一致。
[0090] 人工免疫原的表征：
[0091] 將制備的人工免疫原適當稀釋，使其吸光度在0. 1~2之間，以PBS為空白對照， 用紫外分光光度計在200~500nm分別測定DEHP半抗原和DEHP-BSA吸光值，繪制紫外吸 收光譜圖，并根據(jù)以下公式計算偶聯(lián)比：
[0092]
[0093]式中：ODccinjugate 偶聯(lián)物吸光度；ODprotein 蛋白質(zhì)吸光值；ODhapten 半 抗原吸光值；Chapten--半抗原濃度；Cprotein--蛋白質(zhì)濃度；Mhapten--半抗原分子量； Mpr〇tein--蛋白質(zhì)分子量。
[0094]由圖4的紫外光譜圖可知，DEHP半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯有 兩個紫外吸收峰即286nm和309nm，其中309nm處紫外吸收峰為特征峰；BSA有兩個紫外吸 收峰，分別位于227nm和278nm處，其中278nm吸收峰處的吸收值很低；DEHP人工免疫原有 兩個紫外吸收峰，分別位于237nm和329nm處。此外，我們可以清晰發(fā)現(xiàn)，半抗原在308nm 處的紫外吸收峰發(fā)生紅移后轉(zhuǎn)移到329nm處，這說明DEHP半抗原上的氨基發(fā)生了重氮化后 已經(jīng)成功與BSA相互偶聯(lián)結(jié)合；且BSA紫外吸收峰也有所偏移，由227nm處移至237nm處， 這說明DEHP半抗原已經(jīng)和一部分氨基酸發(fā)生了偶聯(lián)反應(yīng)，從而使DEHP半抗原、BSA與人工 免疫原的紫外吸收光譜既有區(qū)別又有聯(lián)系，綜合得知：免疫原包含了DEHP半抗原和蛋白質(zhì) BSA的吸收特征，說明DEHP半抗原已順利偶聯(lián)到載體蛋白表面，人工免疫原的合成制備成 功。計算DEHP-BSA中DEHP與BSA的結(jié)合比為19. 9:1。
[0095] 實施例8、鄰苯二甲酸二（2-乙基）P1醅免痔原蛋白質(zhì)濃度的測宙
[0096] 根據(jù)考馬斯亮藍G250法測定免疫原蛋白質(zhì)濃度。考馬斯亮藍G250在游離時為紅 色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后為青藍色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm處。以BSA為標準物 質(zhì)配置不同濃度標準溶液，與一定量考馬斯亮藍G250反應(yīng)后，分別在595nm處測定溶液吸 光度值。標準溶液在0-150yg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在稀釋一定倍數(shù)的免疫原溶液中 加入考馬斯亮藍染色，在相同波長處測量吸光度值，后與標準曲線比較，得制備的免疫原蛋 白質(zhì)濃度為4. 14mg/mL。這些DEHP人工免疫原既可以用于免疫動物，通過動物產(chǎn)生的免疫 反應(yīng)得到可以用來做免疫分析的單克隆或多克隆抗體，又可以作為免疫競爭對象而使用。
[0097] 實施例9、動物免痔實驗驗證
[0098] 為證實DEHP半抗原偶聯(lián)合成的人工免疫原具有免疫原性，故通過生物體免疫反 應(yīng)制備抗DEHP多克隆抗體，具體如下：選擇2只成年健康雄性新西蘭白兔，合成出的人工 免疫原經(jīng)過與弗氏完全佐劑充分混合后，對大白兔進行頸部和背部點狀注射免疫，經(jīng)過7 次加強免疫后，采用間接酶聯(lián)免疫分析法測定抗血清效價，其抗血清效價均已達到130000， 具體效價變化見圖5。試驗顯示交叉反應(yīng)均不明顯，說明其特異性較好。
[0099] 實施例10、間接競爭BA-ELISA免痔分析方法檢測環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二（2-乙 基）P1醅
[0100] 間接競爭BA-ELISA免疫分析方法檢測環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯 具體步驟如下：用用包被緩沖液（0.05MpH9. 60碳酸鹽緩沖液）適當稀釋人工包被原溶 液，100yL/孔，加入96孔酶標板中，4°C包被過夜；次日倒掉包被液，每孔加入200yL洗滌 液（0.OlMpH7. 40PBST)，重復洗滌三次，每次3min;用吸水紙拍干酶標板后，每孔加入封 閉液200yL，37°C溫育1小時；倒掉封閉液，重復上述洗滌過程三次，生物素化抗DEHP多克 隆抗體（Bio-pAb-DEHP)稀釋至適當濃度，每孔依次加入50yL生物素化抗體及50yLDEHP 標準樣品（用含5%二甲亞砜（DMSO)的PBS(v/v)梯度稀釋），空白孔每孔加入100yLPBS 緩沖液，37°C溫育30分鐘；倒掉抗原-抗體反應(yīng)液，重復洗滌三次，用PBST適當稀釋辣根過 氧化酶（HRP)標記的鏈霉親和素（HRP-SA)，每孔加入100yL，37°C溫育1小時；倒掉HRP-SA 溶液，重復洗滌五次，每孔加入新鮮配制的顯色液（400yL2. 5mg/mL3, 3'，5, 5' -四甲 基聯(lián)苯胺底物溶液與IOmL磷酸鹽-檸檬酸底物緩沖液、10yL30 %的H2O2混合形成顯色 液）100yL/孔，室溫下避光反應(yīng)15min;每孔加入50yL終止液（2mol/L硫酸溶液）以終 止顯色，然后用酶標儀測定各孔在450nm和630nm處吸光度值（0D值），以O(shè)D=OD45q-OD63q 作為最終讀數(shù)。實驗結(jié)果用抑制率來表示，并以抑制率為縱坐標，標準樣品濃度的對數(shù)值 為橫坐標繪制標準曲線，建立的標準工作曲線如圖6所示。其中，抑制率（％) = (1-A/ A。）X100,其中A為有樣品存在的孔的OD值，A。為沒有樣品存在的孔的OD值。
[0101] 生物素化抗體的制備如下：用0. 05MpH9. 60碳酸鹽緩沖液將純化后的抗DEHP多 克隆抗體稀釋至I.Omg/mL左右，取2mL加入錐形瓶中；用DMSO配制I.Omg/mL生物素-N-琥 珀酰亞胺基酯（BNHS)溶液，向上述錐形瓶中加入BNHS溶液，使BNHS:抗DEHP多克隆抗體 的質(zhì)量比為1 :1〇,室溫下攪拌反應(yīng)4小時；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用PBS緩 沖液透析3d，每天換水3次。離心分離去除少量沉淀后，即得相應(yīng)的生物素化抗體溶液 (Bio-pAb-DEHP)，抗體溶液小體積分裝后，于-20°C冷凍保存。
[0102] 間接競爭BA-ELISA免疫分析方法檢測鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的標準曲 線方程為Y= 21.39LgCDEHP+59. 52,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9815,其中IC5。表示檢測方法的靈敏 度，即抑制率為50%時對應(yīng)的分析物濃度0. 361yg/LJC1。表示方法的檢測下限，即抑制 率為10%時對應(yīng)的分析物濃度0.0053 1^/1;1(：2。-1(：8。表示線性范圍，即0.015^/1~ 8. 965yg/L。與傳統(tǒng)儀器分析方法相比，靈敏度提高了 100-500倍。
[0103] 以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. 一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA，其特征在于，結(jié)構(gòu)式如 式⑴所示：2. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原 DEHP-BSA的制備方法，其特征在于，所述方法包括采用重氮化法將DEHP半抗原與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)制備人工免疫原 腦P-BSA。3. 如權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的制備 方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟： 51、 將所述DEHP半抗原溶于非質(zhì)子有機溶劑中，形成DEHP半抗原溶液； 52、 向所述DEHP半抗原溶液中依次滴加強酸、亞硝酸鈉溶液，控制pH為2. 0~3. 0,反 應(yīng)結(jié)束后去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉，生成重氮鹽溶液； 53、 將牛血清蛋白BSA溶于0. 01~0. 05MpH9. 18硼酸鈉緩沖液中，形成牛血清蛋白 溶液； 54、 在所述重氮鹽溶液加入所述牛血清蛋白溶液，用強堿溶液調(diào)節(jié)pH直至溶液逐漸呈 橙紅色，攪拌進行偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述人工免疫原DEHP-BSA。4. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的制備 方法，其特征在于，所述DEHP半抗原、強酸、亞硝酸鈉、牛血清蛋白BSA的摩爾比為1:4~ 6:4 ~6:0. 005 ~0. 015。5. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的制備 方法，其特征在于，所述強酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸；所述強堿為氫氧化鈉或氫氧化 鉀；所述非質(zhì)子性有機溶劑選自N，N-二甲基甲酰胺或二甲亞砜。6. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的制備 方法，其特征在于，步驟S1中，所述去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉是加入尿素以去除未反應(yīng)的亞 硝酸鈉，所述尿素與DEHP半抗原的摩爾比為120~180:1。7. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的制備 方法，其特征在于，步驟S4中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在0~4°C低溫磁力攪拌下進行；所述攪拌 時間為12~24小時。8. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的制備 方法，其特征在于，所述步驟S4還包括偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，將上清液裝入透析袋中 透析，離心分離沉淀即得所述人工免疫原DBP-BSA的步驟。9. 如權(quán)利要求2或3所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA的 制備方法，其特征在于，所述DEHP半抗原是通過包括如下步驟的方法制備而得： 4-硝基鄰苯二甲酸與異辛醇在強酸的催化下回流反應(yīng)，生 成式（II)化合物以苯或甲苯為溶劑，所述式（II)化合物和鋅粉、強酸發(fā)生還原反應(yīng)，生成所述DEHP半 抗原。10. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA在 用于痕量塑化劑鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯檢測中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯人工免疫原及制備、用途；所述DEHP-BSA的結(jié)構(gòu)式為：其制備方法為通過將DEHP半抗原與蛋白質(zhì)分子BSA偶聯(lián)制備獲得。本發(fā)明免疫原制備方法簡單，穩(wěn)定性好，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯人工免疫原DEHP-BSA通過免疫動物后制備成特異性抗體，為建立親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C07K1/107, C07C227/04, C07C229/62, C07K14/765, G01N33/543
【公開號】CN105085664
【申請?zhí)枴緾N201510515292
【發(fā)明人】莊惠生, 孫瑞艷
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月20日