蓮中芋花葉病毒rt-pcr快速分子檢測(cè)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于植物檢疫領(lǐng)域，設(shè)及蓮中芋花葉病毒的檢測(cè)，具體設(shè)及一種蓮中芋花 葉病毒RT-PCR快速分子檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 蓮（NelumbonuciferaGaedn.)是一種多年生水生植物，主要生長(zhǎng)在湖泊、高沼 地、池塘。在中國(guó)，蓮因其可食用的地下莖和種子而作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物栽培已有2000 多年，有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與效益。蓮的葉子、胚芽和花作為草本藥物，含有很強(qiáng)的抗炎成分， 如生物堿、黃酬類(lèi)、抗氧化劑等，因此具有極大的藥用價(jià)值。除了食用價(jià)值和藥用價(jià)值，蓮花 還具有很高的觀賞價(jià)值。蓮花的顏色有深紅、粉紅、白和淡紫色或間色、W及黃色等，盛開(kāi)時(shí) 吸引大量游客參觀。在泰國(guó)，蓮花還象征著一種佛教精神。蓮因常年用地下塊莖無(wú)性繁殖， 導(dǎo)致病毒大量積累，造成其種性退化，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。
[0004] 芋花葉病毒（Dasheenmosaicvirus,化MV)屬于馬鈴馨Y病毒屬，在天南星科植 物上是發(fā)生最普遍和危害最嚴(yán)重的病毒病原。Zettler( 1970)首次從芋頭中發(fā)現(xiàn)了芋花葉 病毒（DsMV)。該病毒是一種通過(guò)曬蟲(chóng)介導(dǎo)的傳播病毒。很多種類(lèi)的曬蟲(chóng)都可W介導(dǎo)運(yùn)種病 毒的傳播。Pernezny(1993)報(bào)道芋花葉病毒在田間傳播非常快。該病毒在種植植物間進(jìn) 行傳播，導(dǎo)致了產(chǎn)量的大大降低。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明目的在于提供一種蓮中芋花葉病毒RT-PCR快速分子檢測(cè)方法。該方法經(jīng) 濟(jì)簡(jiǎn)便，快速靈敏，可W100%檢測(cè)蓮中是否帶化MV，從而為蓮中化MV的防治、脫毒苗的檢測(cè) 提供了有效手段。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施： 根據(jù)已報(bào)道的化MV-對(duì)特異性外殼蛋白（CP)基因序列，首先合成一對(duì)擴(kuò)增化MV的CP基因中間部分核屯、序列的寡核巧酸引物，然后將提取的蓮葉片的總RNA反轉(zhuǎn)成complement DM(cDNA)，再WcDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若擴(kuò)增得到與預(yù)期的片段，則表明所檢測(cè)樣品 感染芋花葉病毒，反之則未感染芋花葉病毒。
[0007] 一種蓮中芋花葉病毒RT-PCR快速分子檢測(cè)方法，所用引物為DF: 5,一邑邑邑ctt邑邑邑t邑at邑at邑邑a-3，，DR:5,一邑cctttca邑t邑ttctc邑ctt邑一3，。
[0008] 優(yōu)選的，所述的蓮中芋花葉病毒RT-PCR快速分子檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1)根據(jù)化MV特異性衣殼蛋白（CP)基因中間部分核屯、序列，合成特異性引物DF: 5, -gggcttgggtgatgatgga-3，，DR:5, -gcctttcagtgttctcgcttg-3，，目的片段長(zhǎng)度為 35化P。
[0009] (2)取待檢蓮葉化提取其總RNA。
[0010] (3)取 200μΙPCR管，加入提取的RNA8yL，0.5yg/yL的oligo-d燈)152yL， 72°C下變性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入化ase-Freed地2〇 8μ^5Χ反轉(zhuǎn) 錄酶緩沖液5μL，lOmM的dNTPs1μL，200U/μL的反轉(zhuǎn)錄酶1μL，總體積為25μL;將反應(yīng) 混合物于PCR儀中42°C延伸1. 5h，70°C再變性lOmin得到cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?W11] (4)配制25μΙPCR反應(yīng)體系，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA1yL，加無(wú)菌水16yL， 10XDNA聚合酶緩沖液2.5μL，25mM的MgCl2 2μL，10mM的dNTPs0.5μL，10μM的引物DF和DR各1μL2U/μL的DM聚合酶1μL。在PCR儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件是：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，36個(gè)循環(huán)；最后在72°C延伸lOmin。
[001引（5)取擴(kuò)增產(chǎn)物4μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，若擴(kuò) 增得到357bp長(zhǎng)度條帶，則表明所檢測(cè)樣品感染芋花葉病毒，反之則未感染芋花葉病毒。
[0013] 所述的檢測(cè)方法還包括將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序的步驟，測(cè)序結(jié)果與SEQID NO. 1所示序列一樣則所檢測(cè)樣品感染芋花葉病毒。
[0014] 本發(fā)明利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)并合成一對(duì)擴(kuò)增化MV 的CP基因中間部分核屯、序列的寡核巧酸引物，建立了一種能快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)蓮中 化MV進(jìn)行檢測(cè)的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)和效果：在提取植物總RNA同 時(shí)也獲得了芋花葉病毒RNA，從而避免了分離病毒的繁瑣過(guò)程，操作方便，快速靈敏?？朔?了ELISA法需制備抗血清的限制且靈敏度不高，費(fèi)用高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。本方法通過(guò) BLAST比對(duì)分析，能100%判斷蓮是否帶有芋花葉病毒。本方法在分子水平上為蓮中化MV的 檢測(cè)提供了一種快速靈敏，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的新方法，為蓮中DsMV的防治、脫毒苗的檢測(cè)提供了 有效手段。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是蓮中芋花葉病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖中，Μ為化2000Marker，！和2 為溫室中接種后感染芋花葉病毒的蓮；3和6為田間自然條件下感染芋花葉病毒的蓮；4和 5為健康蓮。
【具體實(shí)施方式】
[0016] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均在常 規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)。
[0017] 實(shí)施例1 W溫室中接種后感染芋花葉病毒的蓮、田間自然條件下感染芋花葉病毒的蓮、健康蓮 為待檢樣品。
[0018] (1)根據(jù)化MV特異性衣殼蛋白（CP)基因中間部分核屯、序列，合成特異性引物DF: 5, -gggcttgggtgatgatgga-3,，DR:5, -gcctttcagtgttctcgcttg-3,，目的片段長(zhǎng)度為 35化P (GenbankAccessionnumber:ΚΡ692755)。
[0019] (2)取各待檢蓮葉片，用RNApreppure植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。
[0020] (3)取 200μΙPCR管，加入提取的RNA8yL0.5yg/yL的oligo-d燈)152μ^ 72°C下變性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入foiase-Freed地2〇 8yL5XM-MuLX 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5μL，lOmM的dNTPs1μL，200U/μL的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，總體積為 25μL;將反應(yīng)混合物于PCR儀中42°C延伸1. 5h，70°C再變性lOmin得到cDNA，-20°C保存 備用。
[0021] (4)配制25μΙPCR反應(yīng)體系，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA1μレ加無(wú)菌水16μ^ lOXTaqReactionBuffer2. 5yL，25mM的MgC!22yL，10mM的dNTPs0. 5μL，10μM的引 物DF和DR各1μL2U/μL的TaqDMPolymerase1μL。在PCR儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件是： 94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，36個(gè)循環(huán)；最后在72°C延伸 lOmin。
[0022] (5)取擴(kuò)增產(chǎn)物4μ L加入6XLoadingBuffer進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠 成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，溫室中接種后感染芋花葉病毒和田間自然條件下感 染芋花葉病毒的蓮葉片均檢測(cè)到357bp長(zhǎng)度條帶，與預(yù)想的目的片段大小一致。而對(duì)照(健 康蓮葉片）未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。
[0023] (6)對(duì)擴(kuò)增得到的357bp片段進(jìn)行測(cè)序，采用單向測(cè)序，測(cè)序而結(jié)果如SEQIDNO. 1 所示。在NCBI上進(jìn)行BLAST分析表明，測(cè)序結(jié)果與GenbankAccessionnumber為KP692755 的序列覆蓋率達(dá)到100%。說(shuō)明所擴(kuò)增得到DM片段確為化MVCP基因片段。
[0024] 上述步驟用到的試劑：RNApreppure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限 公司），Ξ憐酸堿基脫氧核巧酸（dNTPs)(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司），5XM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩 沖溶液(譜洛麥格(北京）生物技術(shù)有限公司），M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(譜洛麥格(北京）生物技術(shù) 有限公司），oligo-d(T)(譜洛麥格(北京）生物技術(shù)有限公司），10XTaqReactionbuffer (鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司），MgClz(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司），TaqDMPolymerase(鼎國(guó)生 物技術(shù)有限公司），6XLoadingBuffer(大連寶生物工程有限公司），化2000Marker(鼎國(guó) 生物技術(shù)有限公司）。
[00巧]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蓮中芋花葉病毒RT-PCR快速分子檢測(cè)方法，其特征在于：所用引物為DF: 5? -gggcttgggtgatgatgga~3,,DR：5? -gcctttcagtgttctcgcttg-3,〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 合成特異性引物DF:5' -gggcttgggtgatgatgga-3'，DR: _gcctttcagtgttctcgcttg_3,; (2) 取待檢蓮葉片，提取其總RNA; (3) 取 200yLPCR管，加入提取的RNA8yL，0.5yg/yL的oligo_d(T)15 2yL，72°C 下變性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入Rnase-FreeddH20 8yL，5X反轉(zhuǎn)錄酶 緩沖液5μL，10mM的dNTPs1μL，200U/μL的反轉(zhuǎn)錄酶1μL，總體積為25μL;將反應(yīng)混合 物于PCR儀中42°C延伸1. 5h，70°C再變性lOmin得到cDNA; (4) 配制25以1^?0?反應(yīng)體系，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物〇0嫩1以1^，加無(wú)菌水16以1^，10\0嫩 聚合酶緩沖液 2. 5 μL，25mM的MgCl2 2 μL，10mM 的dNTPs0. 5 μL，10 μΜ的引物DF和DR各 1 μL，2U/ μL的DNA聚合酶1 μL;在PCR儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件是：94°C預(yù)變性5min;94°C變 性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，36個(gè)循環(huán)；最后在72°C延伸lOmin; (5 )取擴(kuò)增產(chǎn)物4μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，若擴(kuò)增得 到357bp長(zhǎng)度條帶，則表明所檢測(cè)樣品感染芋花葉病毒，反之則未感染芋花葉病毒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于：還包括將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序 的步驟，若測(cè)序結(jié)果與SEQIDNO. 1所示序列一樣則所檢測(cè)樣品感染芋花葉病毒。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蓮中芋花葉病毒RT-PCR快速分子檢測(cè)方法，屬于植物檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明合成一對(duì)擴(kuò)增DsMV的cp基因中間部分核心序列的特異性引物（序列如SEQ？ID？NO.2和3所示），通過(guò)提取的蓮葉片的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果來(lái)判定蓮中是否感染DsMV。本發(fā)明在分子水平上能快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)蓮中DsMV進(jìn)行檢測(cè)，為蓮中DsMV的防治、脫毒苗的檢測(cè)提供了有效手段。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12Q1/70
【公開(kāi)號(hào)】CN105368987
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510964430
【發(fā)明人】胡中立, 喻霞, 鄭興汶, 刁英, 盛佳婧, 鄭興飛, 謝克強(qiáng), 周明全
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日