這些層析可以通過使用液相層析，例如諸如HPLC，F(xiàn)PLC等的液 相層析進(jìn)行。用于親和層析的柱的實例包括蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作為使用蛋白A的柱， 可以提及Hyper D、P0R0S、瓊脂糖凝膠FF(由GE Amersham Biosciences制造）等。本發(fā)明還 涵蓋通過這些純化方法高度純化的抗體。
[0087] 此外，本發(fā)明提供了含有上述本發(fā)明抗體作為活性成分的藥物組合物。聚集蛋白 聚糖酶(特別是，ADAMTS4和5)降解聚集蛋白聚糖并促進(jìn)關(guān)節(jié)炎諸如骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎等中的軟骨破壞。因此，本發(fā)明的抗體的施用抑制聚集蛋白聚糖酶的活性，抑制聚集蛋 白聚糖的降解，抑制軟骨破壞，并且，結(jié)果是，可以預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。因此，本發(fā)明 抗體和本發(fā)明的藥物組合物作為用于關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展等的預(yù)防或治療劑是有用的。特別是， 在實施方案中，本發(fā)明的抗體可以同時抑制多種聚集蛋白聚糖酶，其中所述抗體不僅抑制 人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性，還抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。因此，可以預(yù) 期優(yōu)異的軟骨變性或破壞抑制效果，和對關(guān)節(jié)炎的優(yōu)異的預(yù)防或治療效果。不特別限制關(guān) 節(jié)炎的種類，只要其伴有通過聚集蛋白聚糖酶(特別是，ADAMTS4和5)對聚集蛋白聚糖的降 解導(dǎo)致的軟骨破壞或變性，并且本發(fā)明的抗體提供了預(yù)防或治療效果。其實例包括，但不限 于，在例如，骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎等中由于聚集蛋白 聚糖的降解導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨變性或破壞，椎間盤突出癥中的椎間盤的變性和破壞等。
[0088] 此外，由于已經(jīng)指出ADAMTS4和5參與在腦腫瘤(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）中由于短小蛋白聚 糖降解導(dǎo)致的腦腫瘤細(xì)胞的浸潤、在難治性血管炎中由于多能聚糖降解導(dǎo)致的血管破壞、 皮膚組織的破壞，在皮膚慢性潰瘍中由于多能聚糖降解和其產(chǎn)物導(dǎo)致的過量修復(fù)作用等、 瘢痕瘤等，本發(fā)明的抗體和本發(fā)明的藥物組合物作為用于這些疾病進(jìn)展的預(yù)防或治療劑等 也是有用的。
[0089]當(dāng)本發(fā)明的抗體"作為活性成分被包含"時，這意味著本發(fā)明的抗體作為活性成分 的至少一種被包含，并且不限制其含量。本發(fā)明的藥物組合物可以包含其它活性成分連同 本發(fā)明的抗體。
[0090] 本發(fā)明的抗體可以按照常規(guī)方法進(jìn)行配制（例如，Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A) 〇而且，在必要 時，它可以含有藥學(xué)上可接受的載體和/或添加劑。例如，它可以包含表面活性劑(PEG，吐溫 等）、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等）、著色劑、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑(磷酸鹽，檸 檬酸鹽、其它有機(jī)酸等）、螯合劑(EDTA等）、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助流 劑、矯味劑等。不被限定于這些，本發(fā)明的藥物組合物可適當(dāng)?shù)睾衅渌Ｒ?guī)的載體。具體 的實例包括輕質(zhì)無水硅酸、乳糖、結(jié)晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲纖維素鈣、羧甲基纖維素 鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮醛二乙胺乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明 膠、中鏈脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機(jī)鹽 等。它也可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠和蛋白，諸如免疫球蛋白等，以及 氨基酸。當(dāng)配制用于注射的水溶液時，本發(fā)明的抗體溶解于，例如，包含鹽水、葡萄糖或其它 輔劑的等滲溶液。輔劑的實例包括D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，并且可以與合 適的增溶劑，例如醇（乙醇等）、多元醇(丙二醇、PEG等）、非離子表面活性劑(聚山梨醇酯80， HCL-50)等組合使用。
[0091]如果需要，多肽也可以包含在微膠囊中（由羥乙基纖維素，明膠，聚[甲基丙烯酸甲 酯]等制成的微膠囊），或配制成膠體藥物遞送系統(tǒng)(脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒 和納米膠囊等）（參見，Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &，Oslo Ed. (1980)等）。此外配制藥物作為緩釋藥物的方法也是已知的，并適用于多肽(Langer 等，J. Biomed. Mater. Res. (1981)15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98-105;美國專利號 3,773,919;￡卩-厶-58,481;51(111^11等，81〇?〇171116^(1983) 22:547- 56;歐洲專利號133,988)。此外，也可以通過添加或摻合透明質(zhì)酸酶到本發(fā)明試劑中或與本 發(fā)明試劑一起，增加皮下施用的液體量(例如，W02004/078140等）。
[0092]藥物組合物中本發(fā)明的抗體含量為整個藥物組合物的，例如，約0.01-100重量％， 優(yōu)選 0.1-99.9%。
[0093] 雖然本發(fā)明的藥物組合物可以口服和腸胃外施用，優(yōu)選腸胃外施用。具體而言，其 通過注射或透皮施用給予患者。作為注射劑型的實例，其可以全身和局部通過靜脈內(nèi)注射、 肌內(nèi)注射、皮下注射等施用。其也可通過局部注射，特別是肌肉內(nèi)注射施用到治療部位或其 附近。經(jīng)皮施用的劑型的實例包括軟膏、凝膠、霜劑、膏藥、貼劑等，其可全身和局部施用。另 外，施用方法可以適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)患者的年齡和癥狀選擇。作為本發(fā)明的抗體，劑量可以選自， 例如，0.5 mg-1 Omg/kg體重的范圍。然而，本發(fā)明的藥物組合物并不受這些劑量的限制。
[0094] 本說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利文獻(xiàn)等，在此單獨和具體地通 過引用并入，達(dá)到其整體已在本文中具體公開的程度。 實施例
[0095] 本發(fā)明在下面通過參考實施例進(jìn)行更詳細(xì)地解釋，所述實施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為限 制性的。在實施例中的各種基因操作，按照Molecular cloning第三版（Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中描述的方法。
[0096]材料和方法 B策菌體展示庫篩選(panning)和Fab的生成。
[0097] 使用人組合抗體庫（HuCAL; MorphoSys AG, Martinried, Germany)生成對 ADAMTS4和ADAMTS5特異性的單克隆Fab抗體的生產(chǎn)。重組ADAMTS4和ADAMTS5(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)進(jìn)行生物素化，并與HuCAL-起孵育。結(jié)合的Fab表達(dá)噬菌體在三 個連續(xù)的篩選輪次中富集。Fab基因池從噬菌粒分離并插入大腸桿菌表達(dá)載體，其導(dǎo)致裝備 有Strep-標(biāo)簽II的Fab的功能性周質(zhì)表達(dá)。轉(zhuǎn)化后，挑取單獨的菌落，并在微量滴定板中生 長。通過與異丙基0硫代半乳糖苷過夜孵育誘導(dǎo)抗體的表達(dá)后，將細(xì)胞酶促裂解，并且粗提 取物通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進(jìn)行測試。對于在ELISA中給出對抗原的強(qiáng)信號的克 隆，確定抗體VH CDR區(qū)的DNA序列。選擇含有Fab的菌落用于后續(xù)的純化，并且一些Fab被重 排到全人IgGl中用于進(jìn)一步實驗。
[0098] 重組人 ADAMTS4 和 ADAMTS5。
[0099]含有編碼人ADAMTS4的Phe213-Cys685殘基的cDNA片段的表達(dá)載體，所述片段對應(yīng) ADAMTS4的金屬蛋白酶、解聯(lián)蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和富含半脫氣酸的結(jié)構(gòu)域，在C末端具有 Strep-標(biāo)簽II，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Lipofectamine)(Life Technologies, Rockville, MD) 轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染2天后收獲，并且重組人ADAMTS4通過根據(jù)制造商的說明書 (IBA Biotechnica, Hanover, Germany)，使用Strep-Tactin瓊脂糖進(jìn)行純化。含有金屬蛋 白酶，解聯(lián)蛋白和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域(ADAMTS5的Ser 262-Pro622殘基）的重組ADAMTS5蛋 白購自R&D Systems Inc〇 [0100] 人抗-ADAMTS抗體的免疫印跡。
[0101]人ADAMTS1(R&D Systems)、ADAMTS4、ADAMTS5(R&D Systems)、ADAMTS15(R&D Systems)、ADAM10(R&D Systems)、ADAM12(Mochida Pharmaceutical Co.， Ltd.， Tokyo, Japan)、ADAM17(R&D Systems)和MMP_13(Millipore, Billerica, MA)的重組蛋白和純化 的人MMP-l、MMP-2、MMP-3和MMP_9(Daiichi Fine Chemical, Co. , Ltd.，Toyama, Japan) 在還原條件下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并且將在凝膠上分 離的樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜與針對ADAMTS種類的候選Fab-起(5 yg/ 1111;克隆237-1、237-5、237-21、237-43和237-53)在4°(：孵育16小時。用含有0.1%1￥661120 的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌后，將膜與針對人IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA)的辣根過氧化 物酶綴合的第二抗體在室溫下1小時進(jìn)行反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光試劑(Pierce ECL蛋白質(zhì)印跡底 物；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)用于使標(biāo)記的蛋白質(zhì)條帶是可見的。還檢 查了銀染凝膠上的所有樣品，其通過銀染試劑盒(Cosmo Bio Co., Ltd, Carlsbad, CA)制 備。
[0102] 用人抗-ADAMTS抗體(克隆237-53)對ADAMTS4和5的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。
[0103] 重組ADAMTS4(180 ng)和ADAMTS5(180 ng)在37°C下與人抗ADAMTS抗體（IgGl;克 隆237-53)以1:0.2-5的摩爾比（酶:抗體)或人對照正常IgGl(R&D Systems)孵育30分鐘，然 后在37°C下與豬聚集蛋白聚糖（lOOyg)-起反應(yīng)16小時。聚集蛋白聚糖用軟骨素酶ABC和角 蛋白酶（Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan)去糖基化后，通過使用抗NITEGE392聚集 蛋白聚糖新表位抗體（1.2μg/ml)的免疫印跡監(jiān)測聚集蛋白聚糖酶活性(Hashimoto G,等J Biol Chem. 2004;279:32483-91)。蛋白帶的密度通過使用ImageJ分析軟件（National Institute of Health, Bethesda, MD)的光密度測定進(jìn)行評價。
[0104] 抗ADAMTS抗體(克隆237-53)的結(jié)構(gòu)域作圖。
[0105] ADAMTS4的各結(jié)構(gòu)域和具有NH2-或C00H-末端缺失的血小板反應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域的 重組FLAG和二氫葉酸還原酶（DHFR)-標(biāo)記的蛋白使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)（PUREflex)(Gene Frontier Corporation, Chiba, Japan)合成。這些樣品進(jìn)行SDS-PAGE，然后用抗FLAG抗體 (Sigma-Aldrich, St Louis, M0; 2μg/ml)或人抗ADAMTS抗體（克隆237_53;2iig/ml)進(jìn)行 免疫印跡。
[0106] 表面等離子體共振相互作用(BIAcore)分析 重組ADAMTS種類經(jīng)由胺偶聯(lián)共價固定在CM5傳感器芯片流動室(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)〇使用BIAcore 3000CGE Healthcare Life Sciences) 將克隆237-53的IgGl注射到腔室。從所確定的KjPKd值計算Kd(親和力）。
[0107]用抗ADAMTS抗體(克隆237-53)對在培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中聚集蛋白聚糖酶活性的抑 制。
[0108]從人骨關(guān)節(jié)炎軟骨通過酶解分離的軟骨細(xì)胞在補(bǔ)充有10 %胎牛血清和25μg/ml抗 壞血酸的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/Ham F-12培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)中培養(yǎng)，并且通過 在含有0.2 %乳清蛋白水解物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)血清饑餓后，在有或沒有白介素_la( IL_la( 1 ng/ml; Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Company Ltd. , Okada, Japan)的情況下 處理24小時。它們用ADAMTS抗體（5μg/ml，克隆237-53)或人對照IgG(5μg/ml; Invitrogen, Carlsbad，CA)處理1小時，并且然后在聚集蛋白聚糖（100yg)的存在下孵育16小時。濃縮的 培養(yǎng)基在去糖基化后進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。聚集蛋白聚糖酶活性通過用抗 NITEGE 392新表位抗體（1.2iig/ml)的免疫印跡進(jìn)行評價。根據(jù)醫(yī)院的道德準(zhǔn)則從具有骨關(guān)節(jié) 炎的患者獲得對于手術(shù)樣品的實驗用途的知情同意。
[0109] 為了檢查ADAMTS4和5的mRNA表達(dá)，從有或沒有IL-la(l ng/ml)和人抗ADAMTS抗體 (克隆237-53)處理18小時的軟骨細(xì)胞中制備總RNA，并使用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies，Rockville，MD)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如先前所述，用對ADAMTS4和5以及管家基 因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)特異性的引物通過PCR擴(kuò)增cDNA(Naito S，等Pathol Int. 2007;57:703-11)〇
[0110] 結(jié)果： 針對ADAMTS4和ADAMTS5的人抗體的篩選 通過使用噬菌體展示方法篩選人抗體文庫(HuCAL)，通過ELISA獲得共5個克?。?37-1、 237-5、237-21、237-43和237-53)與4041〇^4和4041〇^5兩者反應(yīng)。免疫印跡分析表明，所有 的克隆均識別重組ADAMTS4和ADAMTS5，雖然對ADAMTS5的反應(yīng)性在克隆之間不同（圖1A)。為 了檢驗候選克隆是否抑制ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性，克隆的Fab種類以1:1的摩爾 比與ADAMTS4-起孵育，并且然后通過使用新表位(NITEGE 392)特異性的抗體進(jìn)行免疫印跡 監(jiān)測活性。如在圖1B中所示，克隆237-53抑制五個候選克隆中的聚集蛋白聚糖酶的活性。
[0111] 克隆237-53與ADAMTS4和ADAMTS5的免疫反應(yīng)性 由于克隆237-53顯示對ADAMTS4的抑制活性，所以關(guān)注該抗體。當(dāng)通過免疫印跡檢驗針 對八0經(jīng)^^0411和]\^3種類的抗體的交叉反應(yīng)性時，克隆237-53與40410'34和40410'35兩者反 應(yīng)。然而，對于 ADAMTSl、ADAMTS15、ADAM10、ADAM12、ADAM17、MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-9 或 麗P-13沒有獲得免疫反應(yīng)性（圖2)。這些數(shù)據(jù)表明，克隆237-53與通常存在于ADAMTS4和 ADAMTS5中的某些區(qū)域發(fā)生反應(yīng)。
[0112] 克隆237-53識別的ADAMTS4表位的確定 為了確定被抗體克隆237-53識別的ADAMTS4的免疫反應(yīng)性結(jié)構(gòu)域，我們首先檢驗對通 過PUREf lex產(chǎn)生的單獨金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域或解聯(lián)蛋白和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域的重組蛋 白的反應(yīng)性。如圖3A所示，抗體僅識別解聯(lián)蛋白和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白。因此，我 們進(jìn)一步檢驗了與解聯(lián)蛋白或血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)性，并且發(fā)現(xiàn)，該抗體僅 識別血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域（圖3B)，表明ADAMTS4的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域包含抗體的表 位。
[0113]為了更詳細(xì)地確定表位，使用具有人ADAMTS4的固定化的部分肽的肽陣列用于抗 體克隆237-53的表位作圖。具體地講，如下表所示，相對覆蓋人ADAMTS4的血小板反應(yīng)蛋白 結(jié)構(gòu)域的序列，產(chǎn)生由具有12個氨基酸殘基的殘基數(shù)目和3個氨基酸殘基彌補(bǔ)的肽組成的 肽陣列。HRP標(biāo)記的抗體克隆237-53與肽陣列反應(yīng)。
[0114] 結(jié)果是，237-53特異性結(jié)合于上述肽# 36- # 39。該結(jié)果表明，237-53的表位包含 3￡〇10從):9(￥0￡61?^1^)所示的氨基酸序列，其對于肽#36-#39是常見的。
[0115] 培養(yǎng)所獲得的克隆237-53的大腸桿菌，并回收質(zhì)粒(QIAprep Spin Miniprep試劑 盒:QIAGEN制造），并用于DNA序列分析。表2顯示⑶R237-53 H鏈和L鏈的⑶R(互補(bǔ)決定區(qū)）的 氨基酸序列。
[0116] 237-53的H鏈和L鏈的可變區(qū)的全長氨基酸序列如下。
[0117] 抗體克隆237-53對ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。
[0118] ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性通過使用聚集蛋白聚糖新表位特異性 抗體的具有NITEGE392的C00H-末端序列的65-kDa聚集蛋白聚糖片段的免疫印跡展示來進(jìn)行 測定。如圖4A所示，抗體克隆237-53阻斷ADAMTS4的活性到原活性的不到20%，而ADAMTS5活 性被輕微抑制到原活性的大約70%。用正常對照186(圖4六)沒有觀察到抑制。使用別 &(3〇代 的動力學(xué)分析證明，這種抗體對ADAMTS種類的高親和力結(jié)合，對于ADAMTS4和ADAMTS5分別 顯示 1.17X10-8 M和 1.46X10-9 M的KD值。
[0119] 來自骨關(guān)節(jié)炎軟骨的培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)ADAMTS5，但不表達(dá)ADAMTS4(圖4B，左）。 當(dāng)軟骨細(xì)胞用IL-la處理時，ADAMTS4被誘導(dǎo)，但ADAMTS5的表達(dá)沒有變化（圖4B，左）。未處理 的軟骨細(xì)胞的聚集蛋白聚糖酶活性是最小的，但其在IL-la刺激后增加（圖4B，右）。當(dāng)IL-la 刺激的軟骨細(xì)胞用抗體克隆237-53處理時，聚集蛋白聚糖酶的活性基本上降低到對照水 平，但通過用正常對照IgG處理沒有觀察到抑制（圖4B，右）。
[0120] 工業(yè)實用性 根據(jù)本發(fā)明，提供了對于預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展有用的抗人聚集蛋白聚糖酶抗體。
[0121]本申請基于美國臨時專利申請序列號61/891，087(申請日：2013年10月15日），其 內(nèi)容通過引用全部并入本文。








【主權(quán)項】
1. 特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性 的抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其還抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3的抗體，其在包含SEQ ID N0:9中所示的氨基酸序列的表位結(jié)合 人ADAMTS4。5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項的抗體，其包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中 (1) 輕鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3;或 (2) 輕鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQ ID NO: 1-3的至少一個氨基酸序列中置換、缺失、插入或添加1-3個氨 基酸，和/或 在選自SEQ ID NO: 4-6的至少一個氨基酸序列中置換、缺失、插入或添加1-3個氨基 酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸 序列，并且重鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的抗體，其是人抗體。8. 藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的抗體。9. 多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的抗體。10. 載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求9的多核苷酸。11. 轉(zhuǎn)化子，其包含根據(jù)權(quán)利要求10的載體。12. 用于預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的試劑，其包含特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述 聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性的抗體。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13的試劑，其中所述抗體是根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的抗體。15. 用于預(yù)防或治療哺乳動物中關(guān)節(jié)炎的方法，其包括施用有效量的抗體，所述抗體特 異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶對哺乳動物的聚集蛋白聚糖酶活 性。16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其中所述抗體是根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的抗體。18. 特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性 的抗體，其用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療。19. 根據(jù)權(quán)利要求18的抗體，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19的抗體，其是根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的抗體。21. 特異性結(jié)合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性 的抗體用于生產(chǎn)用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療的試劑的用途。22. 根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。23. 根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，其中所述抗體是根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的抗體。
【文檔編號】C07K16/40GK105849128SQ201480056880
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年10月14日
【發(fā)明人】宮越陽, 中川美紀(jì)子, 古城周久, 望月早月, 岡田保典
【申請人】基因先端領(lǐng)域株式會社, 學(xué)校法人慶應(yīng)義塾