一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素硒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素硒的方法。它利用茶樹內(nèi)生草螺菌對硒酸鹽具有較強還原活性的生物學特性，直接用硒酸鹽與茶樹內(nèi)生草螺菌一起培養(yǎng)，將有毒的硒酸鹽還原成無毒的紅色元素硒，通過培養(yǎng)時間的控制，可獲得高純度的紅色元素硒納米球或納米花。本發(fā)明的技術方法成本低、操作簡單、轉化效率高、安全環(huán)保。
【專利說明】
一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及的是生物細胞生產(chǎn)納米紅色元素砸技術，特別是一種應用茶樹內(nèi)生草螺菌轉化有毒砸酸鹽并結晶生成無毒的納米紅色元素砸的方法。
【背景技術】
[0002]砸是人和動物必需的微量元素之一，與機體的抗氧化能力、免疫功能、抗病毒、抗癌作用等有著重要的關系。與無機砸和有機砸相比，紅色納米砸(零價砸)具有毒性低、生物活性尚等特征。鑒于零價砸的低毒性、尚效抗氧化、抗癌、中和重金屬毒性、尚吸收利用率等獨特的生物學效應，因此在家養(yǎng)動物生產(chǎn)、醫(yī)藥、保健品方面具有廣泛的應用前景;又鑒于紅色納米砸與其它單質砸一樣具有納米粒子的特性，它的高壓電熱電性能、高光電導率、低熔點以及高化學活性也能在整流器、半導體元件、靜電復印技術、激光元件、紅外光導材料、光電器件、光電池以及合成砸化物功能納米材料等方面有著廣泛的應用。
[0003]目前，納米級單質砸生產(chǎn)的方法主要有物理法、化學法或物理-化學綜合法。使用較多的是化學方法，它需要合適的還原劑和分散劑。還原劑主要有維生素C、亞硫酸鈉、肼、硫代硫酸鈉等，分散劑主要有PVP、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、聚乙烯醇等。單質砸具有多種形態(tài):紅色單質砸、灰色單質砸、黑色單質砸以及無定形單質砸，其中紅色單質砸毒性最低，且紅色單質砸毒性小，對熱穩(wěn)定，通常不轉化為灰色或黑色單質砸，被認為是砸生物解毒的方式，在生物活性方面具有較高的應用價值。目前研究發(fā)現(xiàn)許多生物能將砸酸鹽或亞砸酸鹽還原成紅色單質砸，但因其效率低尚處在研究階段。
[0004]茶樹內(nèi)生草螺菌是一種茶樹共生專一性強的內(nèi)生細菌。文獻“兩株茶樹內(nèi)生草螺菌的微生物學特性”(王婷等，微生物學報2014第4期，2014.04.04，P424-432)詳細敘述了茶樹內(nèi)生草螺菌的篩選和微生物學特性，但未涉及茶樹內(nèi)生草螺菌的應用。我們利用茶樹內(nèi)生草螺菌與砸酸鹽共培養(yǎng)，獲得了紅色元素砸納米花結晶，并建立了一種利用茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提出一種利用茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法。使用茶樹內(nèi)生草螺菌與砸酸鹽共培養(yǎng)，細菌能有效促進砸酸鹽還原成紅色元素砸，并形成紅色元素砸納米顆?；蚣{米花結晶。
[0006]—種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，以砸酸鹽為原料，用微生物將砸酸鹽還原為紅色砸，其特征在于:所用微生物為茶樹內(nèi)生草螺菌，所述的方法為茶樹內(nèi)生草螺菌直接與砸酸鹽共培養(yǎng)或內(nèi)生草螺菌活化、培養(yǎng)均與砸酸鹽共培養(yǎng)或培養(yǎng)中分批次加入砸酸鹽。
[0007]優(yōu)選地，如上所述的茶樹內(nèi)生草螺菌直接與砸酸鹽共培養(yǎng)的方法為:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每分鐘150轉搖動，28 ° C培養(yǎng)過夜，將活化后的菌液以體積比1:100接入含有50-500mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，搖床轉速每分鐘100-200轉、溫度為28-37 °C條件下培養(yǎng)6_36小時，即可獲得紅色元素砸納米顆?；蚣{米花晶體。
[0008]優(yōu)選地，如上所述的內(nèi)生草螺菌活化、培養(yǎng)均與砸酸鹽共培養(yǎng)的方法為:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種接種含有50 mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基，每分鐘150轉搖動，28 ° C培養(yǎng)過夜培養(yǎng)過夜，將活化后的菌液以體積比1:100接入含有50-500mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，搖床轉速每分鐘100-200轉、溫度為28-37 ° C條件下培養(yǎng)6_36小時即可獲得紅色元素砸納米顆?；蚣{米花晶體。
[0009]優(yōu)選地，如上所述的培養(yǎng)中分批次加入砸酸鹽的方法為:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種接種LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，將活化后的菌液以體積比1:100接入含有50-200mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，搖床轉速每分鐘100-200轉、溫度為28-37 °C條件下培養(yǎng)3_6小時后，再次加入300-450 mM砸酸鹽，繼續(xù)在搖床轉速每分鐘100-200轉、溫度為28-37 °(:條件下培養(yǎng)4-6小時，即可獲得紅色元素砸納米顆?；蚣{米花晶體。
[0010]優(yōu)選地，如上所述的所述的一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，其特征在于:所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為1g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，加水至1000ml，10yg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素。
[0011 ]優(yōu)選地，如上所述的所述的一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，其特征在于:所述LB液體培養(yǎng)基為1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，加水至100ml，10μg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素。紅色無素砸形成的觀察:在茶樹內(nèi)生草螺菌與砸酸鈉共培養(yǎng)過程中，直接用眼睛觀察培養(yǎng)液的顏色變化，培養(yǎng)液的顏色變紅說明紅色無素砸己生成。
[0012]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點:
1、充分利用了茶樹內(nèi)生草螺菌的生物學特點，茶樹內(nèi)生草螺菌是茶樹專一性強的內(nèi)生細菌，與茶樹互惠共生無公害，它能產(chǎn)生多種抗氧化的蛋白和酶如谷胱苷肽、過氧化物酶等活性物質。這些蛋白或酶的存在使該細菌具有強的還原能力，能有效地將砸酸鹽還原成紅色無素砸。使用茶樹內(nèi)生草螺菌轉化砸酸鹽或亞砸酸鹽制備納米紅色無素砸，轉化率高、成本低廉、操作方便、容易純化、安全環(huán)保。
[0013]2、使用茶樹內(nèi)生草螺菌轉化砸酸鹽或亞砸酸鹽制備納米紅色無素砸，產(chǎn)品單一，無其它形態(tài)單質砸，還可根據(jù)培養(yǎng)時間控制納米紅色無素砸的形態(tài)。培養(yǎng)6-10小時，紅色無素砸驟集形成50-200 nm球形或多角形顆粒。培養(yǎng)12小時以后，紅色無素砸驟集形成Imm大小的納米花晶體。
[0014]3、可根據(jù)需求縮小或放大生產(chǎn)規(guī)模。本發(fā)明是利用細菌培養(yǎng)制備納米紅色無素砸，因此只需依據(jù)細菌培養(yǎng)的方法確定生產(chǎn)規(guī)模。既可使用搖瓶、搖床實驗室規(guī)模制備，也可放大后使用發(fā)酵罐大規(guī)模制備。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明實施例1中加入不同濃度的砸酸鹽與細菌共培養(yǎng)8小時后培養(yǎng)基的顏色，從左至右依次為空白(LB不含砸酸鹽)、砸酸鹽在LB中的終濃度分別為100mM、150mM、200mM、300mM、400mM、500mMo
[0016]圖2為本發(fā)明實施例1中培養(yǎng)8小時后紅色無素砸驟集形成的納米球形顆粒。
[0017]圖3為本發(fā)明實施例2中培養(yǎng)7小時后紅色無素砸驟集形成的納米多形態(tài)顆粒。
[0018]圖4為本發(fā)明實施例3中培養(yǎng)12小時后紅色無素砸驟集形成的納米花晶體。
【具體實施方式】
[0019]以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步描述，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于實施例所述的范圍，凡是不背離本發(fā)明構思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0020]實施例1
(I)取-80。C保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種，接種5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(1g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，10yg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素，加水至100ml)，每分鐘150轉搖動，28 ° C培養(yǎng)過夜。
[0021 ] (2)將活化后的菌液以體積比1:100接入新鮮含50-200mM HiMNa2SeO4的LB液體培養(yǎng)基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，lOyg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素，50-200mM Na2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中放大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:搖床轉速每分鐘150轉，溫度為37 °C。培養(yǎng)6-8小時，培養(yǎng)液開始變紅，說明紅色無素砸己生成，爾后隨著培養(yǎng)時間的延長，紅色逐漸加深。
[0022](3)紅色無素砸納米顆粒形態(tài)檢測:取步驟(3)的100 ml細菌培養(yǎng)液，與900 ml磷酸緩沖液(1mM Na2HP04、2mM NaH2P04、pH=7.4)混合稀釋，混均后取20 ml稀釋液并滴在碳膜型銅網(wǎng)上，室溫條件下晾干，然后使用Tecanai G2 20 S-TWIN透射電子顯微鏡觀察和拍照。透射電鏡觀察到紅色元素砸聚集成50-100 nm大小的球狀顆粒(見圖1和圖2)。
[0023]實施例2
(I)將-80 °(:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種直接接入5 ml含砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，10yg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素，50 mM Na2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中，每分鐘150轉搖動，28 °C培養(yǎng)過夜。
[0024](2)將活化后的菌液以體積比1:100比例接入新鮮含200 mM Na2SeO4的LB液體培養(yǎng)基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，10yg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素，200mMNa2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中放大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:搖床轉速每分鐘150轉，溫度為37 °C。培養(yǎng)6-8小時，培養(yǎng)液開始變紅，說明紅色無素砸己生成，爾后隨著培養(yǎng)時間的延長，紅色逐漸加深。
[0025](3)紅色無素砸納米顆粒形態(tài)檢測:取步驟(3)的100 ml細菌培養(yǎng)液，與900 ml磷酸緩沖液(1mM Na2HP04、2mM NaH2P04、pH=7.4)混合稀釋，混均后取20 ml稀釋液并滴在碳膜型銅網(wǎng)上，室溫條件下晾干，然后使用Tecanai G2 20 S-TWIN透射電子顯微鏡觀察和拍照。透射電鏡觀察到紅色元素砸聚集成100 nm大小的球狀顆粒(見圖3)。
[0026]實施例3
(I)將-80 °(:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種直接接入5 ml含砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，10yg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素，50 mM Na2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中，每分鐘150轉搖動，28 °C培養(yǎng)過夜。
[0027](2)直接將活化的細菌以體積比1:100接入新鮮含200 mM Na2SeO4 LB液體培養(yǎng)基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，10yg/mL壯觀霉素，5yg/mL氨芐青霉素，200 mMNa2SeO4，加水至100ml，pH7.2-7.4)中放大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:搖床轉速每分鐘150轉，溫度為37 °C。培養(yǎng)5小時后，再加入200 mM Na2SeO4,使砸酸鈉的總濃度為400禮。繼續(xù)在搖床轉速每分鐘150轉、溫度為37 °C條件下培養(yǎng)8-10小時。
[0028](3)紅色無素砸納米顆粒形態(tài)檢測:取步驟(2)的100 ml細菌培養(yǎng)液，與900 ml磷酸緩沖液(1mM Na2HP04、2mM NaH2P04、pH=7.4)混合稀釋，混均后取20 ml稀釋液并滴在碳膜型銅網(wǎng)上，室溫條件下晾干，然后使用Tecanai G2 20 S-TWIN透射電子顯微鏡觀察和拍照。透射電鏡觀察到紅色元素砸聚集成大小可達Imm的納米花(見圖4)。
【主權項】
1.一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，以砸酸鹽為原料，用微生物將砸酸鹽還原為紅色砸，其特征在于:所用微生物為茶樹內(nèi)生草螺菌。2.如權利要求1所述的一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，其特征在于:該方法為茶樹內(nèi)生草螺菌與砸酸鹽共培養(yǎng)或內(nèi)生草螺菌活化、培養(yǎng)時均與砸酸鹽共培養(yǎng)或培養(yǎng)過程中分批次加入砸酸鹽。3.如權利要求2所述的一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，其特征在于:茶樹內(nèi)生草螺菌與砸酸鹽共培養(yǎng)的方法為:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，將活化后的菌液以體積比1:100接入含有50-500mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)6-36小時，即可獲得紅色元素砸納米顆?；蚣{米花晶體。4.如權利要求2所述的一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，其特征在于:內(nèi)生草螺菌活化、培養(yǎng)時均與砸酸鹽共培養(yǎng)的方法為:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種接種含有5 O m M砸酸鹽的L B液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，將活化后的菌液以體積比1:1O O接入含有5 O -500mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)6-36小時，即可獲得紅色元素砸納米顆?；蚣{米花晶體。5.如權利要求2所述的一種茶樹內(nèi)生草螺菌制備納米紅色元素砸的方法，其特征在于:培養(yǎng)過程中分批次加入砸酸鹽的方法為:保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種接種LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，將活化后的菌液以體積比I: 100接入含有50-200mM砸酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)3-6小時后，再次加入300-450mM砸酸鹽，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，即可獲得紅色元素砸納米顆?；蚣{米花晶體。
【文檔編號】C12P3/00GK105838740SQ201610285114
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】王行國, 徐蕭, 劉欣, 喻雪婧, 李亞東
【申請人】湖北大學