一種鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種具有鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在長(zhǎng)期進(jìn)化中，植物發(fā)展出不同的防衛(wèi)系統(tǒng)抵御植物病原微生物，通常是產(chǎn)生小分子物質(zhì)抑制微生物的生長(zhǎng)。
[0003]近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)硫堇(th1nin)、防御素(defensin)、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、抗菌肽等在植物防御病原微生物中發(fā)揮著重要作用。抗菌肽PaAMP是Liu等人從美洲商陸(Phytolacca的種子中分離純化出來(lái)的抗菌肽(Liu Y, Luo J, Xu C，Ren F，Peng C， Wu Gj and Zhao J.Purificat1n, characterizat1n, and molecular cloningof the gene of a seed-specific antimicrobial protein from pokeweed.PlantPhys1logy.2000，122: 1015-1024)，其表達(dá)具有種子特異性。在萌發(fā)過(guò)程中，植物種子也會(huì)受到病原微生物或非病原微生物的侵襲，抗菌肽PaAMPl在種子萌發(fā)過(guò)程中被合成后分泌到周圍環(huán)境，對(duì)抑制這些微生物的生長(zhǎng)具有重要作用。PaAMPl成熟肽全長(zhǎng)38個(gè)氨基酸殘基，富含半胱氨酸，多達(dá)6個(gè)半胱氨酸，其二硫鍵骨架與具鎮(zhèn)痛活性的芋螺毒素ω -M VE A完全一致。但是，抗菌肽PaAMPl是否具有鎮(zhèn)痛活性，在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。利用凝膠過(guò)濾層析等技術(shù)從美洲商陸種子種分離純化PaAMP，但含量低，獲得的PaAMP數(shù)量有限，不利于對(duì)PaAMP做深入的功能研宄?；蚬こ淌侄问谦@得大量重組目的蛋白的快速、有效的方法。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，pET-32a載體上的Trx蛋白有利于二硫鍵的形成，而經(jīng)遺傳改造的大腸桿菌Origami (DE3)菌株的細(xì)胞內(nèi)為氧化狀態(tài)，也有助于二硫鍵的形成。
[0004]因此，本發(fā)明借助基因工程手段，在大腸桿菌pET_32a/0rigami (DE3)表達(dá)系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了具三對(duì)二硫鍵的抗菌肽PaAMPl的高效表達(dá)，并首次證實(shí)基因工程菌表達(dá)的重組PaAMPl具有鎮(zhèn)痛活性，為PaAMPl作為鎮(zhèn)痛藥物的應(yīng)用提供了依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)PaAMP功能研宄的不足而公開(kāi)一種具鎮(zhèn)痛活性的多肽的制備方法及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
(1)根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率優(yōu)化植物抗菌肽PaAMPl基因的密碼子；
(2)化學(xué)合成優(yōu)化后的PaAMPl基因，經(jīng)及_1/歷/70111雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的原核表
達(dá)載體pET_32a，得到重組質(zhì)粒pET_32a_PaAMPl，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Origami(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞，得到基因工程菌Origam1-PaAMPl ；
(3)將Origam1-PaAMPl菌株接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)產(chǎn)生可溶性重組PaAMPl ；
(4)用鎳離子親和層析純化后獲得重組PaAMPl，采用小鼠醋酸扭體法證實(shí)，重組 PaAMPl具有顯著的鎮(zhèn)痛活性。
[0007]從美洲商陸種子中提取的天然抗菌肽PaAMPl，除了三對(duì)二硫鍵之外，沒(méi)有其他復(fù)雜的修飾，由于重組PaAMPl具有鎮(zhèn)痛活性，因此，易推測(cè)從天然產(chǎn)物中分離純化或用化學(xué)方法合成的PaAMPl也具有鎮(zhèn)痛活性。
[0008]除了 PaAMPl，美洲商陸中還有另一個(gè)序列與之高度一致的抗菌肽PaAMP2 ；生物信息學(xué)分析表明，紫茉莉QMirabilis jalapa)、冰葉日中HMesembryanthemuncrystalHnum')等植物中也具有MjAMPl、MjAMP2、McAMP等抗菌肽，這些抗菌肽的氨基酸序列與美洲商陸PaAMPl高度相似，因此，易推測(cè)美洲商陸的PaAMP2和其他植物來(lái)源的抗菌肽MjAMPl、MjAMP2、McAMP等也具有鎮(zhèn)痛活性。由于美洲商陸、紫茉莉、冰葉日中花等植物易于大規(guī)模種植，因此有望從這些植物中工業(yè)化提取鎮(zhèn)痛多肽，滿足鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)及臨床需求。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明借助基因工程手段在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)美洲商陸抗菌肽PaAMPl的高效可溶性表達(dá)，小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)PaAMPl劑量為2.0 mg/kg時(shí)，小鼠平均扭體次數(shù)為20.95次，陽(yáng)性對(duì)照組為21.10次，陰性對(duì)照組為37.20次；PaAMPl劑量為5.0 mg/kg時(shí)，小鼠平均扭體次數(shù)為1.60次，陽(yáng)性對(duì)照組為1.95次，陰性對(duì)照組為37.20次。因此，本發(fā)明首次證實(shí)重組PaAMPl具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，在鎮(zhèn)痛領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。由于PaAMPl來(lái)源于植物美洲商陸，該材料易于大規(guī)模種植，其資源遠(yuǎn)比海洋芋螺資源豐富，因此，有望從大規(guī)模種植的美洲商陸中工業(yè)化提取天然的鎮(zhèn)痛多肽，滿足藥物研發(fā)及臨床需求。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1:PaAMPl基因的密碼子優(yōu)化。PaAMPl gene:原始的PaAMPl基因序列，Optimalgene:密碼子優(yōu)化的PaAMPl基因序列，Protein:編碼的PaAMPl蛋白質(zhì)序列。
[0011]圖2:重組載體上PaAMPl基因的測(cè)序鑒定結(jié)果。圖中所示為PaAMPl基因的反向互補(bǔ)序列，劃線部分依次為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)HindVll和BanRl。
[0012]圖3:重組PaAMPl的電泳檢測(cè)結(jié)果。M:蛋白質(zhì)marker，1:1PTG誘導(dǎo)前，2_4:1PTG誘導(dǎo)后，其中2:全細(xì)胞裂解物，3:細(xì)胞裂解物上清，4:細(xì)胞裂解物沉淀部分，5:經(jīng)鎳離子親和層析分離純化的重組PaAMPl ;箭頭所示為重組PaAMPl對(duì)應(yīng)條帶。
[0013]圖4:重組PaAMPl的鎮(zhèn)痛活性分析結(jié)果。
[0014]圖5:PaAMPI及其同源物多序列比對(duì)結(jié)果。PaAMPl和PaAMP2為美洲商陸抗菌肽，MjAMPl和MjAMP2為紫茉莉抗菌肽，McAMP為冰葉日中花抗菌肽。
【具體實(shí)施方式】
[0015]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0016]本發(fā)明實(shí)施例所用的表達(dá)載體pET_32a易被類似功能的表達(dá)載體替換，本發(fā)明所用的表達(dá)菌株也可被類似功能的大腸桿菌菌株替換。
[0017]實(shí)施例1:美洲商陸抗菌肽PaAMPl基因的合成與鑒定根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率，對(duì)PaAMPl基因(GenBank:AF048745)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化(見(jiàn)圖1)，經(jīng)密碼子優(yōu)化的PaAMPl基因的序列為SEQ ID N0.1，其編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID N0.2。
[0018]SEQ ID N0.1:
gcaggctgta ttaagaacgg tggccgctgc aatgcgagcg caggtccgcc gtattgttgcagcagctact gttttcagat tgcgggtcaa agctatggtg tgtgtaaaaa ccgttaaSEQ ID N0.2:
Ala Gly Cys He Lys Asn Gly Gly Arg Cys Asn Ala Ser Ala Gly Pro Pro Tyr Cys Cys Ser Ser Tyr Cys Phe Gln He Ala Gly Gln Ser Tyr Gly Val Cys Lys Asn Arg
采用化學(xué)方法合成PaAMPl基因(由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成Hindlll雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pET-32a (購(gòu)自Novagen公司)，重組質(zhì)粒pET-32a-PaAMPl經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證(見(jiàn)圖2)。
[0019]實(shí)施例2:重組PaAMPI的表達(dá)與分離純化
采用熱擊法將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-32a_PaAMPl導(dǎo)入大腸桿菌Origami (DE3)菌株(購(gòu)自Novagen公司)感受態(tài)細(xì)胞，得到基因工程菌Origam1-PaAMPl。
[0020]將Origam1-PaAMPl菌株接種于LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素lOOPg/mL)，37 °C震蕩培養(yǎng)，至OD6cJ直為0.8左右，將培養(yǎng)的Origam1-PaAMPl細(xì)胞冷卻至28°C，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，28°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。離心收集細(xì)胞，37°C /_20°C反復(fù)凍融5次，200w超聲破碎。高速離心后，利用鎳離子樹(shù)脂從上清中分離可溶性重組PaAMPl。純化的重組PaAMPl經(jīng)透析去除咪唑等雜質(zhì)，然后用冷凍干燥法對(duì)重組PaAMPl溶液進(jìn)行濃縮。用Bradford法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)濃度，并用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白。
[0021]電泳檢測(cè)表明，重組PaAMPl為可溶性表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和層析純化后，重組蛋白在凝膠中為單一條帶，分子量約為22 kDa，與理論大小21.6 kDa基本一致(包含標(biāo)簽部分)(見(jiàn)圖3)。
[0022]實(shí)施例3:重組PaAMPl的鎮(zhèn)痛活性分析
實(shí)驗(yàn)組以實(shí)施例2中得到的不同劑量重組抗菌肽PaAMPl溶液注射小鼠(2.0mg/kg, 5.0mg/kg)，陰性對(duì)照組注射生理鹽水(0.9% NaCl),陽(yáng)性對(duì)照組注射重組芋螺毒素ω-MVEAo每組注射20只雄性小鼠，每只小鼠的體重為20±0.2 g。給藥后45 min，給每只小鼠注射0.2 mL 0.6%冰醋酸刺激扭體行為，對(duì)20 min內(nèi)每只小鼠的扭體動(dòng)作進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0023]結(jié)果顯示，PaAMPl劑量為2.0 mg/kg時(shí)，小鼠平均扭體次數(shù)為20.95次，陽(yáng)性對(duì)照組為21.10次，陰性對(duì)照組為37.20次；PaAMPl劑量為5.0 mg/kg時(shí)，小鼠平均扭體次數(shù)為1.60次，陽(yáng)性對(duì)照組為1.95次，陰性對(duì)照組為37.20次。因此，小鼠醋酸扭體試驗(yàn)首次證實(shí)，在試驗(yàn)所用劑量下，重組PaAMPl具有顯著的鎮(zhèn)痛活性(見(jiàn)圖4)。
[0024]實(shí)施例4:抗菌肽PaAMPl及其同源物的生物信息學(xué)分析
在美洲商陸種子中，除了抗菌肽PaAMPl之外，還有PaAMP2，兩者序列高度一致，僅個(gè)別氨基酸殘基存在差異。此外，在紫茉莉中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽MjAMPl和MjAMP2，在冰葉日中花發(fā)現(xiàn)了抗菌肽McAMP。多序列比對(duì)分析表明，這些抗菌肽的蛋白質(zhì)序列與PaAMPl具有較高的相似性(見(jiàn)圖5)。易推測(cè)這些PaAMPl同源物也具有鎮(zhèn)痛活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)優(yōu)化植物抗菌肽PaAMPl基因序列； (2)合成優(yōu)化后的PaAMPl基因，經(jīng)及_1/歷/70111雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pET-32a，得到重組質(zhì)粒pET-32a-PaAMPl，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌，得到基因工程菌株; (3)將得到的基因工程菌株接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)產(chǎn)生可溶性重組PaAMPl ； (4)用鎳離子親和層析純化后獲得重組活性多肽PaAMPl。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述植物為美洲商陸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述優(yōu)化是根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率對(duì)植物抗菌肽PaAMPl基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述宿主菌為大腸桿菌Origami (DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的重組活性多肽PaAMPl在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具鎮(zhèn)痛活性多肽的制備方法，屬于基因工程領(lǐng)域；所述制備方法如下：根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率優(yōu)化美洲商陸抗菌肽PaAMP1基因序列，經(jīng)化學(xué)合成后連入原核表達(dá)載體pET-32a載體，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Origami（DE3）菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，實(shí)現(xiàn)重組PaAMP1的高效可溶性表達(dá)；采用鎳離子親和層析方法分離純化重組PaAMP1；本發(fā)明通過(guò)小鼠醋酸扭體試驗(yàn)首次證實(shí)重組PaAMP1具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，在鎮(zhèn)痛領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值；由于PaAMP1來(lái)源于植物美洲商陸，該材料易于大規(guī)模種植，其資源遠(yuǎn)比海洋芋螺資源豐富，因此，有望從大規(guī)模種植的美洲商陸中工業(yè)化提取天然的鎮(zhèn)痛多肽，滿足藥物研發(fā)及臨床需求。
【IPC分類】C07K14/415, A61P29/00, C12N15/29, C12N15/70
【公開(kāi)號(hào)】CN104911202
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510352202
【發(fā)明人】朱姍穎, 何華綱, 楚鷹, 魏斌, 李云亮, 馬海樂(lè)
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月24日