assMassLynx-Openlynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行。
[0154] 通用程序B HPLC測量使用AllianceHT2795 (Waters)系統(tǒng)進(jìn)行，其包括帶有脫氣器的四元栗 (quaternarypump)、自動取樣器、二極管陣列檢測器(DAD)和下列各方法中所指定的柱，該 柱保持在30°C的溫度。液流由柱被分流至MS光譜儀。MS檢測器配置有電噴霧離子源。毛細(xì)管 的針電壓為3kV而源溫度于LCT上(購自Waters的TimeofFlightZspray?質(zhì)譜儀)維持在 100°C。使用氮作為霧化氣體。數(shù)據(jù)采集以Waters-MicromassMassLynx-Openlynx數(shù)據(jù)系統(tǒng) 進(jìn)行。
[0155]方法1 除了通用程序A的外:反相UPLC于WatersAcquityBEH(橋接乙基硅氧烷/二氧化娃雜 化的）C18柱（1.7μπι, 2.1X100mm)上以0.35ml/min的流速進(jìn)行。應(yīng)用二個流動相(流 動相A:95% 7mM乙酸銨/5%乙腈;流動相B:100%乙腈)運行梯度條件:于3.5分鐘內(nèi)從90%A 和10%B(保持0.5分鐘）至8%A和92%B，保持2min并于0.5min內(nèi)回到最初的條件，保持 1.5分鐘。使用2μL的注射體積。正和負(fù)離子化模式的錐孔電壓(Conevoltage)為20V。質(zhì) 譜使用0.1秒的中間掃描延遲于0.2秒內(nèi)從100掃描至1000而獲得。
[0156]方法 2 除了通用程序A外:反相UPLC于WatersAcquityBEH(橋接乙基硅氧烷/二氧化娃雜化 的）C18柱（1.7μπι, 2.1X100mm)上以0.345ml/min的流速進(jìn)行。應(yīng)用二個流動相(流動 相A: 95% 7mM乙酸銨/5%乙腈;流動相B: 100%乙腈)來運行梯度條件:于2.18分鐘內(nèi)從84.2% A和15.8%B(保持0.49分鐘）至10.5%A和89.5%B，保持1.94min并于0.73min內(nèi)回到最 初的條件，保持0.73分鐘。使用2μL的注射體積。正和負(fù)離子化模式的錐孔電壓為20V。質(zhì) 譜使用0.1秒的中間掃描延遲于0.2秒內(nèi)從100掃描至1000而獲得。
[0157]方法 3 除了通用程序Β外:反相UPLC于WatersX-bridgeC18柱(3.5μπι, 4.6X100mm)上以 0.8ml/min的流速進(jìn)行。應(yīng)用二個流動相(流動相A: 100% 7mM乙酸銨;流動相B: 100%乙腈） 來運行梯度條件:于4.5分鐘內(nèi)從80%A和20%B(保持0.5分鐘）至90%B，90%B進(jìn)行4分鐘 并以最初條件再平衡3分鐘。使用5μL的注射體積。正和負(fù)離子化模式的錐孔電壓為20V。 質(zhì)譜使用0.3秒的中間掃描延遲于0.4秒內(nèi)從100掃描至1000所獲得。
[0158]方法 4 除了通用程序Β外：反相UPLC于WatersAtlantisC18柱（5μπι, 3.9X100mm)上以 0.8ml/min的流速進(jìn)行。應(yīng)用三個流動相(流動相A: 100% 7mM乙酸銨;流動相B: 100%乙腈； 流動相C:0.2%甲酸+99.8%超純水））來運行梯度條件:于4.5分鐘內(nèi)從50%A和50%C(保持 1.5分鐘)至10%A，80%B和10%C，保持4分鐘并以最初條件再平衡3分鐘。使用5μL的注射 體積。正和負(fù)離子化模式的錐孔電壓為20V。質(zhì)譜使用0.3秒的中間掃描延遲于0.4秒內(nèi)從 100掃描至1000來獲得。
[0159]方法 5 HPLC測量使用HPLC1100/1200 (Agilent)系統(tǒng)進(jìn)行，其包括帶有脫氣器的四元栗、自 動取樣器、二極管陣列檢測器(DAD)和下列各方法中所指定的柱，該柱保持在室溫。MS檢測 器(MS-Agilentsimplequadripole(單一四極桿））配置有電噴霧-APCI離子源。使用氮作 為霧化氣體。數(shù)據(jù)采集以Chemstation數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行。
[0160]反相UPLC于NucleosilC18柱（3μπι, 3X150mm)上以0.42ml/min的流速來進(jìn) 行。應(yīng)用二個流動相(流動相A:水/TFA(0.1%);流動相B: 100%乙腈)來運行梯度條件:從98% A進(jìn)行3分鐘，于12分鐘內(nèi)至100%B，100%B進(jìn)行5分鐘，然后于2分鐘內(nèi)回到98%A，并以98% A再平衡6分鐘。使用2μL的注射體積。毛細(xì)管電壓為2kV，電暈放電保持在1μΑ且源溫度維 持在250°C?？勺冸妷河糜谒榱哑?fragmentor)。質(zhì)譜以電噴霧離子化，而APCI以正電模式 (positivemode)，通過從 100掃描至 1100amu獲得。
[0161]表C.1:LC/MS數(shù)據(jù)

C2.熔點 對于許多化合物而言，熔點用具有線性溫度梯度的加熱板、滑動指示器和攝氏溫標(biāo)所 組成的Kofier熱臺獲得。
[0162]對于許多化合物，熔點使用示差掃描熱量分析儀(DSC)測定。以10°C/分鐘的溫度 梯度由25°C開始測量熔點。最大溫度為350°C。
[0163]對于許多化合物，熔點使用Biichi熔點測定儀B-560獲得。加熱介質(zhì)為金屬塊。樣本 的恪點以放大透鏡和大光度對比(biglightcontrast)以肉眼觀察。恪點以3或10°C/分鐘 的溫度梯度來測量。最大溫度為300°C。
[0164]其余的熔點使用開放的毛細(xì)管測定。
[0165]表C. 2:熔點數(shù)據(jù)
D.藥理學(xué)實施例 D.lFabI酶抑制作用：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)FabI酶抑制分析FabI酶抑制分析于半?yún)^(qū)384-孔微量滴定板中進(jìn)行。以40-μΙ含100mMNaADA，pH6.5 (ADA=N-[2-乙酰氨基]-2亞氨基二乙酸）、250μΜ巴豆?；?CoA、625μΜNADH和50μg/ml 金黃色葡萄球菌ATCC29213FabI的分析混合物來評估化合物。抑制劑典型地于50至0.39 μΜ的范圍內(nèi)變化。將反應(yīng)混合物于室溫培養(yǎng)30分鐘并通過加入200mMTris緩沖液（pH 9.0)產(chǎn)生pH-移位而停止反應(yīng)。通過測量于340的吸收度變化來監(jiān)測NADH的消耗量。比較樣 本讀數(shù)與陰性(無化合物）和陽性(無酶)對照品的讀數(shù)，測定化合物的酶活性的抑制百分 比。以最小平方法擬合最佳擬合曲線。由此得到造成50%酶活性抑制的IC5Q-值（以yg/ml表 示)。
[0166] 表D.1:金黃色葡萄球菌FabIIC50值
D. 2體外試驗化合物對抗各種細(xì)菌株的抗菌活性的方法 制備敏感性試驗的細(xì)菌懸浮液 使用下列細(xì)菌:金黃色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)ATCC700788和大腸桿菌ATCC35218。將用于此研究的細(xì)菌于含100mlMueller-Hinton培養(yǎng)液 (Difcocat.nr.0757-17)的燒瓶中，于無菌去離子水中，伴有震蕩下于37°C生長過夜。將 儲備液于-70°C儲存直到使用。
[0167] 將細(xì)菌于含5%羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)板(BectonDickinsoncat.nr. 254053)于35°C有氧的條件下培養(yǎng)18-24小時（第一代）。對于第二代，將新鮮的Mueller-Hinton培養(yǎng)液以5-10個菌落接種并于35°C生長過夜，直到有氧的條件下達(dá)到混濁(達(dá)到對 數(shù)期）。然后將細(xì)菌懸浮液調(diào)整至0.5McFarland密度并進(jìn)一步以MuellerHinton肉湯培養(yǎng) 基稀釋1:100。將其用作接種物。
[0168] 結(jié)果(對于STAATCC29213)在下表D2中描述。
[0169] 抗菌藥敏感性試驗：IC9Q測定 MIC分析通過肉湯微量稀釋法，在含二倍系列稀釋的化合物的最終體積0.1ml的MuellerHinton肉湯的96-孔格式板(平底微量滴定版）中進(jìn)行，并以5xl05CFU/ml的細(xì)菌 接種(根據(jù)CLSI指南的標(biāo)準(zhǔn)接種物大?。?。抑制劑典型地在63至0.49μΜ的范圍內(nèi)變化。分析 的最終的DMS0濃度為1.25 % (最大可耐受DMS0濃度=6%)。在測試了人血清對于化合物對抗 金黃色葡萄球菌的活性的影響的測定中，以10%的終濃度添加人血清。將板于35°C培養(yǎng)16-20小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，對細(xì)菌生長進(jìn)行熒光計定量。為此，將刃天青添加至所有孔中，并將 板再孵育。孵育時間取決于細(xì)菌的種類。從藍(lán)色到粉紅色的顏色變化指示細(xì)菌的生長。在計 算機控制的焚光計(FluoroskanAscentFL,Labsystems)中，在540nm的激發(fā)波長和590 nm的發(fā)射波長下讀取焚光。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法計算由化合物實現(xiàn)的生長抑制％。1〇9〇(以μg/ml表 示)被定義為是細(xì)菌生長的90%抑制的濃度。同時測試一組參比化合物來用于QC驗證。
[0170] 在下表D2(STA+ 10%HS)中對結(jié)果進(jìn)行了描述。
[0171]細(xì)胞毒性分析 化合物的細(xì)胞毒性使用MTT分析來評估。將生長于96-孔板的人類HelaM細(xì)胞暴露于試 驗化合物的系列稀釋液(最終體積0.2ml)并于37°C和5%C02下培養(yǎng)72小時。抑制劑典型地 在25至0.8μΜ的范圍內(nèi)變化。分析中最終的DMS0濃度為0.5 %。加入MTT(3-(4,5-二甲基噻 唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑鑰，一種四唑）并僅在活細(xì)胞中還原成紫色的甲臜 (formazan)。通過加入100μL2-丙醇使甲臜結(jié)晶溶解。通過測量還原的甲臜(在540nm和 690nm處給出紫色顏色）的吸光度來確定細(xì)胞活力。從在540nm處測定的吸光度自動減去 在690nm處測定的吸光度，以消除非特異性吸收的影響。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法來計算由化合物實 現(xiàn)的細(xì)胞毒性百分比。細(xì)胞毒性報告為CC5Q，這是造成細(xì)胞活力降低50%的濃度。
[0172] 在下表D2 (Τ0ΧHELAM)中對結(jié)果進(jìn)行了描述。
[0173] 表D2-代表性實施例的數(shù)據(jù)
實施例E E.1熱力學(xué)溶解度/在水溶液中的溶解度 pH溶解度分析是在環(huán)境溫度下以4天的時期進(jìn)行的。進(jìn)行了一項飽和溶解度研究，以確 定在特定緩沖溶液中的最大溶解度。將化合物添加至各自的緩沖溶液中，直至達(dá)到飽和點。 隨后在環(huán)境溫度下?lián)u動燒瓶4天。4天之后，將溶液過濾并注入到UPLC上，并且使用通用HPLC 方法對濃
NT=未測試。
[0174]E. 2抗微生物活性譜 按照臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)抗好氧菌(CLSIM07-A8)的方法(見臨床和實驗室 標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會，2009年，抗好氧生長的細(xì)菌進(jìn)行稀釋抗微生物藥敏試驗的方法，CLSI文件M07-A8,第29卷，第2期），通過肉湯微量稀釋法，采用陽離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton(米勒-海 頓）肉湯(CA-MHB)培養(yǎng)基(這種培養(yǎng)基用于除了流感嗜血桿菌以外的大多數(shù)生物體，而流感 嗜血桿菌使用嗜血桿菌測試培養(yǎng)基(HTM)肉湯），對最小抑菌濃度(MIC)進(jìn)行確定。在表中可 以找到對單獨生物的描述。在可能的情況下，對ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行試驗。
[0175]對用于藥敏試驗的接種密度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以給出大約5X105CFU/mL的最終接 種物。將肉湯MIC確定為藥物最低濃度，該藥物最低濃度可在35°C_37°C孵育16-24小時（取 決于物種)之后阻止可見的生長。
[0176]表:對測試的單獨生物的描述
這些化合物的儲備液以1mg/mL的濃度在DMS0中制備。利奈唑胺以2mg/mL的濃度在DMS0中制備。將所有化合物的儲備液稀釋成CA-MHB，得到一系列的2倍稀釋液，取決于被測 試的生物體的靈敏度。
[0177]結(jié)果(如果可獲得的話)
E.3體內(nèi)藥代動力學(xué)以及口服生物利用度 在單次靜脈內(nèi)（i.v.)快速推注以及口服(P.o.)給藥之后，在雄性Swiss小鼠（伺喂）中， 對實施例化合物的體內(nèi)藥代動力學(xué)以及口服生物利用度進(jìn)行研究。對于i.v.以及P.o.溶液 配制物，該化合物被溶解在20%ΗΡ-β-⑶溶液中。配制物的pH值是約pH4。所有的i.v.配制 物均是等滲的。
[0178] 結(jié)果
E.4體內(nèi)效力 通過對腹腔內(nèi)感染的小鼠進(jìn)行治療來研究抗菌化合物的體內(nèi)效力的概念是在1911年 針對奧普托欣(<^1:〇(311；[11)對抗肺炎雙球菌而引入的(10找6111'01:11和1^￥7，1911年）。該模型 的普及來自于其易于使用，同時具有短持續(xù)時間的實驗、可重現(xiàn)的感染以及簡單的終點。
[0179]方法 使用甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌菌株ATCC29213來感染雌性Swiss白化小鼠。將 腦心浸液(BHI)肉湯細(xì)菌培養(yǎng)物在感染前一天進(jìn)行接種，在37°C培養(yǎng)過夜，并且在新鮮的 BHI肉湯中稀釋至所希望的濃度。在腹部的任意側(cè)下象限中進(jìn)行腹膜內(nèi)（i.p.)注射大約5 X1〇9菌落形成單位(CFU)。接種之后，將小鼠關(guān)在它們的籠子里，每日觀察感染跡象進(jìn)展 或死亡。對于小鼠的治療，ρ.ο.和i.v.途徑兩者均可以使用，并且每個小鼠是通過強飼法 或i.v.注射來單獨治療。在此模型中對溶液以及懸浮液兩者均進(jìn)行測試。用于監(jiān)測感染過 程和治療效果的參數(shù)是感染后動物的死亡率或超過3天的存活率。因為死亡也可能是由于 毒副作用，包括了用最高劑量的測試化合物(在所述研究中使用混懸劑)治療的未感染對照 組的3只小鼠。
[0180] 結(jié)果 本發(fā)明/實例的化合物顯示了良好的體內(nèi)效力特性，例如這些化合物可展現(xiàn)出測量為 存活％(按照以上測試)的此類特性。
[0181] 結(jié)果 在使用溶液口服和i.v.給藥后，金黃色葡萄球菌(ATCC29213)感染的腹膜炎模型中活 體內(nèi)抗菌活性
在各個相應(yīng)的試驗中，對照組小鼠表現(xiàn)出80%和100%的死亡率。
【主權(quán)項】
1. 一種化合物，該化合物為或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。2. -種藥用組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體和治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述 的化合物。3. -種制備根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥用組合物的方法，其中治療有效量的根據(jù)權(quán)利要 求1所述的化合物與藥學(xué)上可接受的載體緊密混合。4. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備藥物中的用途。5. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療細(xì)菌感染。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述細(xì)菌感染由表達(dá)FabI酶的細(xì)菌引起。
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗菌的環(huán)戊二烯并[C]吡咯取代的3,4-二氫-1H-[1,8]萘啶酮。本發(fā)明涉及抑制FabI酶活性的新的式(I)化合物，其因此可用于治療細(xì)菌感染。其進(jìn)一步涉及包括這些化合物的藥用組合物，及制備這些化合物的化學(xué)方法。
【IPC分類】A61K31/4375, A61P31/04, C07D401/04
【公開號】CN105461684
【申請?zhí)枴緾N201511000870
【發(fā)明人】J.E.G.圭爾勒蒙特, D.F.A.蘭科伊斯, M.M.S.莫特, A.考爾, W.M.A.巴勒曼斯, E.P.A.阿諾特
【申請人】愛爾蘭詹森科學(xué)公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2012年8月10日
【公告號】CA2842518A1, CN103874698A, CN103874698B, EP2742045A1, US8906923, US9290493, US20140171451, US20150080413, US20160194324, WO2013021054A1